Biosensores Por el Dr. Eduardo Cortón Grupo de Biosensores y Bioanálisis Pertenecemos al CONICET y a la FCEN, UBA Formamos parte del Departamento de Química Biológica Cooperamos con el INTI, la CONEA, y dos grupos en Canadá y Madrid

Grupo independiente El grupo realiza tareas de desarrollo y transferencia de tecnología, investigación básica, divulgación científica, y docencia. Lo componen 9 personas, entre investigadores, técnicos, estudiantes doctorales y de grado.

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Biosensores para Calidad de Aguas Durante la siguiente hora: -Introducción -Los biosensores, que son, ejemplos -Características y ventajas de los biosensores -Materiales biológicos utilizados -Biosensores enzimáticos y microbianos -Biosensores enzimáticos, aplicaciones -Biosensores microbianos, aplicaciones, BOD y Toxicidad -Sensores de alerta temprana en el contexto internacional -El denominado “Proyecto Pilcomayo” -Otros sistemas, otras aplicaciones

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Introducción a los Biosensores Señal Bioquímica

Material Biológico

u

u

Señal Eléctrica

Transductor

Señal Eléctrica

Amplificador

Procesado y archivo

Los biosensores son instrumentos analíticos basados en la respuesta de un material biológico en estrecho contacto con un transductor físico/químico, que convierte la respuesta biológica en una señal eléctrica. La especificidad del reconocimiento biológico permite que muchos de los biosensores puedan operar en matrices complejas (sangre, leche, aguas). 3

Precursor Histórico de los Biosensores (Canary on a cage)

Debido a ello, se suele hablar actualmente de “canary on a chip”, debido a la tendencia actual a los ensayos en microvolumenes 4

Precursor Histórico de los Biosensores The Kemberton Colliery Mines Rescue Brigade 'C' Team, photographed in front of the Rescue Station in 1914. The man on the left is carrying a canary in a cage to detect carbon monoxide after a fire or explosion - canaries were used simply because their yellow colour made them easier to see in semidarkness underground - otherwise sparrows or any other small birds, which were equally sensitive to the effects of gas would have been just as effective! During WWI the sappers tunnelling at the Western Front used canaries for gas detection but they would trim the claws as it was discovered that a canary could die of gas and the effects of rigor meant that they would grip their perch and not fall off. If this happened the miners/sappers might not notice the onset of gas. The men are wearing 'Proto' breathing sets, developed by Siebe Gorman & Co from the earlier 'Fleuss' apparatus.

(Madeley, Shropshire, England) 5

Los “Perros Espaciales” Antes de que el hombre llegara al espacio, los científicos discutían si era posible sobrevivir en ingravidez. Quizás la radiación a esas alturas fuese mortífera. 1948 USA envía los primeros monos en V2s. La Unión Soviética emplea los denominados “Space Dogs”, envía unos 13 perros en distintas misiones para ensayar los trajes presurizados. Abajo Laika en el Sputnik 2, en 1957. Primer animal en orbita terrestre (pero su capsula no fue diseñada para ser recuperada…)

LAIKA 6

Ventajas de los Biosensores Ø Ø Ø Ø Ø Ø

Permiten medir un analito sin purificación previa Altamente específicos (enzimas), o mas o menos inespecíficos (microbianos) La información obtenida es mucho mas real que con los métodos analíticos clásicos (biodisponibilidad) Mediciones rápidas y equipos portátiles han sido diseñados La lista de posibles compuestos tóxicos en el ambiente aumenta continuamente Es necesario, entonces, sistemas analíticos de amplio espectro, inespecíficos 7

Transductores y materiales de origen biológico más utilizados (Los materiales biomiméticos no son mencionados en esta tabla)

8

El Método de Inmovilización del Material Biológico es Crítico

9

Materiales biológicos para aplicaciones medioambientales Enzimas, células enteras y anticuerpos son los materiales biológicos más utilizados

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Que pueden medir los biosensores enzimáticos? Los más importantes (+90% mercado mundial) son los que miden glucosa, usados por diabéticos Si se inmovilizan enzimas “sensibles” a determinado contaminante, este podrá ser medido Biosensores basados en la inhibición de la acetil colinesterasa detectan insecticidas fosforados y otros inhibidores

O2 CH2 OH H

CH2 OH O

H OH

H

H

H OH

OH H

Glucosa Oxidasa

H

O

OH

OH

Glucosa + O2

O H OH

H H2 O2

OH

δ-gluconolact ona + H2 O2

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Ejemplo de Biosensor Enzimático u

PAAOs + PEG 400 + E - NH2 (entrecruzante)

u

GEL

Grupos amino de la enzima

El polietilendiglicidileter, una mezcla con un peso molecular promedio de 400 (PEG 400) entrecruza la enzima y el PAAOs obteniéndose un gel redox estable.

[

]m [ NH

Os Enzima

]n NH2

N N

N Os

Cl

N

PAAOs

N

Electrodo de trabajo 12

Biosensor para pesticidas basado en inhibición enzimática

Acetilcolina: La acetilcolina es el neurotransmisor específico de las sinapsis, tanto del sistema nervioso somático como en las sinapsis ganglionares del sistema nervioso autónomo y en los órganos diana de la división parasimpática. La síntesis de acetilcolina tiene lugar en el botón terminal y es metabolizada por la acetilcolinesterasa en el espacio sináptico

Los organofosforados y carbamatos son inhibidores de la colinesterasa, enzima que cataliza la hidrólisis de los ésteres del neurotransmisor acetilcolina. Los organofosforados se unen a la acetilcolinesterasa e inhiben su actividad de manera irreversible, tanto en los glóbulos rojos como en el plasma, por lo cual su restauración depende de la síntesis de nuevas moléculas de la enzima, a diferencia de los carbamatos en los que esta unión es reversible de manera espontánea

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Biosensor para pesticidas basado en inhibición enzimática La detección de cambios de pH muchas veces no es útil, por ello la combinación con una segunda enzima, como la colina oxidasa (que toma la colina y la oxida, produciendo H2O2, fácil de medir amperométricamente).

La acetilcolina es degradada a colina y acetato, por lo tanto el pH de la solución circundante se acidifica

S. Sotiropoulou et al., Analytica Chimica Acta, 530, 14, 2005, 199-204 Órganofosforado usado como insecticida.

14

Biosensores microbianos Se los puede clasificar en dos tipos: Específicos, en los que un gen reporter, (por ejemplo lux) se activa en presencia de un activador; se han descrito para Hg++, y algunos hidrocarburos

Inespecíficos, en los que el metabolismo microbiano cambia por el conjunto de sustancias que se encuentran en solución. BOD y Toxicidad

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Ejemplo de biosensor microbiano Celda de flujo utilizada en ensayos con Lactobacillus 80

Electrodo de pH

Concentración de glucosa 0,0 mM 0,1 mM 0,5 mM 2,5 mM 10 mM 25 mM

60

∆ mV

Desperdicio Carrier Baño termostatico

40

20

Cuentas de alginato 0 1

2

3

4

5

T / min

Velocidad de acidificación para distintas concentraciones de glucosa 16

Preguntas que puede responder un biosensor inespecífico ¿Es la cantidad de materia orgánica la normal? q ¿Hay elementos tóxicos en el agua? q ¿Hay cambios en el análisis actual respecto a una muestra control? q

En algunos de estos ensayos el criterio de detección es muy amplio, requieren confirmación, generalmente mediante métodos de química analítica instrumental en laboratorio. 17

Demanda bioquímica de oxígeno, BOD5 a. Principle: The method consists of filling with sample, to overflowing, an airtight bottle of the specified size and incubating it at the specified temperature for 5 d. Dissolved oxygen is measured initially and after incubation, and the BOD is computed from the difference between initial and final DO. Because the initial DO is determined shortly after the dilution is made, all oxygen uptake occurring after this measurement is included in the BOD measurement. b. Sampling and storage: Samples for BOD analysis may degrade significantly during storage between collection and analysis, resulting in low BOD values. Minimize reduction of BOD by analyzing sample promptly or by cooling it to near-freezing temperature during storage. However, even at low temperature, keep holding time to a minimum. Warm chilled samples to 20 ± 3oC before analysis. 18

Medición de BOD por el método estándar Es problemático medir varias muestras simultáneamente Sin sensor electroquímico de DO (oxígeno disuelto) la titulación consume mucho tiempo Muestras grandes, diluciones intensivas

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Mas inconvenientes del método estándar para medir BOD u Tiempo

de medición muy largo u No se puede medir on-line (por lo tanto incapacidad de tomar acciones correctivas en plantas de tratamiento) u Dificultad de producir equipos portátiles para gestión medioambiental

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Biosensor para Toxicidad Biosensores Microbianos para la determinación de toxicidad total están basados en la inhibición del metabolismo, medido como disminución de la producción de luz en bacterias luminiscentes, disminución de la respiración u otros indicadores metabólicos.

Biosensores Enzimáticos Basados a)

b)

en dos principios básicos: Utilizando una enzima que degrada el tóxico que se quiere medir. Por ejemplo, la enzima polifenol oxidasa para medir fenol Utilizando la inhibición de la actividad enzimática provocada por diversos tóxicos en enzimas sensibles; órgano fosforados y carbamatos inhiben fuertemente la acetilcolinesterasa 21

El Riachuelo. Muchas veces el efecto de la contaminación no es tan evidente

22

Biosensores de Alerta Temprana, estado de desarrollo a nivel mundial u

Diferentes organismos son utilizados, desde bacterias a peces.

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Sistemas (redes) de Alerta Temprana funcionando en USA ORSANCO–Ohio River Valley Water Sanitation Commission. Lower Mississippi River early warning system. Delaware Valley early warning system. Upper Mississippi River early warning system

Algunos usan biosensores basados en bacterias (Microtox), otros basados en almejas, algas o microinvertebrados. Casi todos miden también parámetros físicoquímicos del agua, por ejemplo usando una sonda multiparamétrica (temperatura, pH, oxígeno disuelto y conductividad). (BEWS) biological early warning systems 24

Los sistemas usados en otros ríos no se adaptan a los grandes ríos sudamericanos Alta cantidad de sólidos en suspensión (Pilcomayo), lo que impide el funcionamiento de cualquier sistema óptico, así como dificulta la supervivencia de peces y almejas.

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Pocos biosensores de toxicidad en el mercado Bio-Sensor model 7008.

Algae Toximeter - Online Biomonitoring Using Green Algae

What These Fish Know Can Hurt You! Employing fish sensors, the Bio- Sensor® detects the presence of a broad range of toxic substances. Changes in ventilatory behavior and certain locomotor activities are detected immediately through noninvasive electronic sensors in each tank

Biological Monitoring, Inc. (BMI) Virginia, USA

bbe Moldaenke GmbH Alemania

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Desarrollo de Tecnología, Grupo Biosensores Proyecto Pilcomayo

Proyecto BOD Biosensor para la determinación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno Se desarrolla un método electroquímico, para medir de manera rápida el BOD. El método se basa en la utilización de compuestos mediadores (como el ferrocianuro) que son reducidos por el metabolismo microbiano, el aumento de su concentración (en su forma reducida) en el medio es proporcional al BOD

Desarrollo y Construcción de un Sistema Automático de Alerta Temprana para el Río Pilcomayo. Diseñar y construir un sistema que permita monitorear en forma continua o discontinua el estado general del agua de ríos de la cuenca del Pilcomayo, que permita detectar eventos anómalos, básicamente el incremento de la toxicidad por presencia de elevadas concentraciones de metales pesados u otras sustancias químicas. Equipo: Pablo Nuñez (estudiante Biología e Ingeniería), Leonardo Cantoni ( Tecnólogo), Celina Bonetto (Bióloga) y Eduardo Cortón (Director) Patrocinado por la Subsecretaria de Recursos Hídricos

Equipo: Anahí Weinstock (Química), Dra. Liliana Fraigi (Ingeniera Electrónica), Norberto Mancuso (Químico) y Eduardo Cortón FCEyN, UBA; INTA; DIRANSA (PYME)

25mV/s 50mV/s 100mV/s

40 30 20 10

µA

0 -10

5mV ferro/ferri cupla_B

-20 -30 -40 -50 -60 -70 -600

-400

-200

0

mV

200

400

600

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Proyecto BOD Tres diferentes enfoques para medir BOD rápida 1) Basado en biosensor potenciométrico de dióxido de carbono, con comunidad microbiana mixta inmovilizada en membrana. Se ha publicado, y el material especifico se encuentra en estudio por la oficina de patentes del CONICET, evaluando su patentabilidad. 2) Basado en respirometría de ferricianuro. Se ha enviado un poster, se esta preparando una publicación, y de acuerdo a los resultados se considerará la posibilidad de protección 3) Basado en Celdas de Combustible Microbianas. Estudios a nivel académico, acerca de las comunidades microbianas que colonizan los electrodos y crecimiento de biofilms sobre electrodos.

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Proyecto BOD Basado en respirometria de ferricianuro Se desarrolla un método electroquímico, para medir de manera rápida el BOD. El método se basa en la utilización de compuestos mediadores (como el ferrocianuro) que son reducidos por el metabolismo microbiano, el aumento de su concentración (en su forma reducida) en el medio es proporcional al BOD Equipo: Celina Bonetto, Natalia Sacco, Anahí Weinstock (Química), Dra. Liliana Fraigi (Ingeniera Electrónica), Norberto Mancuso (Químico) y Eduardo Cortón FCEyN, UBA; INTA; DIRANSA (PYME) 25mV/s 50mV/s 100mV/s

40 30 20 10 0

µA

-10

5mV ferro/ferri cupla_B

-20 -30 -40 -50 -60 -70 -600

-400

-200

0

mV

200

400

600

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Proyecto BOD Basado en sensor potenciométrico de dióxido de carbono

-62 -64 -66

-10 -64

-20

-68

-72

Y = -77.48 + 0.374 X r2 = 0.991

-76

0

-68

Biosensor response (mV)

Biosensor response (mV)

-60

-60

Biosensor response (mV)

-58

10

20

30

40

50

-1

BOD 5 (mg L )

-70 -72 -74

-30 -40 -50 -60 -70

-76 -80

-78 0

50

100

Tim e (minutes)

150

200

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

-1

Glucose (m g L )

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Orígenes y objetivos del “Proyecto Pilcomayo” u

u u

Durante el año 2007, se realizan reuniones con el Ing. Claudio Laboranti y la Lic. Mariana Jakomin para analizar las posibilidades existentes para un sistema de alerta temprana; las características esperadas/necesarias del biosensor se definen con el Dr. Andrés Rodríguez y sus colaboradores durante los años 2009 y 2010, para el desarrollo y construcción de un sistema de alerta temprana. La cuenca trinacional del Río Pilcomayo es puede ser afectada por contaminación en la cuenca alta o media. Existe la necesidad de conocer la calidad del agua en Misión La Paz. Son requisitos que funcione de manera automática, analice y transmita datos, y pueda sobrevivir a condiciones extremas de temperatura, así como a fluctuaciones en la provisión de energía eléctrica.

El proyecto empieza a ser delineado. ¿Porque se necesita un sistema de alerta temprana? ØLos ríos son vulnerables a eventos de contaminación que (muchas veces) no son reportados. ØLa detección temprana permite una respuesta temprana por las Agencias Regulatorias, minimizando los daños y sus costos asociados. ØNo se puede gestionar un recurso sin conocerlo. Hasta ahora la información disponible no es abundante.

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El grupo “Pilcomayo” Pablo Nuñez (estudiante Biología e Ingeniería)

Ø Diseño del software y firmware de los dispositivos involucrados en el biosensor. Ø Desarrollo y puesta a punto de técnicas de fabricación in-house de circuitos impresos. Ø Trabajo conjunto con Leonardo Cantoni en la instalación y puesta a punto de las instalaciones para comunicación.

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El grupo “Pilcomayo” Leonardo Cantoni Desarrollos Electrónicos e Informáticos •Sistemas de campo en ambientes extremos •Adquisición, control y transmisión de datos. •Experiencia en el área de Oceanografía Antártica (I.A.A.), instrumental científico de laboratorio y de campo. •Participación en proyectos multidisciplinarios nacionales e internacionales . •Experiencia Docente en el área de informática nivel terciario (Prof. CON.SU.DEC)

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El grupo “Pilcomayo” Celina Bonetto (Bióloga)

Lic. Bonetto María Celina

Microbiología: Elección de cepa bacteriana sensible ante la presencia de metales pesados. Estudio de condiciones de crecimiento óptimas. Bioensayos: Estudios de metabolismo bacteriano (respiración) empleando un electrodo de CO2. Análisis de muestras artificiales con metales pesados. Análisis de muestras de agua del Río Pilcomayo.

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Avances del Proyecto: Esquema en Bloques

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Avances del Proyecto: sistema electromecánico Ø Ø Ø

Diagramación del sistema electromecánico Análisis de las opciones disponibles Diseño preliminar •Tanques de Reactivos •Dispensers automáticos •Sistema de movimiento de Sensores •Cinta transportadora Muestras •Recipientes de muestras •Bacha de lavado y desagüe •Sist. Lavado automático •Sistema de Control y transmisión de datos

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Desarrollo de electrónica compatible con proyecto Pilcomayo . Hasta el momento se han utilizado placas ADC comerciales, principalmente de National Instruments; si bien estas placas son perfectas para las etapas de desarrollo, el costo de las placas ADC sumado al software propietario de National Instruments hace necesario que su reemplazo por tecnología propia Características técnicas de la placa ADC-Minicomputador, 16 canales Computador monoplaca basado en el microcontrolador LPC2478 de NXP (ARM7, 512KB Flash, 32KB SRAM, controlador LCD) con 16 MB de RAM dinámica externa, slot para tarjetas SD/MMC, USB host y device (1 y 1), bus CAN, Ethernet 10/100, puerto RS-232, conectores para interfaz a través de I2C y SPI, conector JTAG, conector para display LCD (STN o TFT). 16 canales de adquisición de 16-bits de resolución máxima, 125 kilomuestras por segundo (máximo). Pueden utilizarse sistemas operativos GNU/Linux o FreeRTOS, además de firmware específico desarrollado ad hoc para aplicaciones en particular. Aplicaciones posibles: adquisición de datos (local y remota), automatización, control industrial, robótica. 37

Desarrollo de electrónica compatible con proyecto Mastitis y Pilcomayo

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Avances del Proyecto: sistema de adquisición y control ØDiseño y armado de una microcomputadora basada en placas industriales Intel para biosensor. ØPrimera versión de una distro Linux para sistemas embebidos optimizada para biosensor. ØInterfaz con modem GSM/GPRS para transmisión de datos y emisión de alertas via SMS. ØInstalación y puesta en funcionamiento del foro y del wiki de desarrollo con documentación del proyecto. (Sólo uso interno de momento)

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Avances del proyecto, selección de cepa microbiana, transductor y ensayos Elección de cepa bacteriana Pseudomonas putida KT2440: u Sensible a metales pesados como Pb2+, Cr6+, Zn2+, Cd2+, Hg2+. u Requerimientos nutricionales medios, temperatura óptima 32 °C, resistente a la liofilización, aerobia estricta.

•P. putida es tan sensible como V. fischeri a metales pesados. •Condiciones de incubación y crecimiento más sencillas para P. putida.

Tabla: Patrones de inhibición comparando el crecimiento de V. fischeri y P. putida

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Proyecto Pilcomayo

Incubación por 60 min Figura 1. Esquema que muestra el flujo de la señal que proviene desde las soluciones prueba (control y muestra). Se obtiene una grafica de E (mV) vs. tiempo. Se utilizó una frecuencia de toma de datos de 1 Hz).

Concentraciones de 1,48 mg/l de 3,5diclorofenol son efectivamente detectadas por el sistema de medición como EC50. Estos valores presentan un limite de detección menor a los informados para ensayos que utilizan la misma bacteria, pero diferente método de detección y principio de funcionamiento (análisis colorimétricos y crecimiento, respectivamente, ISO 10712:1995 [1], que son de 21,4 mg/l. Los resultados se presentan aquí luego de 60 min de incubación y son favorablemente comparables a los valores publicados en la norma internacional ISO 10712 que estipula

tiempos de incubación de 16 hs. 41

Futuro de la utilización de biosensores en monitoreo ambiental Ø

Ø

Métodos inespecíficos, BOD y Toxicidad Métodos específicos, basados en genes reporters o interacción antígeno anticuerpo

A portable biosensor called RAPTOR Plus for detecting pathogens. Antibody-coated, fiber-optic probes are secured inside disposable plastic cartridges in the center hatch. Up to four target pathogens can be detected simultaneously in only 10 min.

Problemas: Es necesario validar los biosensores respecto a métodos aceptados Falta aceptación legal acerca de su utilización Limites de detección relativamente altos considerando legislación ambiental actual (poco sensibles en general) 42

El proyecto y “nuestra visión” El proyecto Biosensores utiliza un sistema de monitoreo de calidad de agua específicamente desarrollado para su utilización en aguas turbias, como la de los grandes ríos sudamericanos. Incluye la medición de parámetros físico-químicos del agua en forma continua.

El proyecto es mucho más que Biosensores; se desarrollan también los sistemas de comunicación, procesado y circulación de la información vía WEB. Este podría ser el comienzo de una Red Nacional de Monitoreo Automático de Calidad del Agua, siguiendo la tendencia de los países más industrializados. 43

Gracias por su tiempo!

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Importancia de la medición de BOD Efecto de diferentes volúmenes de descarga cloacal en el curso de un río. La descarga mayor (inaceptable) no puede ser depurada por el ecosistema, ocasionando perjuicios (muerte de peces y otros organismos, perdida de calidad del agua, etc.). 45

Biosensor para BOD y Calibración Biosensores. Las células se inmovilizan utilizando membranas de filtración (similar a papel de filtro) u otros métodos (geles) al electrodo. La señal eléctrica entregada por el electrodo es medida y registrada en forma continúa. Mediante el agregado de patrones se puede calcular la BOD de una muestra incógnita. El patrón es una mezcla estandarizada de material orgánico. 46

Método especifico, RAPTOR A portable biosensor called RAPTOR Plus for detecting pathogens. Antibodycoated, fiber-optic probes are secured inside disposable plastic cartridges. Up to four target pathogens can be detected simultaneously in only 10 min.

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Limits of detection for toxins and pathogens using a 1010minute assay performed with RAPTOR Hazard

Type and Limit of Detection

Staphylococcal enterotoxin B (SEB) Ricin Cholera toxin Yersinia pestis F1 Bacillus anthracis Bacillus globigii Brucella abortus Francisella tularensis Giardia lamblia

Toxin, 1 ng/ml Toxin 10 ng/ml Toxin 1 ng/ml Bacterial surface protein 10 ng/ml Gram positive bacterium (vegetative form) 50 cfu/ml Gram positive bacterium (spore) 5 x 104 spores/ml Gram negative bacterium 7 x 104 cfu/ml Gram negative bacterium 5 x 104 cfu/ml Protozoan cysts 3 x 104 cysts/ml

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