FACULTAD CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS

LABORATORIO ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA. PLAN COMÚN AGRONOMÍA E INGENIERÍA FORESTAL

PRACTICO 5: TECNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN

I.-

INTRODUCCIÓN

La manipulación del ADN ha permitido, entre otras cosas, el desarrollo de la clonación de secuencias de ADN para el estudio de mutaciones que estén involucradas en patologías , mapeo y secuenciación de genes con fines terapéuticos, desarrollo dela terapia genética, análisis forenses y de paternidad. Las aplicaciones del ADN son múltiples, de manera que las técnicas de laboratorio desarrolladas hasta la fecha para su estudio presentan una infinidad de variantes. Entre estas tenemos:

A –1 ) Enzimas de restricción Una enzima de restricción (o endonucleasas de Restricción) es una enzima que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto llamado sitio o diana de restricción o en un sitio no muy lejano a este, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. La primera enzima de restricción la descubrió en 1970 Hamilton Smith, en la Universidad de John Hopkins. La enzima fue extraída de la bacteria Haemophilus influenzae y tiene la propiedad de romper el ADN del fago lambda y de E. coli, pero no su propio ADN. Se le denominó Hind II. En las décadas siguientes se ha descrito una gran variedad de enzimas de restricción con diversas secuencias de corte para el ADN. El mecanismo de corte de DNA se realiza a través del rompimiento de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, dando lugar a dos extremos de DNA, que pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados Ver figuras 1, 2 y 3

. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo ya que

los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que puedan haber en la cercanía

Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.

Restricción de SmaI dejando extremos romos.

Figura 1 Tipos de cortes cohesivos y romos

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo

de vectores están los Plásmidos moléculas circulares de ADN halladas en las bacterias , entre estos vectores tenemos el plasmido pBR322.

Figura 2

Figura 3

A – 2) Plasmido pBR 322 Uno de los plásmidos usados como vector de clonación y mejor estudiado y más a menudo utilizado para "propósitos generales" es el pBR322. Estos vectores de clonación, en general, se denominan con la letra minúscula p (de plásmido) y alguna abreviatura que puede ser descriptiva o, en el caso del pBR322, anecdótica. La BR son las iniciales de los investigadores que crearon el plásmido (F. Bolivar y R. Rodríguez) y el 322 es una designación numérica que tiene relevancia para estos investigadores. El plásmido pBR322 contiene 4361 pb. Contiene dos genes de resistencia a antibióticos: uno confiere resistencia a ampicilina (Ampr) y el otro a tetraciclina (Tetr). Este plásmido contiene un único sitio de corte Bam HI, Hind III y Sal I dentro del gen Tetr; un único sitio de corte Pst I en el gen Ampr; y un único sitio de corte EcoRI que no está dentro de ningún DNA codificante. También tiene un origen de replicación que funciona sólo en Escherichia coli. Este plásmido se mantiene con un alto número de copias en Escherichia coli y no puede ser transferido a otra bacteria.

Figura 4 Mapa del plasmido pBR322

B) La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causante de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 ºC en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras con corrección de errores (Pfu, Vent). Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y tests de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Para realizar la técnica se necesitan: •

Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.

•

Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar.

•

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. Actúan como cofactores de la polimerasa.

•

Iones monovalentes, como el potasio.

•

Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

•

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70ºC (la más común es la Taq polimerasa).

•

ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

•

Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos de temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico a alta temperatura (> 90°C), y seguido por otro final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTPs en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores. Los pasos de una PCR son: •

Inicialización Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 9496ºC (ó 98ºC si se está usando una polimerasa termoestable extrema) sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

•

Desnaturalización En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma..

•

Alineamiento/Unión del cebador A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65ºC durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman

cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. •

Extensión/Elongación de la cadena Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP's complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad está en 75-80°C (comúnmente 72°C). El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla básica: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

•

Elongación Final Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74°C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

•

Conservación Este paso se lleva a cabo a 4-15°C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.

Figura 5 Fases de una PCR

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene

fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR. Tipos de PCR 1.

PCR anidada Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy específica.

2. PCR in situ PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación. 3.

PCR multiplex PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de primers en único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción todos pares de primers de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, menor cantidad de templado para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de base de datos.

4.

RT-PCR Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, como Tth, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario).

5.

PCR tiempo real Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original.

Electroforesis Se emplea para el análisis y purificación de fragmentos del ADN. Generalmente, se usan dos tipos: de agarosa y acrilamida. La agarosa se emplea para separar fragmentos de ADN con tamaños de 100 pares de bases hasta 20 kilobases. Los geles de acrilamida se usan en el rango de >200 pares de bases. Si se necesita estudiar ADN de 1 000-2 000 kilobases, se desarrolló la técnica conocida como electroforesis de campo pulsado. Un gel hecho de agarosa está compuesto de polímeros. El grado de concentración de la agarosa en el gel se seleccionará dependiendo del tamaño del fragmento de ADN por estudiar. El ADN al tener carga negativa si se coloca bajo un flujo eléctrico, migrará hacia el polo positivo, donde la rapidez de este movimiento dependerá del tamaño de la molécula de ADN. Los geles sirven como soporte para que el ADN migre hacia el polo positivo y ayudan a separar las

moléculas del ADN con base en su tamaño. Las bandas del ADN o fragmentos de un determinado tamaño pueden observarse en estos geles al intercalar moléculas de bromuro de etidio. El bromuro de etidio se une al ADN y emite una coloración naranja cuando se coloca en un transiluminador con luz ultravioleta ver figura 6.

Figura 6 Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio

II.-

OBJETIVOS.

Objetivo General. •

Identificar mediante electroforesis en geles de agarosa fragmentos amplificados por PCR de tejido vegetales y obtenidos de la digestión enzimática del plásmido pBr322.

Objetivos específicos. •

Amplificar mediante PCR de genes vegetales.

•

Cortar mediante Enzimas de Restricción el plásmido pBr 322

•

Identificar y caracterizar los fragmentos y marcadores genéticos obtenidos.

III

PARTE EXPERIMENTAL.

1.-

Reactivos y Muestras.

2.-

•

Agarosa grado Biología Molecular.

•

Buffer TBE 1X y 0.5 X.

•

H2O destilada estéril.

•

DNA obtenido en paso práctico N°4.

•

Plasmido pBr322

•

Enzima EcoR1

•

Buffer 10X

•

MgCl2 (25 mM)

•

Taq Polimerasa

•

dNTPs 10 mM

•

Materiales. Tubos Eppendorf 1.5 y 0.6 ml.

•

Microcentrifugas

•

Balanzas analíticas.

•

Termociclador.

•

Cámara de electroforesis.

•

Fuentes de poder.

•

Matraz enlermeyer 100 ml

•

Probeta 100 ml

3.-

PROCEDIMIENTO

3.1-

Protocolo de amplificación por PCR.

El profesor preparó dos tubos con los siguientes volúmenes Tubo Control

Tubo 1 DNA

µL

µL

Buffer 10X

5

5

MgCl (50 mM)

2

2

dNTPs (10 mM)

1

1

Primer F 10 mM

2

2

Primer R 10 mM

2

2

Reactivos

Taq 1U/Ul

1

1

Agua destilada

32

32

Volumen Final

50

50

0

5

DNA Vegetal

Llevó al termociclador y aplicó el siguiente programa: Proceso Iniciación Desnaturación Alineamiento Elongación Ciclos Elongación Final Conservación

Temperatura y tiempo 94°C 5 min 94°C 1 min 62°C 1 min 72°C 1 min 35 72°C por 5 min 4°C por 10 min

NOTA: Por motivos de tiempo solamente se entregaran las muestras amplificadas del PCR, pues el protocolo dura mas de 3 horas, por lo cual el profesor lo realizará.

3.2 Corte con Enzimas de Restricción del plasmido pBR322 El profesor preparo dos tubos con los siguientes volúmenes Reactivo Buffer 10 X Enzimas Restricción. Agua Destilada Plamido pBR322

Tubo control 1μL 1 μL

Tubo 1

7 μL 0 μL

7 μL 1 μL

1 μL 1 μL

1. Incubar 30 min a 37°C

3.3-

Resolución de los fragmentos del plásmido mediante electroforesis.

1. Tome con guantes el molde de metacrilato y sellelo con cinta adhesiva en los extremos según la figura 7 2. Pese 0,60 gramos de agarosa y disuélvalos en 60 ml de tampón TBE (1X) para preparar un gel al 1,0 % p/v.

3.

Caliente en el mechero la solución de agarosa cuidando que no ebulle hasta que quede la solución completamente transparente, use guantes de seguridad

4. Agregue la solución al molde y ponga la peineta sin tocar el fondo según figura 7 5.

Una vez polimerizado el gel proceda a depositarlo en la cámara de electroforesis ,cúbralo con la solución tampón de corrida (TBE 0,5X) y saque la peineta.

6. Utilice como indicador de peso molecular Ladder 1Kb. Deposite 2 µL en el primer carril. 7. Cargue 5 μL del DNA amplificado por PCR y deposite más 4 µL de buffer de corrida en un tubo Eppendorf. 8. Repita lo mismo con el control negativo de la digestión y con el DNA digerido de la digestión enzimática. 9.

Deposite el contenido de cada DNA con su colorante en pocillos independientes en el gel.

10. Posteriormente proceda a la electroforesis, que se efectuará a 100 volts, hasta que el

frente de migración se resuelva en el 50% de la longitud del gel. 11. Revele el gel en una solución de BROMURO DE

ETIDIO al 0,4%v/v por 10

minutos 12. Los resultados obtenidos, según el caso, serán reproducidos en fotografías Polaroid, para su posterior análisis.

Figura 7 Elaboración de un gel de electroforesis

Bibliografia 1.

2.

3. 4. 5.

Dieffenbach, C.W., Dragon, E.A. and Dveksler, G.S. (1995). Setting Up a PCR laboratory. In PCR Primer, A laboratory Manual. C.W. Dieffenbach and G.S. Dveksler. CSHL Press. New York. 10-25. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, et al.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487–491 Griffiths, J.F. A. et al. (2002), Genética, McGraw-Hill Interamericana. ISBN 84486-0368-0. Coleman, WB y Tsongalis, GJ (2006), Molecular Diagnostics: For the Clinical Laboratorian, Humana Press. ISBN 1-58829-356-4.pgs. 47-56 y 65-74 Butler, JM (2005), Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR, Academic Press pgs 63-84. ISBN 0-12-1479

6.

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