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PRÁCTICO Nº 4 GLUCOGENOLISIS I.- INTRODUCCIÓN La molécula de Hidrato de Carbono más importante desde el punto de vista fisiológico es la Glucosa, la cual se clasifica como monosacárido del tipo polihidroxialdehido de baja masa molecular, químicamente corresponde a una aldohexosa, es decir, está formada por 6 átomos de carbono y un grupo aldehído en el carbono uno. En solución acuosa, el grupo carbonilo y los grupos hidroxilo de la glucosa reaccionan intramolecularmente para formar una estructura cíclica de 5 miembros denominada piranosa.

CHO H HO H

CH2OH O OH

CH2OH O OH

OH OH

H

OH

HO

OH H

OH HO

CH2OH

OH α-D-Glucopiranosa Estructura Haworth

OH β-D-Glucopiranosa Estructura Haworth

Glucosa Estructura Fischer

Los monosacáridos pueden unirse para formar estructuras mayores, ya sean disacáridos (2 unidades), oligosacáridos (cadenas cortas de unidades) o polisacáridos (cadenas de más de 10 unidades); en todos ellos estas uniones corresponden a enlaces glicosídicos (químicamente enlaces éter).

CH2OH

O

HOCH2

OH

HO

O

HO OH

CH2OH

CH2OH

O

O

O CH2OH

HO

OH

O OH

OH

Sacarosa

(H,OH)

OH

OH

Maltosa Enlaces Glicosídicos

La glucosa forma varios tipos de polisacáridos que se diferencian estructuralmente, lo que deriva en que cumplen diversas funciones:

Autores: Maribel Arnes; Gabriela Cornejo; Alejandra Moreno & Lorena Tapia

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• •

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Forman parte de los tejidos de sostén de plantas y animales, por ejemplo: la celulosa, el almidón, el algodón, el ADN, etc. Constituyen una fuente importante de energía

Con respecto a está última función encontramos el glucógeno; polisacárido formado por varias cadenas que contienen de 12 a 18 unidades de D-glucosas unidas mediante enlaces glicosídicos α (1,4); uno de los extremos de esta cadena se une a la siguiente cadena mediante un enlace α (1,6). Una sola molécula de glucógeno puede contener más de 120.000 moléculas de glucosa.

Los principales lugares destinados para la reserva de glucógeno en animales son el Hígado que puede almacenar aproximadamente 70 g (280 Kcal) de glucógeno y los Músculos Esqueléticos que pueden contener hasta 400 g (1600 Kcal). Sin embargo, este contenido fluctúa notablemente como consecuencia de la alimentación y de los estímulos hormonales, entre otras causas. En el hígado, el glucógeno tiene como misión mantener el nivel de glucosa en la sangre (glicemia) constante. En los músculos, el glucógeno se utiliza para abastecer de energía (ATP) al proceso de contracción muscular. Debido a la estructura tan ramificada del glucógeno, permite la obtención de moléculas de glucosa libre en el momento que se necesiten; éste proceso se denomina Catabolismo del Glucógeno o Glucogenólisis. Para llevar a cabo este proceso se requiere la acción combinada y secuencial de 3 enzimas: • • •

Glucógeno Fosforilasa Enzima Desramificante del Glucógeno Fosfoglucomutasa

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Glucógeno Fosforilasa: Cataliza la denominada Escisión Fosforolítica de los enlaces glicosídicos α (1,4), que consiste en la separación secuencial de restos de glucosa desde el extremo no reductor, según la reacción siguiente n (Glucosa)

+Pi

n-1 (Glucosa)

+ Glucosa-1-P

Enzima Desramificante del Glucógeno: La glucógeno fosforilasa, no puede degradar los enlaces glicosídicos α(1-6) por lo tanto es la enzima desramificante la encargada de realizar dicha función.

Fosfoglucomutasa: Se encarga de transformar la Glucosa-1-P en Glucosa-6-P. Esta es una reacción reversible. Glucosa-1-P

Glucosa-6-P

Para poder ser liberada al torrente sanguíneo y de este modo regular la glicemia, la Glucosa-6-P debe ser desfosforilada, o sea, debe perder el grupo fosfato, para obtener una glucosa libre mediante la enzima Glucosa-6-fosfatasa

Glucosa-6-P

+ H 2O

Glucosa +Pi

En resumen, la regulación del metabolismo del glucógeno en el hígado, se lleva a cabo a través de la concentración de glucosa extracelular. Para mantener la glicemia, el hígado actúa como dador o captador de glucosa, dependiendo de los niveles extracelulares de ella. Las enzimas claves para la regulación de la glicemia son la Glucógeno Fosforilasa y la Glucógeno Sintetasa, ambas enzimas se comportan de acuerdo a la acción de dos hormonas secretadas por el páncreas: el Glucagón y la Insulina que actúan dependiendo de si el organismo se encuentra en condición de hipoglicemia o hiperglicemia. Cuando el nivel de glucosa en la sangre es bajo (hipoglicemia), el glucagón producido por el páncreas activa la acción de la glucógeno fosforilasa, estimulando la degradación del glucógeno en el hígado liberando glucosa al torrente sanguíneo con lo que su concentración aumenta.

Por el contrario, cuando el nivel de glucosa sanguínea es alto (hiperglicemia), la insulina producida también en el páncreas activa la acción de la glucógeno sintetasa que estimula la síntesis de glucógeno por lo que la concentración de glucosa libre en la sangre disminuye.

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La disponibilidad de glucosa es esencial para que la célula pueda realizar correctamente su metabolismo energético. Así, el mantenimiento de una concentración adecuada de glucosa es crucial para el organismo. Un individuo adulto requiere de unos 500 g de hidratos de carbono al día. El glucógeno ingerido en la dieta es degradado en el tubo digestivo por enzimas hidrolíticas, y contribuye de esta manera a los requerimientos energéticos celulares. Frente a una dieta rica en hidratos de carbono, se promueve la acumulación de glucógeno hepático y muscular.

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II.- Objetivos - Reconocer el efecto de una dieta rica en hidratos de carbono sobre la acumulación de glucógeno hepático en ratas. - Comparar los niveles de glucógeno hepático en ratas sometidas a una dieta rica en hidratos de carbono y en ayuna con respecto a ratas controles. - Determinación de Glucógeno por su reacción con Yodo.

III.- PARTE EXPERIMENTAL 1. Animales de experimentación Se utilizaron 3 ratas, las cuales se mantuvieron con pellet comercial y agua ad libitum (libre disposición), a 25º C.

2. Dietas Una de las ratas fue mantenida con dieta glucídica. Para ello, fue alimentada durante los últimos 6 días anteriores a la toma de muestra, con pellet comercial y el agua fue reemplazada por una solución de azúcar al 59% (p/v). La otra fue mantenida en ayuna durante 3 días y agua ad libitum. La tercera rata fue mantenida con dieta normal, es decir, alimentada con pellet comercial y agua ad libitum por un período de 6 días.

3. Obtención de muestras El peso promedio final del hígado de cada rata fue: 

rata alimentada con dieta glucídica: __________



rata en ayuno durante 3 días: __________



rata alimentada con dieta normal: __________

Cada uno de los animales fue anestesiado con éter; luego, se les extrajo el hígado. Estos tejidos fueron homogenizados independientemente en un mortero con arena y con aproximadamente 300 mL de Ácido tricloro-acético al 5% p/v. Cada homogenizado fue centrifugado a 3.000 rpm por 10 min. Luego cada sobrenadante fue filtrado sobre papel filtro y rotulado como filtrado I, II y III.

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4. Curva de Calibración (ó Curva Estándar) Objetivo: - Desarrollar una curva de calibración que permita relacionar la cantidad de sustrato (glucógeno) con la Absorbancia. Procedimiento: a) Desarrolle el siguiente protocolo: - A partir de una solución stock de glucógeno de concentración 0,4 mg/mL realice las diluciones indicadas en la siguiente tabla: TUBOS Reactivos Glucógeno (0,4 mg/mL) H2O destilada

Solución de Yodo (Lugol)

1

2

3

4

5

6

Blanco

Patrón 1

Patrón 2

Patrón 3

Patrón 4

Patrón 5

-----

0,5 mL

1,0 mL

1,2 mL

1,5 mL

2,0 mL

2,0 mL

1,5 mL

1,0 mL

0,8 mL

0,5 mL

-----

1 gota

1 gota

1 gota

1 gota

1 gota

1 gota

b) Homogenice las soluciones. c) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda (utilice el tubo Nº 1 (blanco) para calibrar el equipo a cero. d) Anote las lecturas en la siguiente tabla: Blanco Absorbancia (540 nm)

Patrón 1

Patrón 2

Patrón 3

Patrón 4

Patrón 5

0,00

e) Con los datos anteriores complete la siguiente tabla: CURVA DE CALIBRACIÓN

Patrón 1

Patrón 2

Patrón 3

Patrón 4

Patrón 5

[Glucógeno] (mg/ml) Absorbancia

f) Realice un gráfico (curva de calibración) de Absorbancia versus concentración de glucógeno.

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5. Determinación de glucógeno por método de Yodo 1.

Prepare un tubo blanco adicionando 2,0 mL de agua destilada y una gota del reactivo de yodo (Lugol), agite suavemente.

2. Luego rotule tres tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos, y por separado, 1,0 mL de cada filtrado proveniente de cada corte de hígado que contiene glucógeno. 3. Adicione a cada tubo de ensayo 1,0 mL de agua destilada y 1 gota del reactivo de yodo (Lugol), agite suavemente. 4. Calibre el espectrofotómetro a 540 nm con el tubo blanco, lea la Absorbancia de las muestras en el equipo a la misma longitud de onda y complete la siguiente tabla:

Tubo N°

1

2

3

Absorbancia

5. Con los datos anteriores, interpole los valores de Absorbancia en la curva de calibración para obtener la concentración de glucógeno y complete la siguiente tabla:

1

2

3

[Glucógeno]

6. Deduzca, según los resultados obtenidos, el tipo de dieta a la que fue sometida cada rata y cual le corresponde a cada filtrado: 

Filtrado I: ________________________________________



Filtrado II: _______________________________________



Filtrado III: _______________________________________

7. Exprese el contenido de glucógeno (en mg) por cada 100 mL de filtrado hepático que corresponde a cada rata en estudio: 

Rata con dieta normal: ________________________



Rata con ayuno: _____________________________



Rata con dieta glucocídica: _____________________

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