PROCEDIMIENTO RECUENTO DE AREOBIOS MESOFILOS EN LECHE UHT Sección Microbiología de Alimentos 1.

PRT- 712.02-078

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OBJETIVO

Conocer la calidad microbiológica de la leche sometida a ultra alta temperatura de acuerdo a lo establecido en el Reglamento Sanitario de los Alimentos. 2.

CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Aplicar a leche tipo ultra alta temperatura (UHT). 3.

FUNDAMENTO

Los productos procesados a ultra alta temperatura (UHT) son sometidos entre 135°C a 140°C por 2 a 4 minutos, empacados asépticamente. Productos lácteos de baja acidez. Estos productos están regulados según Food Drugs Administration como productos enlatados o conservas de baja acidez. 4.

REFERENCIAS

4.1

Standard Methods for the examination of Dairy Products, 17 Edición del 2004, capítulos 3, 4, y 9.

4.2

BAM online carpeta 21A, enero 2001.

PROCEDIMIENTO RECUENTO DE AREOBIOS MESOFILOS EN LECHE UHT Sección Microbiología de Alimentos

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5.

TERMINOLOGÍA

5.1

No Aplica

6.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

Equipos

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6.1.1 Incubadora a 35°C ± 1°C 6.1.2 Incubadora a 32°C ± 1°C 6.1.3 Vortex 6.1.4 Baño de agua termorregulador 47°C ± 2°C 6.1.5 Cámara de flujo laminar 6.1.6 Cuenta colonias tipo Québec 6.1.7 Refrigerador 0°C a 4.4°C 6.1.8 Homogeneizador (Stomacher o Blender) 6.1.9 Horno Microonda 6.1.10 Pipetas de 1, 5 y 10 mL 6.1.11 Placas de Petri 6.2

Medios de cultivo e insumos

6.2.1 Agar Plate Count 6.2.2 Diluyentes dosificados en frascos Schott con 99 mL ± 2 mL y tubos con 9 mL ± 0,2: Agua Fosfatada de Butterfield con o sin cloruro de magnesio o agua peptonada al 0,1% o agua peptona sal o solución Ringers a un cuarto de concentración como referencia estándar. 6.2.3 Alcohol al 70%. 6.2.4 Papel absorbente

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DESARROLLO

7.1

Recibir las muestras recepcionadas por el laboratorio 340 según PRT-712-01-001 y PRT712.01-002.

7.2

Preincubación de los envases:

7.2.1

Realizar una inspección de las condiciones físicas de los envases para detectar los defectuosos.

7.2.2

Limpiar los envases con papel absorbente y alcohol 70%.

7.2.3

Incubar por 10 días a 35°C± 1°C. Cada unidad debe estar sobre papel absorbente para detectar filtraciones.

7.3

Siembra:

7.3.1

Cumplido el tiempo de incubación, retirar los envases y mantener a temperatura ambiente el tiempo suficiente para que se enfríen y adquieran la temperatura ambiental antes de analizar.

7.3.2

Procesar la muestra preferentemente en Cámara de Flujo Laminar. Si no dispone de Cámara Flujo laminar, abra y siembre los envases en mesón frente a un mechero.

7.3.3

Un vez que los envases adquieren la temperatura ambiente, nuevamente desinfecte con alcohol 70% en la superficie donde será abierto.

7.3.4

Para abrir los envases utilice material estéril.

7.3.5

Si los envases presentan condiciones normales, homogenice la muestra antes de abrir, invirtiendo 25 veces el contenedor.

7.3.6

Abrir cuidadosamente y obtener la alícuota analítica de 1mL para siembra directa y si se requiere realizar diluciones medir 11 mL y diluir en 99 mL del diluyente seleccionado.

7.3.7

El tiempo estimado entre la homogeneización y la remoción del volumen analítico no debe exceder los 3 min.

7.3.8

Cuando se realiza sólo control de esterilidad comercial, se puede puncionar el envase con una jeringa estéril y obtener el volumen de muestra necesario para análisis.

7.3.9

Agregar 15 a 20 mL de agar Plate Count previamente fundido y mantenido a 47°C ± 2°C.

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7.3.10 Mezclar 5 veces siguiendo la dirección de las manecillas del reloj, 5 veces con movimientos horizontales, 5 veces con movimientos contrario a las manecillas del reloj y finalmente 5 veces con movimientos verticales). 7.3.11 Una vez solidificado el agar, invertir rápidamente las placas. 7.3.12 Incubar a 32°C ± 1°C por 48 horas. 7.4 Lectura y Cálculo: 7.4.1 Realizar lectura y recuento en el cuenta colonias. 7.4.2 Registrar las lecturas en RG-712.00-023. 7.4.3 El recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema: 7.4.3.1

Placas normales (25 - 250 colonias):

• Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo. • Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamaño muy pequeño. • Anotar por dilución, el número de colonias contadas en cada placa. 7.4.3.2

Casos especiales

Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera: 7.4.3.2.1 Placas sobrepobladas (mas de 250 colonias): a1)-Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC) cuando disponga de placas normales. a2) Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas, contar las colonias en porciones de la placa si su distribución es homogénea y calcular el recuento estimado en placa (RPES). •

Si hay menos de 10 colonias por cm², contar las colonias en 12 cuadrados, seleccionar 6 cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos formando ángulo recto, contar cada cuadrado sólo una vez

•

Si hay más de 10 colonias por cm² contar las colonias en cuatro de tales porciones. En ambos casos, multiplicar el número promedio de las colonias contadas por cm² por el área de la placa usada para estimar el número de colonias por placa. Cada laboratorio debe

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determinar el área en cm² de las placas usadas. Registre los valores obtenidos e indique como recuento estimado. •

Si hay mas de 100 colonias por cm², registrar como >100 col / cm².

7.4.3.2.2 Placas con menos de 25 colonias (< 25 colonias) Cuando las placas de las diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, registre los valores obtenidos e indique como recuento estimado. 7.4.3.2.3 Placas sin desarrollo de colonias Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin desarrollo en la dilución correspondiente (SD) o < 1 por la correspondiente dilución más baja e indique como recuento estimado. 7.4.3.2.4 Crecimiento invasivo Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos: a1) El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegración de un grupo de bacterias cuando la placa Petri es rotada para mezclar el agar con la alícuota analizada. Si solamente existe una de tales cadenas contar como una colonia . Si una o mas cadenas parecieran originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia. No contar cada crecimiento individual de tal cadena como una colonia. a2) El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una película de agua entre el agar y el fondo de la placa Petri. a3) El tercer tipo es la que se forma en una película de agua en el costado o en la superficie del agar. Estos dos últimos tipos revelan una acumulación de humedad en el punto en el cual se origina el crecimiento invasivo. Cuando la alícuota de siembra es uniformemente distribuida en el medio, las bacterias raramente desarrollan colonias invasivas. a4) Si en las placas seleccionadas se presenta invasión, realizar recuento de colonias solamente: • Si el área invadida no excede la mitad de la placa. • Si las colonias están bien distribuidas fuera del área invadida. • Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio.

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Los laboratorios con un 5 % de placas cubiertas con más de 1/4 de las placas con crecimiento invasivo, deberían tomar medidas inmediatas, para eliminar este problema (reducir la humedad ambiente en la cámara o estufa de incubación y mezclar cuidadosamente el agar con la siembra). 7.4.3.2.5 Accidente de laboratorio o inhibidores de crecimiento bacteriano. Cuando una placa presenta contaminación u otra condición insatisfactoria registrar como "Accidente de Laboratorio". Especificar. El analista puede sospechar la presencia de sustancias inhibidoras en las muestras que están siendo analizadas, cuando las placas no tienen crecimiento o tienen proporcionalmente menos crecimiento en las diluciones mas bajas. Tal resultado no debería ser interpretado como evidencia de inhibidores hasta confirmar la presencia de ellos en el producto 7.4.4

Para los cálculos del Recuento Standard en placa considerar sólo los dos primeros dígitos. Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es par. Usar ceros para los demás dígitos hacia la derecha. Ejemplo Lectura calculada

7.4.5 7.4.5.1

RAM

12.700

13.000

12.400

12.000

15.500

16.000

14.500

14.000

Placas normales Cuando los recuentos de los duplicados de placas de sólo una de las diluciones caen dentro del rango 25 a 250 colonias:

- Utilizar para el cálculo los recuentos obtenidos en placas normales - Sacar promedio y multiplicar por el factor de dilución.

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Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango 25-250 colonias calcular el RAM según la siguiente fórmula: ΣC

N=

[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d donde : N

= número de colonias por ml o g de producto

Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 = número de placas contadas de la menor dilución. n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva. d = dilución de la cuál fué obtenido el primer recuento Ejemplo 1 : 100

1 :1000

232 y 244

33 y 28

N = 232 + 244 + 33 + 28 [( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01 = 537 0.022 = 24.409

= 24000

7.4.5.3

Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del rango 25-250 colonias, usar sólo aquellos recuentos que estén dentro de este rango.

7.4.6

Todas las placas con menos de 25 colonias.

Cuando las placas de ambas diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, informar el recuento como menor de 25 por el recíproco del factor de dilución menor.

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Ejemplo 1 : 100

1 : 1.000

R A M ( mL o g )

18

2

< 2.500 recuento en placa estimado (RPES)

0

0

< 2.500 recuento en placa estimado (RPES)

7.4.7

Todas las placas con mas de 250 colonias

Cuando las placas de ambas diluciones tienen más de 250 colonias cada una (pero menos de 100 por cm²) contar las placas más cercanas a 250, sacar promedio y multiplicar por el recíproco de la dilución. Ejemplo 1 :100

1 : 1.000

MNPC

640

R A M ( mL o g ) 640.000 recuento en placa estimado (RPES)

( MNPC = Muy numeroso para contar ) 7.4.8

Todas las placas con más de 100 colonias promedio por cm².

Estimar que el R A M es mayor de 100 veces la mayor dilución sembrada, por el área de placa utilizada y por el recíproco de la dilución. Ejemplo 1 : 100

1 : 1.000

R A M ( mL o g )

TNPC

7.150*

> 6.500.000 * ( RPES )

TNPC

6.490**

>5.700.000 **( RPES )

*

basado en un área de placa de 65 cm² ( 9 cm Ø )

**

basado en un área de placa de 57 cm² ( 8,5 cm Ø )

7.4.9 Todas las placas con crecimiento invasivo, presencia de inhibidores o accidente de laboratorio. Informar según corresponda. 7.4.10 Registrar los cálculos en registro RG-712.00-023.

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7.5 Informe 7.5.1 Informar el recuento de aerobios mesófilos (RAM) en unidades formadoras de colonias (ufc) por mililitro o gramo según corresponda.

7.5.2

8.

Expresar el Resultado con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la potencia correspondiente. Ej 2.400 → 2,4 x 103 ufc / g o mL. El Reglamento Sanitario de los Alimentos para las leches clase UHT exige recuentos de aerobios mesófilos < 1, por lo tanto cuando no se presente desarrollo informe como < 1 (recuento en placa estimado). REGISTROS

Identificación del registro Registro de resultados análisis RAM, S. aureus, mohos y levaduras en muestras de alimentos y agua RG-712.00-023 9.

Almacenamiento

Protección

Archivador azul rotulados Registro lectura e informes de resultados laboratorio 346.

Acceso restringido al personal de la Sección de Microbiología Alimentos

TABLA DE MODIFICACIONES

Revisión Nº Pág. Modificada

10.

Recuperación Tiempo retención y disposición Papel 5 años y eliminado en trozos a en basura normal

Motivo del cambio

Fecha Aprobación

ANEXOS

Registro de resultados análisis RAM, S. aureus, mohos y levaduras en muestras de alimentos y agua.