MUESTRAS 6. 1. Selección de la muestra Las consideraciones más importantes que deben tenerse en cuenta son que la muestra debe ser representativa del proceso patológico y que la cantidad recogida sea suficiente para asegurar un examen completo y adecuado. Por ejemplo, tina pequeña cantidad de suero drenado de la úlcera del pie de un diabético con una osteomielitis subyacente no es probable que permita encontrar microorganismos del tipo presentes en el hueso infectado; en realidad, lo más probable es que no permita detectar ningún microorganismo. En el ejemplo citado, la muestra ideal sería una biopsia de hueso (para ser estudiada histológica y bacteriológicamente). Aunque con frecuencia no es posible obtener tejido infectado, éste es sin duda la muestra ideal. En orden de conveniencia el siguiente es un exudado francamente purulento, que resulta por completo satisfactorio. En el caso de una lesión progresiva de la piel y tejido subcutáneo (como gangrena bacteriana sinérgica progresiva), el material del margen activo de la lesión probablemente reflejará con mayor exactitud que el de la zona central la verdadera bacteriología del proceso. El material obtenido con un hisopo del tracto abierto de un seno con frecuencia no proporciona el verdadero organismo infectante; una biopsia profunda será mucho más contable. El esputo expectorado, sobre todo si no es purulento y con mínima contaminación salivar, presenta problemas graves en especial porque la neumonía es con frecuencia una infección severa. Para soslayar el problema se puede recurrir a la obtención de sangre para hemocultivo, al examen de líquido pleural cuando está presente, a la selección de las muestras de esputo bajo un aumento x 100 para determinar su calidad (cap. 4 y 7) y a la aspiración transtraqueal. El material obtenido de localizaciones normalmente estériles del organismo proporciona un espécimen excelente si se tiene cuidado en evitar la contaminación con la flora de la piel. Como las bacterias anaerobias pueden estar implicadas en todo tipo de infección en cualquier parte del organismo, siempre se debe cultivar en anaerobiosis todas las muestras libres de contaminación con la flora normal. Ciertos tipos de muestras están siempre contaminadas con la flora normal y por lo tanto no deben ser cultivadas en anaerobiosis en forma habitual: hisopos de garganta, nasofaríngeos o gingivales, esputo expectorado u obtenido por succión nasotraqueal u orotraqueal, especímenes obtenidos mediante un broncoscopio, contenido gástrico, contenido del intestino delgado (el cultivo de estos dos últimos tipos de muestras puede proporcionar información valiosa en el caso del síndrome del "asa ciega" o similares), contenido del intestino grueso o heces (excepto para Clostridium difficile, C. botulinum), ileostomía y efluentes de colostomía, orina emitida u obtenida por cateterización e hisopos vaginales o cervicales (excepto, como se ha discutido en la sección de toma de muestras, en pacientes con endometritis). 6.2. Procedimientos para la toma de muestras Generalmente el informe del laboratorio bacteriológico sólo puede indicar los hallazgos obtenidos por examen microscópico y cultivo. De esta manera se confirma o no un diagnóstico etiológico. Sin embargo, el fracaso en el aislamiento del agente causal no se debe necesariamente a métodos técnicos inadecuados; a menudo, se debe a una mala toma de muestra o a deficiencias en el transporte. Con frecuencia, en los hospitales con muchos pacientes la recolección de las muestras se relega a personas que no comprenden los requisitos ni las consecuencias de tales procedimientos. En ocasiones también el microbiólogo merece crítica por no proporcionar los materiales necesarios ni las instrucciones adecuadas, lo que conducirá a una mala toma de muestras. A continuación se presentan consideraciones generales acerca de la recolección de muestras para cultivo. En los capítulos siguientes se tratarán las instrucciones específicas para el manejo de diversas muestras. Siempre que sea posible las muestras deben ser obtenidas antes de iniciar la administración de agentes antimicrobianos. Con frecuencia un líquido cefalorraquídeo (LCR) purulento no revela patógenos bacterianos 1

en un preparado en fresco o en el cultivo cuando se ha administrado un antibiótico dentro de las 24 h previas. Un paciente con salmonelosis puede presentar un cultivo de heces negativo si la muestra ha sido tomada mientras recibía una terapia antibacteriana supresora, obteniéndose un cultivo positivo sólo varios días después que ha finalizado la terapia. Si la muestra para el cultivo ha sido recogida después de la iniciación de la terapia antibacteriana, el laboratorio debe ser informado para que pueda tomar las medidas correspondientes, como agregar penicilinasa al medio o simplemente diluir la muestra. Es axiomático que el material debe ser tomado de los lugares donde sea más probable encontrar al microorganismo con la menor contaminación externa posible. La piel y todas las superficies mucosas están habitadas por una flora normal y con frecuencia también pueden adquirir una flora transitoria o incluso ser colonizadas por patógenos potenciales provenientes del ambiente hospitalario. Esto último es particularmente cierto en enfermos graves en especial si reciben una terapia antimierobiana (a medida que la flora normal es eliminada se establecen los organismos resistentes). En consecuencia deben emplearse procedimientos especiales que permitan distinguir entre microorganismos implicados en un proceso infeccioso y aquellos provenientes de la flora normal o que son colonizadores "anormales" pero que no están causando ninguna infección. Para resolver este problema se emplean cuatro metodologías principales: 1. Limpiar el área con un germicida con la fricción suficiente como para realizar también una limpieza mecánica. Comenzar en el centro y extenderse en círculos crecientes. Repetir varias veces empleando un nuevo hisopo cada vez. El alcohol (70%) es satisfactorio para la piel pero se necesitan 2 min de contacto. El yodo (2%) y povidona−yodo actúan más rápidamente (1 min) y son efectivos contra los microorganismos formadores de esporas. La obtención de líquidos normalmente estériles (como líquido sinovial, pleural o LCR) por aspiración con aguja percutánea debe ser precedida siempre por la cuidadosa descontaminación de la piel como se ha descripto aquí. 2.Evitar totalmente las áreas con flora normal (p. ej., aspiración transtraqueal percutánea en lugar de esputo expectorado). 3. Cultivar sólo para un patógeno específico (p. ej., estreptococo grupo A en la garganta). 4. Los cultivos cuantitativos constituyen un medio para determinar la posibilidad de que los organismos aislados estén implicados en una infección (p. ej., urocultivos cuantitativos). Una cuantificación menos rigurosa también puede ser útil y debe ser empleada en la rutina diaria; esto puede realizarse sobre la base de una escala entre 4 + a 1 + o simplemente expresada como crecimiento abundante, moderado, escaso, cuatro colonias, etc. (cap. 8). Otro factor que contribuye al éxito del aislamiento del agente causal es el estadio de la enfermedad en el que se recoge la muestra. Los patógenos intestinales están presentes en un número mucho mayor durante el período agudo o diarreico de la infección intestinal y es más probable aislarlos en ese momento. Los virus causantes de meningoencefalitis se aislan con mayor frecuencia del LCR cuando el líquido se extrae poco después de la aparición de los síntomas de la enfermedad que cuando los síntomas agudos han remitido. En algunas ocasiones, los pacientes deben participar activamente en la toma de la muestra, como en el caso de un esputo. Para ello se le proporcionará instrucciones completas (cap. 16) y se tratará de estimular su cooperación. Con demasiada frecuencia se coloca un recipiente al lado de la cama del paciente y como única instrucción se le dice "escupa en este envase". La muestra de orina por obtención del chorro medio es otro ejemplo para el cual el procedimiento adecuado de recolección es esencial para obtener un cultivo confiable. Estos especímenes, con frecuencia recolectados por el paciente sin la asistencia de personal entrenado, constituyen una alta proporción de las muestras 2

recibidas por el laboratorio de microbiología clínica. Puede requerirse a los microbiólogos cooperación para preparar indicaciones para la obtención correcta de las muestras. El uso de una tarjeta impresa (bilingüe si es necesario) con la descripción clara del proceso (véase p. 94 para un ejemplo de una tarjeta) puede ayudar al mejor cumplimiento por parte del paciente. Deben proporcionarse tarjetas distintas para hombres y mujeres. La cuidadosa instrucción del paciente mejorará la calidad de las muestras de orina recibidas por el laboratorio. Deben tomarse las muestras con tamaño suficiente para permitir un análisis completo y deben colocarse en recipientes estériles para evitar riesgos para el paciente, enfermeras o quienes deben transportarlo. Un peligro grave para el laboratorista, u otro personal, es la contaminación de la superficie externa del envase de un esputo o pérdidas en una muestra de heces o posibilidad de contacto con exudados que contienen sangre. Con frecuencia se pasa por alto el riesgo de diseminación de enfermedades por empleados no profesionales mal entrenados. Su control requiere una educación continua y vigilancia constante por parte de aquellos en posiciones de responsabilidad y supervisión. Para que los resultados del análisis sean válidos deben tomarse los recaudos para que las muestras sean remitidas rápidamente al laboratorio. Por ejemplo, es difícil aislar Shigella de una muestra de heces que ha permanecido demasiado tiempo en la sala del hospital permitiendo un sobredesarrollo de los microorganismos comensales y una creciente desaparición de Shigellas. En algunos casos puede ser conveniente llevar los medios de cultivo y el equipo necesario hasta la cama del enfermo para asegurar la rápida inoculación de la muestra. Esto constituye una circunstancia excepcional y requiere la coordinación previa con el laboratorio. Aunque la mayoría de los microorganismos patógenos no están mayormente afectados por pequeños cambios de temperatura, en general son susceptibles a la desecación, sobre todo cuando se encuentran en hisopos. Sin embargo, algunas bacterias, como el meningococo en LCR, son muy sensibles a las bajas temperaturas y requieren un cultivo inmediato. Las muestras para gonococo pueden ser inoculadas directamente en medios selectivos como el de Thayer−Martin modificado con dióxido de carbono provisto en un dispositivo (Trarsgrow) o colocando una tableta generadora en una cámara (fig. 6−1) (Jembec; caps. 8 y 19). Otros métodos alternativos incluyen la colocación inmediata de las placas de Thayer−Martin sembradas dentro de un frasco con una vela (fig. 6−2). El material clínico que probablemente contiene una flora microbiana abundante, en la mayoría de los casos, puede mantenerse en el refrigerador durante varias horas antes de su cultivo si no puede ser procesado inmediatamente. Esto es válido sobre todo para especímenes como orina, heces y materiales tomados con hisopos a partir de diversas fuentes, con excepción de materiales para cultivo provenientes de heridas que pueden contener anaerobios sensibles al oxígeno. Éstos deben ser inoculados rápidamente. La refrigeración no sólo conservará la viabilidad de la mayoría de los patógenos sino que reducirá al mínimo el sobrecrecimiento de los microorganismos comensales, que si están presentes en número excesivo complicarán el aislamiento de un germen más importante. De todos modos, cuanto más rápido se transfiera un germen que acaba de abandonar el ambiente protector de su huésped a un medio de cultivo apropiado, mayores serán las probabilidades de su supervivencia y posterior multiplicación. Si bien la toma de muestra no es una función, un prerrequisito esencial es que el laboratorio reciba la suficiente información clínica para guiar al microbiólogo en la selección de los medios y técnicas adecuados. En forma análoga es importante que el clínico comprenda las limitaciones y potenciales del laboratorio de bacteriología y tenga presente que un informe negativo no invalida necesariamente un diagnóstico. Es esencial que la estrecha colaboración entre el clínico, la enfermera y el microbiólogo sea la regla y no la excepción. El personal de laboratorio debe rechazar las muestras que no fueron obtenidas en la forma adecuada y deben ser apoyados en esta posición por los clínicos especialistas en infecciosas y por los pat6logos. Por supuesto, al rechazar las muestras deben explicarse claramente las razones al médico que solícita el análisis. Por otra parte, estos especímenes no deben descartarse antes de discutir el problema con el clínico, dado que algunas 3

muestras como las obtenidas durante una cirugía son difíciles o imposibles de obtener nuevamente. Estos especímenes que no pueden ser reemplazados se teñirán con una coloración de Gram y se interpretarán con el mayor cuidado posible. En el capítulo 3 se discuten criterios para el rechazo de muestras. 6.2.a. Procedimientos para muestras en anaerobiosis. Debe insistirse en la adecuada recolección de la muestra (es decir, tener especial cuidado para evitar la inclusión de la flora normal) dado que con frecuencia los anaerobios de, la flora normal son muy numerosos y la mínima contaminación de la muestra puede llevar a resultados erróneos y a la pérdida de muchos esfuerzos. El esputo expectorado es inadecuado porque se contamina con los anaerobios de la flora normal en su pasaje a través de la boca y faringe. Por la misma razón tampoco deben ser cultivados en anaerobiosis los especímenes obtenidos por broncoscopía o por succión con tubo nasotraqueal. El tubo siempre se contamina con la flora normal en su camino descendente. Algunos cuestionan la efectividad de un catéter taponado, con doble lumen, para prevenir esta contaminación, pero es posible obtener resultados confiables si se pone atención a los detalles de la técnica y se realizan cultivos cuantitativos. Pueden obtenerse muestras pleuropulrnonares para cultivos en anaerobiosis mediante aspiración transtraqueal (ATT), toracocentesis o puncíón percutánea con aguja y aspiración del pulmón. Las muestras obtenidas de tubos de traqueostomía pueden ser adecuadas cuando el tubo recién ha sido colocado; al cabo de un tiempo la contaminación con secreciones orofaríngeas es inevitable, existan o no manguitos inflables. Las muestras de orina emitida no son adecuadas para el cultivo en anaerobiosis porque la porción distal de la uretra y del meato está colonizada con una flota normal que contiene anaerobios que contaminarán la orina en su pasaje estas zonas. Si el paciente tiene colocado un catéter vesical suprapúbico o un tubo de cistostosmía o nefrostomía pueden obtenerse a partir de ellos muestras adecuadas de orina. La endometritis presenta un problema muy difícil ya que los anaerobios son claramente muy importantes en esta inacción Sin embargo, la mayoría de las endometritis son posteriores a un parto y se ha demostrado que en el período posparto, Exista o no una infecci6n endometrial, se encuentran en la cavidad uterina grandes números de anaerobios y otros microorganismos provenientes de la flora vaginal y cervical. Tampoco se observan diferencias cuantitativas entre pacientes infectadas y no infectadas. Esta situación también se aplica a una endometritis posaborto. En consecuencia se debe realizar un hemocultivo y traes de cultivar cualquier otro material disponible que se considere adecuado. Puede ser útil el cultivo para gérmenes del grupo de Bacteroides fragilis, ya que la presencia de estas bacterias en la muestra indica un mal pronóstico y por otra parte son más resistentes a los antimicrobianos que otros anaerobios. Las infecciones de úlceras por decúbito comúnmente implican a organismos anaerobios, en especial cuando se encuentra en las proximidades del ano (decúbito sacral y decúbito de la cadera y glúteos). Dado que estas áreas pueden tener contaminación fecal (es así como se infectan) deben limpiarse con cuidado con un agente antiséptico antes de tomar la muestra. Cuando sea posible, se debe aspirar el pus presente debajo de un colgajo de piel o en cavidades profundas, mediante una jeringa y aguja. Las mismas consideraciones se aplican a otras lesiones presentes en esta área (abscesos perirrectales). Las muestras de materiales normalmente estériles (corno LCR y líquido sinovial o sangre) pueden recolectarse en la forma usual luego de una prolija descontaminación de la piel. En general, el material para cultivos en anaerobiosis se obtiene mejor con la ayuda de una jeringa y aguja. Debe expulsarse todo el aire de la jeringa y de la aguja (lámina 6− l). El empleo de hisopos es una mala alternativa a causa de la excesiva exposición de la muestra al efecto deletéreo del oxígeno y la desecación. 6.3. Transporte de las muestras

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En el examen microbiológico de las muestras clínicas es esencial que el envase que las contiene no contribuya con su propia flora microbiana. Además, la flora original no debe multiplicarse ni disminuir debido a una permanencia prolongada del paciente en la sala o a una refrigeración prolongada en el laboratorio. En otras palabras debe usarse un recipiente estéril y la muestra debe inocularse tan pronto como sea posible. Aunque estas reglas no son rígidas cualquier desviación de ellas es responsabilidad del microbiólogo. Se han diseñado una variedad de recipientes para la recolección de muestras para su estudio bacteriológico. Muchas de ellas pueden ser usadas repetidamente luego de su limpieza y esterilización, mientras que otras deben ser incineradas luego de su empleo. Además de la placa de Petri de Pyrex y su versión moderna, las placas de plástico descartabas y preesterilizadas, el equipo de recolección más usado (pero no necesariamente el más aconsejable) es el hisopo de madera con punta de algodón, alginato de calcio o dacrón (poliéster). Estos hisopos se preparan mejor por esterilización en autoclave de la varilla de manera sumergida en solución reguladora de Sorensen pH 7,2 durante 5 min, secándolos y acondicionando el extremo con lana de poliéster (poliéster Dacron, para relleno, bolsas de 250 g, Sears, Roebuck y Co), alginato de calcio (Colab Laboratories) o algodón medicinal de fibra larga. Una técnica emplea una unidad para cultivo estéril (Culturette, Marion Scientific Corp) (fig. 6−3) que consiste en un tubo de plástico con un hisopo estéril, extremo de poliéster y una pequeña ampolla de vidrio que contiene medio de Stuart modificado. La unidad se retira de su sobre estéril y el hisopo se emplea para recoger la muestra. Éste se coloca nuevamente en el tubo, se rompe la ampolla y el hisopo se introduce en el medio de transporte. Esto proporcionará suficiente humedad durante 72 h a temperatura ambiente. Ciertos algodones que se emplean en los hisopos pueden contener ácidos grasos que son nocivos para el desarrollo bacteriano. Un excelente sustituto es la lana de alginato de calcio, derivada del ácido algínico, un producto vegetal natural. Este material que semeja fibras de seda se disuelve en ciertas soluciones compatibles con el mantenimiento de la viabilidad bacteriana (como solución de Ringer diluida con hexametafosfato de sodio) y forma un alginato de sodio soluble. Los hisopos de mandera con extremo de alginato de calcio o los hisopos nasofaríngeos de alambre de aluminio flexible (fig. 6−4) así como los diluyentes con citrato o hexametafosfato pueden encontrarse en el comercio. Cuando se sospecha la presencia de virus herpes no deben emplearse hisopos con alginato de calcio porque puede inhibir su replicación. Una modificación de estos hisopos emplea alambre de Nicromo con calibre 28 o un alambre delgado de aluminio en lugar de la varilla de madera. A causa de su flexibilidad se recomienda el hisopo con alambre para la toma de muestras de la nasofaringe. Para asegurar que la pequeña cantidad de algodón del hisopo no se desaprenda durante su pasaje a través del tracto nasal, debe doblarse el extremo del alambre y colocarse una gota de colodión antes de envolverlo con el algodón; el resto de la unidad es igual a lo descripto anteriormente. En el comercio se encuentran hisopos con alambre, estériles, ya preparados.

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