UNIVERSIDAD VERACRUZANA INSTITUTO DE MEDICINA FORENSE

“IDENTIFICACION DE DIATOMEAS, PARA DETERMINAR LA UBICACIÓN DE ZONA DE MUERTE, POR SUMERSION, EN LA ZONA COSTERA DEL PUERTO DE VERACRUZ”

PROTOCOLO DE INVESTIGACION

ASESOR:

DR. RUBEN RUIZ RAMOS

PRESENTA

Q.C. OLIVIA QUERO HERRERA

VERACRUZ, VER.

2014

1

INDICE Titulo………………………………………………………………………………..3 Marco teórico…………………………………………………………………….…4 Objetivos general y específicos………………………………………………...…16 Hipótesis……………………………………………..…………………………..…17 Material y método………………………………………………………………...18 Tipo de Estudio………………………………………………….……………....…18 Universo…………………………………………………………………….…...…18 Tamaño minimo de muestra………………………………………………………18 Criterios de selección………………………………………………………….….18 Operalizacion de las variables…………………………………………………….19 Procedimiento…………………………………………………………………..….20  Etapa de campo  Etapa de laboratorio  Etapa de gabinete Flujograma…………………………………………………………………………22 Cronograma………………………………………………………………………...23 Bibliografía………………………………………………………………………..24

2

TITULO

IDENTIFICACION DE DIATOMEAS, PARA DETERMINAR LA UBICACIÓN DE ZONA DE MUERTE, POR SUMERSION, EN LA ZONA COSTERA DEL PUERTO DE VERACRUZ

3

INTRODUCCION

De acuerdo al Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI), una de las principales causas de mortalidad “externa” o no natural, en la población mexicana es la muerte por sumersión. Ésta es la segunda y/o tercer causa de muerte accidental, y se considera un grave problema de salud pública. El acumulado desde el año 1998 al 2009 de mortalidad por sumersión, refleja claramente que estados ocupan los primeros cinco lugares: Veracruz, Chiapas, Jalisco, Estado de México y Tabasco. (INEGI, 2011) El estado de Veracruz es uno de los cinco principales lugares en muerte por sumersión, debido a su gran número de ríos y playas en la zona costera. (INEGI, 2011).

La muerte por sumersión se define clásicamente como el resultado de obstaculizar la respiración por obstrucción de la boca y la nariz por un medio fluido, generalmente agua. La recuperación de un cadáver del agua plantea siempre múltiples y variadas interrogantes a las que en algunas ocasiones, no es posible encontrar respuesta adecuada a pesar de la riqueza de signos que suelen ofrecer los cuadros de asfixia por sumersión. (Romero JL, 2007) Uno de los problemas de difícil resolución en medicina legal ha sido establecer una técnica adecuada que permita discriminar con certeza los casos en que la muerte es producto de una sumersión vital, de aquellos donde el cuerpo sin vida de la víctima es arrojado al agua con el fin de ocultar un homicidio. Un largo debate al respecto se inició a fines del siglo XIX y continúa en la actualidad (Rennella, 1996) Una de las principales dificultades radica en que, bajo estas circunstancias, los indicadores fisiológicos poseen un valor limitado especialmente cuando el cuerpo de la víctima presenta un elevado grado de descomposición. En el último siglo, se han propuesto y descartado numerosas técnicas de diagnóstico. Dentro de las técnicas sugeridas, son muchos los autores que han puesto de manifiesto la importancia y el valor que poseen el estudio e identificación de las diatomeas como indicadores biológicos. En la ausencia de otro tipo de evidencia, la presencia de diatomeas en los tejidos corporales resulta uno de los indicadores más confiables de muerte por sumersión. Aún en las situaciones en las que sólo quedaran restos esqueléticos sería posible determinar la presencia de diatomeas en la médula ósea de la víctima. (Rennella,1996)

4

Los estudios que se han realizado sobre las diatomeas en México realmente son muy escasos, aun mas en el estado de Veracruz, sin embargo en Canadá y Bélgica se han realizado estudios que demuestran la importancia de éstas microalgas en la investigación médico-legal de la muerte por sumersión. (Vallejo, 2011). Trabajos a nivel mundial Michael S. Pollanen, Canadá 1998, en su trabajo Diatoms and homicide, estudió seis casos ilustrativos de homicidio por ahogamiento, donde se reportó que la determinación de diatomeas es un complemento útil a la investigación médico-legal de la muerte por sumersión. En cinco casos, las diatomeas se extrajeron de la médula ósea y se compararon con las diatomeas obtenidas a partir de muestras del líquido sumersión; en el total de estos casos, se observaron los mismos tipos de diatomeas en ambas, las muestras de agua y la médula ósea. (Pollanen, 1998). Michel H.A. Piette, en su trabajo Drowning: Still a difficult autopsy diagnosis, revisó los métodos diagnósticos en el ámbito médico-legal de muerte por sumersión y concluyó que la combinación de los resultados de la autopsia y las diatomeas son buenos indicadores biológicos para llegar a dicho diagnóstico (Piette, 2006) Stefan Uitdehaag, en su investigación concluyó que las diatomeas en la ropa pueden ser utilizadas para determinar el contacto con el agua de la superficie. (Uitdehaag, 2010) DIATOMEAS Las diatomeas son un grupo de organismos microscópicos unicelulares pertenecientes a la división Heteronkontophyta y a la clase Bacillariophyceae; son microalgas unicelulares de vida libre o colonial que presentan una pared silícea que encapsula a la célula, rodeando al protoplasto, denominado frústulo; habitan en medios ambientes acuáticos y húmedos; presentan clorofila a, c y c2; como pigmentos accesorios se encuentran la fucoxantina, diatoxantina y diadinoxantina; en varios cloroplastos en forma lobulada (H), sus elementos de reserva derivados de la fotosíntesis pueden ser la glucosa y la crisolaminarina. En la clase Bacillariophyceae (Diatomophyceae) se reconocen dos líneas evolutivas representadas por los órdenes Centrales y Pennales (Código de St. Louis,2000)

5

Las diatomeas centrales son simétricas en vista valvar; en vista periapical presentan simetría radial y presentan reproducción sexual oogámica; las pennales son simétricas en vista valvar y presentan simetría bilateral en vista periapical y producen isogametos amoeboideos. (Fig. 1).

Fig. 1. Diatomeas del orden (a) centrales (Actinocyclus normanii) y del orden (b) pennales (Navicula radiosa).

Las diatomeas se encuentran presentes tanto en el agua dulce como en el agua salada. El tamaño de las mismas varía desde 2 μm a más de 500 μm, midiendo la mayoría de las especies entre 10 y 80 μm de longitud o de diámetro. El “frústulo” o parte silícea de la diatomea, es duro y resistente a la descomposición y a la acción de ácidos fuertes. (Ludes B, 1999) La estructura de esta pared celular consiste de dos elementos alargados o redondeados, detalladamente ornamentados por bandas o conjuntos de poros, llamados valvas, las cuales se unen una sobre la otra a través de unos cinturones de unión (Fig. 2). La estructura y la ornamentación de la valva son el aspecto más estudiado de las diatomeas, así como el perfil de las valvas, esto debido a que es un carácter de amplio uso para su clasificación. (Ludes B, 1999)

Fig. 2. Estructura básica de las valvas de una diatomea para formar el frústulo (tomado de ADIAC 2002).

6

La valva superior y de mayor tamaño se denomina epivalva; la valva inferior y de menor tamaño se llama hipovalva. Cada valva contiene sus propios elementos de unión en forma de pequeñas y delgadas bandas, los de la epivalva se denominan epicingulo y los de la hipovalva se denominan hipocingulo, ambos cíngulos en conjunto se denominan cinturones (Fig.3) (Hans du Buf, 2002)

Fig. 3. Esquema de los elementos de unión de las valvas. (Hans du Buf, 2002)

Otro de los elementos presentes en el frústulo que ha sido de importancia para la determinación y clasificación de las diatomeas es el “rafe” presente en el suborden Raphidineae. Este elemento consiste de una o dos ranuras que atraviesan la valva longitudinalmente desde un polo hacia el otro (Fig. 4). En algunos géneros el rafe se ve interrumpida en una región central por un puente de sílice más delgado y poco ornamentado que el resto de la valva, llamada nódulo central. La rafe, comúnmente en corte transapical, presenta una forma de “V”, esta estructura participa en la prevención del rompimiento de la valva bajo tensión debida a la turgencia u otro tipo de presión física. (Hürlimann J, 2000)

Fig. 4. Estructura de la frústula y sus elementos. Hürlimann J-2000)

La posición del rafe, central o excéntrica, así como la extensión y la forma de sus terminaciones, tanto apical como central, son caracteres taxonómicos 7

principales. (Hürlimann J, 2000)

Durante el proceso de síntesis y crecimiento del frústulo, el sílice se deposita a partir de la zona intermedia entre el nódulo polar y el nódulo central en ambas direcciones, éste se deposita sólo en algunas zonas dejando huecos que tienen número y forma muy variada. El hueco más grande y visible es la rafe. (Fig.5).

Fig. 5. Crecimiento del frústulo de Pinnularia acrosphaeria a partir de la zona de depósito del sílice, dando lugar al nódulo central y el nódulo polar. (Tomado de Novelo, Tavera and Ibarra, 2004)

La terminación del rafe en la zona polar se curva hacia parte interior de la valva, tomando la forma de una lengua, por lo que se denomina helictoglosa y puede variar en tamaño y estructura terminal (Fig. 6) (Novelo, Tavera and Ibarra, 2004)

Fig. 6. Diferentes tipos de terminación de la Rafe en el nódulo polar resaltando la helictoglosa, vista interna de la valva. (Round, Crawford & Mann, 2000)

De la misma manera, la terminación central del rafe es importante para la determinación de los géneros (Fig. 7). En algunos géneros se encuentra subtendida por pequeñas estructuras llamadas en su conjunto fibulas. Esta estructura tiene un efecto sobre el rafe, elevándola a un nivel ligeramente arriba del nivel normal de la valva. (Round, Crawford & Mann, 2000) 8

Fig. 7. Diferentes tipos de terminación de la rafe en el nódulo central vista desde el interior de La valve. (Round, Crawford & Mann, 2000)

Otras estructuras que son básicas para la determinación y clasificación de las diatomeas, son pequeños grupos o conjuntos de poros que adornan finamente la superficie de las valvas formando bandas, llamadas estrías (Fig.8). La función de los poros es permitir el intercambio de agua y solutos hacia dentro y fuera de la célula, además de la secreción de polisacáridos y otras sustancias orgánicas que producen el movimiento del organismo. Se pueden presentar individualmente y se denominan simplemente poros y si se encuentran contenidos como conjunto dentro de una cámara hexagonal se llaman lóculos. (Novelo, Tavera and Ibarra, 2004)

Fig. 8. Micrografía de estrías y poros, también se observa el nódulo central y la rafe. (Tomado de Novelo et all., 2007)

Las diatomeas se encuentran representadas ampliamente: en aguas marinas, tanto en la línea costera como en aguas abiertas; así como en todos los ambientes acuáticos y húmedos continentales, ocurriendo en aguas tranquilas permanentes o con corrientes, formando parte del plancton. (Novelo, Tavera e Ibarra, 2004) 9

De acuerdo a la posición que ocupan en la columna de agua se clasifican en: Bentónicas: Son las diatomeas que habitan fijas, asociadas o sobre varios tipos de substratos como: rocas, granos de arena, macrofitas, sedimentos, etc. Epilíticas. Son las diatomeas que han colonizado las rocas y las piedras y los estratos rocosos del fondo, dominando la zona de oleaje y turbulencia. Dentro de esta clasificación también existen especies que están restringidas a la zona del litoral, en tanto que otras ocurren en aguas más profundas donde la acción del oleaje es menos severo. (Wehr & Sheath, 2003)

Epifíticas. Estas especies de diatomeas se encuentran asociadas con plantas sumergidas y emergidas. De acuerdo a los estudios de Hawes & Schwars (1996) existe una correlación entre el tipo de planta hospedadora y la biomasa y diversidad de diatomeas epífitas. (Wehr & Sheath, 2003) Epipélicas y epizámicas. Son las algas que han colonizado los sedimentos (epipélicas) y el substrato arenoso (epizámicas), principalmente en aguas continentales. Esta clasificación ha permanecido confusa y es poco utilizada, ya que ambos substratos se encuentran comúnmente mezclados y debido a la acción del oleaje y de las corrientes es particularmente inestable. (Wehr & Sheath, 2003)

TAXONOMÍA DE LAS DIATOMEAS Los niveles taxonómicos de familia, género y especie, han evolucionado, principalmente ampliando el número de géneros y familias y en otros casos reduciéndolo. Debido a esto, en la actualidad existen varias líneas taxonómicas de las diatomeas, dependiendo del investigador, de la disponibilidad de las técnicas, métodos y profundidad de observación y análisis de cada laboratorio. En virtud de esto las diatomeas no representan un grupo taxonómico natural de organismos, sino más bien una clase con representantes que comparten las características antes mencionadas. (Siqueiros BD, 2002)

10

CARACTERÍSTICAS DISTINTIVAS DE LA CLASE BACILLARIOPHYCEAE. (Siqueiros BD, 2002)  Fase diploide durante el ciclo de vida.  Todas las especies son unicelulares o cocoideas coloniales. Cada célula está encapsulada por un único tipo de pared celular silícea, llamado frústulo.  Los cloroplastos presentan tres membranas, una de las cuales es continuación del retículo endoplásmico.  La zona de transición del flagelo carece de la hélice transicional.  Los cloroplastos son usualmente pardo-dorados, ya que la clorofila está enmascarada por el pigmento accesorio llamado Fucoxantina.  El DNA del cloroplasto está organizado en forma de nucleoide anular.  Cada elemento de la pared silícea se forma dentro del citoplasma en una vesícula de depósito de sílice.  La mitosis es abierta, la envoltura nuclear se rompe antes de la metafase y el huso en la telofase es persistente.  Las especies con reproducción sexual tienen un ciclo de vida diplóntico, con meiosis gamética.  Los representantes de la clase Bacillariophyceae están ampliamente distribuidos, tanto en aguas marinas como en aguas continentales.

REPRODUCCIÓN Asexual Las diatomeas, igual que la mayoría de las células eucariontes, se reproducen por mitosis y citocinesis. (Fig. 10)

Fig. 10. Secuencia de la división vegetativa de Amphora sp. en vista lateral (Tomado de Round, Crawford & Mann, 1990)

11

Durante la fase G1 se observa un proceso de crecimiento en volumen y masa del citoplasma hasta el momento en que el DNA se replica (fase S), posteriormente se observa otro periodo de crecimiento (G2) que dura hasta la división nuclear (mitosis) y la citocinesis. Como la pared celular es rígida la célula no puede modificar su tamaño, sin embargo el desplazamiento de las bandas de unión permite que se lleve a cabo un crecimiento en la parte central del frústulo (Round, Crawford & Mann, 1990) Durante la fase M, el núcleo se divide y el protoplasma se constriñe para iniciar la citocinesis dentro del frústulo intacto de la célula madre. Cada una de las células hijas comienza a producir una nueva hipoteca y es hasta que se han formado por completo cuando las células hijas se separan, de manera que las tecas o valvas de la célula madre pasan a ser las epivalvas de las células hijas. (Round, Crawford & Mann, 1990) Una de las células resultantes de la división tendrá una epivalva vieja y una hipovalva nueva, lo que le permite conservar su tamaño original, sin embargo, una de las células hijas, la que toma la hipovalva madre (de menor tamaño) como epivalva nueva, desarrollará una hipovalva más pequeña que la original. Este proceso lleva a una reducción del tamaño de la mitad de las células hijas de la población. (Fig. 11) (Round, Crawford & Mann, 1990)

Fig. 11. Esquema de la reducción del tamaño de las células a partir de divisiones vegetativas sucesivas. (Tomado de Round, 1990)

Este proceso de disminución de tamaño de las células de la misma población se presenta recurrentemente en cada división mitótica y aunque las dos células conservan la mayoría de las características taxonómicas en este proceso de reducción de tamaño, ocasionalmente se ve afectado el contorno del frústulo, este proceso puede llevar a complicaciones en la determinación e identificación 12

de las diatomeas cuando no se tiene la experiencia en su clasificación. (Fig. 12) (Hans & Micha, 2002)

Fig. 12. Ejemplo de la reducción del tamaño y las variaciones en forma y perfil del frústulo de Fragilaria bicapitata. (Hans & Micha, 2002)

El proceso de reducción de tamaño se presenta con cada división vegetativa sucesiva, hasta que el tamaño de las células pone en riesgo la continuidad de la población. (Round et all, 1990). Una vez que la población ha presentado varias fases de multiplicación vegetativa con la consecuente reducción del tamaño de las células, éste se restaura evitando la desaparición de la población, a través de la formación de auxosporas, proceso de reproducción sexual, precedido por la meiosis. La reproducción sexual, cuando se presenta, participa principalmente en la restauración del tamaño máximo de las células, el cual se alcanza por el desarrollo y crecimiento de una célula cigótica especializada, llamada auxospora. (Round et all, 1990). Todas las células vegetativas tienen el potencial de funcionar como gametangios a través del proceso de meiosis simple, con la consecuente producción de uno o dos gametos no flagelados. Durante el proceso de plasmogamia, ambas células se envuelven en una capa de mucílago; uno de los gametos migra de una célula sexual a otra dando lugar a una célula binucleada. Al fusionarse los núcleos se forma un cigoto. En esta etapa la célula se expande dando lugar a la auxospora, la cual puede ser libre en el medio o asociada con la teca gametangial, produciendo una pared orgánica de material polisacárido. Posteriormente la auxospora sufre una expansión bipolar y la pared orgánica primaria se rompe, más o menos, ecuatorialmente. Conforme la auxospora se desarrolla, en la zona polar se deposita sílice formando bandas transversales a los polos, de manera que la expansión ocurre solamente en esta región. (Mann, 1996) 13

Una vez que la expansión ha finalizado, la teca primaria se disuelve y comienza la formación de las valvas. Por lo tanto el ciclo de vida de las diatomeas consiste de largos periodos de reproducción asexual con la consecuente reducción de tamaño, la cual puede durar varios años, alternando con una restauración del tamaño vía auxosporulación, el cual puede durar unos pocos días. De manera que una misma población puede estar estructurada de diferentes tallas de diatomeas produciendo un espectro multimodal de tamaños y de formas. (Fig. 13) (Mann,1996)

Fig. 13. Tamaños diferenciales de células de varias especies de diatomeas. (Tomado de Round et all, 1990)

La aplicación de las diatomeas para el diagnóstico de la asfixia por sumersión se basa en el hecho de que penetrarían en los pulmones conjuntamente con el líquido de la sumersión, y si el sujeto se encuentra vivo, con actividad cardiocirculatoria eficaz, atravesarían el filtro pulmonar y se diseminarían por todo el organismo a través del torrente circulatorio, pudiendo identificarlas en médula ósea, hígado, cerebro o riñones. Si se tratara de un cadáver arrojado o caído al agua, las diatomeas podrían penetrar de forma pasiva en el aparato respiratorio, pero no podrían llegar a otros órganos al no existir actividad circulatoria. (Vallejo. 2011)

14

OBJETIVO GENERAL  Identificar las principales especies de diatomeas que se encuentran en las zonas de mayor incidencia de muerte por sumersión en el puerto de Veracruz

OBJETIVO ESPECIFICO

•

Identificar las principales zonas costeras del Puerto de Veracruz con mayor incidencia de muertes por sumersión, mediante la revisión de expedientes del IMEFO de los años 2012-2013.

•

Caracterizar las diferentes especies de diatomeas presentes en las tres principales zonas elegidas del punto anterior.

•

Identificar diatomeas presentes en cadáveres encontrados en las zonas elegidas y analizar la correlación especie/zona previamente establecida.

15

HIPOTESIS 

Las especies de diatomeas son específicas de cada región, por lo que en sujetos muertos por sumersión es posible establecer una relación entre la presencia de éstas y la zona donde ocurrió el deceso

16

MATERIAL Y MÉTODO 

TIPO DE ESTUDIO: Es un estudio descriptivo-exploratorio



LUGAR: Playa de Antón Lizardo, está ubicada en el municipio de Alvarado forma parte de la Zona Metropolitana de Veracruz, sus coordenadas son 19°03′24″N95°59′17″O Playa de Mocambo: Ubicada en boca del Rio tiene de longitud 810m , latitud norte 19° 7'42.01" latitud oeste 96° 6'18.79"

Playa Norte: se localiza en el municipio de Tuxpan, al norte de Veracruz por

la carretera 180.  UNIVERSO:  Las playas seleccionadas en la zona costera de Veracruz  Modelos murinos muertos por sumersión en las playas de Antón Lizardo, playa norte y playa de mocambo



SELECCIÓN DE LA POBLACIÓN: Se analizara 3 playas del puerto de Veracruz: playa norte, playa de Mocambo, playa de Antón Lizardo que de acuerdo al análisis de los expedientes del IMEFO de Veracruz en el 2012-2013 tuvieron una mayor frecuencia de ingreso de cadáveres de muerte por sumersión. Se analizara muestras de cortes histológicos de pulmones, hígado, riñón y corazón de modelos murinos muertos por sumersión en las playas seleccionadas.Se analizaran muestras de médula ósea en modelos murinos muertos por sumersión en las playas seleccionadas



TAMAÑO MÍNIMO DE LA MUESTRA:

De acuerdo al análisis de los expedientes del IMEFO de los años 20122013, Se seleccionaron las playas con mayor frecuencia en muerte por sumersión, ubicadas en la zona costera del puerto de Veracruz En cada una de las playas seleccionadas, se tomaran 2 muestras de agua, una a 2 metros y la segunda a 4 metros de profundidad. Para realizar la clasificación de las diatomeas.

17

Por cada playa seleccionada de utilizaran 3 modelos murinos, en los cuales se analizara muestras de cortes histológicos de pulmones, hígado, riñón y corazón , mediante la tinción de hematoxilina eosina para ver la distribución de las diatomeas También se analizaran muestras de médula mediante la técnica de acido nítrico

CRITERIOS DE SELECCIÓN Inclusión PLAYAS  Las playas de agua salada seleccionadas pertenecientes a las zonas costeras del puerto de Veracruz/ Boca del Río que históricamente, en los últimos 2 años, hayan tenido el mayor numero de ahogados por sumersión.

MODELO MURINO

 Deben presentar muerte por sumersión en la playa seleccionas

No inclusión: PLAYAS Playas que tenga menor frecuencia de muerte por sumersión

MODELOS MURINO



Que no presenten muerte por sumersión de cualquier sexo.

VARIABLES

Variable dependiente: 18

Diatomeas Variables independientes: Playa Profundidad

OPERACIONALIZACIÓN DE LA VARIABLE. VARIABLE.

Diatomeas

Playa

Profundidad

DEFINICION.

TIPO.

Las diatomeas Cualitativa. son algas unicelulares de la clase Bacillariophyceae, Depósito Cualitativa de sedimentos no consolidados que varían entre arena y grava. Distancia que hay Cuantitativa desde el punto tomado como referencia (parte más alta, entrada, borde.) hasta el fondo de una cosa o de un lugar:

19

PROCEDIMIENTO

1. Selección de playas. Se analizaron los expedientes del IMEFO de Veracruz del 2012-2013, recolectando datos de número de cadáveres que ingresaron a causa de muerte por sumersión y playa de donde procedían, para obtener el número de casos totales de muerte por sumersión durante ese periodo Se eligieron las tres primeras playas que tuvieran un mayor número de frecuencia en casos por sumersión. Las playas resultantes fueron playa norte, playa de Mocambo, playa de Antón Lizardo que de acuerdo al análisis realizado

2. Etapa de campo

La recolecta de muestras de agua se realiza en las tres playas seleccionadas, mediante un frasco estéril, con una cantidad de 10 ml preferentemente a diferentes profundidades del lecho fluvial (2 m., 4 metros). Se rotula cada frasco con los siguientes datos: fecha, nombre de la playa, profundidad, observaciones. Se procede a su conservación a fin de detener la división celular y la descomposición de la materia orgánica, mediante formaldehído tamponado o etanol, con una concentración final en la muestra de 4%, 1ml por cada 10ml de agua 3.Etapa de laboratorio (muestra de agua) Una vez en el laboratorio se procede al tratamiento químico con peróxido de hidrógeno (120 vol.) que provoca la digestión de la materia orgánica y permite obtener suspensiones de frústulos y valvas limpios de restos orgánicos. Se centrifuga durante 10 min. A 2500 rpm. Los frústulos de las diatomeas quedan sujetos en el cubre‐objetos, usando una resina sintética (Naphrax®) con un índice de refracción óptica de 1,7, se fija a un portaobjetos de vidrio, previamente etiquetados.

20

Muestra de cadáver Se realiza la recolección de muestra de medula ósea del esternón mediante una aspiración con una aguja para la extracción de diatomeas. Se coloca en un frasco de ebullición 50 ml de ácido nítrico de grado analítico concentrado y la suspensión de la médula osea; se hierve a fuego lento en un plato caliente por aproximadamente 48 h en una campana de humos Después, la suspensión se enfria a temperatura ambiente y se se centrifuga ( 250-500 g , 20-30 min), el sobrenadante se desecha y el sedimento se resuspende en agua destilada y se vuelve a centrifugar . Este procedimiento de lavado se repite al menos una vez. El sedimento final que contiene material resistente a los ácidos se aspira con una pipeta pasteur y se deja caer sobre un portaobjetos limpio. El residuo se seca al aire y se monta con montaje estándar y se examina mediante microscopía de contraste de fase. (Pollanen MS,1998)

Analisis de cortes histologicos Se realizan cortes histológicos de pulmones, hígado, riñón y corazón y se trabajan mediante la técnica de hematoxilina eosina, para observar y determinar las diatomeas encontradas en dichos tejidos

4.-Análisis de datos Con los datos obtenidos se calculan los principales índices bióticos basados en comunidades de diatomeas. Se realiza una base de datos de las principales diatomeas identificadas en las tres diferentes playas.

Se realiza la comparación de la diatomeas obtenidas em la muestra de agua com las diatomeas identificadas en las muestras de médula ósea y diferentes organos de cadáveres.

EQUIPOS DE LABORATORIO:  Centrifuga  Estufa Microscopio de contraste de fase

21

FLUJOGRAMA

Revisión de expedientes del IMEFO de los años 2012-2013.

COSTERA Etiquetar las muestras con los datos de: fecha, playa, profundidad.

Conservación de la muestra mediante formaldehido al 4%, c

Tomar muestras de medula ósea en cadáveres, de muerte por sumersión

Identificación de diatomeas en las muestra biológica tratadas químicamente y mediante microscopia de contraste de fase

Determinar las 3 principales playas con mayor frecuencia de muerte por sumersión COSTERA

Recolección de muestra de agua de cada playa seleccionada a diferentes profundidades (2 m- 4 m)

Tratamiento químico de la muestra de agua para realizar para eliminar los restos orgánicos.

Caracterización de las diatomeas mediante microscopia de contraste de fase

Realizar la correlación de las diatomeas identificadas en la muestra de agua y las muestras biológicas

22

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ABRILMAYO 2014

ELEGIR LAS ZONAS DE MUESTREO DE AGGUA SALADA EN EL PUERTO DE VERACRUZ PREPARAR EL MATERIAL Y REACTIVOS DE LABORATORIO NECESARIOS A UTILIZAR

JUNIO – AGOSTO 2014

SEPTIEMBREOCTUBRE 2014

X

X

ENEROFEBRERO2014

X

X

PROCEDER CON LA TECNICA PARA IDENTIFICACION DE DIATOMEAS

X

REALIZAR UNA TABLA CON LA ZONA Y NOMBRE DE ESPECIES

X

PRESENTACION DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

DICIEMBRE 2014

X

RECOLECTAR LAS MUESTRAS DE AGUA

ANALIZAR LOS DATOS

NOVIEMBRE 2014

X

23

BIBLIOGRAFIA Asociación Internacional para la taxonomía de las Plantas, 2000: Enciclopedia del Código Internacional de Nomenclatura Botánica: Código de St. Louis, http://www.bgbm.org/iapt/nomenclature/code/saintlouis/0000st.luistitle.htm (consulta abril 2014) Hans du Buf, Micha M. B. (2002): Automatic Diatom Identification and Clasification, Machine Perception Artificial Intelligence, 41: 1-10. Hürlimann J, Feer P, Elber F, Niederberger K, Dirnhofer R, Wyler D. Diatom detection in the diagnosis of death by drowning. Legal Med 2000; 114: 6-14. INEGI 2011-http://guardavidasmexico.wordpress.com/estadisticas/ Fecha de consulta: 20-abril del 2014 Ludes B, Coste M, North N, Doray S, Tracqui A, Kintz P. Diatom analysis in victim´s tissues as an indicator of the site of drowning. Int J Legal Med 1999; 112: 163-166 Mann, D.G. and Droop, S.J.M., 1996: Biodiversity, biogeography and conservation of diatoms. Hidrobiology Michel H.A. Piette , Els A. De Letter, Drowning: Still a difficult autopsy diagnosis; Ghent University, Department of Forensic Medicine, Jozef Kluyskensstraat 29, 9000 Gent, Belgium: 20 de octubre del 2004 Novelo, E., Tavera R. and Ibarra C., 2007: Bacillariophyceae from karstic wetlands in Mexico, Bibliotheca Diatomológica, XX. Berlin Stuttgart Pollanen MS (1998). Diatoms and homicide. Forensic.. 91(1): 29-34. Rennella Armando. MUERTE POR SUMERSION: EN BUSCA DE UN DIAGNOSTICO. Cuadernos de medicina forense. Año 3 –Num 1- (13-19)

Round FE, Crawford RM, Mann DG (1990). The Diatoms: Biology and Morphology of the genus. Cambridge: Cambridge University Press.Siqueiros BD ( 2002). Diatomeas bentónicas de la Península de Baja California; Diversidad y Potencial Ecológico. Comité Editorial Instituto Politécnico Nacional, La Paz, Baja California Sur Romero-Palanco JL (2007). Muertes por sumersión. Revisión y actualización de un tema clásico de la medicina forense; Cuad Med Forense, 13:48-49 24

Uitdehaag S, Dragutinovic A, Kuiper I (2010). Extraction of diatoms from (cotton) clothing for forensic comparisons, Forensic Sci Inst 200 (1-3): 112-116.,

Vallejo G. Azparren JE, Sánchez de León SM, Contardi L ,Valverde JL. (2012) Pruebas biológicas complementarias en las muertes por sumersión. Rev Española de Medicina Legal, 38 (1): 17-27.

25

ANEXOS

MUESTREO PARA EL EXAMEN HISTOLÓGICO. La mayoría de las piezas de tejidos sólidos se cortan en forma de fragmentos que miden 10mm a 15mm por 2mm o 3mm de espesor, sino no serán adecuadamente infiltrados por la parafina, el técnico histológico los orientará en una posición plana en el bloque de parafina y no tiene importancia cual lado es cortado. Debe evitarse el sobrellenado de la cápsula o no se embeberá el tejido. El material de sutura, broches de metal y otros cuerpos extraños como esquirlas óseas o metálicas deben ser retirados de los tejidos o se dañará la cuchilla del micrótomo. De la misma manera, deben extraerse las áreas de calcificación u osificación o deberán ser descalcificadas. Si los fragmentos de tejido son pequeños, corren el riesgo de escaparse a través de las perforaciones de la cápsula y deben ser envueltos en papel de filtro y también es aconsejable colorearlos con hematoxilina Cumplido el tiempo de fijación se retiran las muestras y se procede al lavado con agua corriente durante aproximadamente 5hs.

PROCESAMIENTO DE TEJIDOS. Los tres pasos del procesamiento de tejidos (deshidratación, aclaramiento e infiltración) son pasos secuenciales designados para remover toda el agua que se puede extraer de los mismos y reemplazarla con un medio que se solidifique. A) DESHIDRATACIÓN Es necesario que se quite el agua de las muestras para que luego se puedan cortar con el micrótomo. La deshidratación se obtiene con alcohol etílico de graduación creciente, comenzando por el alcohol 70º, luego tres alcoholes 96º (para completar las 24hs.). Luego tres alcoholes de 100º (durante 24hs aproximadamente).

26

Recordando que la deshidratación incompleta perjudica la inclusión y, en cambio, la permanencia prolongada en alcohol absoluto no altera las piezas, es preferible emplear el tiempo de permanencia en el baño de deshidratación. Los procesadores automáticos de tejidos perfeccionan el procesamiento mediante el uso de calor, vacío, presión, y agitación, también logran que tengan lugar durante la noche sin la presencia del personal, éste método es el utilizado en el laboratorio. B) ACLARACIÓN. Terminada la deshidratación las muestras se hallan embebidas en alcohol absoluto. La parafina, que debe penetrarlos, es insoluble en el alcohol, de ahí la necesidad de un líquido intermediario que sea miscible al mismo tiempo en el alcohol 100º y la parafina. Se utiliza para este fin el xilol. Cuando las muestras se hallan impregnadas en solvente, adquieren una acentuada transparencia, considerándose a esta como índice de penetración.

C) IMPREGNACIÓN EN PARAFINA (IMBIBICION) Es necesario mantener tres recipientes con parafina de 58ºC-60ºC de punto fusión, en forma líquida. El tiempo total de procesamiento está estimado en un mínimo de 3-4hs a 24hs, según el tamaño de la muestra

INCLUSIÓN DE TEJIDOS. Es el proceso de rodear un tejido con una sustancia firme, tal como la cera, para poder obtener secciones bien delgadas. La parafina es el medio de inclusión más común Los centros de inclusión son sistemas multifuncionales que usualmente incluyen un proveedor de parafina, un tanque para mantener las muestras, una placa de temperatura tibia para orientar la muestra en parafina derretida y una placa fría para transformar la parafina derretida en un bloque sólido, luego que la muestra haya sido orientada, siendo este método el utilizado en el laboratorio DESPARAFINIZACIÓN. 27

Como la parafina impide la coloración, corresponde eliminarla, utilizando, para tal fin, solventes como el xilol. Los cortes están completamente deshidratados y, como se emplea un colorante en solución acuosa, resulta necesaria su hidratación previamente con alcoholes de graduación decreciente hasta llegar al agua (xilol, alcohol 100º, 96º, 70º y agua destilada) HEMATOXILINA-EOSINA. La cromatina nuclear se tiñe con la solución de hematoxilina, se deja el portaobjeto en la solución, durante 5 minutos, el corte toma color pardo que luego se vira con agua corriente y cambia al azul. Existen varios tipos de tinción del citoplasma con eosina, unas solubles en agua y otras en alcohol, entre las primeras (más aconsejables) denominadas amarillentas

Secuencia de tinción: - Xileno. - Xileno. - Alcohol 100º. - Alcohol 100º. - Alcohol 96º. - Alcohol 96º. . - Alcohol 80º. - Agua destilada. - Hematoxilina Mayer. - Agua corriente. - Agua destilada. - Alcohol 80º. - Eosina - Alcohol 96º. 28

- Alcohol 96º. - Alcohol 100º. - Alcohol 100º. - Xileno. - Xileno. - Montar.

MEDIOS DE MONTAJE. El paso final en la preparación de una lámina portaobjetos es el de cubrir la porción que contiene el tejido con un cubreobjetos. Esto hace que la lámina sea permanente y permite el examen microscópico. Para pegar la laminilla hay tres medios de montaje que se pueden usar: resinas sintéticas (usadas en la actualidad)

.

29