Protocolos de investigación: Ejemplo Probióticos de leche materna.

09/06/2009 Health from nature

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1 Juan Carlos de Gregorio

La situación... de la investigación

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• La Biotecnología en España llega en un momento adecuado en el que existe una base científica con gran capacidad de generación de conocimiento y transferencia de tecnología hacia las empresas y la sociedad 09/06/2009

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Programa Ingenio 2010 El programa Ingenio 2010 pretende involucrar al Estado, la Empresa, la Universidad y otros Organismos Públicos de Investigación en un esfuerzo decidido por alcanzar en I+D el nivel que nos corresponde por nuestro peso económico y político en Europa.

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Programa CENIT "Consorcios Estratégicos Nacionales en Investigación Técnica" • Enmarcado en el programa Ingenio 2010. • Adscrito al CDTI para su gestión (Centro para el Desarrollo Tecnológico Industrial). • Fomenta la colaboración público-privada. • Contempla la financiación de grandes proyectos globales integrados de investigación industrial de carácter estratégico.

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datos • + de 3.000 millones de euros ppto de Ministerio de Educación y Ciencia • 35 % a la Dirección General de Investigación TOTAL: 3.146.361.000,05 Dirección General de Investigación 35,3%

56,9% Dirección General de Política Tecnológica

Dirección General de Universidades 3,6% 2,7% CSIC Recursos presupuestarios del Ministerio de Educación y Ciencia* 09/06/2009

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“No hay inversión más rentable que la del conocimiento" (Benjamín Franklin)

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581 empresas biotecnológicas se repartieron, en 2006, una facturación de 593 millones de Euros

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Y que opina el consumidor ?

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Quien ha oido hablar de biotecnología?? 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 19921994199519961997199920002001200220032004200520062007

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Product life cycle

Need to innovate

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La evolución…y la empresa.

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• El análisis de viabilidad de productos biotecnológicos, desde la identificación de ideas y el análisis inicial, hasta la traslación de la idea al mercado, es un proceso continuo analítico y de traslación 09/06/2009

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Investigación traslacional La investigación traslacional, consistente en la aplicación de los conocimientos básicos del laboratorio a la práctica clínica. Definición de todos los procedimientos y actuaciones para convertir una posible idea en un producto saludable 09/06/2009

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Investigación traslacional

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Conceptos claves

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Conceptos claves • Dos mundos tan dispares, como la ciencia y el mercado, necesitan un intérprete que les acerque y les haga entenderse con el fin de hacer nacer nuevos negocios.

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Conceptos claves • Dos mundos tan dispares, como la ciencia y el mercado, necesitan un intérprete que les acerque y les haga entenderse con el fin de hacer nacer nuevos negocios. • Desarrollar negocios en este sector es una labor típicamente emprendedora.

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Conceptos claves • Dos mundos tan dispares, como la ciencia y el mercado, necesitan un intérprete que les acerque y les haga entenderse con el fin de hacer nacer nuevos negocios. • Desarrollar negocios en este sector es una labor típicamente emprendedora. • La innovación biotecnológica nos lleva a la globalización, empresas globales en sectores globales 09/06/2009

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Heréditum: Probióticos obtenidos de leche materna

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1. 2. 3. 4. 5. 6.

Antecedentes Hipótesis y objetivos Estudios Descubrimiento de lactobacillus y bifidobacterias en leche materna Mecanismo de transferencia propuesto Selección de las cepas Hereditum®: Lactobacillus fermentum Lactobacillus gasseri Lactobacillus salivarius

7. 8. 9.

Patentes Seguridad de las cepas. Estatus QPS de la EFSA Aplicaciones: 1. Lácteos fermentados 2. Nutrición Infantil 3. IBD

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HEREDITUM ®: PROBIÓTICOS OBTENIDOS DE LECHE MATERNA • Tradicionalmente, la leche materna se ha considerado como un fluído libre de bacterias, estéril.

•Hace unas décadas se describieron algunas bacterias en la leche materna que se asociaron con “potenciales contaminaciones” (ElMohandes et al. 1993; Wright & Feeney 1998 “Identification of potential contaminant bacteria in stored milk”)

•Se conoce que la leche materna protege al neonato de infecciones. Las propiedades antiinfectivas de LM se pierden después de la pasteurización 09/06/2009

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Hereditum: Antecedentes 1.

Se pensaba que el feto es estéril y el inicio de la presencia de bacterias en el recién nacido provenía del canal vaginal

2.

Pero también existe presencia de bacterias en los recién nacidos por cesárea. La flora de bebés nacidos por parto natural vs cesárea es muy parecida, lo que descarta la colonización exclusiva a partir de la flora del canal vaginal.

3.

En PB encontramos la presencia de bacterias en el meconio (Jiménez et al., 2008) y en cordón umbilical (Jiménez et al., 2005) de recién nacidos

Demostramos la transferencia de bacterias al feto durante el embarazo a través de la placenta/cordón umbilical.

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Hereditum: LA HIPÓTESIS ¿Existen bacterias ácido lácticas (lactobacillus/bifidobacterias) en la leche materna?

¿existe transferencia de bacterias al recién nacido a partir de leche 09/06/2009 * materna?

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HEREDITUM: Estudios

Aislamos muestras de leche materna a partir de 8 madres lactantes sanas

Se investigó la flora bacteriana usando medios de cultivos genéricos y específicos

Se encontraron varias especies, incluyendo Lactobacillus y Bifidobacterias ¿Una contaminación de la flora de la epidermis?

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Ensayo con madres y bebés Se seleccionaron 8 madres sanas con sus bebés recién nacidos se tomaron muestras: Madres (1-8) •Leche materna •Aureola mamaria •Mucosa vaginal •Heces •Epidermis

Bebés (1-8) •Meconio (primeras heces) •Heces bebé •Mucosa bucal

• MRS

Se investigó la flora bacteriana en las muestras usando medios de cultivos genéricos y específicos

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Se aislaron 300 cepas de cada par madre-bebé x8 * Total: 2,400 cepas

• KAA • VRBA • Nutrient Agar

Martin et al., 2003 27

Caracterización de las especies Las especies de Lactobacillus Y bifidobacterias de Leche Materna = Heces del bebé (HB) = Aureola mamaria (AM) = Mucosa oral del bebé LAB (MO)

identificación genética

LM

AM

HB MO

LM

AM

HB MO

600 bp

600 bp

Madre 1- Bebé 1

Madre 2- Bebé 2

Conclusión: Las bacterias ácido lácticas existentes en la leche materna también se identificaron en las mucosas del bebé •la flora oral del bebé •las heces del bebé 09/06/2009 * 28 Martin et al., 2003;

09/06/2009

*

J Pediatr 2003; 143: 754-8 29

Después, otros grupos han descrito la presencia de bacterias ácido lácticas en leche materna Heikkilä & Saris (2003) J. Appl. Microbiol., 95: 471.

105-107 cfu/800 ml

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HEREDITUM: Mecanismo de transporte propuesto

Lumen intestinal

Enterocitos

Mucus

Bacteria

M cell

Células dendriticas

Migration Células dendriticas 09/06/2009

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Martin et al., 2004 Xaus et al., 2004a; Xaus et al 2004b; 31 Xaus et al., 2005

Puntos a recordar: -La leche materna contiene lactobacillus y bifidobacterias (BAL) -Existe una transferencia desde estas bacterias desde la leche materna al bebé durante la lactancia -Hemos aislado un número de éstas bacterias ácido lácticas

¿Cuáles de ésas cepas tienen potencial probiótico?

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Microbiota Intestinal: Modulación Probióticos: “microorganismos vivos que cuando son ingeridos ejercen un efecto beneficioso en la salud”

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Selección de cepas probióticas Existen diferentes cepas bacterianas en la leche materna con potencial probiótico

¿cómo seleccionar las mejores?

? 09/06/2009

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Selección de cepas probióticas •Sistema de screening de PB con unos 40 ensayos in vitro Supervivencia tras digestión COLONIZACIÓN Y Adhesión ASPECTOS FUNCIONALES Propiedades antimicrobianas Propiedades inmunoreguladoras

Identificación de cepas ASPECTOS DE Ausencia de infectividad SEGURIDAD Resistencia a antibióticos Origen humano

Propiedades organolépticas Características de fermentación ASPECTOS TECNOLÓGICOS Estabilidad Vida media

•Sistema de puntuación de capacidades probióticas vs otras Comerciales

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Martin et al 2005; Martin et al 2006 35

Ejemplo de parámetros de funcionalidad

- Production of bacteriocins - Production of H2O2 - Competition studies - Infectivity (Caco2 monolayers) - Intestinal Translocation (Ussing) - Macrophage stimulation - Dendritic cell stimulation - Lymphocyte stimulation - Phagocytic activity - Antibiotic resistance and metabolism - D- and L-lactate production - Bile salt deconjugation - Exo-polysaccharide production - Production of SCFA - Production of beneficial fatty acids - Production of vitamins - Production of glutathione - etc…

30 25 20 15 5717 5711 5712 5713 5714 5715 5716 LGG LA1 Lcasei Alim. Fermentados

Leche materna

Cepas comerciales

Se seleccionaron 3 cepas con excelentes capacidades probióticas 09/06/2009

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HEREDITUM ® UNA NUEVA GENERACIÓN De Bacterias probióticas aisladas de leche materna Lactobacillus fermentum Lactobacillus gasseri Lactobacillus salivarius

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Referencias:

•1. aislamiento cepas leche materna

•Jimenez E, Fernandez L, Marin ML, Martin R, Odriozola JM, Nueno-Palop C, Narbad A, Olivares M, Xaus J, Rodríguez JM. 2005. Isolation of Commensal Bacteria from Umbilical Cord Blood of Healthy Neonates Born by Cesarean Section Curr. Microbiol. 51: 270-274 •Jiménez E et al., 2008 Is meconium from healthy newborns actually sterile? Research in Microbiology 159; 187-193 • Martin R, Langa S, Reviriego C, Jimenez E, Marin ML, Xaus J, Fernandez L, Rodriguez JM. 2003. Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut. J. Pedriatr. 143: 754-758. • Martin R, Heiling HGHJ, Zoetendal EG, Jimenez E, Fernandez L, Smidt H, Rodriguez JM. 2007a. Cultivation-independent assessment of the bacterial diversity of breast milk among healthy women. Res Microbiol. 2007 Jan-Feb;158(1):31-7. • Martin R, Heiling HGHJ, Zoetendal EG, Smidt H, Rodriguez JM. 2007b. Diversity of the Lactobacillus group in breast milk and vagina of healthy women and potential role in the colonization of the infant gut. Journal of Applied Microbiology, 103: 2638-2644

•2. transferencia.

• Martin R, Langa S, Reviriego C, Jimenez E, Marin ML, Olivares M, Boza J, Jimenez J, Fernandez L, Xaus J, Rodriguez JM. 2004. Trends Food Sci Tech. 15: 121-127 • Xaus J, Olivares M, Rodriguez JM. 2004 a. Probiotics: Infant nutrition as target. Nutrafoods 3: 13-21. • Xaus J, Martin R, Olivares M, Díaz-Ropero MP, Langa S, Rodriguez JM. 2004b. AgroFood Sep-Oct: 27-29 • Xaus J., Olivares M, Rodriguez JM, 2005. Neonatal microbiota: New posibilities after one century, new oportunities for the 21st century. Ing. Health Nutr. Nov: 12-15

3. Selección de cepas de leche materna con potencial probiótico

Martin R, Olivares M, Marin ML, Fernandez L, Xaus J, Rodriguez JM. 2005. Probiotic potential of 3 lactobacilli strains isolated from breast milk. J. Hum. Lact. 21: 8-17 Martin R, Jimenez E, Olivares M, Marín ML, Fernandez L, Xaus J, Rodriguez JM. Lactobacillus salivarius CECT5713, a potential probiotic strain isolated from infant feces and brest milk of a mother-child pair. International Journal of Food 09/06/2009 * 38 Microbiology 112 (2006) 35–43

CEPAS HEREDITUM PATENTADAS: nº WO 2004/003235 Comercialization

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Seguridad de las cepas

Lactobacillus fermentum Lactobacillus gasseri

poseen estatus QPS de la EFSA

Lactobacillus salivarius

QPS: Qualified Presumption of Safety

- El estatus QPS de la EFSA se otorga a especies de microorganismos para las que existe una amplia historia de uso seguro en alimentación y cuyo consumo no representa ningúun riesgo para la salud, basado en la identidad de la especie, el conocimiento científico de la misma, los datos de patogenicidad y los usos finales. - Según la EFSA, las cepas de microorganismos con estatus QPS no necesitan estudios adicionales de evaluación de seguridad. Lactobacillus fermentum posee estatus QPS de la EFSA y por lo tanto puede considerarse como una cepa con todas las garantías de seguridad. Ref: Documento opinión de la EFSA: The EFSA Journal (2007) 587, 1-16 con tabla completa de especies con estatus QPS 09/06/2009 * 40

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41

Lactobacillus fermentum Lactobacillus gasseri 09/06/2009

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Lactobacillus salivarius

Son cepas QPS 42

HEREDITUM®

Aplicaciones

Suplementos

Nutición Infantil

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Lácteos fermentados

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Afecciones Intestinales (E.I.I.)

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HEREDITUM® Probióticos de leche materna

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Conservation Optimization

Pellet frozen

80-100% survival after 6 months at -20ºC (2-6x1010cfu/g)

Lyophilized

Industrial Plant:

15.000-20.000 Kg frozen product/year

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80-100% survival after 12 months at -50ºC (0.5-4x1011cfu/g) 45