RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS

NMX-F-163/3-S-1980. GRANOS DE CACAO. DETERMINACIÓN DE AFLATOXINAS. COCOA BEANS - DETERMINATION OF AFLATOXINS. PARTE 3 CROMATOGRAFÍA PRELIMINAR Y CUANTITATIVA EN CAPA FINA. PRELIMINARY AND QUANTITATIVE THIN LAYER HROMATOGRAPHY. NORMAS MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS. PREFACIO En la elaboración de la presente Norma participaron los siguientes Organismos: Secretaria de Salubridad y Asistencia. Dirección General de Control de Alimentos, Bebidas y Medicamentos. Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos. Dirección General de Sanidad Vegetal. Subsecretaría de Salubridad. Dirección General de Laboratorios de Salud Pública. Subsecretaría de Mejoramiento de Ambiente. Dirección General de Investigación de los Efectos del Ambiente en la Salud. Secretaria de Agricultura y Recursos Hidráulicos. Dirección General de Economía Agrícola. Comisión Nacional del Cacao. Unión Estatal de Productores de Cacao de Chiapas. Unión Nacional de Productores de Cacao. Asociación Nacional de Fabricantes de Chocolates, Dulces y Similares, A.C. Larín, Division Richardson Merrell Nacional de Dulces, S.A. de C.V. Lady Baltimore, S.A. La Azteca, S.A. de C.V. Compañía Nestlé, S.A. 0.

INTRODUCCIÓN

La cromatografía en capa fina es el paso crítico en la separación y determinación de aflatoxinas. La variación en los tamaños de las partículas y la actividad local de los absorbentes, así como la variación de la temperatura y la humedad a que están expuestas las placas durante el manejo y aplicación, requieren de ajustes en el grosor de la capa y la polaridad del solvente. Los vapores reactivos como O3, SO2 y HCl, pueden afectar los absorbentes, como también la estabilidad de los puntos absorbidos. Efectuar la cromatografía en capa fina únicamente en laboratorios libres de reactivos volátiles. Si es necesario proteger la capa absorbente y las manchas desarrolladas, manejando las placas de cromatografía en cajas con atmósferas inertes o colocar una placa de vidrio limpia sobre la capa absorbente, mientras se está aplicando (únicamente con el área de aplicación expuesta) y después del desarrollo y del secado.

Secar siempre las placas completamente, antes de exponerlas a la luz UV. La luz natural o de las lámparas fluorescentes puede catalizar cambios en los compuestos que son examinados, cuando se exponen sobre superficies absorbentes, particularmente en la presencia de solventes. Evitar la exposición de las manchas no desarrolladas a la luz UV, utilizar luz incandescente mortecina y exponer las manchas desarrolladas a la luz UV solamente durante los minutos necesarios para la visualización. 1.

OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN

La presente Norma Mexicana establece el método de cromatografía en capa fina, para la determinación de aflatoxinas. 2.

FUNDAMENTO

Los procedimientos de cromatografía en capa fina de este método se basan en la comparación de la intensidad de fluorescencia de las manchas. Muchos laboratorios calculan la concentración de aflatoxinas basándose en la extinción; en tales casos se determina, por el procedimiento de cromatografía en capa fina que a continuación se describe, el volumen mínimo de la disolución de la muestra que todavía permite destacar una mancha fluorescente. La cantidad de aflatoxinas responsable de esta fluorescencia se calcula por comparación con la cantidad mínima de un patrón de aflatoxinas detectable en la misma placa. 3.

REFERENCIAS

La presente Norma se complementa con las siguientes Normas Mexicanas vigentes: NMX-163/1-S

NMX-F-163/2-S NMX-F-163/4-S

Granos de cacao - Determinación de aflatoxinas parte 1: Preparación de la muestra y obtención del extracto de aflatoxinas en granos de cacao. Granos de cacao - Determinación de aflatoxinas parte 2: Método de preparación de placas para cromatografía en capa fina. Granos de cacao - Determinación de aflatoxinas parte 4: Requisitos de pureza de los patrones de aflatoxinas.

4.

REACTIVOS Y MATERIALES

4.1

Reactivos

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico, a menos que se indique otra cosa y estar libres de impurezas fluorescentes que interfieran con el método. Algunos disolventes orgánicos almacenados en recipientes metálicos, adquieren impurezas fluorescentes que interfieren con la determinación final por cromatografía en capa fina, por lo tanto, se recomienda que los disolventes se almacenen en frascos de vidrio.

• • •

Mezcla benceno - Acetonitrilo (CH3CN) (98:2) Mezcla acetona - Cloroformo (CHCl3) (1:9) ó de (5:95) hasta (15:85) según se necesite (véase A.1). Solución patrón de aflatoxinas de trabajo preparada como se indica en el capítulo 5.3 de la Norma NMX-F-163/4-S (véase 2).

4.2

Materiales

• • • •

Pipetas de 200 microlitros o equivalentes Jeringas de 10 microlitros Probetas de 50 ml. Tanque para cromatografía en capa fina 23 x 23 x 9 cm, con tapa, o equivalente. Saturado con agua y con su cubeta o artesa preparada para recibir entre 40 y 50 ml de mezcla acetona - cloroformo, en el momento de efectuar la cromatografía, tapar el tanque y dejar saturar durante 30 minutos (véase fig. 1).

5.

APARATOS E INSTRUMENTOS

• • •

Vortex. Lámpara de luz UV de 15 watts, de onda larga. Filtro que absorba luz UV, para proteger los ojos.

6.

PROCEDIMIENTO

6.1

Cromatografía preliminar en capa fina

6

Este paso puede evitarse, cuando se conoce el contenido aproximado de aflatoxinas.

6.1.1

Destapar el frasco vial que contiene el extracto de aflatoxinas de la muestra problema, preparado como se indica en la Norma NMX-F-163/1-S (véase 2). Agregarle 200 microlitros de mezcla benceno-CH3CN (98:2), y volver a sellar con un tapón hueco de polietileno.

6.1.2

Agitar vigorosamente para disolver perfectamente, en un vortex.

6.1.3

Agujerar el tapón de polietileno para acomodar la aguja de una jeringa de 10 microlitros.

6.1.4

Con luz incandescente mortecina y lo más rápidamente posible, sobre una placa preparada de acuerdo con la Norma NMX-F-163/2-S (véase 2) aplicar alicuotas de la muestra problema de 2, 5 y dos de 10 microlitros, sobre una línea imaginaria a 4 cm del borde inferior de la placa de cromatografía (véase fig. 2).

6.1.5

Conservar el matraz con la muestra problema, para el análisis cuantitativo.

6.1.6

En la misma placa aplicar alícuotas de la solución de trabajo de aflatoxinas de 2, 5 y 10 microlitros preparada como se indica en el capítulo 5.3 de la Norma NMX-F-163/4-S (véase 2 y fig. 2).

6.1.7

Aplicar 5 microlitros de solución patrón, sobre la superficie de una de las manchas de la muestra original de 10 microlitros, como control interno (véase fig. 2).

6.1.8

Colocar 50 ml de mezcla acetona-CHCl3 (1:9) en la cubeta de una cámara para cromatografía, saturada con agua y no alineada, cuidando que el volumen usado, provea dos cm de profundidad.

La composición de la mezcla acetona-CHCl3 (1:9) puede variar desde (5:95) hasta (15:85), para compensar por variaciones en el gel de sílice y por las condiciones de desarrollo (véase A.1). FIGURA 1. TANQUE PARA CROMATOGRAFÍA

6.1.9

Usar únicamente una placa por tanque

6.1.10 Colocar la cubeta cerca de un lado del tanque, para permitir la máxima exposición de la superficie recubierta, en el volumen del líquido desarrollador. 6.1.11 Insertar inmediatamente una placa dentro del tanque y sellarlo. Las aflatoxinas pueden descomponerse en la placa, si ésta, no se desarrolla de inmediato en la obscuridad por ser muy sensibles a la luz, el aire, los ácidos y las bases. 6.1.12 Correr el cromatograma durante 40 minutos a una temperatura entre 23 y 25°C; o hasta que las aflatoxinas alcancen un Rf entre 0.4 y 0.7 (El frente del solvente haya alcanzado de 12 a 14 cm por encima del origen).

6.1.13 Ajustar el tiempo de corrimiento, para compensar si se utiliza una temperatura de corrimiento diferente. 6.1.14 Sacar la placa del tanque y evaporar el solvente a temperatura ambiente, hasta que seque completamente. 6.1.15 Iluminar la placa desde abajo colocándola horizontalmente y con el lado cubierto hacia arriba, sobre una lámpara de luz UV de onda larga, en un cuarto obscuro. O mirar la placa en un aparato de cromatografía. O iluminarla desde arriba. Si la iluminación requiere ver directamente las lámparas, proteger los ojos con un filtro que absorba la luz UV. 6.1.16 Observar las cuatro manchas fluorescentes del patrón de aflatoxinas: En orden de Rf decreciente son B1, B2, G1, G2. Observar una pequeña diferencia de color en las distintas manchas: azul fluorescente de B, en contraste con un verde pálido de las aflatoxinas G. 6.1.17 Examinar en las muestras problema, las manchas fluorescentes, que tengan un Rf cercano o idéntico al de los patrones y véase si ofrecen un aspecto similar al de los patrones. 6.1.18 De esta placa preliminar, establecer una dilución aceptable, para el análisis cuantitativo de cromatografía en capa fina. 6.1.19 En los cálculos finales tomar en cuenta la cantidad de extracto de aflatoxinas, utilizado para la cromatografía preliminar en capa fina. 6.2

Cromatografía cuantitativa en capa fina

6.1.9

Si la placa preliminar muestra que se necesita una nueva concentración del extracto de aflatoxinas de la muestra problema, evaporarlo a sequedad en el baño de vapor y volver a disolverlo, en un volumen precalculado de mezcla benceno - CH3 (98:2) (generalmente 0.5 a 3 ml).

6.1.10 Aplicar sucesivamente alícuotas de 3.5, 5.0 y dos de 6.5 microlitros del extracto de la muestra problema. (véase fig. 3).

FIGS. 2, 3.- COLOCACIÓN DE ALICUOTAS PARA LA CROMATOGRAFÍA

6.2.3

Todas las manchas deben tener aproximadamente 0.5 cm de diámetro.

6.2.4

En la misma placa aplicar alícuotas de la solución de aflatoxinas patrón de 3.5, 5.0 y 6.5 microlitros, (véase fig. 3).

6.2.5

Manchar por lo menos 5 microlitros de la solución de aflatoxinas patrón, sobre la superficie de una de las dos manchas de muestra de 6.5 microlitros, como control interno, (véase fig. 3).

6.2.6

Proceder al corrimiento como se indicó a partir de 6.1.9.

6.3

Interpretación del cromatograma

6.3.1

En el patrón de aflatoxinas deben estar visibles cuatro manchas claramente identificables. Si no repetir la cromatografía, corrigiendo y ajustando las condiciones para obtener una separación adecuada.

6.3.2

Puesto que las manchas del extracto de la muestra problema, se comparan directamente con las manchas de las soluciones patrón de aflatoxinas, en la misma placa, la magnitud de Rf no es importante; ésta puede variar de placa a placa.

6.3.3

Comparar las manchas corridas del extracto de la muestra con las del patrón de referencia. Toda mancha fluorescente en las muestras problema que pretenda identificarse como aflatoxinas B o G debe tener valor Rf idéntico y color similar a la mancha de la solución patrón de aflatoxinas. Identifíquense las manchas desconocidas de la muestra como aflatoxinas B o G, solo cuando la mancha desconocida y la mancha de control interno, estén sobrepuestas.

6.3.4

Las manchas ofrecidas por la combinación de la muestra y del patrón interno, deben ser más intensas que cualquier mancha de muestra o patrón separada.

6.3.5

Comparar las intensidades de fluorescencia de las manchas B1 de la muestra, con aquellas fluorescencias de las manchas patrón y determinar cual alícuota de la muestra coincide o es igual con uno de los patrones. Para ayudar en la determinación, retirar la placa de la lámpara para atenuar la luz UV, de tal manera que puedan ser comparados a extinción todos los pares de manchas particulares.

6.3.6

Si la intensidad de fluorescencia de la mancha de la muestra de prueba, está entre las intensidades de fluorescencia de dos manchas de la solución patrón: interpolar.

6.3.7

Si las manchas de la alícuota más pequeña de la muestra problema ofrecen una fluorescencia demasiado intensa para ser comparada con las manchas patrón, diluir la muestra y volver a hacer otro cromatograma.

6.3.8

Comparar las manchas de las aflatoxinas B1, G2 y G2 de la misma manera.

7.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS

El contenido de la aflatoxina B1, expresado en microgramos por kilogramo, se calcula mediante la siguiente fórmula: (S) x (Y) x (V) C = (X) x (W) Donde: C=

Microgramos por kilogramo de la aflatoxina B1

S= Y= V= X=

W=

Microlitros del patrón de aflatoxina B1, de intensidad de fluorescencia igual a la mancha de la muestra problema. Concentración de la aflatoxina B1 en el citado patrón, en microgramos por mililitro. Volumen en microlitros de la dilución final del extracto de aflatoxinas de la muestra problema. Microlitros manchados del extracto de la muestra de aflatoxinas, que proporcionan una intensidad de fluorescencia igual a la S (patrón de aflatoxinas B1) Masa de la muestra, expresada en gramos, aplicada a la columna (10 g si se utilizan 50 ml de extracto de CHCl3). Si la dilución del extracto final, no representa 10 g, calcular la masa correcta de la muestra y substituir.

Las aflatoxinas B2, G1 y G2 se calculan similarmente. 8. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA PARA LA CONFIRMACION DE LAS AFLATOXINAS G1 Y/O G2 Este método es aplicable sólo, cuando el producto contiene interferencias que tienden a migrar dentro del área de aflatoxinas G. Si G1 + G2 es mayor o igual al 20% del total de aflatoxinas, confirmar su identidad y contenido, mediante cromatografía, utilizando el sistema de solventes indicando en A.1 b. 8.1 8.2

8.3

8.4 8.5 8.6

8.7 8.8

Volver a aplicar alícuotas de la muestra y del patrón sobre un placa de gel de sílice como se indicó en 6.2. Colocar 50 ml de la fase inferior del solvente separada en A.1b en el fondo de una cubeta para cromatografía y 50 ml de la fase superior. (la cuba no debe estar recubierta interiormente con papel). Utilizar solo una placa por tanque y colocar la cubeta cerca de un lado, para permitir la exposición máxima de la superficie recubierta, al volumen del solvente. Sin esperar a que se alcance el equilibrio, insertar la placa en la cubeta y sellar la cuba. Permitir que el solvente se eleve hasta la línea de parada (12 a 14 cm sobre el origen, 30 a 50 minutos), y sacar la placa. En orden decreciente los valores de Rf de los patrones de aflatoxinas de referencia aparecerán: B1, B2, G1, y G2, como antes; pero muchas substancias fluorescentes extrañas, encontradas en la muestra, tendrán un Rf completamente diferente en relación con aquellos de las aflatoxinas en los dos sistemas de solventes. Las aflatoxinas G1 y G2 de la muestra problema, deben tener los mismos Rf relativos de los patrones. Calcular cuantitativamente la cantidad de aflatoxinas G1 y G2 como se indicó arriba. APÉNDICE

A.1

Disolventes opcionales para el desarrollo

Las muestras o las condiciones del laboratorio, pueden no ser compatibles, lo que ocasiona separaciones inadecuadas con el solvente desarrollador para cromatografía en capa fina especificado. A continuación se indican solventes alternativos que pueden ser útiles en tales situaciones. (Los sistemas no están en equilibrio, a menos que se indique otra cosa). A.la. Benceno - MeOH - HOAc ........................... Eter - MeOH - H2O ..................................... CH2Cl2 - C2HCl3 - n-amil ........................... Alcohol - HCOOH (orden de Rf cambiado a: CHCl3 - C2HCl3-n-amil ............................... Alcohol - HCOOH ....................................... CH Cl3 - acetona - H2O ................................ CH Cl3 - acetona - isopropanol H2O ............ CH Cl3 - isopropanol ...................................

(90 + 5 + 5) (96 + 3 + 1) (80 + 15 + 4 + 1) B1, G1, B2, G2) (80 + 15 + 4 + 1) (tanque equilibrado) (88 + 12 + 1.5) (88 + 12 + 1.5 + 1) (99 + 1)

A.1b. Benceno - alcohol - agua: Agitar benceno - alcohol - agua (46+35+19) (V/V) en un embudo de separación y dejar asentar durante toda la noche a 22°C ó menos. Separar y almacenar cuidadosamente las dos capas en recipientes separados. Si aparecen turbias, calentarlas antes de usarlas. Alternativamente usar benceno alcohol - agua (40+6+3) para la capa superior y (40+27-20) para la capa inferior. Las proporciones de los solventes pueden variarse, para adaptarlas a los cambios en los geles de sílice y a las condiciones del laboratorio. Un incremento en el componente polar, incrementará el Rf. La identidad dudosa de las manchas, puede resolverse algunas veces, desarrollando muestras con un número de diferentes solventes. El diferente Rf de la mancha de la muestra de prueba comparado con la mancha del patrón, aún en un solvente, es prueba positiva de diferencia en identidad. Coincidencia en la migración no prueba la identidad, para dicha prueba, véase AOAC 26.066 - 26.072. 9.

BIBLIOGRAFÍA

Association of Official Analytical Chemists.- Official Methods of Analysis (A.O.A.C.) Twelft Edition. Willian Horwitz Editor. Washington D.C. 1975. Chaper 26, Natural Poisons, Aflatoxins parts 26.019 b, c, d, e.