REPLICACION DEL DNA La información genética se transfiere de padres a hijos mediante una replicación (R) exacta de las moléculas de DNA. Toda la información genética contenida en una molécula de ácido nucleico reside en su secuencia de bases. Por tanto, el papel principal de cualquier forma de R es duplicar la secuencia de bases de la molécula progenitora. Tanto si la célula tiene un único cromosoma (procariota) como si tiene muchos (eucariota), la totalidad del genoma debe replicarse cada vez que la célula se divide. La R del genoma se lleva a cabo en forma de unidades discretas, cada una de las cuales recibe el nombre de replicón. Cada replicón se divide una sola vez durante el ciclo celular. Posee un origen, donde se inicia la R y un término, donde se para. Además, posee todos los elementos necesarios para el control de la R. Una vez iniciada la R, sigue hasta que el replicón completo se ha duplicado. El cromosoma bacteriano constituye un único replicón, así como cada plásmido e incluso cada virus. En estos casos la iniciación en un único origen promueve la R de todo el genoma. El cromosoma eucariótico contiene un gran número de replicones, cada uno de los cuales se replica una vez durante el ciclo celular, con lo cual, sus mecanismos de regulación deben ser más complejos (Figura 1). LA REPLICACION DEL DNA ES SEMICONSERVADORA La R del DNA implica que a partir de una molécula de DNA progenitora se obtienen dos moléculas hijas idénticas a la original. ¿Cómo se distribuyen las hebras de la molécula original entre las moléculas hijas? Si las dos hebras de la molécula progenitora permaneciesen apareadas tras la R y las dos hebras recién sintetizadas se apareasen para formar la molécula hija, la R sería conservadora. Si, por el contrario, las hebras de DNA de la molécula progenitora se mezclan con hebras nuevas para formar las moléculas hijas, la R sería semiconservadora. La respuesta a esta cuestión la dieron Matthew Meselson y Franklin Stahl en 1957. Cultivaron células de Escherichia coli en un medio con 15N, de manera que todo el DNA contenía el isótopo pesado. Este DNA con 15N resultaba ser un 1% más denso que el DNA normal, que contiene 14N. Así, si se centrifugan en un gradiente de densidad en cloruro de cesio (CsCl) formarán dos bandas diferentes (Figura 2). Las células que han crecido durante varias generaciones en presencia de 15N tienen prácticamente todo su DNA en la forma "pesada". A continuación se transfieren estas células a un medio que contiene 14N y se les deja replicar una vez. Si la R fuese conservadora, el 50% del DNA extraído de estas células sería de la forma "pesada", y el otro 50% sería de la forma normal, de manera que el DNA extraído de estas células formaría dos bandas en un gradiente de CsCl. En una R semiconservadora , cada molécula de DNA tendría una hebra normal y otra del tipo "pesado", de forma que en el gradiente de CsCl formaría una única banda en una posición intermedia. Esto es exactamente lo que ocurre (Figuras 2

Replicación 1

y 3). Si además, desnaturalizamos este DNA y se centrifuga, las hebras por separado originan dos bandas distintas, una en la posición que corresponde al 14N y otra en la posición del 15N, lo que refuerza aún más la hipótesis semiconservadora (Figura 3). Otro sencillo experimento confirma esta hipótesis. Si se espera a la siguiente generación de células crecidas con 14N y se centrifuga el DNA en el gradiente de CsCl se observan dos bandas, una correspondiente al DNA "ligero" (con 14N) y otra correspondiente al DNA híbrido (una hebra 15N y otra 14N) (Figuras 2 y 3). Por lo tanto, puede concluirse que la R del DNA es semiconservadora: cada una de las hebras progenitoras actúa como molde para la síntesis de una nueva hebra, que a medida que se va sintetizando se une mediante puentes de hidrógeno con su progenitora. INICIACION DE LA REPLICACION Todas las moléculas de DNA inician su ciclo de replicación en una secuencia de bases determinada llamada origen de replicación. La iniciación se produce en el interior de la hélice, y al microscopio electrónico (ME), el aspecto que presenta la región de R es la de un ojal o burbuja de replicación en el interior de la fracción del DNA que no se ha replicado (Figura 4). Una molécula circular de DNA que se está replicando recibe el nombre de estructura θ (theta), por su similitud con esa letra griega (Figura 5). En una molécula de DNA que se está replicando, la región no replicada consiste en la doble hebra progenitora, que se abre en la región replicada, donde se han formado las dos dobles hélices correspondientes a cada una de las moléculas hijas (Figura 6). Esta disposición de la estructura del DNA recibe el nombre de horquilla de replicación (HR). La R puede ser unidirecional o bidireccional. En la unidireccional, una HR parte del origen y avanza a lo largo del DNA en un solo sentido. En la bidireccional, se forman dos HR que avanzan en sentidos opuestos. A simple vista no se puede saber si la R es uni o bidireccional. Para averiguarlo, se exponen las células que se están replicando a concentraciones crecientes de [3H]-timidina, de forma que la base marcada radioactivamente se va incorporando al DNA recién sintetizado. El marcaje que se obtiene es más o menos intenso en función de la concentración de la base marcada. En la replicación unidireccional, se observa un marcaje que va creciendo en intensidad a lo largo de la hebra que se está sintetizando de nuevo. En la R bidireccional, el marcaje va aumentando en intensidad en las dos direcciones, observándose un patrón simétrico en la intensidad del marcaje (Figura 7). Estos experimentos han demostrado que aunque en algunos casos la R puede ser unidireccional, lo normal es que sea bidireccional.

LAS ENZIMAS DE LA REPLICACION EN PROCARIOTAS

Replicación 2

DNA-POLIMERASAS La creencia general era que el DNA no podía sintetizarse en ausencia de células. La búsqueda de un enzima que sintetizase el DNA la inició en 1955 Arthur Kornberg. Como consecuencia de este trabajo se aisló y caracterizó un enzima de E. coli capaz de sintetizar DNA en un sistema libre de células. Este enzima se llamó DNA-polimerasa I (pol I), y consiste en un único polipéptido de peso molecular 103.000 que cataliza la polimerización de desoxinucleósidos trifosfato en DNA (Figura 8). Estos precursores son moléculas ricas en energía (cada molécula posee una energía similar a la del ATP) de manera que proporcionan la energía necesaria para catalizar un proceso desfavorable en términos de la termodinámica. La actividad polimerasa se desarrolla siempre en la dirección 5'Æ3'. El proceso consiste en un ataque nucleofílico del grupo hidroxilo en posición 3' de la hebra creciente sobre el fosfato α en posición 5' del desoxinucleósido trifosfato que se va a incorporar. En la reacción se libera pirofosfato: d(NMP)n + dNTP

d(NMP)n+1 + PPi

Pol I presenta dos requerimientos comunes a todas las DNA polimerasas (Figura 8). En primer lugar, necesita de un molde que guíe la síntesis de la nueva hebra según el principio de la complementariedad entre las bases. En segundo lugar, hace falta un cebador (primer). Un cebador es un pequeño segmento de DNA o de RNA de la nueva hebra que es complementario al molde y que tiene un grupo OH en posición 3' al cual se le pueden añadir nuevos nucleótidos. Este extremo 3' se llama extremo del cebador, y debe estar correctamente apareado para que comience la síntesis por pol I. Esto quiere decir que una parte de la nueva hebra debe estar ya colocada para que empiece a funcionar pol I. Ninguna DNA polimerasa puede iniciar la síntesis de una nueva hebra a partir de cero. Sin embargo, las RNA-polimerasas sí pueden, y por esta razón los cebadores son casi siempre oligonucleótidos de RNA. Pol I tiene otras propiedades. Presenta actividad exonucleasa 3'Æ5' que le permite asegurar que cada nuevo nucleótido añadido esté correctamente apareado. Cuando pol I se encuentra con un error en el apareamiento de las bases se detiene su actividad polimerasa y se estimula se actividad exonucleasa en dirección 3'Æ5' de manera que elimina la base mal apareada, y a continuación reinicia su actividad polimerasa (Figura 9). Esta es la llamada función correctora de pol I, una actividad que es común prácticamente a todas las DNA polimerasas. Pol I presenta también actividad exonucleasa 5'Æ3'. Esta actividad permite que se sinteticen nuevas hebras, incluso cuando el molde está apareado con su complementaria. Así, la pol I puede ir eliminando o degradando un segmento de DNA o de RNA apareado con el molde al mismo tiempo que lo reemplaza por DNA de nueva síntesis (Figura 10). La actividad exonucleasa 5'Æ3' reúne las siguientes características: • •

tiene lugar tanto en nucleótidos de DNA como en nucleótidos de RNA el nucleótido que se elimina debe estar correctamente apareado.

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• • •

los nucleótidos se eliminan de uno en uno a partir del extremo 5'. se puede eliminar más de un nucleótido por cortes sucesivos. empieza a actuar en una muesca siempre que haya un grupo fosfato en 5'.

La actividad polimerasa 5'Æ3' y la exonucleasa 5'Æ3' pueden actuar simultáneamente en una hebra. Así, cada vez que la actividad exonucleasa elimina un nucleótido del extremo 5', la actividad polimerasa lo reemplaza por otro. Como la pol I no puede formar un enlace entre el OH en 3' y el fosfato en 5', nunca se podrán "soldar" los dos fragmentos para formar una sola hebra de DNA, sino que lo que se produce es un desplazamiento de la muesca (Figura 10) en la dirección de la síntesis del DNA (nick translation). De esta forma es como se eliminan los RNA cebadores en el proceso de replicación. Esta actividad es característica de pol I y juega un papel fundamental tanto en la replicación como en la reparación del DNA, como veremos más adelante. En E. coli pol I es responsable del 90% de la actividad DNA-polimerasa. Sin embargo, empezaron a acumularse evidencias en contra del hecho de que pol I fuese responsable de la R del cromosoma bacteriano. Primero, este enzima añade nucleótidos a una velocidad de 600 nucleótidos por minuto, demasiado lento en comparación con la velocidad de R de la célula. Segundo, se han descrito otros genes necesarios para la R, por lo tanto, pol I no actúa sola. Tercero, en 1969 John Cairns aisló un mutante bacteriano con el gen de la DNA polimerasa I alterado y que producía una polimerasa inactiva. Estas células eran viables. A principio de la década de los 70 se descubrieron otros dos enzimas implicados en la síntesis de DNA. Estos enzimas se llaman DNA-polimerasa II (pol II) y DNA-polimerasa III (pol III), para distinguirlos del enzima descubierto por Kornberg (DNA-polimerasa I o pol I) (Figura 11). Las células pueden seguir creciendo en ausencia de pol I o de pol II, pero nunca en ausencia de pol III. Pol III es la principal enzima de la R en E. coli. Es mucho más compleja que pol I y consiste en un complejo enzimático donde se pueden encontrar al menos 10 subunidades distintas, y cada una está presente en más de una copia. A este complejo se le suele llamar holoenzima de pol III (Figura 12). El complejo tiene actividad incluso en ausencia de alguna de sus subunidades, y aún queda mucho por averiguar sobre su funcionamiento. Entre sus características podemos destacar las siguientes: • • • • •

Necesita también de un molde y de un cebador. No actúa en una muesca ni sobre DNA monocatenario con cebador. Sólo actúa cuando en el DNA de doble hebra se produce un hueco de unos 100 nucleótidos, como los que se forman en la HR. Posee actividad exonucleasa 3'Æ5', por lo que puede efectuar correcciones en el DNA recién sintetizado. Sólamente tiene actividad exonucleasa 5'Æ3' en DNA de una hebra.

La función de pol II aún no está muy clara, aunque parece que está relacionada con la reparación del DNA tras haber sido sometido a alteraciones por métodos químicos o físicos.

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Las polimerasas no pueden unir un OH en 3' y un fosfato en 5', de forma que no puede producir hebras hijas continuas. La unión de estos grupos la realiza la DNA-ligasa. Este enzima cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo OH del extremo 3' de una hebra y el extremo 5'-fosfato de otra (Figura 13). Sólamente actúa cuando: (1) ambos extremos pertenecen a dos nucleótidos adyacentes, (2) los dos nucleótidos están correctamente apareados y (3) existe un aporte de energía, generalmente en forma de ATP. AVANCE DE LA HORQUILLA DE REPLICACION La molécula de DNA consta de dos hebras antiparalelas: mientras que una de ellas discurre en la dirección 5'Æ3', la otra lo hace en la dirección opuesta 3'Æ5'. Sin embargo, las cadenas nuevas de DNA sólo se pueden sintetizar en la dirección 5'Æ3' porque las DNA-polimerasas sólo pueden catalizar la adición de nuevos nucleótidos en el extremo que contiene el grupo hidroxilo libre en posición 3' de un DNA ya existentente. En una HR, una de las hebras (la llamada hebra guía) se replica en la dirección adecuada 5'Æ3'. La otra hebra (hebra retardada) debe crecer de otra manera. En 1968, Reiji Okazaki sugirió que en la hebra retardada el DNA se formaba mediante fragmentos cortos (entre 1000 y 2000 nucleótidos) que después se unían gracias a una DNA-ligasa que cataliza la formación de un enlace covalente fosfodiéster entre el extremo 3' de una cadena de nucleótidos y el extremo 5' de otra (Figura 14). Estos fragmentos cortos reciben el nombre de fragmentos de Okazaki. Esta hipótesis se enfrenta con un serio problema: ¿Cómo puede iniciarse la síntesis en varios puntos sin que haya un cebador?. Posteriores investigaciones demostraron que: • • •

los fragmentos de Okazaki suelen presentar cortas secuencias (entre 4 y 12 nucleótidos) de RNA en el extremo 5'. la RNA polimerasa, a diferencia de la DNA-polimerasa puede comenzar la síntesis de un RNA sin que haya un cebador. la DNA-polimerasa puede añadir un desoxirribonucleótido al extremo 3' de un RNA.

Combinando todas estas observaciones se desarrolló un modelo para la R del DNA que en la hebra retardada según el cual: • •

La R comienza gracias a la acción de un enzima llamado primasa que cataliza la formación de un RNA cebador (Figura 15). La pol III inicia la síntesis de DNA en el extremo del cebador y prosigue en dirección 5'Æ3', creando los fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos deberán unirse para formar una hebra contínua. Para ello habrá que eliminar las cortas secuencias de RNA, reemplazarlas por DNA y unir los fragmentos.

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Cuando pol III llega al RNA cebador del fragmento de Okazaki sintetizado previamente, no puede continuar, ya que (1) no tiene actividad exonucleasa en dirección 5'Æ3', y (2) no puede unir el grupo hidroxilo en 3' con un grupo trifosfato en posición 5'. La DNA-ligasa tampoco puede actuar, ya que (1) en el extremo correspondiente al cebador hay un grupo trifosfato en posición 5', y (2) en lugar de un desoxirribonucleótido hay un ribonucleótido. Pol I, por el contrario, sí puede continuar la síntesis, ya que tiene (1) acción polimerasa en la dirección 5'Æ3' y (2) acción exonucleasa también en dirección 5'Æ3'. Por lo tanto es pol I la encargada de ir eliminando los nucleótidos del RNA cebador y reemplazarlos por DNA. De este modo, la muesca se va transladando hasta encontrarse con el fragmento de DNA. En este punto ya puede actuar la DNA-ligasa para unir los dos fragmentos de Okazaki en una sola hebra de DNA (Figura 16).

En resumen, en la hebra guía, el DNA se sintetiza de manera continua, mientras que en la hebra retardada el DNA se sintetiza de manera discontinua. Este modelo que se ha descubierto en E. coli, se cumple probablemente en otros organismos, y recibe el nombre de replicación semidiscontinua. PROBLEMAS TOPOLOGICOS DURANTE LA REPLICACION Durante la R, las dos hebras de la doble hélice de DNA deben separarse, al menos de forma transitoria, para que las bases de la hebra que actúa como molde y los nuevos nucleótidos que se van a incorporar a la cadena creciente establezcan los puentes de hidrógeno correspondientes. Sin embargo, la doble hélice de DNA es muy estable en condiciones normales gracias a las interacciones hidrofóbicas y a los puentes de hidrógeno entre sus bases. La unión entre las dos hebras es tan fuerte que se requieren temperaturas de hasta 90ºC para separarlas en el tubo de ensayo. Las DNA polimerasas sólo pueden copiar el DNA cuando la hebra molde se encuentra separada de su complementaria. Por lo tanto, se necesitan proteínas adicionales que ayuden a abrir la doble hélice. Dos tipos de proteínas contribuyen a realizar esta misión, que además requiere considerable energía. El desenrollamiento lo realizan las enzimas llamadas helicasas, que hidrolizan 2 moléculas de ATP por cada par de bases que desenrollan (Figuras 17 y 19). Así van dejando en su camino dos hebras sencillas de DNA. Las DNA helicasas utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para desplazarse a lo largo de un DNA de hebra sencilla, y allí donde encuentren una zona con estructura de doble hélice, desenrollan la doble hélice para seguir desplazándose (Figura 19). Para evitar que las regiones separadas vuelvan a unirse o que formen puentes de hidrógeno intracatenarios, las hebras sencillas del DNA se unen a una proteína que en E. coli se llaman proteína ssb (Figuras 18 y 19). Las proteínas ssb (single strand binding proteins) se unen fuertemente tanto al DNA monocatenario como entre sí y desestabilizan la doble hélice dejando accesibles sus bases para que puedan servir de molde durante la replicación. Estas proteínas no pueden abrir una doble hélice, pero

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ayudan a las proteínas que sí la abren porque estabilizan las zonas de DNA de hebra sencilla (Figura 19). Según va avanzando la HR, la doble hélice progenitora debe desenrollarse. Cada 10 pares de bases que se replican en la HR corresponden a una vuelta completa de la doble hélice alrededor de su eje. El desenrollamiento de la doble hélice implica un problema topológico: o bien las dos hebras hijas van girando la una sobre la otra a medida que van creciendo, o bien es la zona sin replicar la que gira. Si la molécula estuviese en disolución y completamente extendida, lo más sencillo sería que la parte no replicada girase rápidamente sobre sí misma (Figura 20). El problema es aún más grave en las moléculas circulares de DNA, ya que no hay un extremo libre que permita la rotación de la zona no replicada, por lo que se produce un superenrollamiento de la parte no replicada, que puede llegar a impedir el avance de la HR. En realidad, es poco probable que la totalidad de la parte no replicada del cromosoma esté girando contínuamente y a gran velocidad, ya que el material genético está superempaquetado en un volumen muy pequeño y además este giro requeriría gran cantidad de energía. Una solución alternativa a este problema la aportan las DNA-topoisomerasas (también llamadas DNA-girasas). Las topoisomerasas rompen un enlace fosfodiéster de una de las hebras de DNA y forman una muesca en una de las hebras (Figura 21). Esta incisión permite que la parte de la doble hélice anterior a la muesca gire libremente alrededor de la otra hebra y que así se libere la tensión topológica acumulada durante el avance de la HR. Así, la R tiene lugar de forma que únicamente gira un corto segmento de la hélice (el que está justo por delante de la HR y antes de la incisión). La acción de la topoisomerasa es reversible, ya que una vez eliminada la tensión topológica, los dos extremos de la hebra cortada vuelven a unirse. Esta unión debe producirse antes de que la HR llegue a ese punto porque si no, se perdería una de las hebras hijas (Figura 21).

LA REPLICACION EN PROCARIOTAS Estudios in vitro sobre la R del DNA en E. coli permiten dividir el proceso en 3 etapas: iniciación, elongación y terminación. 1.- INICIACION Las HR se originan en unas secuencias especiales del DNA llamadas origen de la R. El origen de la R en E. coli se llama oriC y consiste en una secuencia de 245 pares de bases muy conservada entre las bacterias. Entre 20 y 40 copias de una proteína iniciadora (la proteína DnaA) se unen a zonas concretas del origen de R, formando un gran complejo proteico. La proteína DnaA se une a una zona del origen oriC especialmente rica en pares de bases A-T, que se desnaturaliza fácilmente para crear una región local donde las dos hebras de la doble hélice parental de DNA se separan para servir de molde para la R. En este momento, DnaB y DnaC se unen a esta región. DnaB es una helicasa que separa las hebras en ambas direciones, creando dos HR. DnaB también es capaz de activar a la proteína DnaG (una primasa) par aque comience la síntesis de los RNA cebadores. Una girasa deshace la tensión

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topológica causada por la helicasa DnaB y las proteínas ssb se unen a las zonas de DNA de hebra sencilla estabilizando esta conformación y evitando que se renaturalice la doble hélice (Figura 22). Todo este conglomerado de proteínas, necesarias todas ellas para que se produzca la R forman una macroestructura denominada primosoma, y tiene un tamaño tan grande que ha podido ser observado al microscopio electrónico. 2.- ELONGACION La síntesis del DNA es diferente en cada una de las hebras de la HR. En la hebra guía la R es continua: la primasa sintetiza un RNA cebador, al que la pol III va añadiendo desoxirribonucleótidos a medida que avanza la HR. En la hebra retardada el DNA se sintetiza de forma discontínua, mediante los llamados fragmentos de Okazaki (Figura 16). Esta forma de R recibe el nombre de replicación semidiscontinua. 3.- TERMINACION En el cromosoma circular de E. coli, las dos HR deben encontrarse en algún punto. Se sabe poco sobre esta etapa, pero parece ser que para que las dos moléculas de DNA se separen hace falta la intervención de una DNA-topoisomerasa especial.

LA REPLICACION EN EUCARIOTAS En este caso, la R es más compleja, debido al gran tamaño del cromosoma y a la compleja organización del DNA en nucleosomas. La velocidad de la HR en E. coli es de unos 105 nucleótidos por minuto, con lo cual su genoma (3 x 106 pares de bases) se replica en unos 30 minutos. Las polimerasas de eucariotas son mucho más lentas, con una velocidad entre 500 y 5000 nucleótidos por minuto. Como una célula animal típica tiene 50 veces más DNA que una bacteria, el tiempo de R en eucariotas sería unas 1000 veces más que en E. coli (unos 21 días). Sin embargo, la célula humana, que contiene unos 3 x 109 pares de bases puede replicarse en unas 8 horas. Esto se debe a la presencia de múltiples orígenes de replicación. (Figuras 1 y 4) Se calcula que puede haber hasta 50.000 HR en una célula eucariota. Este hecho implica además que el número de copias de las moléculas de DNA-polimerasa debe ser también mucho mayor. Así, mientras que en E. coli hay entre 10 y 20 copias del holoenzima pol III, en una célula animal hay entre 20.000 y 60.000. En eucariotas, las secuencias de origen de la R se llaman secuencias de replicación autónoma (SRA). En levaduras se han identificado unas 400 SRA, lo que quiere decir que cada cromosoma contiene más de una. También se han encontrado proteínas que se unen específicamente a las SAR.

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En eucariotas también hay varios tipos de DNA-polimerasas. La R de los cromosomas nucleares la realizan la DNA-polimerasa α y la DNA-polimerasa δ. DNA-polimerasa α es un enzima con 4 subunidades y parece estar implicada en la síntesis de la hebra retardada, ya que presenta actividad primasa. DNA-polimerasa δ tiene dos subunidades y presenta actividad exonucleasa 3'Æ5' (función correctora) y se piensa que es la responsable de la R de la hebra guía. Una tercera polimerasa, la DNA-polimerasa ε parece estar implicada en la reparación del DNA. La función de las proteínas ssb la desempeña una proteína llamada factor de replicación A (FRA). La replicación de la cromatina presenta dos problemas adicionales: la disociación de DNA e histonas en la molécula progenitora, y la asociación del DNA y las histonas en las moléculas hijas. Cuando avanza la HR, debe haber algún mecanismo para (1) disociar el nucleosoma (NS) para poder replicar el DNA y (2) volver a reconstruir el NS una vez que el DNA se ha replicado. El modelo actualmente aceptado sugiere que durante la R el NS se divide en dos mitades dejando expuesto el DNA, de forma que la DNA-polimerasa puede utilizarlo como molde para la R (Figura 23). Cada vez que se replica el DNA de una célula eucariota hay que doblar la cantidad de histonas para formar la cromatina (Figura 24). Las nuevas histonas se asocian al DNA unos 5 minutos después de haber pasado la HR. Por lo tanto, la síntesis de DNA y la síntesis de histonas deben estar sincronizadas para que en el momento de la R haya suficiente cantidad de histonas para formar la cromatina. Las histonas, a diferencia del DNA se replican de forma conservadora, es decir, los octámeros de la molécula progenitora no se disocian para volver a formarse con otras histonas recién sintetizadas. Hay otro aspecto que aclarar: ¿Cómo se distribuyen los octámeros paternos entre las moléculas hijas? ¿Se distribuyen indistintamente entre las dos moléculas hijas o están localizados sobre una de ellas?. Para resolver esta cuestión se llevó a cabo el siguiente experimento (Figura 25): Se añade cicloheximida a células en crecimiento, con lo cual se interrumpe la síntesis de proteínas pero no la de DNA. La R del DNA continúa a pesar de que no se sinteticen nuevas histonas. En este caso, la HR aparece con una de las moléculas hijas asociada a histonas y con la otra "desnuda", es decir no asociada a histonas (Figura 25). Los octámeros de la molécula progenitora se asocian a una sóla de las moléculas hijas, que parece ser la hebra guía. Si la R es bidireccional, el punto donde se juntan los octámeros de histona marca el punto de origen de la R (Figura 25).

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