TEMA 8.- TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE DNA.
1.-Tecnología del DNA recombinante 2.- Herramientas básicas necesarias para el conocimiento y modificación del DNA 3.- Marcadores moleculares aplicados a la identificación genética
TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE 1973 - Berg, Boyer y Cohen – Primeros experimentos de DNA recombinante con los que introducen Genes en E.coli
Unión artificial de DNA de distintos orígenes
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Utilizacion: Clonación de genes es decir obtener copias del mismo PRIMER PASO: PASO cortar DNA que se quiere clonar y el vector que se va a utilizar con enzimas de restricción
PLÁSMIDO
GEN
(otro tipo de vector)
SEGUNDO PASO: LIGACIÓ LIGACIÓN. Mediante un enzima denominado ligasa se unen el
vector y el fragmento de DNA
+
MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE
TERCER PASO: Introducción de la molécula de DNA recombinante en las células procariotas o eucariotas correspondientes para la obtención de numerosas copias Procariotas: transformación, conjugación Eucariotas: Electroporacion microinyección, vectores virales, proyectiles de DNA
HERRAMIENTAS BÁ BÁSICAS NECESARIAS PARA EL CONOCIMIENTO Y MODIFICACIÓ MODIFICACIÓN DEL DNA
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN VECTORES DE CLONACIÓN GENOTECAS IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS PCR MARCADORES MOLECULARES
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN …FINALES DE LOS 60
¿Cómo era posible que algunas bacterias resistiesen la invasión de ciertos virus?
El DNA del virus se introduce en la bacteria, donde se corta en pequeños fragmentos inactivándose
Demostraron que las bacterias sintetizaban endonucleasas que cortaban el ADN en una secuencia corta y específica
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN - Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural - Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena - Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8 - Reconocen secuencias palindrómicas y el corte es simetrico AAGCTT TTCGAA
Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus
influenzae
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PUEDEN CORTAR DE DOS FORMAS: EXTREMOS COHESIVOS
EXTREMOS ROMOS
ALGUNOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE LOS MILES (>3000) QUE SE HAN AISLADO.. NOMENCLATURA: 1 letra del Genero, 2 letras de la especie, 1 letra de la cepa (Opcional) y 1 numero romano ( si existen mas de una) ALU I – primera enzima de restricción de Arthrobacter Luteus
Extremos romos
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VECTORES DE CLONACIÓN Características generales: - Replicación autónoma - Mapa de restricción conocido: un único punto de corte - Tengan marcadores selectivos: - resistencia a antibióticos - cambios de color - De fácil recuperación TIPOS:
-
Plásmidos Fago λ Cósmidos YACs BACs
Clonación de fragmentos de hasta 10 kb
PLÁSMIDOS
-ADN doble y circular -Replicación autónoma; información no vital -Pueden conferir resistencia a antibioticos -Posibilidad de integración en cromosoma principal bacteriano → EPISOMA -Tamaño variable: 1 a 500Kb
FAGO λ EXTREMOS COS
Clonación de fragmentos de hasta 25 kb DNA doble hélice lineal con ~ 48.000 pb infecta E. coli extremos cohesivos complemenaria)
(COS):
extremos
5’
monocatenarios
(12
nucleótidos
de
secuencia
5
Cósmidos Clonación de fragmentos de hasta 45 kb
Vectores híbridos Fago λ + plásmido
BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) Clonación de fragmentos de hasta 300 kb
YACs (Yeast Artificial Chromosomes) Clonación de fragmentos de hasta 1000 kb
CONSTRUCCIÓN DE GENOTECAS - Clonación de todas las secuencias del genoma de una especie - Presente al menos una copia de cada gen o fragmento de DNA - Numero de clones necesarios depende de - Tamaño del inserto - Tamaño del genoma
Fórmula de Clarke y Carbon N= Ejemplo -E.coliTamaño: 4.300 Kb P= 0,95
ln (1 - p) ln (1 - f )
N= nº de clones necesarios P= probabilidad de tener el genoma completo F= tamaño medio del inserto/ tamaño genoma
1300 plásmidos 300 cósmidos 130 BACs 12 YACs
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IDENTIFICACIÓN DE CLONES O SECUENCIAS ESPECÍFICAS
PARA PODER IDENTIFICAR, AISLAR Y TRABAJAR CON LAS SECUENCIAS CLONADAS… TODOS LOS MÉTODOS SE BASAN EN LA HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NÚCLEICOS
TRANSFERENCIA del ácido nucleico a una membrana o soporte físico (“blotting”)
+ HIBRIDACIÓN CON UNA SONDA SONDA: Fragmento de DNA de secuencia conocida que hibridará por complementariedad
OTROS TIPOS DE HIBRIDACIÓN PARA AISLAMIENTO DE SECUENCIAS SOUTHERN BLOTTING Digestión del DNA con enzimas de restricción Separación mediante electroforesis
NORTHERN BLOTTING Similar a Southern blot pero para identificación de secuencias de RNA
SLOT/DOT BLOTTING. No se realiza electroforesis, simplemente se deposita y se transfiere a soporte sólido
HIBRIDACION IN SITU. Hibridación en preparaciones histológicas o células en cultivo
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HASTA AHORA HEMOS HABLADO DE CLONAR DNA… existe otra forma de “clonación de DNA”
PCR ¿Qué es?
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA FORMA DE CLONACIÓN “ IN VITRO” FOTOCOPIADORA MOLECULAR
Técnica que nos permite amplificar o clonar selectivamente un segmento específico de DNA, hasta obtener una cantidad suficiente para su posterior manipulación
¿Cuáles son los fundamentos? EXTENSIÓN DEL CEBADOR: La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde DNA Polimerasa 5’
3’ dNTPs
5’
dTTP dATP dGTP dCTP
+
Mg
++
3’
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EXTENSION DEL CEBADOR Utilizando dos cebadores que son complementarios a los extremos 3’ del fragmento de DNA de doble cadena que queremos amplificar
3’
5’
DNA polimerasa
DNA Polimerasa 5’
3’
REPETICIÓN “n” VECES DE UN CICLO CONSTITUIDO POR TRES ETAPAS
DESNATURALIZACIÓN
HIBRIDACIÓN DE LOS CEBADORES
C i c l o 1
EXTENSIÓN
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“n CICLOS”: ciclo 3
“n CICLOS”: ciclo 5
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La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR, Después de cada ciclo, la cantidad de DNA es dos veces la del ciclo anterior.
Después de: - 2 ciclos tenemos 2 x 2 - 3 ciclos - 2 x 2 x 2 - 4 ciclos 2 x 2 x 2 x 2 Así, después de ciclos de N ciclos tendremos 2N. Pero la reacción no puede mantenerse indefinidamente, se alcanza una fase de meseta, según lo demostrado en las cifras que aparecen en rojo.
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MARCADORES MOLECULARES
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA Patógenos Test de paternidad
Trazabilidad
Autentificación de productos
Diagnóstico de patologías
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA: Bases moleculares Los animales presentan diferencias en su ADN, a excepción de los gemelos monocigóticos o los clones. ¿CÓMO SE GENERA ESTA GRAN VARIACIÓN GENÉTICA? •Mezcla de cromosomas de origen paterno y materno en cada generación en las especies de reproducción sexual. • Recombinación genética que permite el intercambio de fragmentos de cromosomas homólogos en la meiosis. •Mutaciones que suponen cambios de bases o bien adición o pérdida de algunas de ellas. Causar patologías
Generar variabilidad
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• RFLPs : Polimorfismos tamaño de los fragmentos de restricción • Microsatélites: repeticiones de un pequeño número de bases • RAPDs : Random amplified polymorphic DNA • SNPs: Single nucleotide polymorphisms •…
Para su detección : amplificación por PCR
RFLPs : Polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción Origen: mutaciones delecciones insercciones reordenaciones
CARACTERÍSTICAS • Detectables por PCR • Bialélicos • Muy abundantes • Ampliamente distribuidos por el genoma • Codominancia • Alta reproducibilidad
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Ejemplo RFLP _ 199 pb 165 pb
34 pb
+ CC
Ampl.
TT
CT
_
+
1
2
3
4
5
6
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MICROSATÉLITES Secuencias del genoma que consisten en repeticiones de 1 a 6 pb.
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MICROSATÉLITES - Características - Su polimorfismo radica en el número de repeticiones
- Altamente polimórficos ( nº medio de alelos 10) - Se han encontrado en todas las especies conocidas - Muy numerosos y bien distribuidos por el genoma - Posibilidad de hacer multiplex : amplificar varios micros a la vez
TGLA227
TGLA126
ETH225 BM2113 TGLA122
BM1824
INRA23 ETH10
SPS115
TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227
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RAPDs (Random ampliflied polymorphic DNA) Ventajas • Se utilizan primers diseñados al azar. • Generalmente de pequeño tamaño (10-12 nucleótidos) • No es necesario el conocimiento previo de la secuencia
El mayor inconveniente puede ser su baja reproducibilidad
SNPs (single nucleotide polymorphisms) Son mutaciones, debidas a la variación de un nucleótido. A
C
G
A
C
A
A
C
G
T
C
A
A
C
G
A
C
A
A
C
G
A
C
A
A
C
G
T
C
A
A
C
G
T
C
A
cerdo 1
cerdo 2
cerdo 3
AA
TT
AT
C/C
C/T
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SNPs Características • Variación muy frecuente (1 cada 1000bp) • Dos posibles alternativas en cada individuo • Herencia muy estable ( t. mutación 10-6) • Fácil estandarización • Posibilidad de automatización
MARCADORES GENÉTICOS APLICADOS A LA IDENTIFICACIÓN
Un marcador de ADN, para ser utilizable en identificación genética, necesita reunir una serie de características: • Que sea muy polimórfico, • Que esté distribuido por todo el genoma. • Que tenga un bajo coste tanto en la obtención como en la
aplicación
• Que sea público . • Que sea fácilmente interpretable de una forma objetiva. • Que requiera poca cantidad y calidad de muestra a partir de la que se obtendrá el ADN. • Que sea fácilmente intercambiable entre laboratorios • Que sea automatizable para aumentar el rendimiento y abaratar los costes. • Que sea estable