TEMA 1 MICROORGANISMOS Se localizan en todas partes. La enorme cantidad y diversidad hace necesaria su clasificación. Se hallan en tres de los cinco reinos (Whitlaker 1969). • Moneras.− bacterias y cianobacterias. • Protistas. − algas unicelulares y protozoos. • Hongos o Fungi.− mohos y levaduras. • Virus. MONERAS Son procariotas, unicelulares, no poseen núcleo definido. • Bacterias.− se clasifican según: Su forma: Cocos, bacilos, espirilos, espiroquetas y vibrio. Su metabolismo: fuentes de carbono; autótrofos, heterótrofos. • Fuentes de energía; fotosintéticas, quimiosintéticas. ♦ Autótrofos−fotosintéticos.− bacterias púrpuras y verdes sulfureas. ♦ Autótrofos−quimiosintéticos.− bacterias nitrificantes del azufre y del CH4, ciclos biogeoquímicos, reciclaje de la materia . ♦ Heterótrofos saprófitos.− reciclaje de la materia , uso alimentario industrial. ♦ Heterótrofos simbióticos− bacterias intestinales. ♦ Heterótrofos parasitarios.− bacterias de la sífilis, cólera, tuberculosis. ♦ Cianobacterias.− microorganismos acuáticos con pigmentos verde azulados que les permite captar luz para realizar la fotosíntesis. • Enriquecimiento en O2 de la atmósfera. • Contribuyen ala fijación del nitrógeno atmosférico en le medio acuático. • Forma líquenes en asociación con hongos, en el medio terrestre. PROTISTAS Unicelulares y pluricelulares, son los mas diversificados de los eucariotas. Según el tipo de nutrición : • Autótrofos fotosintéticos.− algas unicelulares. • Habitan en medios acuáticos o lugares húmedos, simbiosis con hongos (líquenes) o animales como las esponjas. • Viven libres o en colonias. • Clasifican por los pigmentos fotosintéticos y la sustancias de reserva que acumulan. 1

• Heterótrofos.− protozoos. • Características de animales como la captura y digestión del alimento primeros animales. • Vida libre en agua , suelo o materia orgánica , parásitos causantes del paludismo, disentería ,etc HONGOS O FUNGI • Peculiares características, en parte, propias de animales y, en parte, de vegetales. • Carecen de clorofila y se reproducen generalmente por esporas. Son heterótrofos saprofitos. Descomponedores de la materia orgánica. • Importancia en el medio ambiente: ♦ El descomponer la materia orgánica desempeñan un papel relevante como recicladores en los ecosistemas terrestres. ♦ En ocasiones pueden causar perdidas económicas si atacan a los alimentos o a la madera. • Son de gran importancia para la industria: ♦ Fermentaciones industriales: producción de pan, cerveza, vino. ♦ Producen antibióticos. • Se dividen en dos grandes grupos: ♦ Mohos: Pluricelulares ◊ Cuerpo vegetativo formado por hifas (filamentos celulares con paredes de celulosa, quitina o ambas) que constituyen el micelio. ◊ Soportan condiciones extremas como altas concentraciones de azúcar, acidez extrema o falta de humedad. ◊ Ejemplo: Rhizopus sp. En pan, frutas etc. De aspecto algodonoso. Penicillium sp. Productor de penicilina. (sp. Que hay varias especies) ♦ Levaduras: Unicelulares ◊ Reproducción por gemación. ◊ Ampliamente distribuidas por la naturaleza. ◊ Algunas son patógenas de animales y vegetales. ◊ Muy utilizadas en procesos fermentativos. ◊ Modelo para el estudio de procesos metabólicos. Investigación. ◊ Ejemplos: Saccaharomyces cerevisiae, responsable de la fermentación alcohólica. ◊ Son de fácil cultivo e interesantes por ser eucariotas igual que las células humanas. VIRUS ◊ Es un grupo aparte. No se consideran seres vivos. ◊ Carecen de metabolismo por ello son parásitos intracelulares obligados de animales, plantas u otros microorganismos. ◊ Clasificación por el tipo de material genético que presenten (ADN o ARN) TEMA 2 MEDIOS DE CULTIVO. CLASIFICACIÓN Y PREPARACIÓN 1. INTRODUCCIÓN Para estudiar adecuadamente los microorganismos se deben crecer en un medio de cultivo en condiciones de laboratorio.

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Medios de cultivo: • Nutrientes • Condiciones físicas Usos de los medios de cultivo: • Separación y aislamiento de microorganismos presentes en una muestra. • Paso previo para el estudio de identificación de un microorganismo. • Conocer el tipo de metabolismo que presentan en función del nutriente o sustrato que utiliza o metabolito que produce. • Estudios macroscópicos. Visualizar colonias en medio sólido. • Realización de antibiogramas. Prueba de resistencia a antibióticos. • Pruebas de CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) Prueba de resistencia a antibióticos. • Para la conservación de cepas. 2. REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS Y NO ENERGÉTICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 2.1 REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Son útiles para la identificación bioquímica del microorganismos y consiguiente clasificación taxonómica del mismo. FUENTES DE CARBONO: • Sustancias muy sencillas: ácido acético, alcohol, citrato sódico, etc.) • Mono y disacáridos: glucosa, lactosa etc. (Mayoría de los casos) • Glúcidos más complejos: almidón , etc. • Metano, benceno, hidrocarburos, etc. FUENTES DE NITRÓGENO: • Proteínas (gelatina, extractos de carne, sales de amonio, etc.) • Péptidos, peptonas (extractos de levadura, bio−Thione, caseína, peptona papaínica de soja, etc.) • Nitratos nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de amonio, etc. 2.2 REQUERIMIENTOS NO ENERGÉTICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO FUENTES DE AZUFRE: • Sulfatos (mayoría de los casos) • Tiosulfatos. • Aminoácidos (metionina, tiamina, etc.) FUENTES DE FÓSFORO: • Fosfatos. IONES METÁLICOS: utilizados a concentraciones muy bajas. • Sodio, potasio, magnesio, hierro

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FACTORES DE CRECIMIENTO: No todas las bacterias son capaces de crecer sobre medios donde se encuentran cubiertas las necesidades elementales. Les hacen falta componentes que no son capaces de fabricar por sí solas en su crecimiento. • Vitaminas. • Bases púricas, pirimidínicas. FACTORES DE ARRANQUE: permiten a las bacterias salir de su fase de latencia y comenzar la fase de crecimiento exponencial. • Glucosa • Algún ión, etc. FACTORES INHIBIDORES: impiden el crecimiento de algún microorganismos por bloqueo de sus procesos metabólicos. • Azida sódica • Antibióticos • Eosina azul de metileno 3. CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario: • Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo. • Unas condiciones físico−químicas apropiadas. CONDICIONES: ♦ Temperatura: ◊ Psicrófilos <20ºC

♦ Mesófilos 18−45ºC ♦ Termófilos > 45ºC ♦ Grado de humedad: cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento. ♦ pH: ◊ Óptimo: pH 7 ◊ Tiobacilos. PH 0 ◊ Proteus pH 8, Vibrio cholerae pH 9 ♦ Presión osmótica: se usan condiciones, en general, de isotonía aunque muchas bacterias pueden crecer a condiciones algo superiores. ◊ Bacterias que pueden crecer en medios muy acuosos e hipotónicos, poseen pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y ésta se rompa. ◊ Bacterias halófilas; Staphylococcus crece con alta concentración de sal. Son causas excepcionales ya que las bacterias no suelen aguantar altas concentraciones salinas, de ahí que la salación sea un método de conservación de alimentos. ◊ Bacterias halófilas facultativas: bacterias que pueden crecer con o sin sal en el medio. ♦ Oxígeno ◊ Cantidad suficiente: aerobio (metabolismo oxidativo) ◊ Crear ambientes microacrófilos con cantidades suficientes de dióxido de carbono: anaerobio facultativo (metabolismo fermentativo) ◊ Ausencia de oxígeno: anaerobio estricto ♦ Dióxido de carbono: para fotoautótrofos y quimioautótrofos ( por aireación) 4

♦ Luz: para fotosintéticos 4. PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO 4.1 MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PROPORCIÓN EN AGUA • Medios sólidos: proporción de agar siempre por encima del 1,5% • Medios líquidos o caldos: no contienen agar. • Medios semisólidos: proporción en agar inferior al 0,5% 4.2 MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU USO O UTILIZACIÓN • Medios para aislamiento para obtener colonias aisladas ♦ Medios enriquecidos o de enriquecimiento: llevan componentes que facilitan el crecimiento de algún tipo de microorganismo. Normalmente se usa este el primero. Son líquidos. ♦ Medios selectivos: llevan componentes que impiden el crecimiento de algún tipo bacteriano estableciendo con ello una selección del tipo de microorganismos. Se usan para seleccionar el microorganismo buscado. ♦ Medios diferenciales: tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y lo que es más característico, presentan sustancias que al ser utilizadas por las bacterias dan una información suplementaria y especifica o diferencial. Ponen en relieve propiedades que el microorganismo posee. En una misma placa diferencia dos tipos de microorganismos. • Medios generales o para el crecimiento general: sirven para el crecimiento de la mayor parte de las bacterias. • Medios de mantenimiento de cepas: tienen los nutrientes necesarios para mantener las cepas durante un período de tiempo relativamente largo manteniéndose a temperaturas suficientemente bajas en cada caso para impedir su crecimiento. Ej: leche. 4.3 MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU COMPOSICIÓN • Medios naturales: Los componentes se encuentran en la naturaleza: huevo, patata, suero sanguíneo, etc. Son muy poco utilizados. • Medios semisintéticos: Parte de su composición corresponde a extractos naturales a los que se añaden constituyentes sintéticos. • Medios sintéticos: Tiene estructuras sintéticas más o menos puras y químicamente definidas. Son los más utilizados en bacteriología. • Medios complejos: Actualmente son de uso restringido en bacteriología, pero su uso es habitual en parasitología y virología. Se preparan de forman compleja a partir de tejidos animales y más raramente vegetales. Su composición no es rigurosamente constante. 4.4 MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PRESENTACIÓN

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• Medios deshidratados o liofilizados: Adición de agua en el laboratorio. • Medios sólidos en placas petri: Viene ya preparados comercialmente. Un inconveniente es que tienen unas fechas de caducidad cortas. • Medios sólidos en tubo: Con agar inclinado y solidificados para aumentar la superficie. • Medios líquidos en tubo: Para aumentar la concentración de microorganismos inoculados y para pruebas bioquímicas. • Medios semisólidos en tubo: Para aumentar la concentración de microorganismos inoculados y para pruebas bioquímicas. • Medios de doble fase en frasco: Están constituidos por una fase sólida y otra líquida, se usan para la detección rápida de microorganismos en sangre) 5. TIPOS DE CULTIVO ♦ Cultivo estático División y crecimiento bacteriano que consta de varias fases: • Fase de latencia: tiempo necesario para la adaptación de las bacterias al medio donde se siembran. Aumenta el volumen pero no se dividen. • Fase exponencial de crecimiento : las bacterias se multiplican a velocidad constante y exponencial, la actividad metabólica es máxima y la sensibilidad a los agentes, químicos, agentes antimicrobianos y fagos es óptima en esta fase. • Fase estacionaria: el número de células que nacen es igual al que mueren. • Fase de muerte: las condiciones del medio se vuelven adversas y las bacterias mueren. ♦ Cultivo continuo: Se añade un medio de cultivo a la población microbiana al tiempo que se va sacando una cantidad igual de suspensión bacteriana. En las industrias se usan Quimiostatos y Turbidostatos para realizar estas pruebas. TEMA 3 SIEMBRAS. CULTIVO DE CEPAS 1. INTRODUCCIÓN

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Para poder estudiar debidamente los microorganismo, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto, inicialmente deber ser aislados. Las muestras suelen presentar los siguientes problemas: • Que no exista cantidad suficiente del microorganismo que se busca. • Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros. Aislamiento: método directo sobre placa usando un medio selectivo solidificado una vez separadas las colonias se reaíslan volviéndose a sembrar en placa: • Siembra por estría • Siembra en profundidad 2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIÓN ♦ Asas de siembra: asas de platino, acero−inoxidable o cromo−níquel que presentan un arco bastante cerrado en su extremo, cuyo diámetro es más o menos especifico (0´01ml). Se esteriliza por flameado. Uso: inoculación o siembra por estría en medios sólidos, picadura en sólidos y semisólidos y siembra en medios líquidos. ♦ Hilos de platino: similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, únicamente es un hilo. Uso: siembra por picadura en medios sólidos y semisólidos. ♦ Asas de Digrosky: asas de vidrio o platino con forma de triángulo más o menos abierto. Uso: extender el inóculo líquido. Se esterilizan en estufa Pasteur autoclave y sobre todo metiéndolo en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa. ♦ Hisopos: se utilizan para toma de muestras. En muchos casos llevan un medio incorporado que permite transportar la muestra sin que éste sufra desecación, deterioro o contaminación. Se suelen comercializar ya estériles, listos para utilizar y desechables. ♦ Pipetas: ◊ Vidrio (esterilizadas) o plástico (desechables) ◊ Graduadas (volúmenes específicos), Pasteur (no graduadas) y micropipetas (microlitros 10−3ml) las pipetas con aspirador pera o eléctrico y las Pasteur con chupete. 3. MÉTODOS DE INOCULACIÓN O SIEMBRA 3.1 SIEMBRA DEL INÓCULO EN MEDIO LÍQUIDO ♦ Con asa de siembra ♦ Con pipeta ♦ Con escobillón o hisopo. ♦ Técnica de Barry Añadir el inóculo al medio con líquido a 45−50ºC, se agita en placa 10 veces arriba abajo a los lados y 10 veces en círculos en ambos sentidos. ♦ Siembra de la muestra líquida en placa con asa de Digrasky Siembra en placa con pipeta y se extiende con asa Digrasky. ♦ Siembra por agotamiento o aislamiento en estría 7

♦ Siembra por agotamiento Lo normal son 3 estrías pero se puede hacer hasta 5. ♦ Técnica de los 4 cuadrantes Dar pases. Se divide la placa en 4 y se siembran 4 bacterias 3.2.2 SIEMBRA DEL INOCÚLO EN TUBO ♦ Siembra pos estría en tubos con medio sólido inclinado ♦ Siembra por picadura ♦ Siembra por picadura y estría Primero picadura y segundo estría. TEMA 4: TÉCNICAS DE DESCONTAMINACIÓN: LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN. 1. INTRODUCCIÓN Limpieza: eliminación de toda materia extraña de los objetos. Se lleva a cabo con agua, detergentes y acción mecánica. La limpieza debe preceder siempre a todo procedimiento de desinfección y esterilización. Desinfección: elimina la mayoría de los microorganismos de los objetos, con la excepción de las esporas bacterianas. Se usan desinfectantes. Esterilización: es la completa eliminación o destrucción de todas las formas de vida microbiana. 2. APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE LIMPIEZA Como ya hemos dicho se usan detergentes, estos contienen en su gran mayoría agentes de superficie tensioactivos. Agentes de superficie tensioactivos: son constituyentes esenciales de los productos de limpieza ya que aportan las propiedades mojantes, espumantes, detergentes solubilizantes y antiespumantes en función de su estructura. Clasificación: ◊ Aniónicos: jabones, alquilsulfatos. ◊ Catiónicos: malos detergentes, excelentes bactericidas. ◊ Ni iónicos (sin carga): poderosos emulsionantes con acción espumante prolongada. ◊ Anfóteros (dependen del pH del medio): normalmente usados para jabones de baño/ducha. 3. DESINFECCIÓN 3.1. DESINFECCIÓN: MÉTODOS FÍSICOS 8

◊ Hervido, ebullición, pasteurización: utilizan el calor por ebullición del agua. ⋅ Temperatura alcanzada oscila entre 65ºC y 95ºC ⋅ Tiempo entre un minuto y una hora, siendo más largo cuanto menor es la temperatura alcanzada. ◊ Radiación ultravioleta: utiliza las radiaciones que oscilan entre 2.000 y 3.000 Å. Tienen un efecto letal de los microorganismos que se encuentran a una distancia corta del foco emisor. ◊ DESINFECCIÓN: MÉTODOS QUÍMICOS Se basan en al utilización de una amplia gama de productos (generalmente líquidos) con poder antibacteriano. Algunos son bacteriostáticos (paralizan las bacterias, hacen que no se multipliquen) y otros bactericidas o incluso destruyen hongos y virus. MODALIDAD: ⋅ Inmersión ⋅ Pulverización ⋅ Loción ⋅ Fumigantes ⋅ Aerosoles ⋅ Brumas Estos tres últimos se usan para desinfectar ambientes y suelen necesitar aparatos apropiados. ◊ CONTROL DE LA DESINFECCIÓN ⋅ Aire: • MAS 100 (aparato de MERK): mide los microorganismo del aire. Realiza un recuento en placa de bacterias, también mide mohos y levaduras. Máximo: 5.000 UFC/m3 ⋅ Superficies: Se utilizan dos hisopos: • Hisopo mojado en suero fisiológico • Hisopo seco Ambos se pasan por la superficie del anillo y después se colocan en una solución fisiológica (0,9%) y se llevan al stomacher (no necesario). Anillo de plástico rojo de 35 cm de diámetro. 4. ESTERILIZACIÓN AGENTE

SISTEMA ESTERILIZACIÓN CALOR SECO

FÍSICO

MÉTODO Incineración, flameado, estufa Pasteur, hormo Poupinell. CALOR HÚMEDO Autoclave RADIACIONES Ionizantes (Rayos y) No ionizantes (Rayos ultravioleta 9

FILTRACIÓN

QUÍMICO

GASES

LÍQUIDOS

e infrarrojos) Membranas filtrantes Filtros laminares Óxido de etileno, peróxido de hidrógeno, ácido peroxiacético, gas plasma, combinación gas plasma y otros agentes Glutaraldehído

4.1 ESTERILIZACIÓN: MÉTODOS FÍSICOS ⋅ Calor seco: • Incineración: hornos crematorios o incineradoras que esterilizan y destruyen el material • Flameado: esterilizar asas de siembras. Llama de alcohol o mechero Bunsen (más de 2500ºC) • Horno Pasteur o estufa Poupinell: proceso basado en la circulación de aire caliente en un aparato de acero inoxidable sometido a una elevada temperatura regulada por un termostato. Mecanismo de destrucción de los microorganismos: desecación por el calor. Dos horas a 160−180ºC. Se usa para material termoresistente. ⋅ Calor húmedo: • Autoclave o estufa de vapor: 1 atmósfera, 20 minutos a 120ºC. Mecanismo de destrucción de los microorganismos: desnaturalización y posterior lisis de sus proteínas. Los microorganismos se reproducen entre −5ºC y 80ºC. Pero las formas de resistencia o esporas soportan más temperatura. ♦ Limitaciones: Materiales termolábiles, sustancias inmiscibles en agua (grasas, etc) en los que la penetración del vapor es muy limitada, sustancias termolábiles 9 Cada tipo de microorganismo podrá crecer en un medio de cultivo determinado.

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