Simposium Internacional de Resistencia a Pesticidas en Artrópodos: Un Enfoque Toxicológico y Molecular. Manzanillo, Colima, México. Mayo 2006.

SIMPOSIUM INTERNACIONAL DE RESISTENCIA A PESTICIDAS EN ARTROPODOS: UN ENFOQUE TOXICOLOGICO Y MOLECULAR

LA

PUBLICACIÓN DE ESTE VOLUMEN SE LLEVÓ A CABO CON EL APOYO DE LA FUNDACIÓN PRODUCE Y

ACCESORIOS

PARA

GUERRERO

L A B O R A T O R I O S S. A.

E DITORES R ODRIGO R OSARIO C RUZ E LIAS H ERNANDEZ C ASTRO D ELIA I NÉS D OMINGUEZ G ARCÍA

i

DE

C.V.

Simposium Internacional de Resistencia a Pesticidas en Artrópodos: Un Enfoque Toxicológico y Molecular. Manzanillo, Colima, México. Mayo 2006.

DIRECTORIO SOCIEDAD MEXICANA DE ENTOMOLOGIA CÁNDIDO LUNA LEÓN Presidente J O R G E R. P A D I L LA R A M I R E Z Primer Vicepresidente S E R G I O G. S T A N F O R D C A M A R G O Segundo Vicepresidente MARCELA IBARRA Secretaria J O S E L U I S R O S A S A C EV E D O Tesorero

COMITE ORGANIZADOR DEL SIMPOSIUM D R . R OD R I G O R O S A R I O C R U Z Presidente P R O F R . S A N T O S A N D R A D E C OR TÉ S Vicepresidente D R . E L I A S H E R N A N D E Z C A S TR O Secretario ING. FRANCISCO GARCÍA SANCHEZ Vocal COMITE CIENTIFICO D R . R U B ÉN H E R N Á N D E Z O R T Í Z D R A . C ON SU EL O A L M A ZÁ N G A R C Í A DR. ROGER IVAN RODRIGUEZ VIVAS M.

EN

C. D E L I A I N ÉS D OM ÍN G U E Z G A R C Í A

M.

EN

C. J U A N P É R E Z S A L GA D O

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INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS DR. PEDRO BRAJCICH GALLEGOS Director General DR. SEBASTIÁN ACOSTA NUÑEZ Coordinador de Planeacion y Desarrollo DR. EDGAR RENDÓN POBLETE Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculacion LIC. MARCIAL GARCÍA MORTEO Coordinador de Administración y Sistemas

CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN DISCIPLINARIA EN PARASITOLOGÍA VETERINARIA DR. ZEFERINO S. GARCÍA VÁZQUEZ Director del Centro

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO DR. ARTURO CONTRERAS GÓMEZ Rector de la Universidad Autónoma de Guerrero DR. AGUSTÍN DAMIÁN NAVA Director General de Integración de las Funciones Sustantivas de la UAG DR. JAVIER SALDAÑA ALMAZÁN Director General de Planeación y Evaluación Institucional de la UAG DR. MIGUEL ZAVALETA REYEZ Director General de Gestión de los Recursos Estratégicos de la UAG M. EN C. ANGEL CARRILLO CHORA Director general del Desarrollo de los Recursos Humanos de la UAG DR. OSCAR CESAR ALVARADO AVALOS Director General de Innovación de la Red Académica

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FUNDACION PRODUCE GUERRERO A.C. PROFR. SANTOS ANDRADE CORTÉS Presidente ING. FRANCISCO GARCÍA SÁNCHEZ Gerente

ASOCIACION MEXICANA DE PARASITOLOGOS VETERINARIOS A.C. D R . P ED R O M E N D O ZA Presidente DR.

DE

GIVES

ROSARIO CRUZ Secretario

RODRIGO

MVZ. F R A N C I S C O M A R T Í N E Z I B A Ñ E Z Tesorero

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SIMPOSIUM INTERNACIONAL DE RESISTENCIA A PESTICIDAS EN ARTROPODOS: UN ENFOQUE TOXICOLOGICO Y MOLECULAR

CONFERENCISTAS INVITADOS

D R . Z E F E R I N O G A R C Í A V Á ZQ U E Z CENID-PAVET INIFAP MVZ. M A R T Í N O R T Í Z E S T R A D A NOVARTIS México D R . R O B ER T J. M I LL E R Agricultural Research Services USDA D R . A N T HO N Y J. C O R N E L Department of Entomology University of California Davis USA D R . R OD R I G O R O S A R I O C R U Z CENID-PAVET INIFAP D R . N I C H O L A S N. J O N S S ON School of Veterinary Science University of Queensland, Australia D R . R U B ÉN H E R N Á N D E Z O R T I Z CENID-PAVET INIFAP D R A . C ON SU EL O A L M A ZÁ N G A R C Í A Fac. de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad Autónoma de Tamaulipas

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No esta permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, por fotocopia, por registro o por otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares. La información contenida en cada uno de los capítulos es responsabilidad de los autores. Derechos reservados 2006, Instituto Nacional De Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. Serapio Rendón 83 Col. San Rafael Del. Cuauhtémoc C. P. 06470 México, D.F. Tel. (55) 5140 1600 Primera edición 2006 Impreso en México Esta obra se terminó de imprimir En Mayo del 2006 Editores de la publicación Dr. Rodrigo Rosario Cruz. Dr. Elías Hernández Castro. M. en C. Delia Inés Domínguez García. ISBN: en trámite.

Libro técnico No. 1, Mayo del 2006 CENID-PAVET INIFAP Km. 11.5 Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla Col. Progreso Apdo. Postal 206 CIVAC 62500 Morelos Teléfono: (777) 319 2850 ext 123 Fax: (777) 319 2850 ext 129 Correo electrónico: [email protected]

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CONTENIDO Página I. Contenido ........................................................................................................ 1 II. Prólogo........................................................................................................... 2 III. Agradecimientos........................................................................................... 3 IV. Epidemiología de la Resistencia a los Ixodicidas en México. Dr. Zeferino García Vázquez ................................................................. 4 V. Avances en el Diagnóstico de la Resistencia a Insecticidas en Mosquitos Transmisores de Malaria en Africa. Dr. Anthony J. Cornel........................................................................... 12 VI. Uso de Sinergistas en la Identificación de Mecanismos de Resistencia Metabólica en la Garrapata Boophilus microplus. Dr. Robert J. Miller............................................................................... 29 VII. Amitraz Resistance in Boophilus microplus in Australia: Progress in Diagnosis and Epidemiology. Dr. Nick N. Jonsson.............................................................................. 36 VIII. Resistencia al Amitraz en Boophilus microplus en Australia: Avances en la Epidemiología y el Diagnóstico. Dr. Nick N. Jonsson.............................................................................. 42 IX. Diagnóstico Molecular de la Resistencia a Piretroides en la Garrapata Boophilus microplus en México. Dr. Rodrigo Rosario Cruz....................................................................... 49 X. Avances en el Control Inmunológico de la Garrapata Boophilus microplus. Dr. Rubén Hernández Ortiz. ................................................................. 56 XI. La Genómica Funcional y el Desarrollo de Vacunas Contra Artropódos de Importancia Veterinaria. Dra. Consuelo Almazán García. ........................................................... 65 XII. Comisión de Parasiticidas (SAGARPA-INFARVET-CNOG): Antecedentes y Situación Actual. M. en C. Noé Soberanes Céspedes. ...................................................... 71 1

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PROLOGO Las garrapatas forman parte de un complejo en el cual participan, como vectores de enfermedades, que no solo afectan al ganado, sino que le causan eventualmente la muerte, debido a los efectos directos ocasionados por la conducta hematófaga de este artrópodo, y por los efectos indirectos producidos por las enfermedades transmitidas por el vector, lo cual invariablemente se refleja en los altos costos de producción, debidos al uso constante de parasiticidas para controlar tanto a las garrapatas como a las enfermedades que transmiten. Por esta razón, y en este renglón en particular, gracias a la entusiasta y desinteresada colaboración de cada uno de los participantes en este simposio, y la de la Sociedad Mexicana de Entomología, las instituciones participantes, como el Comité de Parasiticidas, El Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias, la Universidad Autónoma de Guerrero y la Fundación Produce Guerrero A.C., han conjuntado esfuerzos e invertido un tiempo valioso para contribuir con el desarrollo de la ganadería nacional, y con la difusión de los avances tecnológicos más novedosos en esta área del conocimiento, en la cual, cada uno de los ponentes, han hecho aportaciones importantes, que han contribuido a la comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la resistencia a las diferentes familias de pesticidas en este vector, con la meta final de generar la infraestructura diagnóstica que nos permita predecir la aparición de la resistencia y mitigar sus efectos a partir de la aplicación de estos conocimientos básicos, aplicados en el campo, logrando con esto, regresar los conocimientos a los productores que con su trabajo han hecho posible la realización de este tipo de investigaciones. Con este propósito en mente, este libro, pretende poner al alcance de científicos, académicos, estudiantes, técnicos y agentes de cambio de nuestro país la información sistematizada y actualizada de este esfuerzo colectivo de investigación con el fin de desarrollar nuevas tecnologías diagnósticas que nos permitan de manera masiva estudiar la resistencia desde el punto de vista de la Epidemiología Molecular, con el propósito final de generar opciones diagnósticas rápidas y confiables.

Dr. Rodrigo Rosario Cruz

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AGRADECIMIENTOS El Comité Organizador de este Simposium agradece infinitamente la participación entusiasta de todos los conferencistas, así como a las Instituciones que representan, por otorgarles, las facilidades para asistir a este evento. Al Comité de Parasiticidas, de la Cámara Nacional de la Industria Farmacéutica Veterinaria, por el apoyo brindado, para hacer posible la participación del Dr. Robert J. Miller, en este Simposio. A todos los participantes nacionales e internacionales, por su gran contribución en la organización de este evento. A la entusiasta participación de el Dr. Elías Hernández del Posgrado de Producción Agropecuaria de la FMVZ y al M. en C. Juan Pérez Salgado, de la Unidad Académica de Ciencias Químico-Biológicas, ambas instituciones de la Universidad Autónoma de Guerrero. Asi mismo al Prof. Santos Andrade Cortés Presidente de la Fundación Produce Guerrero A.C., al Dr. Roger Ivan Rodríguez Vivas de la Universidad Atónoma de Yucatán, y a la Dra. Consuelo Almazán García de la Universidad Autónoma de Tamaulipas. Al Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitología Veterinaria, por las facilidades brindadas para la organización de este evento, en especial al Dr. Zeferino García Vázquez, Director del Centro. A la Sociedad Mexicana de Entomología, y en especial al Maestro Cándido Luna León Presidente de la Sociedad Mexicana de Entomología, por su decidido apoyo en la organización de este evento. De la misma manera agradecemos a la Fundación Produce Guerrero A.C. y a la Compañía Accesorios para Laboratorio, S.A. de C.V (ACCESOLAB) por el cofinanciamiento de la impresión de este volumen y por su interés en la difusión de la ciencia y la tecnología en nuestro país en beneficio de científicos, académicos, estudiantes, técnicos y agentes de cambio.

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EPIDEMIOLOGIA DE LA RESISTENCIA A LOS IXODICIDAS EN LA GARRAPATA Boophilus microplus EN MEXICO. Epidemiology of ixodicide resistance in the cattle tick Boophilus microplus in Mexico. Zeferino S. García Vázquez. Centro Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitología Veterinaria. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (CENID-PAVET-INIFAP). Carretera Federal Cuernavaca Cuautla No. 8534. Col. Progreso, Jiutepec, Morelos. C.P. 62550. [email protected] PALABRAS CLAVE: Boophilus microplus, ixodicide resistance, pesticides. Introducción Aproximadamente un billón de bovinos en el mundo se encuentran en zonas de riesgo de ser afectados por varias géneros y especies de garrapatas y de las enfermedades que transmiten, causando significantes pérdidas en la producción (Estrada-Peña et al., 2006). La garrapata del ganado bovino Boophilus microplus (Canestrini) es una las parasitosis más importante en la ganadería bovina. En los sistemas de producción ganadera localizados en regiones tropicales y subtropicales del mundo, las afecciones por ectoparásitos son consideradas como causa importante de pérdidas en la productividad ganadera, debido a daños tales como: morbilidad y mortalidad de los animales, reducción de los niveles de producción y productividad, alteraciones reproductivas y altos costos del control, entre otros. Los últimos treinta años se han caracterizado por el desarrollo y aplicación en distintas áreas ecológicas del mundo, de numerosas estrategias de control de ectoparásitos que afectan la producción animal. La mayoría de ellas mostraron ser altamente eficaces, prácticas y económicas para el control de parásitos, pero incapaces de prevenir y/o controlar el constante desarrollo de resistencia a los parasiticidas. Casi sin excepción y en la medida que los ixodicidas han perdido eficacia, estas estrategias se hacen menos rentables, comprometiendo en algunos casos, la propia sustentabilidad del sistema productivo (Schillhorn van Veen, 1997). Esta transformación en la genética de las poblaciones de parásitos se ha desarrollado en un marco mundial de profundas transformaciones políticas, sociales y económicas que, sin duda, modificaron la actitud del productor pecuario ante la problemática del control parasitario. Resulta fácil instaurar una estrategia de control cuando la economía de un país o región se encuentra en apogeo, las drogas son eficaces y el productor se encuentra dispuesto a colaborar. La situación cambia radicalmente, cuando la empresa pecuaria presenta problemas de financiamiento y el productor debe enfrentar otras prioridades, y en la actualidad con la competitividad de los mercados globalizados. La disponibilidad futura de nuevos ixodicidas, no sólo se encuentra comprometida por el progresivo aumento de los casos de resistencia y los crecientes costos de investigación y desarrollo, sino también por una cierta falta de conocimiento y competencia para el descubrimiento de nuevas drogas (Vial et al., 1999; Sangster and Gill, 1999). Además, el "elevado umbral" que significó el descubrimiento y desarrollo de ixodicidas por sus características de espectro y potencia, ha complicado las posibilidades para que la industria farmacéutica pueda desarrollar a corto plazo alguna molécula "superior", que 4

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justifique una inversión en investigación y desarrollo. Es así como se ha indicado (Geary et al., 1999) que dado el alto costo y bajo retorno de la investigación y desarrollo de parasiticidas, en el futuro se requerirá de nuevos enfoques en el proceso de descubrimiento de drogas, lo que implicará un mayor componente de investigación básica y por lo tanto, mayores costos. El escenario actual se caracteriza además por la crisis económica del sector pecuario, por mercados cada vez más regionalizados, competitivos y exigentes (Schillhorn van Veen, 1999). En este marco económico productivo, si no ocurre un cambio drástico en el enfoque de control, cabe esperar un aumento progresivo de casos de resistencia múltiple en distintas especies/géneros de ectoparásitos junto a la posibilidad de crear desequilibrios ecológicos y ocasionar la presencia de residuos de ixodicidas en carne, y leche (Nari and Hansen, 1999). La resistencia a los pesticidas se define como la habilidad de una población de parásitos, para tolerar dosis de tóxicos que serían letales para la mayoría de individuos en una población normal (susceptible) de la misma especie (Stone, 1972). Este fenómeno es una habilidad fundamental de los seres vivos, para evolucionar en condiciones ambientales cambiantes con el fin de sobrevivir bajo nuevas circunstancias. La resistencia es una respuesta genético-evolutiva de las poblaciones de artrópodos expuestas a un estrés ambiental severo continuo, como lo son las aplicaciones frecuentes de un producto; en condiciones de una fuerte presión selectiva, el desarrollo de resistencia es un fenómeno ineludible (Conway and Comins, 1979). En el campo se sospecha la presencia de resistencia, cuando un producto que antes era útil para el control, ya no demuestra el mismo efecto, siempre y cuando se asegure que se está trabajando bajo óptimas condiciones de aplicación (Benavides, 2001). Los parasiticidas químicos son un recurso no renovable (Kunz and Kemp, 1994; Vial et al., 1999; Geary et al., 1999); es decir, una vez se ha desarrollado la resistencia el producto, se torna inservible y es abandonado; por lo tanto se trata de un bien que debe ser utilizado prudentemente para alcanzar el mayor beneficio. La evolución de resistencia a los plaguicidas es un proceso complejo dependiente de muchos factores, que se han dividido en intrínsecos y operativos (Riddles and Nolan, 1986; Denholm and Rowland, 1992). Los factores intrínsecos son aquellos relacionados directamente con el parásito y corresponden a aspectos de la genética, ecología, comportamiento y fisiología de la plaga. Aquí se incluyen aspectos como; el grado de dominancia de los heterocigotos, la velocidad de mutación a la cual se producen alelos resistentes y el potencial reproductivo de estos individuos. Estos factores están por fuera del control directo del hombre, pero es necesario estudiarlos para poder explorar los posibles impactos sobre la tasa de selección de individuos resistentes, que pudiesen tener las diferentes estrategias utilizadas para el control del parásito. La dinámica poblacional de muchas interacciones huésped-parásito es bien caracterizada, sin embargo la conjunción entre un proceso epidémico y la evolución de un parásito dentro y entre huéspedes, no está bien definido. La conexión es central en muchos problemas aplicados, desde la evolución de la resistencia a las drogas y la virulencia, el diseño de vacunas y la emergencia de nuevas enfermedades. La revolución actual de la genómica en el huésped y el parásito son verdaderamente importantes en el tiempo y espacio para entender este problema. La investigación de la dinámica de las cepas de parásitos ha iluminado los problemas antes descritos. Sin embargo 5

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la unión de la dinámica del parásito y la diversidad genómica cuantitativa dentro del huésped y a nivel de poblaciones es un formidable problema, porque requiere información empírica acerca del juego de la dinámica y genética en ambos niveles. Es importante unificar la interacción epidemiológica y el proceso evolutivo que conduce a la incidencia de espacio y tiempo y patrones filogenéticos diferentes. Aunque nuestro actual conocimiento de estos patrones es incompleto, es importante resumir el conocimiento actual que permita hacer inferencias cuantitativas del problema. Por lo tanto nos enfocaremos al problema de la resistencia a los ixodicidas de las poblaciones de garrapata B. microplus que afecta al ganado bovino. El mayor determinante de la presencia de la resistencia los ixodicidas es el comportamiento de la garrapata relativa a una escala de tiempo y de las infestaciones en huéspedes susceptibles antes de la aparición de la resistencia. La principal distinción epidemiológica es por lo tanto la rapidez de presentación de la resistencia en la garrapata B. microplus cuando este parásito infesta a los bovinos en forma intensa y el periodo de infestación puede ser medido en semanas, meses o años, que es una infestación lenta pero persistente. En contraste los patrones filogenéticos son primariamente afectados primeramente por selección natural que surge de mecanismos bioquímicos y genéticos que son variables en las diferentes cepas de garrapatas B. microplus. Por ejemplo existen varios mecanismos de resistencia a los piretroides en la garrapata B. microplus y secundariamente por un proceso neutral epidemiológico tal como la separación en espacio de las poblaciones de garrapatas B. microplus. Ultimadamente las cepas de garrapatas B. microplus y sus líneas filogenéticas son producidas por mutaciones y su sobrevivencia depende que prevalezcan las fuerzas epidemiológicas, bioquímicas y genéticas. Un ejemplo de esta situación es la resistencia a los ixodicidas e insecticidas que está ampliamente diseminada hacia los diferentes tipos de compuesto disponibles en el ámbito veterinario (Kunz and Kemp, 1994). El objetivo de este documento es realizar una revisión sobre los conocimientos y experiencia actuales en cuanto a la problemática de resistencia a los ixodicidas, con énfasis en el ámbito mexicano. En México el control de las garrapatas es a través del uso de diversas familias de ixodicidas, habiéndose utilizado inicialmente compuestos organofosforados, posteriormente piretroides, mezclas de ambos ixodicidas y amidinas. Esto fue debido a la necesidad de controlar la presencia de la resistencia inicialmente diagnosticada hacia los organofosforados (Aguirre et al., 1981), posteriormente a los piretroides (Santamaría et al., 1990) y recientemente a las amidinas (Soberanes et al., 2002). La amplia distribución de la resistencia en el territorio nacional y la presencia de la resistencia a las diferente familias de ixodicidas hace el problema epidemiológico complejo, debido a que a través del tiempo se han presentado diversas poblaciones de garrapatas B. microplus con fenotipos de resistencia diferentes entre la misma familia de ixodicidas como en el caso de los piretroides donde reportan poblaciones de garrapatas resistentes a un solo piretroide (Tapia-Pérez, et al., 2003) o poblaciones resistentes a dos piretroides (Foil et al., 2005), y combinaciones entre las tres principales familias de ixodicidas utilizados para el combate de la garrapata B. microplus en México (Soberanes et al., 2002). En el Cuadro 1 se observa la frecuencia reportada por los servicios veterinarios oficiales de México, Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA), sobre la distribución de los casos de resistencia a los ixodicidas en la 6

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garrapata B. microplus diagnosticados en México durante el periodo del 2001 al 2005, y lo cual confirma lo anteriormente señalado. La epidemiología de la resistencia presenta una multicausalidad que podemos referirla a factores intrínsecos y extrínsecos, los cuales en forma conjunta permiten operar a las poblaciones de garrapatas para el establecimiento de la resistencia. Los factores extrínsecos son aquellos que estimulan la presencia de la resistencia como son: ecología de la localidad o región que permiten el desarrollo, sobrevivencia y densidades de las poblaciones de B. microplus, factores de variación como la migración, selección de poblaciones, mutaciones y recombinaciones, dosis, frecuencia y formulaciones de los ixodicidas, y aspectos culturales del combate a la garrapata entre otros. Los factores intrínsecos de la resistencia están relacionados al proceso evolutivo de la garrapata B. microplus para su sobrevivencia debido a la presión de selección y es de tipo genético, que podría manifestarse en co-evolución, variabilidad genética (resistencia a un ixodicida y a varios, presencia de una mutación génica puntual o cromosómica) y especialización fisiológica (individuos genéticamente iguales). Por lo cual es importante entender o elaborar modelos que nos permitan tener un mejor entendimiento de la epidemiología de la resistencia de las diferentes poblaciones de garrapatas observadas a nivel de campo. La estrategia de control actualmente contempla en términos generales la biología de la garrapata B. microplus, y el conocimiento de la situación y distribución de la resistencia a los ixodicidas de la garrapata B. microplus, y estas estrategias suelen desarrollarse a partir de tres niveles igualmente importantes y complementarios. Los dos primeros, son los más generales y deberían servir como marco en la toma de decisiones oficiales (gobiernos), académicas (universidades e institutos de investigación), empresariales (industria farmacéutica) y gremiales (asociaciones de profesionales y productores). Mientras que el tercer nivel es más específico y dirigido al manejo de la resistencia en el ámbito regional o explotación ganadera. Partiendo de lo general a lo más específico, estos niveles para el conocimiento de la situación de la resistencia parasitaria son: a) Encuestas. Estas recogen la experiencia de los servicios veterinarios oficiales u otros profesionales, para tener una visión preferentemente nacional, regional de la resistencia a los ixodicidas. b) Estudios de prevalencia. Diagnóstico y control son dos acciones inseparables de cualquier programa sanitario. En este caso no solamente basta conocer el agente causal sino también es imprescindible determinar lo más precozmente posible, el grado de sensibilidad de las poblaciones de garrapatas a los grupos químicos disponibles (Nari, 1987). En el ámbito nacional/regional en ocasiones es necesario establecer la prevalencia de la resistencia de géneros/especies de parásitos, hacia los diferentes principios activos. Para ello es indispensable contar con técnicas estandarizadas, un muestreo estadísticamente representativo y un adecuado equipamiento de laboratorio. Este tipo de estudio, esta sujeto a los mismos principios de todo estudio epidemiológico transversal (Putt et al., 1987; Thrusfield, 1998), en los cuales la precisión del estimativo depende del límite de error aceptado por el investigador (el cual determina el tamaño de la muestra); pero también del sesgo de selección, el cual está influenciado en cómo se selecciona la muestra a partir de la población. Además se deben considerar aspectos de la sensibilidad y especificidad de las técnicas de diagnóstico disponibles. Bajo estas consideraciones, 7

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este tipo de estudios posee un valor indudable, que orienta sobre la situación real de resistencia en una región. Además nos permite identificar factores de riesgo asociados a la presencia de resistencia (Rodríguez-Vivas et al., 2006). c) Diagnóstico de caso. Generalmente el diagnóstico de un caso de resistencia se produce frente a un llamado generado por los servicios veterinarios oficiales, la industria farmacéutica, el veterinario privado y en menor grado los productores. En este caso, el diagnóstico de resistencia debe estar en manos de profesionales capaces de realizar las pruebas diagnósticas y/o interpretar los resultados enviados por el laboratorio. En la mayoría de situaciones, es importante mantener una estrecha relación entre las actividades de campo y laboratorio, ya que a veces, es necesario desarrollar estudios especializados para determinar el perfil y tipo de resistencia de la cepa causante del problema. En cualquiera de las tres situaciones esbozadas arriba, la disponibilidad de pruebas de campo y laboratorio para confirmar la sospecha o presencia de situaciones de resistencia es crucial. La temprana detección de resistencia es importante para poder tomar a tiempo las medidas correctivas; debido a su naturaleza, la prevención y manejo de la resistencia deben ser abordados como un problema de genética poblacional (Stone, 1972; Conway and Comins, 1979; Sangster, 2001). Querer iniciar acciones de control una vez la resistencia se ha establecido puede ser muy tardío; se debe recordar, que para el mejor control de la resistencia el diagnóstico temprano es muy importante, ya que se pueden establecer medidas para retardar la su presencia y alargar la vida útil de los pesticidas. Con el advenimiento de nuevas técnicas de biología molecular, los estudios genómicos aplicados a la epidemiología son de vital importancia, ya que la sensibilidad de estas pruebas para la detección temprana y manejo de un gran numero de muestras son mayores que las que se utilizan actualmente en los laboratorios de diagnóstico. La genómica es el estudio relativo a la estructura y la función del genoma, resulta un instrumento poderoso para la determinación de los mecanismos de resistencia de pesticida, es un mapa físico completo del ectoparásito. Esto facilitará el análisis completo de los mecanismos multigénicos que pueden ser tan importantes en los mecanismos de resistencia a los insecticidas. En algunos estudios de B. microplus, el mapa ha revelado los sitios en el que el genoma se identifican a los genes que confieren la resistencia a organofosforados, y piretroides (Guerrero et al., 2001; Guerrero et al., 2002; Rosario et al., 2000; Rosario et al., 2005). El enfoque ahora se ha extendido al estudio del genoma entero a la garrapata B. microplus, y así se probaría cada cromosoma posible para asociarlo con la resistencia (Guerrero et al., 2006). La genómica se utiliza también para encontrar genes que confieren resistencia a los ixodicidas, para descubrir las estrategias para combatir la resistencia. Por lo cual es evidente la importancia del estudio poblacional de la garrapata B. microplus intrínseca y operativamente. Conclusiones Por lo que concluimos que, aunque la comprensión científica y técnica de la resistencia a insecticidas ha avanzado dramáticamente sobre los últimos cinco años, hay todavía una necesidad para una apreciación más amplia de la resistencia. El punto clave que necesita dirigirse sobre la resistencia, es una respuesta evolutiva y enfatizar que solo se puede demorar la resistencia antes que esta sea controlada. Esto puede ser la mejor adopción a una variedad de estrategias aplicadas antes que fiarse de sólo un método. 8

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25 120 3 23 0 5 332 0 27 9 26 124 9 10 7 18 144 72 4 166 469 204 107 16

Resultados S OF 1 1 3 3 2 0 2 2 0 0 1 0 14 2 0 0 8 2 5 0 11 0 40 3 5 1 0 1 0 0 5 0 8 6 3 1 0 1 5 7 68 31 1 2 6 20 15 0

Pr. 0 15 0 4 0 2 61 0 1 0 3 35 1 0 1 6 10 18 3 13 32 12 8 0

OF/Pr 12 41 1 12 0 2 49 0 6 1 4 35 0 8 3 1 54 20 0 35 98 58 39 0

Am 0 2 0 0 0 0 12 0 6 1 1 5 0 0 0 2 4

1920

203

225

479

Estado

No. muestras

Campeche Chiapas Coahuila Colima Durango Edo. México Guerrero Hidalgo Jalisco Michoacán Morelos Nayarit Nuevo León Oaxaca Puebla Queretaro Q. Roo San Luis Potosí Sinaloa Tabasco Tamaulipas Veracruz Yucatán Zacatecas Total

83

0 2 24 3 1 1

OF/Pr/Am 7 44 0 1 0 0 110 0 2 0 2 3 1 0 3 0 57 21 0 95 147 110 19 0

OF/Am 0 4 0 2 0 0 1 0 2 1 1 1 1 0 0 0 1 2 0 6 39 7 9 0

Pr/Am 4 8 0 0 0 0 83 0 0 1 4 2 0 1 0 4 4 7 0 3 30 11 5 0

64

622

77

167

Cuadro 1. Distribución de la frecuencia de la resistencia a los ixodicidas. Literatura citada Aguirre E.J.; Santamaría V.M. (1986).Purificación y caracterización toxicológica de Boophilus microplus resistentes a ixodicidas organofosforados y organoclorados. VII Reunión Anual Asociación Mexicana de Parasitología Veterinaria A.C. Cd. Victoria Tamaulipas. Benavides O., E.; Hernández M., G.; Romero N., A.; Castro A., H., Rodríguez B., J.L. 2001. Evaluación preliminar de extractos del Neem (Azadirachta indica) como alternativa para el control de la garrapata del ganado Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Rev. Colombiana Entomol. 27(1-2): 1-8 Conway, G.R., Comins, H.N. 1979. Resistance to pesticides. 2. Lessons in strategy from mathematical models. Span 22(2): 53-55. Denholm, I., Rowland, M.W. 1992. Tactics for managing pesticide resistance in Arthropods: Theory and Practice. Ann. Rev. Entomol. 37: 91-112.

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Estrada-Peña, Garcia, Z., Fragoso S.H. 2006. The distribution and ecological preferences of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) in Mexico. Exp. Appl. Acarol. 38: 307-316. Foil LD, Coleman P, Eisler M, Fragoso-Sanchez H, Garcia-Vazquez Z, Guerrero FD, Jonsson NN, Langstaff IG, Li AY, Machila N, Miller RJ, Morton J, Pruett JH, Torrs. 2004. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tickborne diseases. Vet Parasitol. 125(1-2):163-81. Geary, T.G.; Thompson, D.P., Klein, R.D. 1999. Mechanism-based screening: discovery of the next generation of anthelmintics depends upon more basic research. International J. Parasitol. 29: 105-112. Guerrero, D.F.; Davey, B.R.; Miller, J.R.(2001). Use of an allele specific polymerase Chain reaction assay to genotype pyrethroid resistant strains of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 38 (1):44-50. Guerrero FD, Li AY, Hernandez R. 2002. Molecular diagnosis of pyrethroid resistance in Mexican strains of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J Med Entomol. 39(5):770-6. Guerrero FD, Nene VM, George JE, Barker SC, Willadsen P. 2006. Sequencing a new target genome: the Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) genome project. J.Med. Entomol. .43(1):9-16. Kunz, S.E., Kemp, D.H. 1994. Insecticides and acaricides: resistance and environmental impact. Revue Scientifique et Technique, Office International des Epizooties 13: 1249-1286. Nari, A. 1987. Enfoque epidemiológico sobre el diagnóstico y control de resistencia a antihelmínticos en ovinos. Editorial Hemisferio Sur. Montevideo, Uruguay. 60p. Nari, A., Hansen, J.W. 1999. Resistance of Ecto- and Endo-parasites: Current and future solutions, 67th General Session. International Committee. Office International des Epizooties, OIE. Paris. 17- 21 May 1999. Putt, S.N.H.; Shaw, A.P.M.; Woods, A.J.; Tyler, L., James, A.D. 1987. Veterinary epidemiology and economics in Africa. A manual for use in the design and appraisal of livestock health policy. ILCA Manual # 3. International Livestock Centre for Africa. University of Reading. 130p. Riddles, P.W., Nolan, J. 1986. Prospects for the management of arthropod resistance to pesticides. In: "Parasitology. Quo Vadit?". Proceedings 6th International Congress of Parasitology, Brisbane, 1986. (Howell, M.J., ed.). Australian Academy of Sciences, Camberra: 679-687. Rodriguez-Vivas RI, Alonso-Diaz MA, Rodriguez-Arevalo F, Fragoso-Sanchez H, Santamaria VM, Rosario-Cruz R. 2006. Prevalence and potential risk factors for organophosphate and pyrethroid resistance in Boophilus microplus ticks on cattle ranches from the State of Yucatan, Mexico. . Vet. Parasitol. 136(3-4):335-42. Rosario, C.R.; García, V.Z.; George, E.J. (2000). Detección inmunoquímica de esterasas en dos cepas de la garrapata Boophilus microplus (Acarii: Ixodidae) resistentes a ixodicidas. Téc Pecu Méx. 38(3): 203-210. Rosario-Cruz R, Guerrero FD, Miller RJ, Rodriguez-Vivas RI, Dominguez-Garcia DI, Cornel AJ, Hernandez-Ortiz R, George JE. Roles played by esterase activity and by a sodium channel mutation involved in pyrethroid resistance in populations of

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Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) collected from Yucatan, Mexico. J Med Entomol.42(6):1020-5. Sangster, N.C. 2001. Managing parasiticide resistance. Vet. Parasitol. 98: 89-109. Sangster, N.C., Gill, J. 1999. Pharmacology of anthelmintic resistance. Parasitol. Today 15: 141- 146. Santamaría, V.M.; Soberanes, C.N.; Ortiz, N.H.; Fragoso, S.H. (1999). Análisis de la situación actual mediante el monitoreo de susceptibilidad a Ixodicidas en Boophilus microplus de 1993 a 1999 y medidas preventivas para retardar la resistencia al amitraz en México. En: IV Seminario Internacional de Parasitología Animal. Control de la resistencia en garrapatas y moscas de importancia veterinaria y enfermedades que transmiten. 20-22 de Octubre de 1999. Puerto Vallarta, Jalisco. México. pp. 103-112. Schillhorn van Veen, T.W. 1997. Sense or nonsense? Traditional methods of animal parasitic disease control. Vet. Parasitol. 71: 177-194 Schillhorn van Veen, T.W. 1999. Agricultural policy and sustainable livestock development. International J. Parasitol. 29: 7-15. Soberanes Céspedes, N., Santamaría Vargas, M., Fragoso Sánchez, H., García Vázquez, Z. 2002. Primer caso de resistencia al amitraz en la garrapata del ganado Boophilus microplus en México. Téc. Pecu. Méx. 40 (1): 81-92. Stone, B.F. 1972. The genetics of resistance by ticks to acaricides. Austr. Vet. J. 48: 345350. Tapia-Perez G, Garcia-Vazquez Z, Montaldo H, George J. 2003. Inheritance of resistance to flumethrin in the Mexican Aldama strain of the cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Exp Appl Acarol. 2003;31(1-2):135-49. Thrusfield, M. 1990. Epidemiología Veterinaria. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, España. Traducción de la Primera Edición Inglesa. 339p. Vial, H.J., Traore, M., Failamb., Ridley R.G. 1999. Renewed strategies for drug development against parasitic diseases. Parasitol. Today 15: 393-394.

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ADVANCES IN INSECTICIDE RESISTANCE DIAGNOSIS IN AFRICAN MALARIA VECTORS. Avances en el Diagnóstico de la Resistencia a Insecticidas en Mosquitos Vectores de Malaria en Africa. Anthony John Cornel. UC Davis, Department of Entomology, Mosquito Control Research Laboratory. 9240 South Riverbend Avenue. Parlier, California 93648 [email protected]. PALABRAS CLAVE: Insecticide resistance, Kdr, Malaria Vectors. Introduction Recently insecticide resistance studies on African malaria Anopheles mosquito vectors have focused on pyrethroid resistance because of increasing evidence of resistance to permethrin arising in Africa. In this talk I will touch on what we know about the extent of resistance in relation to selection pressures and recent developments in tools for detection of resistance in African malaria vectors in the Anopheles gambiae complex and Anopheles funestus sensu strictu. Distribution of pyrethroid and kdr-type resistance in An. gambiae sensu strictu Resistance to permethrin was first detected in West Africa (Ivory Coast) by Elissa et al. (1993) and by the end of the 1990’s had spread into many more West African countries (Chandre et al. (1999) and in Kenya (Vulule et al. 1999). In West Africa, resistance to permethrin, cross resistance to DDT and lower knockdown effects to deltamethrin and lambda cyhalothrin all lead to the conclusion that resistance was associated with a point mutation on the voltage gated sodium channel gene (VGSC) as each of these chemicals similarly bind the VGSC to exert their insecticidal effects. This mechanism is otherwise known as kdr-type resistance for which a PCR based diagnostic assay ha been developed for Anopheles gambiae s.s. (Martinez-Torres et al. 1998). The use of DDT for control of malaria vectors in the 1960s to 1970’s likely selected for low frequencies of the kdr resistance allele. These populations were then predisposed for rapid selection of higher frequencies of the kdr mutation when permethrin impregnated bednets were used on a large scale in the 1990s. Pyrethroids were also commonly used for control of cotton pest and resistance to permethrin is also thought have been selected for by agricultural use of pyrethroids. A similar situation arose in Kenya, where instead of the replacement of the leucine amino acid with the “resistant” phenylalanine amino acid that occurred in West Africa, the leucine was replaced by a serine. A second kdr diagnostic PCR assay was developed to detect this alternative mutation that also confers resistance (Ranson et al., 2000). In Kenya, original reports also implicated that higher levels of esterases and oxidases were responsible for pyrethroid resistance (Vulule et al. 1999). Resistance to permethrin was suggested to have arisen directly in response to exposures on impregnated bed nets in Kenya. The discovery of kdr resistance was also used to investigate spread of resistance amongst the two assortative mating molecular M and S forms of Anopheles gambiae s.s. (Fanello et al. 2002) and hence exploited as a population genetic tool to investigate gene 12

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flow between the two forms. In West Africa the leucine to phenylalanine substitution is strongly associated with the S form in several countries in West Africa, and more recently detected in the M form in Benin, Burkina Fasso and Ghana (Reimer et a. 2005) and Bamako chromosomal form in Mali (Tripet et al. in press). It is believed that the kdr mutation recently reached the M form by introgression from sympatric S forms (Weill et al. 2000). An interesting anomaly to the evolution and selection of the kdr mutation was found on the island of Bioko. On Bioko kdr is highly frequent in the M form and absent in the S form indicating that this mutation arose independently on Bioko from mainland Africa S form (Reimer, et al. 2005). In investigations to evaluate frequencies of kdr among the various forms of Anopheles gambiae we encountered numerous occasions of un-interpretable results using the standard Martinez-Torres et al. (1998) assay. For this reason a new much more sensitive assay was developed using a PCR elongation assay implementing fluorescently labeled primers and run on an ABI 3100 capillary sequencer according to the methodology described in Tripet et al. (in press) (Figure 1.). Using this new assay we are currently investigating the frequency of kdr in Cameroon, where so far published records report evidence of no kdr but oxidase based resistance (Etang et al. 2004). So far, we have found kdr type resistance in several Cameroon sites in the S form and in one location in the M form. While frequencies are still very low, individuals heterozygous for the kdr mutant have been found in Anopheles arabiensis. In several instances individuals that were knocked down in the presence of permethrin in the WHO standard bio-assay were heterozygous for kdr. This suggests that the WHO approved diagnostic assay is not sensitive enough to pick up presence of kdr gene when it is at low frequency and may need to be modified to yield more sensitive results of incipient resistance before resistance mitigating and management strategies can be applied. Distribution of pyrethroid resistance in Anopheles funestus Resistance to pyrethroids was detected in southern Africa populations (Mozambique and North-Eastern South Africa) of Anopheles funestus in 2000 (Hargreaves et al. 2000). Biochemical and synergist assays suggested that resistance was mediated by mixed function oxidases that may also confer cross resistance to the carbamate insecticide propoxur (Brooke et al. 2001). Resistance arose in these mosquitoes after about three years of an extensive indoor house-spraying program with deltamethrin in South Africa. Increases in resistance showed a strong association with increase in malaria cases (Figure 2). Advances in biochemical and molecular assays for detection of enzyme mediated resistance in Anopheles gambiae sensu strictu Not much is known about the role of the supergene families cytochrome P450’s (P450s), the glutathione-s-transferases (GSTs) and the carboxylesterases (COEs) in pyrethroid metabolism. However, the full genome sequencing of the Anopheles gambiae complex (almost entire edition of Science vol 298: No.5591 devoted to show this effort, see figure 3.) has begun to facilitate progress in identifying enzymes that are either upregulated or amplified. Towards this goal an Anopheles gambiae detoxification chip (microarray) has been constructed (David et al. 2005). The chip contains unique fragments from 230 putative genes that may be involved with insecticide metabolism representing the 13

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supergene families P450s, GSTs, COEs, redox genes, partners of the P450 oxidative metabolic complex and various control genes. The detox chip was used to identify which of these genes showed up and down regulation between the DDT resistant Zamu, pyrethroid resistant RSP and insecticide susceptible Kisumu, Anopheles gambiae strains (example of expression profiles depicted in Figure 4.). It is expected that this detox chip will rapidly enhance identification of insecticide metabolizing enzymes in populations across Africa. Another approach that my laboratory is currently involved in is on development of biochemical based assays using novel substrates that detect P450 and carboxylesterase mediated pyrethroid resistance. The purpose of these assays is to develop high throughput, inexpensive but yet highly sensitive and more selective substrates for detection of metabolic pyrethroid resistance than the current available methods for mosquitoes. Studies have progressed using pyrethroid resistant Culex pipiens mosquito complex mosquitoes and we expect that small refinements may have to be made for use in malaria vectors. Below are some of the highlights of progress. Further progress will be discussed in the symposium as ongoing improvements are being made. We investigated the ability of partially purified GSTs isozymes of mosquitoes to metabolize 14C labeled pyrethroid permethrin. Briefly, radiolabeled pyrethroid (14C permethrin) was incubated for 30 minutes at 30°C with partially purified GSTs in the presence of glutathione. As a negative control a reaction with bovine serum albumin was set up in parallel. The reaction product was then extracted with ethyl acetate three times, pooled and dried under a gentle flow of N2. The samples were resuspended in 25 ul ethyl acetate and spotted onto a TLC plate, run with a mobile phase of hexane: ethyl acetate (4:1) and monitored by a BIOSCAN (value as cpm) scanner. 14C-permethrin was conjugatively hydrolyzed by larval cytosolic GSTs derived from Boane and Marin pyrethroid-resistant colonies. No new peaks were observed in the Blank and susceptible CQ-1 Culex quinquefasciatus larval extracts confirming that GSTs in CQ-1 were incapable of metabolizing permethrin. Following GST affinity purification, the GST isozymes of the larvae were separated and identified using liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry (LCESI/MS). The GST fractions were resuspended in 5% acetonitrile:95% water: 0.1% trifluoroacetic acid and subjected to HPLC separation using an analytical Vydac C18 reverse phase column at 40 °C. A gradient of 5 to 60% acetonitrile:water in 0.1% trifluoroacetic acid was formed over 40 minutes. The HPLC was connected to a Finnigan LCQ Deca XP mass spectrometer equipment. Total ion count was followed and peaks were deconvoluted to molecular mass using Excalibur software. A single major isozyme of similar retention time was observed in all five colonies which is the only isozyme found in CQ-1 (Table 1). This isozyme and two others were found in the other susceptible colony SLab. Bean, Marin and Boane colonies had yet still additional unique isozymes. Noteworthy though, is that the major isozyme found in all five colonies had mutated with respect to the amino acid sequence in the Marin colony as indicated by a different molecular mass obtained by LC-ESI/MS analysis (Table 1). This suggests the presence of a mutated form of a GST isozyme in Marin that may be kinetically more adept at metabolizing pyrethroids. In addition, we show that resistant colonies posses additional GST isozymes that are either absent or expressed in very low quantities in susceptible colonies. These findings lead us to believe that at least some of the isozymes that are present in the resistant colonies are

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associated with pyrethroid resistance and also specifically with lambda cyhalothrin metabolism. Retention time (min) 22,75 22,23 21,73 22,00 22,38 25,80 23,55 23,75

Boane

Bean

Marin

CQ1

S_Lab

23050 23445 23535 23871* 24662 24760 24848

23083 23867* 23927 24648 24677 24813

23081 23885* 24658

23868*

23038 23871*

-

24640 -

24740

Table 1. Molecular masses in Daltons of GST isozymes identified from three resistant (Boane, Bean and Marin and two susceptible (CQ1 and S-lab) colonies of Culex mosquitoes by LC/ESI-MS. As an alternative approach the GSTs were separated using 2D-PAGE to provide higher resolving capacity. Equal quantities of GST larval protein extracts from each colony were loaded and separated through a 3-9 pI range isoelectric focusing apparatus. The IEF strip was then laid over a 22 cm 10% SDS PAGE gel and run again. The gel was stained with commassie blue (Figure 5). Multiple spots were observed in gels prepared from both susceptible and resistant larvae. However, the resistant colonies consistently produced higher numbers and more intense spots than CQ-1 and S-Lab. Consistent with our results from the mass spectroscopy the CQ1 colony showed fewer spots on the gel. Interestingly, despite similar high susceptibilities of CQ-1 and S-Lab to pyrethroids their 2-D GST profiles appear different with respect to numbers and intensity of spots. Several spots from these gels were selected, cut out and treated with sequencing grade trypsin to produce fragments that were de novo amino acid sequenced. Direct sequencing of 12 of these spots were identified as GSTs belonging to all known major insect GST classes. Protein Blast searches identified some of the spots corresponding to sequences homologous with transcription factors, elongation factors, DNA binding proteins and ribosomal proteins all possibly having the ability to bind glutathione. By using a 2D PAGE analysis software the images of all five gels were aligned and GSTs with identical mobility were located. Amino acid sequences of the fragments of these GSTs were very similar but in several cases we were able to identify some point mutations as well. In short, by employing this proteomic analysis we were able observe the GSTs in detail. Our results clearly show that there are multiple GSTs being expressed in these colonies and there are both quantitative and qualitative differences between the colonies. This suggests that in the resistant colonies in addition to unique isozymes elevation of GSTs is likely to be another mechanism for resistance against pyrethroids. Only after cytosol extracts were purified through a GST affinity purification column were we able to show higher levels of GST activity using the commercially available CDNB substrate between pyrethroid susceptible and resistant Culex mosquito strains (Figure 6).

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Based on similar 14C labeled pyrethroid-TLC-BIOSCAN assays described above for GST evaluations, cytosol extracts after removal of GSTs and partial purification for esterases were exposed to radiolabled permethrin. Peaks corresponding to the permethric acid were identified confirming that carboxylesterases that mediate hydrolytic metabolism of permetrhin was also occurring in the pyrethroid resistant colonies. This direct evidence led us to evaluate the usefulness of substrates that more closely mimic pyrethroids, that have shown promise in detection of mammalian carboxylesterases (Shan et al. 2001, Wheelock et al.2003, Stok et al.2004, Huang, et al.2005), to replace the commercially available naphthyl acetate substrates (Figure 7). These assays were performed in 96 well plates (homogenate from 10 mosquitoes per batch) using substrates tagged with a fluorescent reporter that produces a fluorescence’s after hydrolytic action. The greater the fluorescence, the greater the enzyme activity of the mosquito homogenate. The data is summarized below in Table 2. In summary, the Marin colony which is highly resistant to permethrin showed high activity to cis and trans coumarin. Marin is also resistant to deltamethrin which was supported by high levels of activity to 1S trans, ĮS. Boane is resistant to deltamethrin confirming activity to both 1R cis, ĮS and 1S trans, ĮS. No correlations were observed between resistant and susceptible colonies when the general naphthyl acetate substrate was used. We are also evaluating substrates for detection of P450 activities in Culex mosquitoes that we expect will work for malaria vectors as well. Traditional commercial assays such as ECOD (Ullrich and Weber, 1972; deSousa et al. 1995) and MROD (Mayer et al. 1977) for measuring mixed function oxidases levels require preparation of microsomal extracts from midgut of 100 to 200 mosquitoes. Assays conducted on pyrethroid resistant (Marin) and susceptible Culex quinquefasciatus (CQ-1) mosquitoes following the recommended Promega P450 Glo assay (Miller, 2000) that uses the substrates Luciferan 6’ methyl ether (demethylation) and 6’ Deoxyluciferan (hydroxylation) and Luciferan –BE (debenzylation) showed higher levels of activity in midguts dissected from individual larvae of pyrethroid resistant than susceptible mosquitoes. The Promega P450-Glo™ assays is a luminescent method for measuring cytochrome P450 activity originally designed for measurements in mammalian tissues. The only difference in the protocol is that mosquito midguts were added in place of mammalian tissue at the NADP regenerating step and holding the reaction for 50 minutes before microplate reading. The system worked on mid-gut microsomal extracts from individual larvae and adults in 96 well plates which could prove highly useful for high throughput testing of field collected samples. Although sensitivity is compromised in measurements on non microsomal whole midgut extractions, readings can still be obtained. This feature represents a step forward in that the equipment needed and time taken to prepare microsomal extracts from midguts of individual mosquitoes can be avoided (Figure 8). Inhibition assays can be conducted as well by addition of the actual pyrethroid in the P450 Glo™ assay to measure cross – reactivity of the specific individual mosquito microsomal extract to several pyrethroids (Figure 9).

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Table 2: Specific activity of partially purified esterase from mosquito larval cytosols toward general and pyrethroid-specific substrates. SD in parentheses).

Fractions Protein 1-NA

S-acetate

cis-coumarin transcoumarin

1R cis, ĮS

1S trans, ĮS

(%) nmol/min/mg nmol/min/mg pmol/min/mg pmol/min/mg pmol/min/mg pmol/min/mg CQ1(411)

26

93(11)

2.2(0.3)

NM(8)

1383(43)

NM(79)

NM(79)

CQ1 (18- 16 31)

163(24)

6.7(0.7)

NM(5)

57(9)

NM(49)

9.88(0.79)

CQ1(42- 17 49)

51(6)

1.5(0.6)

33.6(7.4)

389(59)

NM(53)

11.18(2.34)

Borne F62 16

124(8)

4.6(0.4)

NM(7)

77(13)

NM(73)

NM(73)

28(1)

21.3(0.8)

19.2(8.6)

761(44)

16.73(2.75)

40.79(10.61)

11

128(18)

2.8(0.1)

NM(7)

87(18)

NM(66)

7.71(2.19)

12

64(10)

1.7(0.1)

NM(7)

2174(141)

NM(71)

7.66(1.07)

4

48(8)

25.4(1.2)

111.8(19.3)

1201(50)

NM(25)

152.94(19.7)

(4-11) Borne F62 12 (40-49) Marin F48 (4-11) Marin F48 (18-31) Marin F48 (42-49)

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Concluding remarks One of the primary questions requiring a definitive answer for, is whether resistance mediated by kdr alone or enzyme mediated alone or together confer sufficient resistance to affect repellency by and contact on nets impregnated with permethrin or other pyrethroid. To answer this question much more still needs to be done to develop methods for determining resistance mechanisms on field samples. Once resistance mechanisms can be measured on individual mosquitoes rather than on populations, associations between resistant mosquitoes and malaria infections can be made to determine if resistance is affecting malaria transmission rates. High throughput and sensitive selective assays for determining resistance mechanisms will also prove to be highly valuable in developing and evaluating resistance management strategies. References Brooke, B.D., Kloke, G., Hunt, R. H., Koekemoer, L. L., Temu, E. A., Taylor, M. E., Small, G., Hemingway, J. and Coetzee, M. 2001. Bioassay and biochemical analyses of insecticide resistance in southern African Anopheles funestus (Diptera: Culicidae). Bulletin of Entomological Research, 91-265-272. Chandre, F., Darriet., Manga, L., Akogbeto, M., Faye, O., Mouchet, J. and Guillet, P. 1999. Status of pyrethroid resistance in Anopheles gambiae s.l. Bulletin of the World Health Organization, 77: 230-234. David, J-P., Strode, C., Vontas, J., Nikou, D., Vaughan, A., Pignatelli, P., Louis, C., Hemingway, J. and Ranson, H. 2005. The Anopheles gambiae detoxification chip: A highly specific microarray to study metabolic-based insecticide resistance in malaria vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 102:4080-4084. de Sousa, G., Cuany, A., Brun, A., Amichot, M., Rahmani, R. and Berge, J. B. 1995. A microfluorometric method for measuring ethoxycoumarin-O-deethylase activity on individual Drosophila melangaster abdomens: interest for screening resistance in insect populations. Annals of Biochemistry, 229: 86-91. Elissa, N., Mouchet, J., Riviere, F., Meunier, J.Y. and Yao, K. 1993. Resistance of Anopheles gambiae s. s. to pyrethroids in Cotê d’Ivoire. Annales de la Societe Belge de Medicine Tropicale, 73: 291-294. Etang, J., Chandre, F., Guillet, P. and Manga, L. 2004. Reduced bio-efficacy of permethrin EC impregnated bednest against Anopheles gambiae strain with oxidase-based pyrethroid tolerance.Malaria Journal, 3: 46-52. Fanello, C., Santolamazza, F. and della Torre, A. 2002. Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Medical and Veterinary Entomology, 16: 461-464. Huang, H.; Stok, J.E.; Stoutamire, D.W.; Gee, S.J. and Hammock, B.D. 2005. Development of optically pure pyrethroid-like fluorescent substrates for carboxylesterases. Chem. Res. Toxicol, 18: 516-527. Hargreaves, K., Koekemoer, L.L., Brooke, B. D., Hunt, R. H., Mthembu, J. and Coetzee, M. 2000. Anopheles funestus resistant to pyrethroid insecticides in South Africa. Medical and Veterinary Entomology, 14: 181-189. Martinez-Torres, D., Chandre, R., Williamson, M. S.,Darriet, F., Berge, J. B., Devonshire, A. L., Guillet, P., Pasteur, N. and Pauron, D. 1998. Molecular characterization of 18

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pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Molecular Biology, 7: 179-84. Mayer, R. T., Jermyn, J. W., Burke, M. D. and Prough, R. A. 1977. Methoxyresorufin as a substrate for the fluorometric assay of insect microsomal o-dealkylases. Pesticide Biochemistry and Physiology, 7: 349-354. Miller, V. P.., Stresser, D. M., Blanchard, A. P., Turner, S. and Crespi, C. L. 2000. Flourometric hight-throughput screening for inhibitors of cytochrome P450. Annals of the New York Academy of . Sciences, 919: 26-32. Ranson, H., Jensen, B., Vulule, J. M., Wang, X., Hemingway, J. and Collins, F. H. 2000. Identification of a point mutation on the voltage-gated sodium channel gene of Kenyan Anopheles gambiae associated with resistance to DDT and pyrethroids. Insect Molecular Biology, 9: 491-497. Reimer, L. J., Tripet, F, Slotman, M., Spielman, A., Fondjo, E. and Lanzaro, G. C. 2005. An unusual distribution of the kdr gene among populations of Anopheles gambiae on the island of Bioko, Equatorial Guinea. Insect Molecular Biology, 14: 683-688. Shan, G. and Hammock, B.D. 2001. Development of sensitive esterase assays based on Įcyano-containing esters. Anal. Biochem., 299: 54-62. Stok, J.E.; Huang, H.; Jones, P.D.; Wheelock, C.E.; Morisseau, C. and Hammock, B.D. 2004. Identification, expression and purification of a pyrethroid hydrolyzing carboxylesterase from mouse liver microsomes, J. Biol. Chem,. 279: 29863-29869. Tripet, F., Wright, J. A., Cornel, A. J., Fofana, A., McAbee, R., Meneses, CX. R., Reimer, L. J., Slotman, M. A., Thiemann, T. C., Dolo, G., Traore, S. and Lanzaro, G. C. in press. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. Tripet, F.,Vulule, J.M., Beach, R. F., Atieli, F. K., McAllister, J. C., Brogdon, W. G., Roberts, J. M., Mwangi, R. W. and Hawley, W. 1999. Elevated oxidase and esterase levels associated with permethrin tolerance in Anopheles gambiae from Kenyan villages using permethrin-impregnated nets. Medical and Veterinary Entomology, 13: 239-244. Ullrich, V. and Weber. 1972. The o-dealkylation of 7-ethoxycoumarin by liver micrsomes: A direct flourometric test. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem, 353:1171. Weill, M., Chandre, F., Brengues, C., Manguin, S., Akogbeto, M., Pasteur, N., Guillet, P. and Raymond, M. 2000. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Molecular Biology, 9: 451-455. Wheelock, C.E.; Wheelock, A.M.; Zhang, R.; Stock, J.E.; Morisseau, C.; LeValley, S.E.; Green, C.E. and Hammock, B.D. 2003. Evaluation of Į-cyanoesters as fluorescent substrates for examining interindividual variation in general and pyrethroidselective esterases in human liver microsomes. Anal. Biochem, 315: 208-222.

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Figure 1. Depiction of PCR elongation assay using Fluorescently labeled primers for detection of the leucine–phenylalanine mutation associated with kdr type resistance.

SS

RS

RR

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Figure 2. Increase in malaria cases associated with increase in resistance to deltamethrin in South Africa.

DDT applications resumed

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Resistance to pyrethroids in An. funestus and introduction of this mosquito into RSA from neighboring Mozambique

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Figure 3. Drawn representation of Anopheles gambiae polytene chromosomes, with physical locations of numerous genes. Copied from Science vol:298 (5591).

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Figure 4. Example of expression profiles of the detoxification genes across several insecticide resistant strains and a susceptible strain of Anopheles gambiae. Profiles copied directly out of David et al. (2005) manuscript.

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Figure 5. 2D gels showing differences in levels of expression of GSTs and numbers of GSTs between pyrethroid resistant Marin Culex pipiens pipiens var. molestus and Culex quinquefasciatus (Cq-1 and S-Lab) susceptible mosquitoes.

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Figure 6. GST profiles obtained from cytosol extracts from Culex pipiens s.l. mosquitoes. A= before affinity purification and B = after affinity purification. A

Specific activity (units/mg)

GST activity of cytosol fraction 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Marin

Boane

Bean

S-Lab

CQ-1

Culex colonies

B

Specific Activity (units/mg)

GST activity of purified isozym es 25.000 20.000 15.000 10.000 5.000 0 Marin

Boane

Bean

S-Lab

CQ-1

Culex colonies

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Figure 7. Chemical structures of substrates for detection of hydrolysis of pyrethroids (carboxylesterase mediated detoxification) in Culex pipiens s.l. mosquitoes.

Br

H

H

O

1R

Br

aS

Cl

Deltamethrin

O

OH

CN OCH3

H

H

Cl

O

1R

1R cis, aS

aS

O H

CN OCH3

H O

1S trans, aS

aS

1S

Cl

H

Cl

CN

O H

OCH3 H3C

O

aS

O H

S-acetate

CN N

Cl

Green substrate

O

Cl O

CN OCH3

Cl

Blue substrate

O

Cl

CN

O

Cl O

Cl

Permethrin

O

O

Cl O

Cl

O

O Cis or trans-coumarin

O

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30000

20000

10000

Dead Whole Larvae

Pan Water

Vivo (Midgut - Clean)

Vivo (Midgut - Whole)

Vivo (Headless)

27

Vivo (Whole - Washed)

Vivo (Whole)

Micro (Midgut - Clean)

Micro (Midgut - Whole)

Micro (Headless)

Micro (Whole)

Hom (Midgut - Clean)

Hom (Headless)

0

Hom (Whole)

counts / mg protein / assay time

Figure 8. Specific activity / minute preparation time for larval Marin preparations with P450 Glo methylated substrate.

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Figure 9. Inhibition of rat microsomal P450s by permethrin in the P450 Glo™ assay system. Permethrin used in combination with the demethylation substrate 50000

40000

Activity

-0.0299

y = 32890x 2

R = 0.9605

30000

20000 -100

150

400

650

Permethrin ppm

28

900

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THE USE OF SYNERGISTS FOR THE DETERMINATION OF THE MECHANISMS OF ACARICIDE RESISTANCE IN THE SOUTHERN CATTLE TICK, Boophilus microplus (ACARI: IXODIDAE). El uso de Sinergistas para la Determinación de los Mecanismos de la Resistencia a Acaricidas en la Garrapata Boophilus microplus (ACARI: IXODIDAE). Robert. J. Millera, A. Y. Lib, R. B. Daveya, and J. E. Georgeb . aUSDA, ARS Cattle Fever Tick Research Laboratory, Mission, Texas, USA. bUSDA, ARS, Knipling-Bushland U. S. Livestock Insects Research Laboratory, Kerrville Texas, USA. [email protected] Abstract Synergists have been used to study the mechanisms of acaricide resistance in the southern cattle tick, Boophilus microplus, with success. Investigations involving 3 classes of acaricides, pyrethroids, organophosphates (OPs), and formamidines, have greatly increased the understanding of acaricide resistance in ticks. For pyrethoid-resistant ticks, esterases played an important role in resistance. Oxygenases and glutathione-S-transferases (GSTs) were involved in OP resistant strains tested. Oxygenases conferred resistance to coumaphos whereas GSTs were responsible for diazinon resistance. Susceptibility to formamidine acaricides using amitraz was increased with synergists that blocked the activity of esterases and GSTs in the strains tested. Synergist studies have had the secondary benefit of implicating target site insensitivity as a mechanism of resistance depending on the pattern of results obtained. Synergist studies involving strains containing macrocyclic lactone resistance will be the next important step in the understanding of enzyme-mediated resistance in the southern cattle tick. KEY WORDS: Boophilus microplus, resistance, bioassay Introduction Resistance develops in a population as a response to selection pressure. It occurs when a change in the genetic makeup of a population allows a population to survive a dose of pesticide that would normally kill the individuals within the population. Resistance requires three things; 1) genetic variability, caused by random mutations or genetic rearrangements; 2) selection pressure (death), so that individuals not containing the resistance trait are removed from the population; and 3) reproduction, to increase the numbers of resistant individuals within a population. The mechanisms by which individuals become resistant to pesticides vary, but one of the main types of resistance is due to the action of enzymes. Enzymes are complex proteins that occur in living organisms that catalyze chemical reactions. Enzymes can reduce the lethality of pesticides in two ways, detoxification and sequestration. Detoxification normally occurs through hydrolysis (esterases), oxidation (oxidases), or conjugation (glutathione-S-transferases). Sequestration occurs when an enzyme binds to the toxicant and makes it unable to reach its target site. This paper will cover scientific work involving synergists. For our purposes, a synergist is a compound that when exposed to a test subject will not cause mortality. However, when the compound is added to a pesticide, it will increase the lethality of that 29

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pesticide beyond what was expected when the pesticide was used alone. The synergists that will be covered in this paper were all inhibitors of enzymes that sequester or detoxify pesticides within ticks. Therefore, when a pesticide was introduced into a tick, the enzymes that would normally detoxify or sequester the toxicant were disabled by the synergist used in the study. Therefore, the lethality of the pesticide was increased. The relative potency of a pesticide with and without the presence of synergist was determined by dividing the concentration of pesticide required to kill 50% of the test subjects with synergist present to that concentration of pesticide required to kill 50% of test subjects without synergist present. By comparing the “synergist ratio” from susceptible and resistant strains, an indication of the role of enzymes played in resistance was determined. By using a synergist that inhibits a specific class of enzyme, an indication of which enzyme system involved in resistance was learned. This paper will discuss three studies involving the use of synergists to determine if enzymatic activity was involved in the resistance of southern cattle ticks, Boophilus microplus (Canestrini). One study was developed to study the mechanisms of pyrethroid resistance, the other studied the resistance of organophoshorous acaricides, and the final study investigated formamidine acaricides. Materials and Methods Ticks All ticks used for these studies were B. microplus originally collected in Brazil, Mexico or the United States and reared in colony at the Cattle Fever Tick Research Laboratory (CFTRL), Edinburg TX. Rearing conditions at the CFTRL are described in Davey et al. (1980). Susceptible strains were tested against all pesticides and found not to be resistant and were reared without selection to pesticides. Resistant strains were selected for maximum levels of resistance in the laboratory to provide the greatest comparison of resistance in relation to the susceptible strain. Pesticides Tick larvae were exposed to pesticides following the Larval Packet Test (LPT) procedure recommended by the Food and Agriculture Organization (FAO 2004). Pyrethroid pesticides used in the following studies were permethrin (FMC, Philadelphia, PA), cypermethrin (Hoechst-Rousell Veterinary, S. A. de C. V. Alvaro Obegon, Tabasco, Mexico), and flumethrin (Bayer de Mexico, S. A. de C. V. Mexico D. F., Mexico). Organophosphate (OP) pesticides were coumaphos (Bay Vet, Shawnee, KS) and diazanion (ECTO Development Co., Excelsior Springs, MO). The formamidine pesticide used was amitraz (NOR-AM, Wilmington, DE). Synergists The contribution of enzymatic activity to resistance was determined with the use of synergists and bioassay. Synergists used in this study were, triphenylphosphate (TPP, Aldrich, Milwaukee, WI), an inhibitor of esterase; piperonyl butoxide (PBO, Aldrich, Milwaukee, WI) an inhibitor of cytochrome P450; and diethyl maleate (DEM, Aldrich, Milwaukee, WI) an inhibitor of glutathion S-transferase (GST). These were added to the pesticide formulations at a constant rate of 1% [AI] (the highest rate that would not cause mortality in B. microplus when applied alone, R.J.M. unpublished data) and the response 30

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compared to acaricide formulations without synergist using the above described LPT bioassay technique. Statistical Analysis Probit analysis was run on bioassay results using Polo PC or PoloPlus (Le Ora Software 2004). Control mortality (larvae exposed to solvent and/or solvent and synergist only) was always below 10% and corrected by using Polo PC or PoloPlus. Resistance ratios (RRs) for pesticide susceptibility comparisons were calculated relative to the susceptible strain. Synergism ratios (SRs) were calculated relative to the formulation not containing synergist within a given strain. Significance of each comparison was determined when the number 1 was not contained in confidence interval of the resistance ratio (Robertson and Preisler 1992). Results and Discussion Use of synergists with pyrethroid-resistant tick strains Miller et al. (1999) published the first study that used synergists to determine the mechanisms of resistance to pyrethroid acaricides in B. microplus. In this study, 4 strains of B. microplus were used. Two strains, Corrales and the San Felipe, were determined to be highly resistant to pyrethroid acaricides, but this resistance was not lowered by the addition of the three synergists used in the study, TPP, PBO, and DEM. One strain did show a reduction in the estimated LC50. This strain was the Coatzacoalcos strain. When either permethrin, cypermethrin, or flumethrin were used, it was found that TPP lowered the LC50 estimate to about half of what was estimated when each acaricide was used without TPP (Table 1). The conclusion was that esterases were involved in the pyrethroid resistance of the Coatzacoalcos strain, but not for the Corrales or the San Felipe. Further study revealed that the Coatzacoalcos strain was resistant due to an over expression of esterase within those ticks (Jamroz et al. 2000). He et al. (1999) proved that the resistance profile detected in the Corrales and San Felipe strains was due to a mutation on the sodium channel gene. Use of synergists with OP-resistant tick strains Li et al. (2003) published the fist study that investigated the mechanisms of OP resistance with the use of synergists. In this study 10 different strains were tested against the OP acaricides coumaphos and diazinon. Regardless of the acaricide used, when the tick strains were exposed to TPP, some resistant strains were synergized while others were not synergized. As a result, the estimated synergist ratios did not correlate with LC50 estimates, suggesting that esterases did not play a major role in OP resistance of the strains tested. Significant positive correlations were developed from other combinations of acaricides and synergists. When PBO was added to coumaphos the synergist ratio correlated well (r=0.837) with LC50 estimates indicating that oxidases were involved in coumaphos resistance for the strains tested (Fig. 1). Additionally, when DEM was added to diazanion a correlation (r=0.844) was recorded with the synergist ratio and the LC50 estimate, suggesting that GSTs were involved in diazinon resistance. Additionally, the authors theorized that since there was a correlation between the LC50 estimates from coumaphos and diazinon another resistance mechanism must have been present in the strains tested, possibly an insensitive acetylcholine esterase (AChE). Pruett (2002) showed that an insensitive AChE did exist in the strains tested by developing an AChE inhibition assay 31

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whereby AChE was extracted from the synganglia of adult ticks and the activity measured toward an acetylthiocholine iodide substrate in the presence of an OP acaricide. In this assay, resistant ticks contained AChE that still functioned (hydrolyzed acetylthiocholine iodide) in the presence of activated coumaphos (coroxon) whereas the AChE from susceptible ticks did not function in the presence of activated coumaphos at the same concentration. Use of synergists with formamidine-resistant tick strains In 2004 Li et al. published the first study designed to characterize the enzymatic basis of formamidine resistance in B. microplus. In this study, 4 strains were investigated with synergists added to the LPT with amitraz used as the acaricide. For the Santa Luiza strain, collected from Brazil, the synergist ratio for TPP was 3 fold higher when compared to the synergist ratios of the other susceptible and resistant strains tested (Fig. 2). This indicated that esterase activity was involved in the amitraz resistance for this strain. For the Pesqueria strain, from Nuevo Leon, Mexico, the DEM synergist ratio was over 2 fold higher than that of the other susceptible and resistant strains tested, indicating that GSTs were involved in the amitraz resistance for this strain (Fig. 2). The authors hypothesized that there may be a possible target site mediated resistance mechanism for these strains as well. Work continues on formamidine resistance, but little is known about the mode of action of amitraz. Without a target site to investigate, it is difficult to know how target site insensitivity may be involved in formamidine resistance for B. microplus. Conclusions The use of synergists in bioassay has been a valuable tool for the discovery of the mechanisms of resistance present in the southern cattle tick. Synergists have successfully implicated esterase activity involvement in pyrethroid resistance, oxidase and GST involvement in OP resistance, and esterase and GST involvement in amitraz resistance. When no synergism was detected further research found that the resistance mechanism was target site insensitivity (non-enzyme mediated resistance) in strains with resistance to pyrethroids and OPs. This pattern may be true for amitraz resistant ticks as well. Thus, in some instances, synergist studies have served to eliminate the possibility of enzyme mediated mechanisms of resistance so that research could be focused on more likely possibilities. Synergists will be used in the near future to search for potential mechanisms of resistance to macrocyclic lactones in B. microplus. References Davey, R. B., J. Garza Jr., G. D. Thompson, and R. O. Drummond, 1980. Ovipositional biology of the cattle tick, Boophilus annulatus (Acari: Ixodidae), in the laboratory. J. Med. Entomol. 17: 287-289. (FAO) Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2004. Guidelines resistance management and integrated parasite control in ruminants. FAO, Rome. P. 216. He, Haiqi, A. C. Chen, R. B. Davey, G. W. Ivie, G. G. Wagner, and J. E. George. 1999. Sequence analysis of the knockdown resistance-homologous region of the para-type sodium channel gene from pyrethroid-resistant Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). 36: 539-543. 32

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Jamroz, R., F. Guerrero, J. Pruett, D. Othler, and R. J. Miller. 2000. Molecular and biochemical survey of acaricide resistance mechanisms in larvae from Mexican strains of the southern cattle tick (Boophilus microplus). Journal of Insect Physiology. 46: 685-695. Le Ora Software. 2004. A user’s guide to probit or logit analysis. Le Ora Software, Berkeley, CA. Li, A. Y., R. B. Davey, R. J. Miller, and J. E. George. 2003. Resistance to coumaphos and diazinon in Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and evidence for the involvement of an oxidative detoxification mechanism. Journal of Medical Entomology 40: 482490. Li, A.Y., R. B. Davey, R. J. Miller, and J. E. George. 2004. Detection and characterization of amitraz resistance in the southern cattle tick, Boophilus microplus (Acari: Ixodidae).Journal of Medical Entomology. 41: 193-200. Miller, R. J., R. Davey, and J. E. George. 1999. Characterization of pyrethroid resistance in Mexican strains of the cattle tick (Boophilus microplus) Acari: Ixodidae. Journal of Medical Entomology. 36: 533-538. Pruett, J. H. 2002. Comparative inhibition kinetics for acetylcholinesterases extracted from organophosphate resistant and susceptible strains of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J. Econ. Entomol. 95: 1239-1244. Table 1. Results of synergist studies with pyrethroid acaricides taken from Miller et al. (1999).

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Figure 1. Results taken from Li et al. (2003) showing a correlation of PBO synergism to coumaphos LC50 estimates, indicating a role of oxidases in resistance to coumaphos, and DEM synergism to diazinon LC50 estimates, indicating GST involvement in diazinon resistance.

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Figure 2. Results taken from Li et al. (2004) showing the synergism ratio of various resistant strains compared to a susceptible strain. For the Santa Luiza strain, esterase activity was considered a resistance mechanism because of synergism with TPP and for the Pesqueria strain, GSTs were implicated as a resistance mechanism due to synergism with DEM.

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PROGRESS IN THE EPIDEMIOLOGY AND DIAGNOSIS OF AMITRAZ RESISTANCE IN THE CATTLE TICK Boophilus microplus. Avances en la Epidemiología y el Diagnóstico de la Resistencia al Amitraz en la Garrapata Boophilus microplus. Dr. Nicholas N. Jonsson. School of Veterinary Science, University of Queensland QLD 4072 Australia. +61 7 3365 1279. e-mal: [email protected] PALABRAS CLAVE: Acaricides resistance, Boophilus microplus, amitraz. Introduction Amitraz continues to be one of the most popular acaricides for the control of cattle ticks (Boophilus microplus) in use in Australia. It is currently the only effective acaricide that is available for application to dairy cows in plunge dips or by spray. In comparison with the endectocides and the acarine growth regulators, an application of amitraz costs about one tenth as much. It has a rapid action and is suitable for application in clearing dips prior to government controlled movements of cattle into tick-free areas. It has minimal toxicity to cattle or humans and no meat withholding period, making it suitable for use in cattle shortly before slaughter, if required by regulation. Finally, amitraz is rapidly degraded in the environment, although government bodies are still not united in their recommendations for the management of amitraz dip effluent. All of these characteristics weigh up well against the occasional problems with suspension and maintenance of activity that producers can manage using correct mixing and dipping procedures. The surprising thing about amitraz is its continued efficacy despite sustained, heavy use. It was introduced for use in Australia in 1975 and resistance was first identified against amitraz in Australia in 1980 (Nolan, 1981). The amitraz-resistant strain was designated Ulam, after the shire in which was first characterised. In 1992 ticks were found on a beef producing property, near Rockhampton in Central Queensland, which expressed resistance against amitraz and all synthetic pyrethroid acaricides (Kunz and Kemp, 1994). These ticks were designated Ultimo strain and they presented a great threat to the cattle industries because the only alternative product at the time was ivermectin, which was not able to be used by dairy farmers. In Mexico, amitraz resistance was not identified until 2001, fifteen years after its introduction in 1986 (Santameria et al., 2001; Soberanes et al., 2002). Similarly, reports of amitraz resistance in Boophilus microplus have been recently emerging from other parts of the world (Benavides et al., 2000; Miller et al., 2002). Many aspects of the epidemiology of amitraz resistance are poorly understood and appear to differ from other, better characterized acaricide resistance problems. The purpose of this paper is to examine recent work that clarifies the epidemiology and diagnosis of amitraz resistance. Prevalence and distribution Few studies on the prevalence of amitraz resistance have been undertaken. In 1994, 14 years after the first diagnosis, there were only 14 properties with amitraz resistance in Australia. In 2006, there are still fewer than 150 properties in Australia with amitraz resistance. In 1997, a small survey of the Queensland dairy industry was undertaken (Jonsson et al., 2000). It indicated that the prevalence of amitraz resistance was about 10% 36

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although the sample might have been subjected to a small amount of selection bias, and the 95% confidence interval for prevalence of amitraz resistance was between 2 and 17%. More recently, the Department of Primary Industries and Fisheries (DPI&F) in Queensland, with support from Meat and Livestock Australia (MLA) conducted a targeted, random survey of cattle properties. Presently, data are available from one hundred and forty-five farms, of which conclusive amitraz results are available from 120. Of these, 13 (10.8%) were resistant to amitraz and 107 were susceptible. This contrasts with 67 (55.8%) resistant to synthetic pyrethroids. Although this indicates that the prevalence of amitraz resistance has not changed over the ten years, it is not valid to compare the two studies because the earlier study was restricted to dairy herds. Dairy herds are subjected to more intensive tick control because of the dominance of tick-susceptible Bos taurus cattle and because of the greater frequency of dairy farms in the areas that favour tick survival. Nonetheless, it is clear that resistance to amitraz has emerged more slowly in Australia than resistance against other acaricides. As an example, resistance against synthetic pyrethroids (SPs) first emerged in Australia in 1984, ten years later it was present on 430 known properties (Kunz and Kemp, 1994) and now the prevalence is over 50% across northern Australia (unpublished data). The slow development or emergence of amitraz resistance after initial detection has also been noted in Mexico (Fragoso et al., 2004). However, the prevalence of amitraz resistance in Mexico appears to be double that in Australia, achieved in a much shorter time period. Rodriguez-Vivas (2003) showed a farm level prevalence of amitraz resistance of 19.4% in Yucatan State. In New Caledonia, amitraz is used on 54% of properties. A survey using the larval packet test for amitraz resistance in 2003 demonstrated resistance in two of the 21 farms tested that were using amitraz (Ducornez et al., 2005). There is little information on the prevalence of amitraz resistance in Africa. Perhaps this reflects the fact that it is used less than the SPs and the organophosphates, possibly because of the greater importance of the multi-host ticks in the continent, for which SPs and OPs are often still reasonably effective. Risk factors for resistance to amitraz Few risk factors have been confirmed for the development or appearance of amitraz resistance to date. Ducornez et al. (2005) noted that one of the two properties in New Caledonia with amitraz resistance had been using the product at a high frequency and would have applied 86 treatments with amitraz from October 1997 to 2003 when the resistance was identified. Jonsson et al (2000) found that the probability of resistance to amitraz was highest in Central Queensland, increased when more than five applications of acaricide were made in the previous year, and decreased on farms when a hand spray apparatus was used to apply acaricides to cattle. This study was based on a small number of positive samples, so should be interpreted cautiously. In 1998, all 12 of the Queensland dairy farmers that had diagnoses of amitraz resistance were contacted and information obtained on the movements of cattle onto their properties (unpublished observations). All except two of the eleven farmers had purchased cattle from properties or properties adjacent to those that were subsequently known to have amitraz resistance. This suggests that in Australia, amitraz resistance emerges in new areas as a result of cattle movements rather than from de novo development of resistance. At the University of Queensland, we are currently testing this hypothesis by using a panel of 12 microsatellite markers applied to ticks from properties with and without amitraz resistance from five different locations. 37

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Using phylogenetic analyses we intend to determine whether the populations of ticks with amitraz resistance from diverse locations are more closely related to each other than to non-resistant populations from the same location. If the hypothesis were found to be true, the most important recommendation for the prevention of emergence of amitraz resistance would be to maintain a high level of property biosecurity. Persistence of resistance and mode of inheritance There is some evidence to suggest that resistance to amitraz is not maintained in populations in which selection is not applied (Foil et al., 2004). Thirty-three of 44 farmers with confirmed amitraz resistance and some evidence of failure of amitraz in the field returned to use amitraz after resistance was diagnosed and the treatment frequency after resistance was diagnosed was not significantly different. Our ongoing study on the management of amitraz resistance has shown that the degree of resistance indicated by the LPT fluctuates during the year, falling away every winter and increasing again during the tick season as selection pressure is applied. This tendency for resistance against amitraz to wane when selection pressure is not applied suggests that the resistance mechanism comes with a cost to overall fitness. At present there is no firm experimental evidence to support this hypothesis for amitraz resistance, although reduced egg production has been documented in SP resistant B. microplus in Mexico (Tapia-Perez et al., 2003). The mode of inheritance is likely to be an important factor in the speed of emergence of resistance. Dominantly inherited resistance is more likely to emerge rapidly than resistance that is inherited recessively. Resistance that is a polygenic trait is also more likely to emerge slowly. The unstable nature of diagnosis of amitraz resistance, the apparent inability to achieve totally satisfactory probit analysis results and the diverse effects of amitraz on the tick (larval mortality as well as hyperactivity and detachment) led to the suggestion that it was a polygenic trait (Kemp et al., 1999). The same paper describes a study to determine whether resistance to amitraz is dominant or recessive in B. microplus. Two pen trials were conducted, the first of which showed 98% control in susceptible homozygotes, 69% control in resistant ticks (presumed homozygous resistant) and 79% control in hybrids (presumed heterozygotes). The second trial showed 98 and 99% control in susceptible ticks and 92 and 95% control respectively in hybrids when the recommended and double the recommended concentrations of amitraz were used. These results are suggestive of an incompletely dominant mode of inheritance. More recent work by Li and colleagues in the US, using Brazilian strains of B. microplus (Li et al., 2005) has shown clearly that inheritance of amitraz resistance is recessive in the Santa Luiza strain, with a strong maternal effect. The LC50 in susceptible (Muñoz) homozygotes (SS) was 0.0024%, in homozygote resistant Santa Luiza ticks it was 0.45%, in heterozygotes with a susceptible male and resistant female parent it was 0.022% and in heterozygotes with a resistant male and susceptible female parent it was 0.0089%. Further back-crossing indicated deviations of the observed from expected probit mortalities, taken as evidence of a polygenic resistance mechanism. It is important to note that the results of the American and Australian studies should be compared with caution, because the Australian study (Kemp et al., 1999) was a pen trial whereas the American study (Li et al., 2005) was conducted using the LPT. The modes of inheritance of resistance expressed in the two systems might be quite different. It is also possible that different mechanisms might exist in the two strains of resistant tick. 38

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Mechanisms The mode of action of the amidine acaricides is not known. Several targets have been proposed, including monoamine oxidase (MAO) (Knowles and Roulston, 1973) and octopamine receptor (Davenport et al., 1985; Baxter and Barker, 1999; Li et al., 2005). The work by Baxter and Barker (1999) did not provide evidence in support of a mutation in the octopamine receptor gene. However it appears from existing ESTs on GenBank that there is likely to be more than one octopamine receptor gene in B. microplus. Work at CSIRO by Shelly Hope and colleagues provide some support for the involvement of MAO. Diagnosis The positive predictive value of the larval packet test for amitraz failure in the field does not appear to be particularly high. In a trial that we are currently undertaking on the management of amitraz resistance, we frequently see results from the LPT consistent with very high levels of resistance, yet we often obtain satisfactory results when we spray the animals with correctly diluted commercial amitraz emulsifiable concentrate, although incomplete kills of nymphs and larvae are usually noted (unpublished observations). Nolan (1981) described populations of ticks in which LPT indicated reduced susceptibility to amitraz, but in which pen studies indicated normal efficacy. When lower than usual concentrations of amitraz were used, tick control was poor compared with fully susceptible ticks. A similar lack of agreement between the Shaw larval immersion test (SLIT) and field results for B. decoloratus has been obtained (Taylor and Oberem, 1995). The technical limitations of the current bioassays have been well documented. The adult immersion test applied to fully engorged females with formulated commercial acaricides is not suited to the diagnosis of amitraz resistance, no discriminating concentration being suitable (Jonsson et al., 2003). In response to the lack of a linear response to amitraz of the standard LPT, Thullner et al. (2000) described a dispersal test using a paper grass stem model. This model provided linear responses to amitraz but has not been widely adopted. The larval packet test has been effectively modified by the introduction of formulated commercial acaricide in place of technical product and by using a nylon material in place of filter paper (Miller et al., 2002). It now provides a more accurate and repeatable test, although it has still not been adopted by Australian government laboratories. Regardless, any form of LPT is quite a cumbersome test and it would be preferable to be able to use more rapid diagnostics such as molecular or biochemical assays. Progress on the development of molecular tests for amitraz resistance has been hampered by the lack of knowledge about the mechanism(s) of action of the compound in the tick. Early attempts to identify mutations in the octopamine receptor gene (Baxter and Barker, 1999) were unsuccessful but might be worth revisiting again, now that more information on the genome is available. As stated previously, there is some evidence that polymorphisms in the genes for MAO and variation in expression levels might play a role in amitraz resistance. Work is in progress to determine whether this can be developed into a useful diagnostic test. In all cases, where tests for resistance are based on the identification of an adaptive mechanism, it is important to remember that the bioassay is still essential. Mechanisms of resistance can vary and new mutations arise. Hence a positive molecular test is useful, but a negative PCR for a given mutation or a negative enzymatic assay does not tell us that the population of ticks is not resistant to the acaricide in question. 39

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Conclusions There has been some progress in understanding of amitraz resistance in recent years. The gains in knowledge have been incremental and there is much to discover. However, it appears that resistance to amitraz is likely to be polygenic and is recessive. It also appears that there is a cost in fitness to amitraz resistance, allowing the effective management of amitraz-resistant populations through careful acaricide selection. Diagnosis has been improved by recent modifications to the LPT and it will not be long before molecular or enzymatic tests are available to diagnose resistance. References Baxter, G.D. and Barker, S.C. 1999. Isolation of cDNA for an octopamine-like G-protein |coupled receptor from the cattle tick, Boophilus microplus. Insect Biochem. Mol. Biol., 29: 461-467 Benavides, E., Rodriguez, S.C., Romero, A. 2000. Isolation and partial characterization of the Montecitos strain of Boophilus microplus (Canestrini) multi-resistant to different acaricides. Ann. N.Y. Acad. Sci. 916: 668-671 Davenport, A.P., Morton, D.B., Evans, P.D. 1985. The action of formamidines on octopamine receptors in the locust. Pesticide Biochemistry and Physiology, 24: 4552 Ducornez, S., Barre, N., Miller, R.J., de Garine-Wichatitsky. 2005. Diagnosis of amitraz resistance in Boophilus microplus in New Caledonia with the modified larval packet test. Vet. Parasitol., 130: 285-292 Foil, L.D., Coleman, P., Eisler, M., Fragoso-Sanches, H., Garcia-Vazquez, Z., Guerrero, F.D., Jonsson, N.N., Langstaff, I.C., Li, A.Y., Machila, N., Miller, R.J., Morton, J., Pruett, J.H., Torr, S. 2004. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol., 125: 163-181 Fragoso, S.H., Martinez, I.F., Ortiz, N.A. YEAR. Situacion actual de la resistencia a los ixodicidas en Mexico. Redectopar, 2004 Jonsson, N.N., Mayer, D.G., Green, P.E. 2000. Possible risk factors on Queensland farms for acaricide resistance in the cattle tick (Boophilus microplus). Vet. Parasitol., 88: 79-92 Jonsson, N.N., Miller, R.J., Finn, A., Verrall, R.G., George, J.E. 2003. Adult immersion tests of acaricide susceptibility in America and Australian strains of Boophilus microplus. In Garcia, Z.V., and Fragoso, H.S. (eds) V International Seminar in Animal Parasitology: World situation of parasite resistance in veterinary medicine, Merida, Yucatan, Mexico; 1 – 3 October, pp. 86-91 Kemp, D.H., McKena, R.V., Thullner, R., Willadsen, P. 1999. Strategies for tick control in a world of acaricide resistance. Proceedings of the IV International Seminar of Animal Parasitology, Puerto Vallarta, Mexico, October 20-22 1999. pp1-10. Knowles, C.O. and Roulston, W.J. 1973. Toxicity to Boophilus microplus of formamidine acaricides and related compounds, and modification of toxicity by certain insecticide synergists. J. Econ. Entomol., 6:1245-1251 Kunz,, S.E., and Kemp, D.H. 1994. Insecticides and acaricides: resistance and environmental impacts. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 13: 1249-1286

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Li, A.Y., Davey, R.B., Miller, R.J., George, J.E. 2005. Mode of inheritance of amitraz resistance in a Brazilian strain of the southern cattle tick, Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Exp. Appl. Acarol., 37: 183-198 Miller, R.J., Davey, R.B., and George, J.E. 2002. Modification of the Food and Agriculture Organisation larval packet test to measure amitraz susceptibility against Ixodidae. J. Med. Entomol. 39: 645-651 Nolan, J. 1981. Current developments in resistance to amidine and pyrethroid tickicides in Australia. In: Whitehead, G.B., and Gibson, J.D. (Eds) Proceedings of tick biology and control conference. Tick Research Unit, Rhodes University, Grahamstown, South Africa, pp. 109-114 Rodriguez-Vivas, I. 2003. Prevalence and potential risk factors for amitraz resistance in Boophilus microplus ticks in cattle in the state of Yucatan, Mexico. In Garcia, Z.V., and Fragoso, H.S. (eds) V International Congress in Animal Parasitology: World Situation of Parasite Resistance in Veterinary Medicine. October 1-3, Merida, Mexico, pp. 32-36 Soberanes, N.C., Santamaria, M.V., Fragosos, H.S., and Garcia, Z.V. 2002. First case reported of amitraz resistance in the cattle tick Boophilus microplus in Mexico. Tec. Pecu. Mex. 40: 81-92 Tapia-Perez, G, Garcia-Vasquez, Z., Montaldo, H., George, J.E. 2003. Inheritance of resistance in he Mexican Aldama strain of the cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Exp. Appl. Acarol. 31: 135-149 Taylor, R.J. and Oberem, P. 1995. Some characteristics of an amitraz resistant strain of Boophilus decoloratus originating from the Republic of South Africa. In Coons, L. Rotchild, M. (Eds) Proceedings of the second international conference on tick-borne pathogens at the host-vector interface – a global perspective. Kruger National Park, South Africa, August 28 to September 1, p 62 Thullner, F., Kemp, D.H., McKenna, R.V., Willadsen, P. 2000. Dispersal test for the diagnosis of amitraz resistance in tick larvae (Boophilus microplus). In Kazimirova, M., Labuda, M., Nuttall, P.A. Proceedings of the third international conference Ticks and Tick-Borne Pathogens: Into the 21st Century, pp. 205-208

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AVANCES EN LA EPIDEMIOLOGÍA Y EL DIAGNÓSTICO DE RESISTENCIA AL AMITRAZ EN LA GARRAPATA Boophilus microplus EN AUSTRALIA. Progress in the Epidemiology and Diagnosis of Amitraz Resistance in the Cattle Tick Boophilus microplus in Australia. Nicholas N. Jonsson. School of Veterinary Science, University of Queensland QLD 4072 Australia. +61 7 3365 1279. [email protected]. PALABRAS CLAVE: Acaricides resistance, Boophilus microplus, amitraz. Introducción El amitraz sigue siendo en Australia uno de los más populares acaricidas para el control de la garrapata bovina (Boophilus microplus). Es el único acaricida actualmente efectivo para su aplicación en vacas lecheras ya sea mediante baños o por spray. Comparado con los endectocidas y reguladores del crecimiento, su costo de aplicación es alrededor de una décima parte del costo. Es de acción rápida y su aplicación es conveniente para usar en baños en donde oficialmente se controla los movimientos de ganado hacia zonas libre de garrapatas. Su toxicidad hacia el ganado o el hombre es mínima y no tiene un período de persistencia en carne, lo cual lo hace conveniente para ser usado en los animales poco tiempo antes que estos sean enviados al matadero. Finalmente, el amitraz es rápidamente degradado en el medio ambiente, aunque todavía no hay consenso entre distintas entidades gubernamentales en sus recomendaciones para el manejo de los efluentes de los baños de amitraz. Todas estas características se contraponen con los problemas ocasionales de suspensión y mantenimiento de actividad que los productores pueden controlar mezclando correctamente la droga y respetando los procedimientos para efectuar los baños. Lo sorprendente de esta droga es su continua eficacia a pesar de su uso fuerte y sostenido. Fue introducida para ser utilizada en Australia en 1975 y su primer diagnóstico de resistencia fue en este país fue en 1980 (Nolan, 1981). La cepa resistente al amitraz fue denominada Ulam en referencia al condado donde fue por primera vez identificada. En 1992, en un campo productor de bovinos de carne, cerca de Rockhampton, en la región central del Estado de Queensland, fueron encontradas garrapatas resistentes al tratamiento con amitraz y a todos los piretroides sintéticos (Kunz and Kemp, 1994). A estas garrapatas se les denominó cepa Ultimo y presentaron una gran amenaza para la industria bovina porque el único producto disponible en ese momento era la ivermectina, el cual no era posible de usar por los productores lecheros. En México, la resistencia al amitraz no fue identificada sino hasta el 2001, quince años después de su introducción en 1986 (Santamaría et al., 2001; Soberanes et al., 2002). Similarmente, informes de resistencia al amitraz en Boophilus microplus han ido apareciendo recientemente en otras partes del mundo (Benavides et al., 2000; Miller et al., 2002). Muchos aspectos de la epidemiología del amitraz son muy poco entendidos y, parecen diferir de otros problemas mejor caracterizados de resistencia a acaricidas. El propósito de este artículo es el de examinar trabajos recientes que ayuden a comprender la epidemiología y el diagnóstico de resistencia al amitraz.

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Prevalencia y distribución Se han llevado a cabo pocos estudios sobre la prevalencia de resistencia al amitraz. En 1994, 14 años después de su primer diagnóstico, hubo sólo 14 propiedades con resistencia al amitraz en Australia. En 2006, todavía hay menos de 150 propiedades en Australia con resistencia a esta droga. En 1997 se llevó a cabo un pequeño estudio de la industria lechera en Queensland (Jonsson et al., 2000) donde se observó que la prevalencia al amitraz era cercana al 10% (IC 95% 2-17%) aunque una pequeña proporción de las propiedades pudieron estar sesgadas en cuanto a su selección. Más recientemente, el Departamento de Industrias Primarias y Pescadería (Department of Primary Industries and Fisheries, DPI&F) en Queensland, con el apoyo de Carne y Ganado Australia (Meat and Livestock Australia, MLA) condujo un estudio al azar, dirigido a establecimientos de productores ganaderos. Se realizaron pruebas en 145 establecimientos obteniendo datos concluyentes sobre el amitraz en 120 de ellos. De estos, 13 (10,8%) fueron resistentes al amitraz y 107 fueron susceptibles. Esto se contrapone con 67 (55,8%) establecimientos con resistencia a piretroides sintéticos. Aunque esto indica que la prevalencia de resistencia al amitraz no ha cambiado después de 10 años, no es válido comparar los dos estudios porque el primero de ellos fue limitado a los rodeos lecheros. Estos rodeos están sujetos a un control más intensivo de garrapatas debido a la dominancia de Bos taurus en ellos y por el gran número de este tipo de establecimientos en aquellas zonas que favorecen la supervivencia de la garrapata. Sin embargo, es claro que la resistencia al amitraz en Australia ha emergido mucho más lentamente que la resistencia contra otros acaricidas. A modo de ejemplo, la resistencia contra los piretroides sintéticos (PS) apareció por primera vez en Australia en 1984, diez años después estuvo presente en 430 propiedades (Kunz and Kemp, 1994) y ahora la prevalencia es mayor al 50% a lo largo de la región norte de Australia (datos no publicados). En México el desarrollo o emergencia de la resistencia al amitraz también fue lento después de su primera detección (Fragoso et al., 2004). Sin embargo, la prevalencia de resistencia al amitraz en México parece ser el doble que en Australia, y alcanzada en un período de tiempo más corto. Rodriguez-Vivas (2003) mostró un nivel de prevalencia al amitraz del 19,4% en el Estado de Yucatán. En Nueva Caledonia, el amitraz es utilizado en el 54% de las propiedades. Allí, un estudio realizado en 2003 usando la prueba del paquete de larvas (LPT, Larval Package Test) demostró resistencia en dos de los 21 establecimientos evaluados que estuvieron usando amitraz (Ducornez et al., 2005). Hay poca información de la prevalencia en África. Quizás, esto refleje el hecho que el amitraz es usado en menor medida que los PS y los organofosforados (OF), posiblemente debido a los múltiples huéspedes de garrapatas en ese continente, para los cuales los PS y OF siguen siendo razonablemente efectivos. Factores de riesgo para la resistencia al amitraz Hasta el momento, pocos factores de riesgo han sido confirmados para el desarrollo o aparición de resistencia al amitraz. Ducornez et al. (2005) advirtieron que uno de los dos establecimientos estudiados en Nueva Caledonia con resistencia al amitraz había estado usando el producto con una alta frecuencia y habría estado aplicando 86 tratamientos desde octubre de 1997 a octubre de 2003 cuando la resistencia fue finalmente identificada. Jonsson et al (2000), comprobaron que la probabilidad de resistencia al amitraz era más alta en la región central del Estado de Queensland. Esta probabilidad se incrementaba cuando en el año anterior se habían hecho más de cinco aplicaciones pero disminuía en aquellos 43

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campos que aplicaban los acaricidas a los animales mediante spray de mano. Este estudio fue realizado con base en un pequeño número de establecimientos resistentes por lo que debe ser interpretado con precaución. En 1998, los 12 productores lecheros de Queensland que habían tenido resistencia al amitraz fueron contactados para obtener información del movimiento de los animales dentro de sus establecimientos (observaciones no publicadas). Excepto dos de los 11 propietarios que contestaron la encuesta, el resto había comprado su ganado de campos adyacentes a establecimientos que posteriormente se supo tenían resistencia al amitraz. Esto sugiere que en Australia, la resistencia al amitraz surge en nuevas áreas como resultado de movimientos de animales más que por un nuevo desarrollo. Actualmente, en la Universidad de Queensland, estamos evaluando esta hipótesis usando un panel de 12 marcadores microsatélites aplicados a garrapatas provenientes de campos de distintas localidades, con y sin resistencia al amitraz. Usando análisis filogéneticos pretendemos determinar si las poblaciones de garrapatas con resistencia al amitraz de diversas localizaciones están más estrechamente relacionadas entre si que otras poblaciones no resistentes de la misma localidad. Si esta hipótesis fuera verdadera entonces la recomendación más importante para evitar la aparición de resistencia al amitraz sería la de mantener altos niveles de bioseguridad en el campo. Persistencia de resistencia y mecanismo de herencia Existe evidencia que sugiere que la resistencia al amitraz no se mantiene en poblaciones en las cuales la selección no es aplicada (Foil et al., 2004). Treinta y tres de 44 productores con resistencia confirmada al amitraz y con alguna evidencia de falla de la droga a campo volvieron a utilizar el amitraz aún después que la resistencia a este producto fuera confirmada; la frecuencia de tratamiento después que la resistencia fuera confirmada, no fue significativamente diferente. Nuestro estudio en curso sobre el manejo de resistencia al amitraz ha mostrado que el grado de resistencia indicado por el LPT fluctúa a lo largo del año, disminuye cada invierno y vuelve a incrementarse durante la temporada de garrapatas cuando la presión de selección es aplicada. Esta tendencia para la resistencia al amitraz que tiende a disminuir cuando la presión de selección no es aplicada sugiere que el mecanismo de resistencia viene con un costo en la tasa reproductiva. Hasta el presente no existe evidencia experimental firme que apoye esta hipótesis aunque una reducción en la producción de huevos ha sido documentada en México, en B. microplus resistente a piretroides sintéticos (Tapia-Perez et al., 2003). Es probable que el mecanismo de herencia sea un factor importante en la velocidad de aparición de la resistencia. La resistencia que es heredada de forma dominante es más probable que emerja más rápidamente que aquella que es heredada en forma recesiva. Asimismo, cuando la resistencia tiene características poligénicas también es más probable que aparezca en forma lenta. La naturaleza inestable del diagnóstico de resistencia al amitraz, la aparente imposibilidad para alcanzar resultados de análisis probit totalmente satisfactorios y los diversos efectos del amitraz en la garrapata como la mortalidad larval así como también la hiperactividad y el desprendimiento sugieren un rasgo poligénico (Kemp et al., 1999). El mismo trabajo describe un estudio para determinar si la resistencia al amitraz es dominante o recesiva en B. microplus. Se hicieron dos ensayos en corral donde el primero de ellos mostró un 98% de control en homocigotos susceptibles, 69% de control en garrapatas resistentes (presuntas homocigotas resistentes) y 79% de control en híbridos (presumidos heterocigotos). El segundo ensayo mostró 98 y 99% de control en 44

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garrapatas susceptibles y 92 y 95% de control en híbridos cuando se utilizó la dosis recomendada y el doble de la dosis recomendada de amitraz, respectivamente. Estos resultados son sugerentes de un modo de dominancia incompleto de herencia. Usando cepas brasileñas de B. microplus, un trabajo reciente de Li y colaboradores (2005) en los Estados Unidos, ha mostrado claramente que la herencia de resistencia al amitraz es recesiva en la cepa Santa Luiza, con un fuerte efecto maternal. La LC50 en homocigotas (SS) susceptibles (cepa Muñoz) fue 0,0024%, en garrapatas homocigotas resistentes Santa Luiza fue 0,45%, en heterocigotas provenientes de un padre susceptible y una madre resistente fue de 0,022% y en heterocigotas provenientes de un padre resistente y una madre susceptible fue 0,0089%. Entrecruzamientos posteriores indicaron desviaciones entre lo observado y esperado en mortalidades probit, tomado como evidencia de un mecanismo de resistencia poligénico. Es importante mencionar que los resultados de los estudios estadounidense y australiano, deben ser comparados con precaución ya que el australiano (Kemp et al., 1999) fue un ensayo en corral mientras que el estudio americano (Li et al., 2005) fue realizado usando el LPT. Los mecanismos de resistencia expresados en los dos sistemas podrían ser bastante diferentes. También es posible que puedan existir mecanismos diferentes en las dos cepas de garrapatas resistentes. Mecanismos de acción de las amidinas El modo de acción de las amidinas no es conocido. Varios blancos fueron propuestos incluyendo las monoamino oxidasas (MAO) (Knowles and Roulston, 1973) y el receptor de octopamina (Davenport et al., 1985; Baxter and Barker, 1999; Li et al., 2005). El trabajo de Baxter and Barker (1999) no aportó evidencia en apoyo de una mutación en el gen receptor de octopamina. Sin embargo, parece probable que por las ESTs (Expressed Sequence Tags) existentes en GenBank haya más de un gen receptor de octopamina en B. microplus. El trabajo de Shelly Hope y colegas en el CSIRO proporciona algunos indicios para que las MAO esté involucrada. Diagnóstico El valor predictivo positivo de la prueba del paquete de larvas (LPT) para falla del amitraz en el campo no parece ser particularmente alto. En un ensayo que actualmente estamos realizando sobre el manejo de la resistencia al amitraz, frecuentemente vemos resultados del LPT consistentes con altos niveles de resistencia. Sin embargo, a menudo obtenemos resultados satisfactorios cuando usamos el concentrado emulsificable comercial de amitraz correctamente diluido mediante la aplicación en spray a los animales, aunque muertes incompletas de ninfas y larvas son comúnmente observadas (observaciones no publicadas). Nolan (1981) describió poblaciones de garrapatas en las cuales el LPT indicaba reducida susceptibilidad al amitraz pero la eficacia era normal en estudios en corral. Cuando concentraciones de amitraz más bajas de lo habitual son usadas, el control de garrapatas es pobre comparado con garrapatas completamente susceptibles. Una falta de concordancia similar ha sido obtenida en B. decoloratus entre el test de inmersión larval de Shaw (Shaw Larval Immersion Test, SLIT) y resultados en campo (Taylor and Oberem, 1995). Las limitaciones técnicas de los actuales bioensayos han sido ampliamente documentadas. La prueba de inmersión de adultos aplicada a teleóginas con acaricidas comercialmente formulados no es apropiada para el diagnóstico de resistencia al amitraz, ya 45

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que no garantiza una concentración discriminatoria conveniente (Jonsson et al., 2003). Ante la falta de una respuesta lineal del amitraz en el LPT estándar, Thullner et al. (2000) describieron una prueba de dispersión usando un modelo de papel semejante a un tallo de hoja (paper grass stem model). Este modelo proporcionó respuestas lineales al amitraz pero no ha sido ampliamente adoptado. La prueba del paquete de larvas (LPT) ha sido eficazmente modificado mediante la introducción de formulaciones de acaricidas comerciales en lugar de formulaciones técnicas y por el reemplazo del papel de filtro por material de nylon (Miller et al., 2002). Ahora la prueba da resultados más exactos y repetibles, aunque todavía no ha sido adoptado por los laboratorios gubernamentales de Australia. No obstante, cualquiera sea la forma del LPT, es una prueba engorrosa y sería preferible poder usar otras pruebas de diagnóstico más rápidas como pueden ser los ensayos moleculares o bioquímicos. El progreso en el desarrollo de pruebas moleculares para la detección de resistencia al amitraz ha sido obstaculizado por la falta de conocimiento de los mecanismos de acción de los compuestos en la garrapata. Intentos tempranos para identificar mutaciones en el gen receptor de octopamina (Baxter and Barker, 1999) no fueron exitosos pero ahora que hay más información disponible sobre el genoma de la garrapata, podría ser de utilidad volver a intentarlo. Como se mencionó previamente, existe alguna evidencia de polimorfismos en los genes que codifican para MAO y la variación en los niveles de expresión podrían jugar un papel importante en la aparición de resistencia al amitraz. Se está trabajando al respecto para determinar si esto puede ser desarrollado como una prueba útil de diagnóstico. En todos los casos donde los tests de resistencia están basados en la identificación de un mecanismo adaptativo, es importante recordar que el bioensayo todavía es esencial. Los mecanismos de resistencia pueden variar y nuevas mutaciones pueden surgir. Por consiguiente, el resultado positivo de un test molecular es útil, pero una PCR negativa para una mutación dada o un ensayo enzimático negativo no nos dice que la población de garrapatas no es resistente al acaricida en cuestión. Conclusiones En años recientes, el entendimiento de la resistencia al amitraz ha progresado. Los avances en esta área del conocimiento han sido crecientes y todavía hay mucho por descubrir. Parece probable que la resistencia al amitraz sea poligénica y recesiva, así como también parece que existe un costo en la aptitud reproductiva debido a la resistencia al amitraz, permitiendo el manejo efectivo de las poblaciones resistentes a esta droga a través de una cuidadosa selección acaricida. El diagnóstico ha sido mejorado por recientes modificaciones en el LPT y no pasará mucho tiempo antes que ensayos moleculares o enzimáticos estén disponibles para el diagnóstico de la resistencia a ixodicidas. Agradecimientos. Muchas gracias a Christian Cutullé por la traducción al español de este manuscrito. Literatura citada Baxter, G.D. and Barker, S.C. 1999. Isolation of cDNA for an octopamine-like G-protein coupled receptor from the cattle tick, Boophilus microplus. Insect Biochem. Mol. Biol., 29: 461-467

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Benavides, E., Rodriguez, S.C., Romero, A. 2000. Isolation and partial characterization of the Montecitos strain of Boophilus microplus (Canestrini) multi-resistant to different acaricides. Ann. N.Y. Acad. Sci. 916: 668-671 Davenport, A.P., Morton, D.B., Evans, P.D. 1985. The action of formamidines on octopamine receptors in the locust. Pesticide Biochemistry and Physiology, 24: 4552 Ducornez, S., Barre, N., Miller, R.J., de Garine-Wichatitsky. 2005. Diagnosis of amitraz resistance in Boophilus microplus in New Caledonia with the modified larval packet test. Vet. Parasitol., 130: 285-292 Foil, L.D., Coleman, P., Eisler, M., Fragoso-Sanches, H., Garcia-Vazquez, Z., Guerrero, F.D., Jonsson, N.N., Langstaff, I.C., Li, A.Y., Machila, N., Miller, R.J., Morton, J., Pruett, J.H., Torr, S. 2004. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol., 125: 163-181 Fragoso, S.H., Martinez, I.F., Ortiz, N.A. YEAR. Situación actual de la resistencia a los ixodicidas en Mexico. Redectopar, 2004 Jonsson, N.N., Mayer, D.G., Green, P.E. 2000. Possible risk factors on Queensland farms for acaricide resistance in the cattle tick (Boophilus microplus). Vet. Parasitol., 88: 79-92 Jonsson, N.N., Miller, R.J., Finn, A., Verrall, R.G., George, J.E. 2003. Adult immersion tests of acaricide susceptibility in America and Australian strains of Boophilus microplus. In Garcia, Z.V., and Fragoso, H.S. (eds) V International Seminar in Animal Parasitology: World situation of parasite resistance in veterinary medicine, Merida, Yucatan, Mexico; 1 – 3 October, pp. 86-91 Kemp, D.H., McKena, R.V., Thullner, R., Willadsen, P. 1999. Strategies for tick control in a world of acaricide resistance. Proceedings of the IV International Seminar of Animal Parasitology, Puerto Vallarta, Mexico, October 20-22 1999. pp1-10 Knowles, C.O. and Roulston, W.J. 1973. Toxicity to Boophilus microplus of formamidine acaricides and related compounds, and modification of toxicity by certain insecticide synergists. J. Econ. Entomol., 6:1245-1251 Kunz,, S.E., and Kemp, D.H. 1994. Insecticides and acaricides: resistance and environmental impacts. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 13: 1249-1286 Li, A.Y., Davey, R.B., Miller, R.J., George, J.E. 2005. Mode of inheritance of amitraz resistance in a Brazilian strain of the southern cattle tick, Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Exp. Appl. Acarol., 37: 183-198 Miller, R.J., Davey, R.B., and George, J.E. 2002. Modification of the Food and Agriculture Organisation larval packet test to measure amitraz susceptibility against Ixodidae. J. Med. Entomol. 39: 645-651 Nolan, J. 1981. Current developments in resistance to amidine and pyrethroid tickicides in Australia. In: Whitehead, G.B., and Gibson, J.D. (Eds) Proceedings of tick biology and control conference. Tick Research Unit, Rhodes University, Grahamstown, South Africa, pp. 109-114 Rodriguez-Vivas, I. 2003. Prevalence and potential risk factors for amitraz resistance in Boophilus microplus ticks in cattle in the state of Yucatan, Mexico. In Garcia, Z.V., and Fragoso, H.S. (eds) V International Congress in Animal Parasitology: World

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Situation of Parasite Resistance in Veterinary Medicine. October 1-3, Merida, Mexico, pp. 32-36 Soberanes, N.C., Santamaria, M.V., Fragosos, H.S., and Garcia, Z.V. 2002. First case reported of amitraz resistance in the cattle tick Boophilus microplus in Mexico. Tec. Pecu. Mex. 40: 81-92 Tapia-Perez, G, Garcia-Vasquez, Z., Montaldo, H., George, J.E. 2003. Inheritance of resistance in he Mexican Aldama strain of the cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). Exp. Appl. Acarol. 31: 135-149 Taylor, R.J. and Oberem, P. 1995. Some characteristics of an amitraz resistant strain of Boophilus decoloratus originating from the Republic of South Africa. In Coons, L. Rotchild, M. (Eds) Proceedings of the second international conference on tick-borne pathogens at the host-vector interface – a global perspective. Kruger National Park, South Africa, August 28 to September 1, p 62 Thullner, F., Kemp, D.H., McKenna, R.V., Willadsen, P. 2000. Dispersal test for the diagnosis of amitraz resistance in tick larvae (Boophilus microplus). In Kazimirova, M., Labuda, M., Nuttall, P.A. Proceedings of the third international conference Ticks and Tick-Borne Pathogens: Into the 21st Century, pp. 205-208

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DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA RESISTENCIA A PIRETROIDES EN LA GARRAPATA Boophilus microplus EN MÉXICO. Advances in the Molecular Detection of Pyrethroid Resistance in The Cattle Tick Boophilus microplus in Mexico. Rosario-Cruz, R., y Dominguez-García D.I. Centro Nacional de Investigación Disciplinaria em Parasitologia Veterinaria. INIFAP. Km. 11.5 Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla, Col. Progreso, C.P. 62550. Jiutepec, Mor., Mexico. [email protected]. PALABRAS CLAVE: Boophilus microplus, Acaricide resistance, Pyrethroids. Introducción Las garrapatas Boophilus microplus encuentran ampliamente distribuidas en regiones tropicales del mundo. Son los ectoparásitos de mayor importancia por su capacidad para producir daño, su amplia distribución y la cantidad de ganado que afectan (Castellanos, 1996). Por su importancia económica y sanitaria las infestaciones debidas a garrapatas Boophilus microplus se han tratado de combatir empleando diferentes métodos como el químico, biológico y cultural. Sin embargo, en el mundo se ha privilegiado el uso de acaricidas sobre cualquier otro, utilizando diversos productos que incluyen, arsenicales, organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides, amidinas cíclicas e ivermectinas (Aguirre, 1987; FAO, 1987). Estos ixodicidas, han sido utilizados con éxito, pero su uso continuo ha ocasionado la selección de poblaciones resistentes a la acción de estos productos químicos (Nolan y Schnitzerling, 1986). En la actualidad el control químico se ha vuelto ineficaz en algunas regiones debido a la aparición de garrapatas resistentes a estos productos, haciendo imposible el control de este tipo de poblaciones. Uno de los métodos autorizados por la FAO (Food and Agricultural Organization of the United Nations) para la detección de resistencia es el ensayo de paquete de larvas, el cual posee serias limitaciones como su poca sensibilidad para detectar alelos de resistencia, el personal que realiza los ensayos son expuestos a los pesticidas y el largo tiempo que se requiere para obtener los resultados que pueden ser hasta de 50 días. Esto pone de manifiesto la importancia de realizar investigaciones en busca de alternativas usando técnicas moleculares como herramientas para un rápido diagnóstico y detección de alelos de resistencia en poblaciones de garrapatas, que permitan diseñar y establecer programas de control estratégico en forma eficiente. Importancia económica de las garrapatas Boophilus microplus A través de su acción directa o del efecto indirecto sobre la producción animal, las garrapatas causan graves pérdidas a la ganadería bovina. Su efecto directo sobre la producción resulta por el daño en las pieles, pérdida de sangre y al efecto inmunosupresor de la saliva. El daño directo en la piel es causado por el piquete y los abscesos que desarrolla y en consecuencia una apreciable pérdida en el valor de las pieles. En el caso de las vacas lecheras, los abscesos frecuentemente están involucrados en el daño y la pérdida de uno o mas cuartos de la glándula mamaria con la consecuente disminución de la producción de leche (Quiroz, 1991). 49

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Las garrapatas también tienen un nocivo efecto directo en la ganancia de peso de los bovinos. En el ganado de engorda cada garrapata adulta ha demostrado reducir la ganancia de peso diaria en 0.6 g. (Sutherst., 1983). Las pérdidas atribuidas a Boophilus microplus por disminución en la ganancia de peso se han estimado en 7.3 dólares/cabeza/año (FAO, 1987). Así mismo, las garrapatas producen bajas en la fertilidad, mayor tiempo en la engorda y dificulta la importación de razas mejoradas para incrementar la calidad genética en áreas infestadas (Vega, 1991). El efecto indirecto esta dado por las enfermedades que transmiten. En México la garrapata Boophilus microplus, común en el ganado, transmite tres agentes de importancia en la ganadería: Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale (Rodriguez y Domínguez., 1988). Vega, (1991) menciona que las pérdidas económicas que provoca la anaplasmosis y la babesiosis bovina en México son de 48 millones de dólares anualmente. Uso de ixodicidas para el control de las garrapatas El método mas utilizado para el control de las garrapatas Boophilus microplus ha sido el uso de compuestos químicos llamados garrapaticidas o ixodicidas, los cuales se aplican sobre el cuerpo del hospedero a intervalos específicos determinados por la región ecológica, especies a las que se va a combatir y eficacia residual del ixodicida (FAO, 1979). La aplicación tópica ha sido principalmente a través de baños de inmersión y aspersión, las preparaciones epicutáneas son ixodicidas concentrados que se aplican directamente sobre la piel de los bovinos y actúan después de dispersarse sobre la superficie del animal o después de absorberse a través de la piel e ingestión por el artrópodo. Entre las principales familias de productos que se han utilizado para el control de las garrapatas incluyen los arsenicales, organoclorados, órgano fosforados, carbamatos, piretroides, amidinas cíclicas e ivermectinas (FAO, 1987). Uso de piretroides en el control de Boophilus microplus El control de las garrapatas Boophilus sp en México tiene su origen en los años 20´s, pero fue hasta 1972 cuando se normó un programa para liberar 2.5 millones de hectáreas en el estado de Sonora, estableciéndose así las características técnicas de lo que sería el Programa de Control y Erradicación (Bustamante, 1999). En 1975 El Gobierno Federal creo el Fideicomiso de la Campaña Nacional Contra la Garrapata (FCNCG), planteando la utilización de baños de inmersión por períodos de 14 a 21 días de acuerdo a la zona geográfica, utilizando compuestos organofosforados como los ixodicidas autorizados para dicho control (Castellanos,1993). En 1981, el control químico de las garrapatas se enfrentaba a uno de los problemas más graves, por primera vez fue documentada en México la resistencia en las poblaciones de garrapatas Boophilus microplus a partir de fallas de control en la zona del Golfo de México en la región de Tuxpan, Veracruz, por lo que se procedió a realizar el diagnóstico correspondiente, demostrándose así el primer caso de resistencia a organofosforados (Aguirre y Santamaría, 1986). Debido a la aparición de cepas de garrapatas resistentes a organofosforados en México, en 1986 se permitió la comercialización de nuevos ixodicidas que fueron los piretroides (PS) y amidinas, siendo los primeros los de mas amplio uso debido a su poder residual, su efecto insecticida y su estabilidad en baños de inmersión (Aguirre, 1987).

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Las piretrinas naturales con actividad insecticida fueron extraídas de la flor del crisantemo (Chrysantemum cinaerifolium) (Tessier, 1983). La eficacia insecticida de las piretrinas se demostró desde 1935; pero debido a las características indeseables como inestabilidad a la luz, al calor y elevados costos de producción, su uso se generalizó hasta 1973. (Núñez et al., 1982). A partir de los años 80, los piretroides han sido utilizados en una mayor proporción debido a su baja toxicidad para mamíferos, casi nula acumulación en el ambiente y gran utilidad en el combate contra los parásitos. Estos principios poseen en su fórmula estructural dos ácidos y dos alcoholes. Los ácidos son el crisantemico y el pirétrico y los alcoholes son la piretrolina y la senerolona, estos fueron sintetizados a partir del polvo de flores secas del Crysantemum coccineum y el C. cinerariaefolium que son el principio activo de los piretroides (Tessier, 1983). Los piretroides son poco tóxicos para los mamíferos y muy tóxicos para los insectos y fauna acuícola, debido a que tienen un coeficiente de selectividad alto (Núñez et al., 1982). El mecanismo de acción de los piretroides consiste en actuar a nivel del sistema nervioso central y periférico presentando primero una fase de intensa agitación, seguida de una inmediata parálisis general, dando lugar a un efecto de choque conocido también como “efecto de derribe” y posteriormente la muerte (Nolan, 1981). Se ha propuesto que los piretroides tienen una acción sobre los ganglios nerviosos periféricos provocando una despolarización total del sistema nervioso, lo que induce una actividad motriz no coordinada y caracterizada por excitación, seguida de parálisis y finalmente la muerte, la absorción de las piretrinas es rápida, por contacto; penetra a través de los orificios de las tráqueas, cutícula, antenas o alas de los insectos. Resistencia a pesticidas en artrópodos Uno de los problemas más importantes a los que se enfrenta el control químico de las garrapatas, es el desarrollo de la resistencia a los ixodicidas, como ha ocurrido en casi todos los países en donde se han usado por largos períodos (Sutherst, 1989), es decir que en la mayoría de los casos estos productos propiciaron alteraciones en las garrapatas que conducen a través del fenómeno de selección genética a una adaptación, que les permite sobrevivir bajo nuevas condiciones ya sean artificiales ó naturales impuestas, por esta razón definimos a la resistencia como: “La condición genética que le confiere a una población de artrópodos, la capacidad para adaptarse exitosamente a un ambiente tóxico a partir de un proceso de selección, promovido artificialmente y/o naturalmente”. Ya que invariablemente la evolución genética de las especies de artrópodos en la naturaleza, ha conducido a un grado de especialización por las especies vegetales depredadas y concomitantemente, a un grado de especialización de la maquinaria metabólica propia de los artrópodos, que en la medida en que el proceso se repite en la naturaleza, genera un proceso de acumulación genética que hace que las especies se vuelvan menos susceptibles a las sustancias aleloquímicas producidas por las plantas de las cuales se alimentan, lo cual le confiere la capacidad de sobrevivir. Este evento se repite, aunque de manera artificial cuando tratamos de controlar a las especies de importancia agrícola médica y veterinaria mediante la utilización de diferentes moléculas químicas comúnmente llamadas pesticidas. Las especies tratadas, haciendo uso de un gran repertorio de enzimas previamente diseñadas para detoxificar compuestos que pongan en peligro la sobrevivencia del artrópodo y que forman 51

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parte de su maquinaria metabólica, repiten este proceso, que en la naturaleza le ha tomado millones de años, en unas cuantas décadas en las cuales el hombre ha inducido, la reaparición de genes a partir de esta “selección natural” inducida de manera artificial y de esta manera ha producido artrópodos resistentes contra casi cualquier molécula de las que actualmente se usan como pesticidas. Estado actual de la resistencia a la familia de los piretroides La selección de los genes asociados con la resistencia en poblaciones de artrópodos plaga es la consecuencia de la utilización repetida de pesticidas y la aparición de la resistencia en una población, es una de las mayores amenazas que va a frenar el uso eficiente de los pesticidas para seguir controlando plagas de importancia agrícola y vectores de enfermedades en humanos y animales. En el caso de Boophilus microplus, se han demostrado dos principales tipos de resistencia a los piretroides. Uno es el incremento en la detoxificación metabólica y el otro es la insensibilidad del sitio blanco ocasionado por la presencia de una mutación en el canal de sodio, la cual es diferente que la mutación tipo Kdr, la cual ha demostrado ser la causa de la resistencia a piretroides en varias especies de artrópodos como Drosophila melanogaster, Musca domestica y Boophilus microplus (Pittendrigh et al. 1997; Williamson et al. 1996; Miller et al. 1999, He et al. 1999, Jamroz et al. 2000, y Guerrero et al., 2001). La respuesta fenotípica de las larvas evaluadas por el bioensayo de paquete de larvas (LPT) de las poblaciones estudiadas correlacionaron significativamente con la presencia de una mutación en el canal de sodio detectada por medio de la prueba de PCR. Por lo tanto, el ensayo de PCR para realizar la genotipificación de larvas individuales resistentes a piretroides, detectaron confiablemente la presencia de individuos resistentes conteniendo la alteración en el canal de sodio en las muestras obtenidas del Estado de Yucatán y este mecanismo, estuvo involucrado en la resistencia a piretroides en las poblaciones analizadas (Rosario-Cruz et al, 2005). Se ha demostrado que la resistencia mediada por esterasas es un mecanismo importante en los procesos de detoxificación de piretroides y organofosforados en varios insectos y especies de garrapatas incluyendo a Boophilus microplus, pero el mecanismo específico mediante el cual la resistencia es conferida no ha sido elucidada (Rosario-Cruz et al. 1997, Jamroz et al. 2000, Hemingway et al. 1993, Downs et al. 2000, Zhu 2004). En estudios realizados recientemente por nuestro equipo de trabajo, no se encontró correlación entre la actividad de esterasas y la resistencia a piretroides en poblaciones provenientes del estado de Yucatán (Rosario-Cruz, et al 2005). Sin embargo, el uso del bioensayo de DD el cual se define como dos veces la concentración letal 99.9% (CL99.9) puede ser que dificulte encontrar una correlación entre la actividad de esterasas y la resistencia a piretroides. Miller et al (1999) demostraron que la magnitud de la resistencia es mucho menor en poblaciones de Boophilus microplus en las cuales estaban implicadas las esterasas como el principal mecanismo de resistencia a piretroides que las poblaciones en las cuales el mecanismo de modificación del canal de sodio es el responsable. Por lo tanto, la concentración utilizada en el bioensayo puede ser que sea lo suficientemente alto para matar a la fracción de la población en la cual las esterasas son la principal causa de la resistencia. Aún cuando, la actividad metabólica incrementada, mediada por esterases ha sido documentada como un mecanismo de resistencia a piretroides, y así como también se ha documentado la secuencia del gen de una esterasa con capacidad para hidrolizar piretroides, específicamente en el caso de la cepa Coatzacoalcos (Pruett et al, 2002; Hernández et al, 2002; Jamroz et al, 2000) no se puede inferir a partir de este estudio que el mecanismo de resistencia mediado por esterasas es un 52

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mecanismo común para el caso de los piretroides en el estado de Yucatán, aunque no se puede excluir, su participación en los procesos de detoxificación de compuestos organofosforados, los cuales en este estudio no han sido considerados. Conclusiones Los estudios mas recientes en el estado de Yucatán han puesto de manifiesto que el principal, mecanismo de resistencia a la familia de los piretroides es conferida por la presencia de una mutación en el canal de sodio ya que se ha encontrado un alto grado de asociación entre la frecuencia de alelos y la mortalidad larval. Los estudios realizados en el municpio de Coahuayutla del Estado de guerrero, demuestran también que existe una situación grave de resistencia a piretroides encontrandose frecuencias alélicas del alelo mutado del canal de sodio superiores al 90%, lo cual pone de relieve la importancia de implementar estudios de resistencia con el fin de diseñar métodos de control que nos permitan mitigar el problema de la resistencia a ixodicidas con criterios estrictamente científicos. Agradecimientos Los estudios incluidos en este trabajo fueron financiados por el programa de CONACYT-SAGARPA, mediante el proyecto SAGARPA-2002-C01-1447 bajo la responsabilidad del Dr. Rodrigo Rosario Cruz. Literatura citada Aguirre, E.J. 1987. Detección de brotes de resistencia en poblaciones de garrapatas durante una campaña de erradicación, con especial referencia a las Américas. Consulta de expertos sobre la erradicación de las garrapatas. México. D.F. Editorial. FAO. Aguirre, E.J., y V.M. Santamaría. 1986. Purificación y caracterización toxicológica de garrapatas Boophilus microplus resistentes a ixodicidas organofosforados y organoclorados. VII Reunión anual. Asoc. Mex. Parasitol. Vet. A.C. Ciudad Victoria, Tamaulipas. México. Bustamante, G.A. 1999. Situación Actual de la Campaña Nacional Contra la Garrapata en México. En: IV Seminario Internacional de Parasitología. Control de la resistencia en garrapatas y moscas de importancia veterinaria y enfermedades que transmiten. García, V.Z., Fragoso, S.H., Eds. 20-22 octubre. Puerto Vallarta, Jalisco, Medico. pp. 4750. Castellanos, J.L.H. 1996. El género Boophilus. Manual de acreditación técnica para la aprobación de Médicos Veterinarios como unidades de verificación en la Campaña Contra la Garrapata. Tomo I. FEDMVZ: México. pp. 36- 51. Downs, A. M., K. A. Stafford, , I. Harvey, and G.C. Coles. 2000. Evidence for double resistance to permethrin and malathion in head lice. Br. J. Dermatol. 142:1066-1067. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 1979. Recommended methods for the detection and measurement of resistance. FAO, Rome. 1, 246–249. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 1987. Epidemiology of tick-borne diseases: epidemiological parameters and their application to the control of tick-borne disease control. A practical field manual. Vol. II. Rome: FAO/WHO. pp. 373-381.

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Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 1999. Resistance of Ecto and Endo-parasite: Current and future solution, 67th General session. International Comite. OIE, Paris, France. 17-21. Guerrero, F. D., R. B. Davey, and R. J. Miller. 2001. Use of an allele-specific polymerase chain reaction assay to genotype pyrethroid resistant strains of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae), J. Med. Entomol. 38: 44–50. He, H., A. C. Chen, R. B. Davey, G. E. Ivie, and J. E. George. 1999. Identification of a point mutation in the para-type sodium channel gene from a pyrethroid-resistant cattle tick. Biochem. Biophys. Res. Com. 261: 558–561. Heminway, J., S.J. Dunbar, A.G. Monro, and G.J. Small. 1993. Pyrethroid resistance in German cockcroaches (Dyctioptera: Blattelidae): resistance level and underlying mechanisms. J. Econ. Entomol. 86: 1631-1638. Hernández, R., F.D. Guerrero., J.E. George, G.G. Wagner. 2002. Allele frequency and gene expression of a putative carboxylesterase-encoding gene in a pyrethroid resistant strain of the tick Boophilus microplus. Insect Biochem. Mol. Biol. 32:1009-1016. Jamroz, R. C., F. D. Guerrero, J. H. Pruett, D. D. Oehler, and R. J. Miller. 2000. Molecular and biochemical survey of acaricide resistance mechanisms in larvae from Mexican strains of the southern cattle tick, Boophilus microplus. J. Insect Physiol. 46: 685–695. Jamroz, R.C., F.D. Guerrero, D.M. Kammlah and S.E. Kunz. 1998. Role of the kdr and super.kdr sodium channel mutations in pyrethroid resistance: correlation of allelic frecuency to resistance level in wild and laboratory populations of horn flies (Haematobia irritans). Insect Biochem. Mol. Biol. 28, 1031-1037. Miller, R. J., R. B. Davey, and J. E. George. 1999. Characterization of pyrethroid resistance and susceptibility to coumaphos in Mexican Boophilus microplus (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 36: 533–538. Nolan, J. 1981. Current developments on resistance to amidine and pyretroid tickicides in Australia In: Whitehead, G.B. and Gibson, J. D., eds. Tick biology and control. Univ. Rodees–Grahamstown South Africa. pp. 109–114. Núñez, J.L., E. Muñoz-Cobeñas y H.L. Moltedo. 1982. Boophilus microplus: la garrapata común del ganado vacuno. Uruguay: Hemisferio Sur. p. 84. Pittendrigh, B., R. Reenan, R.H. ffrench-Constant, and B.Ganetzky. 1997. Point mutation in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and Pyrethroid insecticides. Mol. Gen. Genet. 256:602-610. Quiroz, R.H. 1991. Situación actual de la problemática de las garrapatas. II Seminario Internacional de Parasitología Animal. Garrapatas y enfermedades que transmiten. Morelos, México. pp. 3-7. Rodríguez, V.R.I. y A.J.L. Domínguez. 1988. Grupos entomológicos de importancia veterinaria en Yucatán, México. Rev. Bioméd. 9, 26-37. Rosario-Cruz, R., M.E. Miranda, V.Z. Garcia, and E.M. Ortiz. 1997. Detection of esterase activity in susceptible and resistant Boophilus microplus tick strains. Bull. Entomol. Res. 87, 197-202 Rosario-Cruz, R., Felix D. Guerrero, Robert J. Miller, Rodriguez-Vivas, R.I., DomínguezGarcía, D.I., Anthony J. Cornel, Hernandez-Ortiz, R., John E. George (2005) Roles Played by esterase activity and by a sodium channel mutation envolved in pyrethroid Resistance in populations of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) collected from Yucatán, Mexico. J. Med. Entomol. 42(6) 1020-1025. 54

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Sutherst, R.W. 1989. Resistence of cattle ticks as one element in tick control programe. The eradication of tick. FAO. Rome, Italy. Pp. 154-164. Tessier, J. 1983. Monograph Deltametrhin, by Roussel UCLF, 1. Vega, M.C. 1991. Actualidad e importancia de las enfermedades del ganado causadas por hemoparásitos En: II Seminario Internacional de Parasitología Animal. Garrapatas y enfermedades que transmiten. Del 9 al 11 de octubre de 1991, Oaxtepec, Morelos, México. pp. 144-150. Williamson, M.S., D. Martinez-Torres, C.A. Hick, and H.L. Devonshire. 1996. Identification of Mutations in the house-fly para-type sodium channel gene associated with Knockdown resistance (Kdr) to pyrethroid insecticides. Mol. Gen. Genet. 252: 51-60. Zhu, Y.C., G.L. Snodgrass, and M.S. Chen. 2004. Enhanced esterase gene expression and activity in a malathion-resistant strain of the tarnished plant bug, Lygus lineolaris. Insect Biochem. Mol. Biol. 34: 1175-118

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AVANCES EN EL CONTROL INMUNOLÓGICO DE LA GARRAPATA Boophilus microplus. Advances in the Immunological Control of the Cattle Tick Boophilus microplus. Rubén Hernández Ortiz, CENID-Parasitología Veterinaria. INIFAP Km. 11.5 Carretera Federal Cuernavaca Cuautla Km. 11.5, Col. Progreso Jiutepec, Morelos México. PALABRAS CLAVE: Ticks, vaccine, Boophilus microplus. Introducción Las garrapatas son los ectoparásitos más importantes para la industria ganadera en el mundo, no solo por los daños directos que ocasionan como son la disminución en la producción de carne y leche, los daños a pieles, la predisposición a infecciones secundarias en el sitio de alimentación, toxicosis, parálisis y reacciones alérgicas, sino que además son vectores de virus, bacterias, ricketsias y protozoarios causantes de enfermedades (Jongejan et al., 1994). De las más de 899 especies de garrapatas conocidas en el mundo (Barker & Murrell, 2004), en México se han identificado 77 en animales domésticos y silvestres, cinco especies de la familia Argasidae o garrapatas blandas y 72 especies de la familia Ixodidae o garrapatas duras. Trece especies ixodidas son las de mayor frecuencia e importancia para la industria ganadera de nuestro país, incluyendo a la garrapata Boophilus microplus (Solis, 1986). Esta especie conocida como la garrapata común del ganado, se encuentra distribuida en regiones tropicales y subtropicales alrededor del mundo, entre los paralelos 30º de latitud norte y 40º de latitud sur, incluyendo gran parte de América, África, Asia y Australia (Núñez et al., 1982). Los métodos de control utilizados para B. microplus han incluido quema controlada de potreros, control biológico como parasitoides, hongos o nemátodos, control químico con acaricidas aplicados ya sea en forma tópica o sistémica y mas recientemente el uso de vacunas. El método más utilizado y que mejores resultados había dado fue el uso de ixodicidas químicos, desafortunadamente en años recientes su uso continuo ha seleccionado alelos resistentes en poblaciones de garrapatas en diferentes partes del mundo incluyendo México (Nolan y Schnitzerling, 1986), además de los problemas de alto costo, toxicidad para mamíferos, residualidad en productos para consumo humano y contaminación ambiental. Por otro lado el uso de vacunas como método preventivo es una herramienta relativamente nueva que ha arrojado resultados alentadores en diversas regiones del mundo, en un limitado número de casos, la inmunidad se ha duplicado por vacunación con antígenos recombinantes (Willadsen, 2004). Las ventajas de las vacunas es que tienen efecto de larga duración, no representan complicaciones de residualidad en animales ni de contaminación ambiental, la posibilidad de resistencia es mucho menos probable en desarrollarse y tiene la ventaja de actuar sobre blancos muy específicos (Pruett, 1999). En esta revisión se presenta un panorama general de los antígenos utilizados actualmente y aquellos en fase experimental, potencialmente útiles para el diseño de vacunas contra garrapatas.

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Inmunidad natural contra garrapatas Actualmente el control con pesticidas químicos y animales genéticamente resistentes a garrapatas se presenta como una alternativa, sin embargo, conservar la resistencia a garrapatas a la vez que características productivas deseables, tales como la producción de carne y leche podría ser difícil de conjuntar en un mismo hato. La inmunidad o resistencia a garrapatas se manifiesta como una reducción en el número de garrapatas repletas, en el peso de hembras ovigeras y una disminución de la oviposición y la eclosión, lo que finalmente conduce a una disminución del índice reproductivo. En primera instancia la garrapata produce sustancias que actúan sobre los tejidos del huésped en el sitio de la lesión, la saliva de garrapatas incluye sustancias anestésicas que reducen la actividad de defensa del huésped, cemento que ayuda a la fijación y alimentación de la garrapata y sustancias anticoagulantes que ayudan a mantener un flujo constante de alimento, además elementos farmacoactivos como bradiquinina, anafilatoxina e histamina. Las glándulas salivales también actúan como osmoreguladores al eliminar el excedente de agua y mantener el balance iónico interno (Cruz et al., 1995). Por su parte, en condiciones naturales la respuesta del huésped ante la agresión del artrópodo consiste en reparar el daño y eliminar al parásito, lo cual se ve reflejado en una reacción de hipersensibilidad inmediata en el sitio de unión con infiltración de neutrófilos, eosinófilos, basófilos y degranulación de células cebadas con liberación de histamina, produciendo un desprendimiento de la mayoría de las larvas en las primeras horas después del contacto, principalmente en animales que han adquirido resistencia, además de una respuesta de coagulación con el fin de reparar la lesión (Preston y Jongejan, 1999). Sin embargo, estudios recientes en Rhipicephalus appendiculatus han identificado proteínas con una alta afinidad a la histamina, posiblemente como un mecanismo para contrarrestar el efecto de rechazo del huésped (Willadsen y Jongejan, 1999). Hay evidencia que el suero de animales expuestos a garrapatas, reconocen varios antígenos, algunos con reacción cruzada entre especies, sin embargo, se desconoce si están relacionados con protección cruzada, ya que los antígenos protectivos de la inmunidad natural no han sido identificados (Willadsen y Jongejan, 1999). Se debe mencionar que la respuesta inmune como la producción de anticuerpos no siempre es protectiva y los hallazgos en ratones y conejos no siempre aplican a bovinos. Es difícil diferenciar reacciones inmunológicas protectivas de aquellas que son solo reacciones inducidas por el parásito que no confieren protección, aún una fuerte reacción humoral puede estar dirigida a antígenos no protectivos, aunque como veremos más adelante con vacunas específicas como la Bm86 los títulos de anticuerpos y la protección correlacionan en forma positiva. Desafortunadamente durante la infestación natural están presentes tanto inmunógenos como agentes inmunosupresores de saliva y glándulas salivales, reduciendo la respuesta inmune protectora o suprimiéndola. La vacunación elimina esta posibilidad (Willadsen y Jongejan, 1999). De esta forma, la inmunosupresión en el huésped aumenta las posibilidades de transmisión de enfermedades, su efecto se caracteriza por un decremento en la respuesta primaria de anticuerpos hacia los antígenos dependientes de células T, con un decremento en la producción de citocinas de células T cooperadoras tipo1 (Th1) y una alta producción de citocinas Th2 (Wikel, 1996).

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El aspecto negativo de la exposición natural a los parásitos es la improbabilidad que la respuesta inmune pueda desarrollar una respuesta a los antígenos ocultos, lo que implica continua vacunación para mantener la inmunidad. Antígenos crudos y de glándulas salivales Los primeros intentos para inmunizar contra garrapatas consistieron en inocular macerados de extractos crudos del parásito completo, evidentemente había respuestas variables de protección, ya que el huésped estaba expuesto a un gran número de antígenos difíciles de identificar (Trager, 1939). Posteriores intentos se encaminaron a imitar la infestación natural, principalmente con glándulas salivales completas y sus extractos ya que son los antígenos que tienen contacto con el mamífero. En Haemaphysalis longicornis se encontró una proteína de 29-kDa similar a colágeno, posiblemente esta relacionada a la formación de cemento en el sitio de la lesión. El cemento es de los primeros compuestos inyectados en el sitio de alimentación 5 a 30 minutos después de la fijación. La proteína se ha considerado un blanco importante como inmunógeno, mostrando un buen desempeño al inocular el antígeno recombinante con un buen adyuvante y dosis adecuada. Los autores (Mulenga et al., 2000) sugieren que la protección sería incrementada al usar una combinación de varios antígenos mediando funciones fisiológicas ya sea en forma independiente o sinérgica. En diversas especies de garrapatas se han identificado en la saliva proteínas inhibidoras de factores de la coagulación, principalmente contra factor Xa y factor de agregación de plaquetas, estos inhibidores de la cascada de la coagulación en mamíferos se han considerado como posibles candidatos de antígenos vacunales, pero los estudios necesitan ser profundizados (Mulenga et al., 2000). Wang y Nutall han caracterizado un grupo de proteínas que se unen específicamente a las inmunoglobulinas del huésped. Se ha sugerido que estas proteínas están involucradas en la secreción específica de inmunoglobulinas ingeridas por la garrapata que han pasado del intestino a la hemolinfa como una forma de evitar el efecto anti-garrapata que podría ser tomado durante la alimentación con sangre. La situación parece más compleja que esto. Aún así, se considera a este grupo de proteínas para ser utilizadas como un blanco apropiado para el desarrollo de vacunas (Wang y Nutall, 1999). Proteínas derivadas de glándulas salivales muestran variación de individuo a individuo, además de la variación de especie a especie, así como cambios dinámicos durante el proceso de alimentación de las garrapatas. Desde el punto de vista vacunal las serin proteasas son atractivas no solo porque están involucradas en procesos digestivos, sino además en activación del complemento, coagulación de la sangre y muchos aspectos relacionados con el sistema inmune del huésped. Otros compuestos en saliva son un homólogo del Factor inhibitorio de migración de macrófagos (MIF), identificado en A. americanum, o la proteína IRIS, proteína recombinante de Ixodes ricinus capaz de inhibir la producción de IFN-gamma (Leboulle et al. 2002). Ambas, proteínas atractivas como antígeno vacunal, ya que actúan como un componente del sistema inmunomodulatorio del parásito hacia el huésped. Inhibidores de proteinasas en B. microplus han demostrado que tienen inhibición del complemento (Willadsen & Riding, 1980); por otro lado se ha caracterizado otra proteína anticomplemento de la saliva de I. scapularis (Valenzuela et al. 2000).

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Antígenos ocultos Galun (1975) fue el primero en sugerir el estímulo de la producción de anticuerpos contra moléculas internas de artrópodos tales como hormonas, las cuales serían neutralizadas durante la alimentación del parásito en animales inmunizados. El término de antígenos ocultos (concealed antigens) se refiere a moléculas del parásito las cuales no tienen contacto con el huésped durante el desarrollo de una infestación natural. De esta forma se estarían inhibiendo procesos en la garrapata que en condiciones naturales no serían afectados por el sistema inmune del huésped. En años recientes se han probado diversos antígenos internos de garrapatas que han probado ser protectivos. Una de las especies más estudiada es B. microplus debido a su alto impacto en la economía de los países ganaderos. De esta especie se aisló el Bm91, identificada como una carboxilpeptidasa involucrada en el metabolismo de proteínas y hormonas y la BmA7 una proteína con características similares a mucina, la cual se piensa participa para la formación del cemento celular en el sitio de alimentación (Willadsen, 1997; McKenna et al., 1998). Del mismo modo se han probado como antígenos, diversas enzimas de otras garrapatas. Una pro-catepsina que es precursor de enzimas proteolíticas, una hexosaminidasa que utiliza el artrópodo en la hidrólisis de oligosacáridos y otros antígenos de función desconocida (Mulenga et al., 2000). También se encontró una superfamilia de inhibidores de serin-proteasas (serpins) en garrapatas, que actúan como posibles moduladores de la defensa antiparasitaria en mamíferos, en este caso se sabe que el genoma de Drosophila contiene aproximadamente 400 serin-proteasas, con este número se piensa será difícil seleccionar la proteasa correcta como antígeno vacunal (Mulenga et al., 2001). Otro potencial antígeno interno de vital importancia para el artrópodo es la vitelina, que ha resultado en una reducción de la oviposición en B. microplus alimentadas sobre ovinos inmunizados (Tellam et al., 2002). Se ha pensado que la vitelina dadas las altas concentraciones de la proteína y su tendencia a fijar materiales en forma inespecífica, hay dudas que los efectos no sean debidos a pequeñas cantidades de material contaminante. Estudios posteriores demostraron que una forma recombinante hexaHis de la proteína, que fue incorrectamente doblada y no glicosilada, no tuvo efecto significativo como antígeno vacunal. Alternativamente se sabe que vitelina se une al grupo heme (Tellam et al. 2002). En trabajos previos (Da Silva et al., 1998) aislaron un precursor de una proteasa aspártica de huevos de B. microplus, la cual es secretada como proenzima en hemolinfa y activada en huevo, se cree que actúa en la degradación de vitelina, a la vacunación genera una protección de 14 a 36%. El uso de vitelina-proteasa en una vacuna polivalente tendría un efecto sinergista al interferir con la vitelogénesis en diferentes puntos del procesamiento de la proteína para su utilización por el embrión, hipótesis que es necesario probar en condiciones experimentales. Los ejemplos anteriormente citados son solo unas pocas de posibilidades, donde se ha demostrado ya sea algún efecto de vacunación o la caracterización molecular de una proteína sugestiva de ser útil como antígeno vacunal. Los antígenos de intestino de garrapatas han sido una de las fuentes más usadas para la obtención de antígenos ocultos. Inmunización con antígenos de intestino ha demostrado una mejor protección que aquella inducida por antígenos de glándulas salivales, utilizando garrapatas Rhipicephalus sanguineus, R. appendiculatus y Hyalomma marginatum (Willadsen y Jongejan, 1999).

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Vacunas comerciales contra garrapatas Para el caso de B. microplus actualmente existen dos vacunas comerciales, una australiana y una cubana que utilizan el antígeno recombinante denominado Bm86. El gene identificado codifica para una molécula de 650 aa, con un peso molecular de 71.7 kDa como proteína no procesada, conteniendo cuatro sitios potenciales de glicosilación, sugestivo de transporte a la superficie de la célula, a la fecha no se han detectado secuencias similares en las bases de datos de proteínas que puedan sugerir su función potencial. El antígeno esta presente en todos los estadios desde huevos hasta adultas repletas y se localiza en la superficie de células intestinales de B. microplus. El hecho que la vacuna afecta más a garrapatas adultas puede ser consecuencia del volumen de sangre ingerida mas que a la presencia o ausencia del antígeno. No se han definido los epitopes protectivos, sin embargo se han aislado peptidos de 14-15 aa que protegen a la infestación contra garrapatas en más de 72%. El mecanismo de acción del Bm86 posiblemente se debe a la formación de complejos Ag-Ac que con la intervención del complemento ocasiona daño al tejido intestinal de la garrapata, ya que la proteína se encuentra involucrada en procesos de endocitosis, sin embargo, esto no ha sido completamente probado (Willadsen, 2001). El antígeno ha sido expresado como proteína recombinante en E. Coli, Pichia pastoris y células de insectos usando baculovirus. La Bm86 en la garrapata esta extensamente glicosilada y la glicosilación contribuye a inducir una fuerte respuesta de anticuerpos. La proteína se encuentra presente en diferentes cepas de garrapatas con variaciones en la secuencia del gene. Es protectiva como recombinante o nativa, aunque tiene efectividad variable en diferentes cepas, además de variación entre razas de animales e individuos, donde los más susceptibles van a aumentar la carga de garrapatas en la siguiente generación. Su principal efecto es sobre los valores reproductivos disminuyendo el número y peso de hembras repletas y la fecundidad, resultando hasta en 90% de reducción de larvas en la siguiente generación (Willadsen y Jongejan, 1999). Es importante destacar que en aislados de B. microplus de diferentes zonas geográficas el gene llega a tener una variación de hasta 21 amino ácidos, tal fue el caso de Bm86 aislado de una cepa argentina comparado con una cepa australiana, el cual fue renombrado como Bm95. Se ha observado que el Bm86 tiene una significativa protección cruzada con B. annulatus (casi 100%), B. decoloratus., H. anatolicum, H. dromedarii y un efecto menor o insignificante contra R. appendiculatus y A. variegatum. La secuencia del gene tiene alta homología con los genes de H. anatolicum y R. appendiculatus. La información sobre la similitud de secuencias es incompleta; sin embargo, la protección cruzada contra otras especies no esta dada simplemente en función del grado de conservación de la secuencia, aunque protección cruzada no siempre ocurre, los datos anteriores justificarían la búsqueda de protección con otras especies de garrapatas. Animales inmunizados con la vacuna desarrollada en el Centro de Biotecnología de la Habana, en Cuba, tuvieron baja protección al ser desafiados con la cepa argentina, lo cual se atribuyó a la variación genética; pero no hubo evidencia para relacionar el grado de variación en aa y la eficacia vacunal. Por otro lado al vacunar con Bm95 los animales son protegidos contra la cepa homóloga argentina y contra la cepa heteróloga cubana de donde se derivó la vacuna GAVAC (García-García et al., 2000). El efecto de Bm86 se vuelve más complejo ya que se observa una alta similitud del gene entre cepas mexicanas y 60

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venezolanas en relación a las argentinas, pero la vacunación con Bm86 australiano y argentino seguido por desafío con cepas homologas y heterólogas, sugiere que esta variación genética no influye en la protección. En otro experimento, sin embargo, la protección contra la cepa Tuxpan es claramente menor que con la cepa CENAPA, ambas cepas mexicanas. También hay variaciones cuando se desafia con altas cargas de garrapatas o en animales vacunados de razas que tienen una baja resistencia los resultados de protección son insatisfactorios (Willadsen, 2001). Es evidente que diferencias en la secuencia son una posible causa de variación en la eficiencia pero no la única, se deberá tomar en consideración otros factores como el sistema de expresión usado, el plegamiento de la proteína y la glicosilación en los sitios adecuados, además de los adyuvantes utilizados para la estimulación del sistema inmune. Más investigación y experimentación es necesaria alrededor de esta proteína. Es necesario realizar más estudios para aclarar estas inconsistencias sobre la variación genética relacionada a protección, se deberían preparar antígenos por especie y quizás sea necesario por región geográfica, si asumimos que la protección sería mayor. Hay evidencias que la vacunación con extractos de garrapatas parcialmente purificados fue mucho más efectiva que la vacunación con Bm86 solo (Willadsen et al. 1988). Lo anterior puede atribuirse a diferencias en el adyuvante, glicosilaciones que no son replicadas en proteínas recombinantes o a la presencia de múltiples antígenos. Aunque la desventaja radica en poder estandarizar estos antígenos en un proceso de producción masiva, lo que requerirá un sinnúmero de trabajos previos, al menos para caracterizar las proteínas, muchas de las cuales serán intrascendentes e incluso nocivas para el sistema inmune (inmunosupresoras), sin dejar del lado la capacidad de transmitir microorganísmos patógenos a los bovinos. Varios investigadores han sugerido que el efecto de la vacuna se podría incrementar con la inclusión de otros antígenos efectivos o por el uso de adyuvantes. Hay evidencia que el Bm86 incrementa su efectividad al combinarse con Bm91 o BmA7 (Willadsen et al., 1996). Para mejorar la eficacia de las vacunas actuales, se sugiere o bién la incorporación de mas de un antígeno en la vacuna o el uso conjunto de vacuna e ixodicida. Los productores no aceptan fácilmente el uso de la vacuna, debido a que el efecto es paulatino y no tiene el mismo efecto de derribe que los acaricidas químicos, por lo cual lo encuentran inaceptable y recurren al uso de acaricidas. De esta forma, la vacuna se comercializa con la recomendación del uso estratégico combinado de acaricidas, constituyendo un sistema simple de manejo integrado de garrapatas. Cada vacunación ahorra un promedio de 2 a 4 tratamientos químicos; un cuarto de los productores encontraron que después de la vacunación no era necesario el tratamiento acaricida, lo que reduce la posibilidad de seleccionar poblaciones resistentes, ya que la frecuencia de los tratamientos químicos correlaciona positivamente con la frecuencia de resistencia. Usando la vacunación como parámetro, se reporta un incremento en el número de días entre tratamientos acaricidas con un promedio de 32 días o un 60% de reducción en el número de tratamientos, reduciendo así el costo de control. Además la vacuna es altamente efectiva contra poblaciones resistentes a OP y piretroides, usándola en un sistema de control integrado junto con amidinas. En Cuba después de seis años del uso de la vacuna se reporta una reducción de 16 baños a 2.8 baños por año, mientras que el consumo nacional de acaricidas se redujo de 480 toneladas a 80 toneladas por año. El uso conjunto de vacuna y lactonas macrocíclicas parece incrementar 10 veces la efectividad de estas, lo anterior 61

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podría ser debido al efecto aditivo o a consecuencia de la penetración aumentada del pesticida a su blanco, como resultado del daño del intestino de la garrapata, lo cual no ha sido probado (Willadsen, 2004). El proceso para el desarrollo de la vacuna se inició en 1981, mientras que la vacuna se liberó en el mercado en 1994, esto es, se necesitaron 14 años desde el inicio de la investigación hasta poner la vacuna en los anaqueles de las farmacias. Seis años fueron necesarios para demostrar la factibilidad y para el aislamiento de un antígeno nativo único y efectivo, en 1986 se identificó el antígeno clave Bm86. Subsecuente desarrollo y registro tomó alrededor de 8 años, tiempo no excesivo para el desarrollo estándar de pesticidas o farmacéuticos. Perspectivas futuras en el control inmunológico de garrapatas Para la selección de antígenos adecuados debemos asumir que las moléculas deberán tener un papel crítico para la sobrevivencia de garrapatas, donde su inhibición conducirá al rechazo o muerte de las mismas. Hay que considerar la amplia gama de antígenos de función desconocida, considerando varias categorías bioquímicas de las que se podrían obtener proteínas de interés para ser evaluadas como candidatos a inmunógenos, entre ellas proteínas estructurales, enzimas hidrolíticas y sus inhibidores y moduladores del sistema inmune, solo por mencionar algunas de las que faltan estudios profundos. Hay que resaltar que al estudiar “antígenos ocultos” de la garrapata, será mucho mayor el rango de posibilidades que si solo nos enfocamos al estudio de antígenos con los que el vertebrado tiene contacto durante la interacción natural de la relación huéspedparásito. También se ha descuidado el estudio de los antígenos responsables de la inmunidad natural, sería conveniente continuar con estas investigaciones. Dado lo complejo de las garrapatas es difícil creer que un solo antígeno como el Bm86 sea efectivo, posiblemente la vacuna ideal debería involucrar el uso de antígenos ocultos y “expuestos” durante la infestación natural. Se requieren más estudios sobre inmunidad en bovinos y no extrapolar información de roedores. Los antígenos disponibles en la actualidad son muy pocos, y estos requieren de una caracterización más profunda, para mejorar la respuesta inmune hacia ellos. El estudio de nuevos antígenos actualmente es más simple que antes, ya que con los avances en ingeniería genética y manipulación de DNA la producción y caracterización será más rápida. Conclusiones El uso de vacunas contra garrapatas deberá ser parte de un programa de Manejo Integral de Plagas, ya que las vacunas no tienen el efecto inmediato de los insecticidas y no protegen al animal de la infestación, su efecto es gradual y progresivo reduciendo las poblaciones al afectar su capacidad reproductiva. El programa deberá involucrar además el uso racional de acaricidas, el uso de razas de ganado resistentes, la selección de genes antigarrapata y el control biológico. Entendiéndose por control integrado el uso óptimo de todos los métodos de control que están disponibles, en una forma flexible, adaptados a las condiciones locales y la realidad económica. Por último, debido a las ventajas que representan las vacunas sobre los acaricidas respecto a residualidad, contaminación ambiental y resistencia, el nivel de protección generado deberá ser evaluado en forma diferente a los insecticidas químicos.

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A la fecha solo hay dos vacunas comerciales contra garrapatas, ambas conteniendo la proteína recombinante Bm86, estos son los únicos ejemplos de vacunas recombinantes contra un parásito. Literatura citada Barker, S.C. and Murrell, A. 2004. Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names. Parasitology. 129: S15-S36. Cruz, V. C., García, V.Z. y Quintero, M.T. 1995. Avances en la inmunización contra garrapatas del ganado bovino. Vet. Mex. 26: 251-262. Da Silva, V.I., Logullo, C., Sorgine, M., Velloso, F.F., Rosa, D.E., Lima, M.F., Gonzales, J.C., Matsuda, H., Oliveira, P.L. and Matsuda, A. 1998. Immunization of bovines with an aspartic proteinase precursor isolated from Boophilus microplus eggs. Vet. Immunol. Immunopathol. 66: 331-341. Galun, R. Research into alternative arthropod control measures against livestock pests (part 1). In: Immunity to animal parasites of economic importance on bovines in Latin America. Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT, Colombia, 1975, pp. 155-161. García-García, J.C., González, I.L., González, D.M., Valdes, M., Mendez, L., Lamberti, J., D’Agostino, B., Citroni, D., Fragoso, H., Ortiz, M., Rodríguez, M., and de la Fuente, J. 1999. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23: 883-895 García-García, J.C., Montero, C., Redondo, M., Vargas, M., Canales, M., Boue, O., Rodríguez, M., Juglar, M., Machado, H., González, I.L., Valdes, M., Mendez, L., and de la Fuente, J. 2000. Control of ticks resistant to immunization with Bm86 in cattle vaccinated with the recombinant antigen Bm95 isolated from the cattle tick Boophilus microplus. Vaccine. 18: 2275-2287. Jongejan, F. and Uilenberg G. 1994. Ticks and control methods. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 13: 1201-1226. Leboulle, G., Crippa, M., Decrem, Y., Mejri, N., Brossard, M., Bollen, A., and Godfroid, E. 2002. Characterization of a novel salivary immunosuppressive protein from I. ricinus ticks. J. Biol. Chem. 277: 10083-10089. McKenna, R.V., Riding, G.A., Jarmey, M.J., Pearson, R.D. and Willadsen, P. 1998. Vaccination of cattle against the Boophilus microplus using a mucin-like membrane glycoprotein. Parasite Immunol. 20: 325-336. Mulenga, A., Sugimoto, C. and Onuma, M. 2000. Issues in tick vaccine development: Identification and characterization of potential candidate vaccine antigens. Microbes and Infection. 2: 1353-1361. Mulenga, A., Sugino, M., Nakajima, M., Sugimoto, C. and Onuma, M. 2001. Tick-encoded serine proteinase inhibitors (serpins); Potential target antigens for tick vaccine development. J. Vet. Med. Sci. 63: 1063-1069. Nuñez, J.L., Muñoz, C.M. y Moltedo H.L.: Boophilus microplus la garrapata común del ganado vacuno. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aires, Argentina, 1982. Nolan, J., and Schnitzerling, H.J. 1986. Drug resistance in arthropod parasites, pp. 603-620. In W.V. Campbell and R.S. Rew (eds), Chemotherapy of parasitic diseases. Plenum, New York. 63

Simposium Internacional de Resistencia a Pesticidas en Artrópodos: Un Enfoque Toxicológico y Molecular. Manzanillo, Colima, México. Mayo 2006.

Preston, P.M. and Jongejan, F. 1999. Protective Immune Mechanisms to ticks and Tickborne diseases of ruminants. Parasitology Today. 15: 255-258. Pruett, J.H. 1999. Immunological control of arthropod ectoparasites-a review. Int. J. Parasitol. 29: 25-32. Solis, S. Ecología de garrapatas en México. En AMPAVE-SARH Eds. Seminario Internacional de Parasitología Animal. Cuernavaca, Morelos 1986. Tellam, R.L., Kemp, D., Riding, G., Briscoe, S., Smith, D., Sharp, P., Irving, D. and Willadsen, P. 2002. Reduced oviposition of Boophilus microplus feeding on sheep vaccinated with vitellin. Vet. Parasitol. 103: 141-156. Trager, W. 1939. Acquired immunity to ticks. J. Parasitol. 25: 57-81. Valenzuela, J.G., Charlab, R., Mather, T.N., and Ribeiro, J.M.C. 2000. Purification, cloning and expression of a novel salivary anticomplement protein from the tick, Ixodes scapularis. J. Biol. Chem. 275: 18717-18723. Wang, H. and Nuttall, P.A. 1999. Immunoglobulin–binding proteins in ticks: new target for vaccine development against a blood-feeding parasite. Cell. Mol. Life Sci. 56: 286295. Wikel, S.K. 1996. Host immunity to ticks. Annu. Rev. Entomol. 41: 1-22. Willadsen, P. 1997. Novel vaccines for ectoparasites. Vet. Parasitol. 71: 209-222. Willadsen, P. 2001. The molecular revolution in the development of vaccines against ectoparasites. Vet. Parasitol. 101: 353-367. Willadsen, P. 2004. Anti-tick vaccines. Parasitology. 129: S367-S387. Willadsen, P. and Jongejan, F. 1999. Immunology of the tick-host interaction and the control of ticks and tick-borne diseases. Parasitol. Today. 15: 258-262. Willadsen, P., and Kemp, D.H. 1988. Vaccination with “concealed” antigens for tick control. Parasitology Today. 4: 196-198. Willadsen, P., and Riding, G.A. 1980. On the biological role of a proteolytic-enzyme inhibitor from the ectoparasitic tick B. microplus. Biochemical J. 189: 295-303. Willadsen, P., Smith, D., Cobon, G., and McKenna, R.V. 1996. Comparative vaccination of cattle against Boophilus microplus with recombinant antigen Bm86 alone or in combination with recombinant Bm91. Parasite Immunol. 18: 241-246.

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LA GENÓMICA FUNCIONAL Y EL DESARROLLO DE VACUNAS CONTRA ARTRÓPODOS DE IMPORTANCIA VETERINARIA. The functional Genomics and the Development of Recombinant Vaccines Against Arthropods of Veterinary Importance. Almazán García C1., Rosario-Cruz R2., Torres Rodriguez, L.1 de la Fuente J3. 1Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Tamaulipas, Km 5 carretera Victoria-Mante, Cd. Victoria, Tam. CP 87000 México. 2Cenid-Pavet, INIFAP Km 11.5 Carretera Cuernavaca-Cuautla, Col. Progreso, Jiutepec, Mor. CP 62550 México. 3Center for Veterinary Health Sciences, Oklahoma State University, 250 Mc-Elroy Hall, Stillwater, Ok. 74075 USA PALABRAS CLAVE: Tick Vaccines, Boophilus microplus, Acaricide Resistance Introducción Los ectoparásitos hematófagos constituyen la mayor limitante de la industria bovina de zonas tropicales y subtropicales debido a las pérdidas económicas por parasitación directa y por transmisión de enfermedades. Las garrapatas del ganado bovino, Boophilus spp. y la mosca del cuerno Haematobia irritans son los artrópodos de mayor importancia en Medicina Veterinaria en México. La importancia de las garrapatas Boophilus spp. es tal en este país que a fines del siglo pasado se estableció el fidecomiso Campaña Nacional contra la Garrapata, el cual funciona actualmente en todo el país con el objetivo de evitar la movilización de ganado infestado con estos ectoparásitos. La mosca del cuerno o de la paleta, H. irritans ha rebasado en importancia en los últimos años a la garrapata en predios donde se realiza un estricto control de estos ixodidos o en zonas donde las condiciones climáticas no son aptas para el desarrollo de Boophilus spp. Sin embargo, en la mayoría de las explotaciones extensivas es común encontrar ambos ectoparásitos. El control de garrapatas y moscas que ha funcionado mayormente es el uso de ixodicidas e insecticidas aplicados de diversas maneras sobre los animales. Sin embargo, el desarrollo de resistencia a estos productos químicos obliga a la búsqueda de otras alternativas para su control como el inmunológico mediante vacunas que impidan o reduzcan la infestación de animales por estos artrópodos. A raíz del descubrimiento del antígeno Bm86 en intestino de garrapatas B. microplus y su uso en el control de esta garrapata en bovinos, una serie de trabajos se han publicado sobre otros antigenos ó proteínas de interés vacunal contra infestaciones por diferentes especies de garrapatas (de la Fuente y Kocan, 2003). La genómica funcional ha jugado un papel importante recientemente en la investigación para el desarrollo de vacunas contra garrapatas. El mapeo inmunológico, la Inmunización con genetecas de expresión de ADNc (cDNA-ELI) en combinación con el análisis de marcadores de secuencias expresadas (EST) y la Interferencia de ARN (iARN) son algunas de las metodologías que se mencionan aquí. Dado que la mayoría de la investigación en esta área se ha realizado en garrapatas, en esta revisión no se incluye información sobre otros artrópodos; sin embargo, el uso de las técnicas mencionadas en combinación con nuevas tecnologías en el futuro establecerán las bases para la

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identificación de antígenos protectores contra otros artrópodos de importancia veterinaria como la mosca del cuerno H. irritans. Importancia de garrapatas Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos que parasitan a los animales domésticos, silvestres y al hombre. Después de los mosquitos, las garrapatas son los vectores más importantes de enfermedades (Parola y Raoult, 2001). El rango de patógenos transmitidos tanto al hombre como a los animales incluye virus, hongos, bacterias, protozoarios y nematodos. Aproximadamente el 83% del ganado en el mundo esta expuesto a las garrapatas y enfermedades que estas transmiten, lo cual implica un costo de 13.9 a 18.9 billones de dólares (Castro, 1997). Además de la transmisión de enfermedades, los efectos por el parasitismo con garrapatas incluyen reducción en el crecimiento, reducción de la producción de carne y leche, anemia y parálisis (Estrada-Peña y Jongejan, 2001; Parola y Raoult, 2001). El género Boophilus (Rhipicephalus) spp. parasita al ganado bovino de países tropicales y subtropicales. Estas garrapatas son las que mayores pérdidas económicas ocasionan a la ganadería bovina. En México, B. microplus (Canestrini) se encuentra presente de forma endémica en las zonas tropicales del país, mientras que B. annulatus se distribuye principalmente en zonas áridas del norte del país (Rosario-Cruz et al. 2003). Ambas garrapatas causan pérdidas directas por parasitismo y transmisión biológica y mecánica de enfermedades como la babesiosis y anaplasmosis bovina respectivamente. Estas enfermedades representan un obstáculo en programas de mejoramiento genético en el país (Rodríguez-Camarillo et al. 1999). A pesar de los esfuerzos para el establecimiento de nuevas alternativas de control, el método comúnmente usado en garrapatas ha sido por mucho tiempo, el uso intensivo de ixodicidas en baños de inmersión o directamente sobre el ganado por lo que las poblaciones de garrapatas han mostrado resistencia (Nolan, 1990; Schroder 1992), observándose una disminución del efecto letal de estos productos (Pegram, 1991). Resistencia de garrapatas Boophilus spp. a los ixodicidas El método de control que se ha usado comúnmente en garrapatas es el uso de acaricidas en baños de inmersión y aspersión directa sobre los animales. Dentro de los acaricidas se incluye a los arsenicales, organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides, amidinas e ivermectinas (Rosario-Cruz et al. 2003). El uso de acaricidas incrementa los costos de manejo, además, se requiere utilizar aplicaciones estratégicas y un manejo adecuado de estos productos debido a que contaminan el medio ambiente y a que se puede contribuir a la selección de artrópodos resistentes a estos productos químicos. Se debe además considerar la toxicidad en animales jóvenes como becerros, los que son altamente susceptibles a la intoxicación por acaricidas (Kocan, 1995). Actualmente, en México se tiene conocimiento de garrapatas B. microplus resistentes a fosforados (Aguirre et al. 1985) piretroides (Fragoso et al. 1995) y amidinas (Soberanes et al. 2002), lo que incluye a la mayoría de los grupos de ixodicidas existentes. Desarrollo de vacunas contra garrapatas El problema de resistencia de garrapatas a los ixodicidas ha motivado el interés por el desarrollo de vacunas contra garrapatas como una alternativa para evitar la parasitación 66

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de estos artrópodos y a la vez bloquear la transmisión de enfermedades que transmiten a sus hospedadores. Las garrapatas, a diferencia de otros ectoparásitos, se alimentan de sangre lentamente manteniéndose adheridas al hospedador por varios días, esto las pone en contacto con la respuesta inmune, provocando una asociación entre el epitelio intestinal de la garrapata y los anticuerpos del hospedador (Willadsen, 2001). El desarrollo de vacunas contra garrapatas se ha visto limitado por la identificación de antígenos. Los antígenos contra garrapatas se han identificado mediante la evaluación de proteínas derivadas de extractos crudos utilizadas para inmunizar animales que son sometidos posteriormente a infestaciones experimentales con cierto número de garrapatas; por mapeo inmunológico de antígenos en animales infestados y al probar proteínas consideradas importantes para la función y sobrevivencia en experimentos de vacunación contra garrapatas (Wang y Nuttall, 1999). La identificación del antígeno Bm86 y posteriormente el Bm95 en células intestinales de la garrapata B. microplus son el primer ejemplo de antígenos utilizados en vacunas para el control de garrapatas. La respuesta a la vacunación con estos antígenos produce anticuerpos que al estar en contacto con la garrapata provocan lisis de las células intestinales, trayendo como consecuencia la reducción en la sobrevivencia del artrópodo, disminución del peso y de la fertilidad (Willadsen y Kemp, 1998; de la Fuente, 2000; García-García et al. 2000). Mulenga et al. (1999) identificaron una proteína de 29 kDa mediante mapeo inmunológico de antígenos a partir de glándulas salivales de Haemaphysalis longicornis. La inmunización de conejos con la proteína recombinante p29 confirió una reducción del 40 y 56 % en la ingurgitación y mortalidad de larvas y ninfas respectivamente. El antígeno p64, es una proteína de 15 kDa que fue identificada en la garrapata de tres hospedadores Rhipicephalus appendiculatus, la función putativa de esta proteína esta relacionada al cemento y su papel en la adherencia y alimentación de garrapatas. El efecto de la inmunización con esta proteína en cobayos infestados con ninfas y adultos fue la disminución de la infestación de 48 y 70 % respectivamente (Revisado por de la Fuente y Kocan, 2003). Inmunización con genetecas de expresión de ADNc (cDNA-ELI) El uso de cDNA-ELI fue propuesto para detección de antigenos protectores contra leishmaniosis (Melby et al. 2000). A diferencia de otros métodos, aquí no se requiere un conocimiento previo de los antigenos y es posible tamizar el genoma completo de un organismo patógeno en modelos animales de laboratorio (Moore et al. 2002). Para obtener una geneteca de ADNc, se requiere hacer la extracción de ARN del organismo blanco, el ADNc se obtiene mediante transcripción reversa, se amplifica y se clona en un vector de expresión; el vector es después administrado al organismo hospedador donde se lleva a cabo la expresión de proteínas, con lo que se confiere una respuesta inmune hacia el agente patógeno en estudio (Kofta y Wedrychowiez, 2001). El tamizado de cDNA-ELI realizado a partir de células embrionarias de garrapatas Ixodes scapularis fue utilizado para la identificación de antígenos protectores en ratones infestados experimentalmente con larvas de garrapatas I. scapularis. Mediante esta metodología fue posible identificar cDNAs que inhiben la infestación y disminuyen la muda de larvas a ninfas (Almazán et al. 2003a). La combinación de cDNA-ELI y análisis de EST permitió identificar tres genes, 4F8, con homología a nucleotidasa y 4E6 y 4D8 de función 67

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desconocida (Almazán et al. 2003b). Estos genes se expresan en todas las fases evolutivas de intestinos y glándulas salivales de I. scapularis y en tejidos de otras especies de garrapatas como I. ricinus, I. ricinus e I. pacificus. A través de estudios de RT-PCR se encontró que el perfil de expresión del gen 4D8 es muy diverso y se expresa en otros géneros y especies de garrapatas como Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis, Rhipicephalus sanguineus, y B. microplus. Por lo anterior, el antígeno 4D8 representa un buen candidato para ser incluido en experimentos de vacunación contra diferentes especies de garrapatas de importancia medica y veterinaria (Almazán et al. 2005a). Las proteínas 4F8, 4E6, y 4D8 fueron expresadas y utilizadas en un experimento de inmunización contra garrapatas I. scapularis adultas en ovinos. El efecto de la inmunización con los antígenos recombinantes 4D8, 4F8 y 4E6 y la combinación de los tres antígenos redujo la infestación de garrapatas de 16 a 58 % y la oviposición de 22 a 49 %. La eficacia general considerando la reducción de la infestación y la oviposición fue del 33 al 71%. Los resultados fueron estadísticamente significativos solo para los grupos inmunizados con 4D8 y 4F8 y los mejores resultados se obtuvieron en el grupo inmunizado con 4D8 (Almazán et al. 2005b). Interferencia de ARN (iARN) en garrapatas La iARN o la inducción del silenciamiento de un gen específico se realiza mediante la introducción de cadenas cortas de ARN de doble cadena (ARNdc) del gen blanco mediante diferentes vías (Sorensen et al. 2003). Esta metodología fue descrita en el nematodo Caenorhabditis elegans (Fire et al. 1998). El análisis de la función génica mediante iARN fue publicado por primera vez en garrapatas por Aljamali et al. (2002). Posteriormente, la iARN fue utilizada en el tamizado de antígenos protectores contra garrapatas I. scapularis (de la Fuente et al. 2005) y en la evaluación de la función del gen 4D8 en garrapatas I. scapularis, D. variabilis, D. marginatus, A. americanum y R. sanguineus mediante la inyección de cadenas cortas de ARNdc en la hemolinfa, estos estudios permitieron conocer la función de 4D8 en la modulación de la alimentación y reproducción de estas especies de garrapatas (de la Fuente et al. 2006). Debido a que la iARN representa una metodología rápida y sencilla en la identificación de antigenos protectores contra artrópodos y a los excelentes resultados obtenidos en garrapatas, nuestro grupo esta trabajando en el uso de esta herramienta para la detección de antígenos protectores contra infestaciones por las garrapatas del ganado bovino Boophilus spp. y en la mosca del cuerno Haematobia irritans. Los estudios de la genómica funcional junto con el uso de la información existente en las bases de datos de ESTs, la bioinformática, el análisis del transcriptoma y la proteómica, además del tamizado completo de genetecas de tejidos de artrópodos mediante herramientas como la iARN proveerán información valiosa de manera rápida y eficiente en la identificación de antígenos que podrán incluirse en el desarrollo de vacunas que impidan o disminuyan el parasitismo por artrópodos de importancia veterinaria y a la vez bloqueen las enfermedades que estos artrópodos transmiten a sus hospedadores. Agradecimientos Este trabajo fue financiado por el proyecto 12260, del Programa CONACYT-SAGARPA, otorgado a la Dra. Consuelo Almazán García y colaboradores.

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Referencias Aguirre J, Sobrino A, Santamaría M, Aburto S, Hernández M, Ortiz EM. Resistencia de garrapatas en México. Seminario Internacional de Parasitología Animal, Cuernavaca, Mor. México. 1985. Aljamali MN, Sauer JR, Essenberg RC. RNA interference: applicability in tick research. Exp Appl Acarol 2002; 28: 89-96. Almazán C, Kocan KM, Bergman DK, Garcia-Garcia JC, Blouin EF, de la Fuente J. Identification of protective antigens for the control of Ixodes scapularis infestations using cDNA expression library immunization. Vaccine 2003a; 21: 1492-1501. Almazán C, Kocan KM, Bergman D, Garcia-Garcia JC, Blouin E, de la Fuente J. Characterization of genes transcribed in an Ixodes scapularis cell line that were identified by expression library immunization of expressed sequence tags. Gen Ther Mol Biol, 2003b, 7: 9-25. Almazán C, Blas-Machado U, Kocan KM, Yoshioka JH, Blouin EF, Mangold AJ, de la Fuente J. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine 2005a; 23: 4403-4416. Almazán C, Blas-Machado U, Kocan KM, Yoshioka JH, Blouin EF, de la Fuente J. Vaccination with recombinant antigens for the control of Ixodes scapularis adult infestations. Vaccine 2005b; 23:5294-5298. Castro JJ. Sustainable tick and tick-borne disease control in livestock improvement in developing countries. Vet Parasitol 1997; 71:77-97. de la Fuente J. Immunological control of ticks through vaccination with Boophilus microplus gut antigens. Ann NY Acad Sci 2000; 916:617-621. de la Fuente J, Kocan KM. Advances in the identification and characterization of protective antigens for development of recombinant vaccines against tick infestations. Expert Rev Vaccines 2003; 2: 583-93. de la Fuente J, Almazán C, Blouin EF, Naranjo V, Kocan KM. RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens. Parasitol Res 2005; 96: 137-141. de la Fuente J, Almazán C, Blas-Machado U, Naranjo V, Manglod A, Blouin E, Gortazar C, Kocan KM. The tick protective antigen 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick feeding and reproduction. Vaccine 2006 (en prensa). Estrada-Peña A, Jongejan F. Ticks feeding on humans: a review of records human-bitting Ixodidea with special reference to pathogen transmission. Exp App Acarol 1999; 23:685-715. Fire A, Xu S, Montgomerym MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391:806-811. Fragoso SH, Ortiz EM, Soberanes CN, Santamaría VM, Ortiz NA. Epidemiología de la resistencia a ixodicidas en garrapatas Boophilus microplus en la Republica Mexicana. III Seminario Internacional de Parasitología Animal. Resistencia y control en garrapatas y moscas de importancia veterinaria. Acapulco, Gro., México. 1995. Garcia-Garcia JC, Montero C, Redondo M, Vargas M, Canales M, Boue O, Rodriguez M, Joglar M, Machado H, Gonzalez I, Valdes M, Mendez L, de la Fuente J. Control of ticks resistant to immunization with Bm86 in cattle vaccinated with the recombinant

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antigen Bm95 isolated from the cattle tick, Boophilus microplus. Vaccine 2000; 18:2275-2287. Kocan KM. Targeting ticks for control of selected hemoparasites of cattle. Vet Parasitol, 1995, 57:121-151. Kofta W, Wedrychowiez H. c-DNA vaccination against parasite infections: advantages and disadvantages. Vet Parasitol 2001; 100:3-12. Melby PC, Ogden GB, Flores HA. Identification of vaccine candidates for experimental visceral leishmaniasis by immunization with sequential fractions of a cDNA expression library. Infec Immunol 2000; 68:5595-5602. Moore RJ, Lenghaus C, Sheedy SA, Doran TJ. Improved vectors for expression library immunization: Aplication to Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs. Vaccine 2002; 20:115-120. Mulenga A, Sugimoto C, Sako Y, Ohashi K, Musoke A, Shubash M, Onuma M Molecular characterization of a Haemaphysalis longicornis tick salivary gland-associated 29kilodalton protein and its effect as a vaccine against tick infestation in rabbits. Infect Immunol 1999, 67: 1652-1658. Nolan J. Acaricide resistance in single and multi-host ticks and strategies for control. Parasitology 1990; 32: 145–153. Parola R, Raoult D. Tick-borne bacterial diseases emerging in Europe. Clin Microbiol Infect 2001; 7: 80-83. Pegram RG, James AD, Oosterwijk GPM, Killorn KJ, Lemche J, Ghirotti M, Tekle Z, Chizyuka HJB, Mwose ET, Chizyuka F. Studies on the economics of ticks in Zambia. Exp. Appl. Acarol. 1991;12: 9-26. Rodríguez-Camarillo SD, García-Ortiz MA, Cantó-Alarcón GJ, Hernandez-Salgado G, Santos-Cerda N, Aboytes-Torres R. Ensayo de una vacuna experimental inactivada contra Anaplasma marginale. Tec Pecu Méx 1999, 37: 1-2. Rosario-Cruz R, Domínguez-García DI, Hernández OR, Cornel AJ, Rodríguez-Vivar RI, Alonso-Díaz MA. Resistance to acaricides and esterase activity variation in Boophilus microplus tick strains from Yucatan, Mexico. Seminario Internacional de Parasitología Animal, Mérida, Yucatán, México. 2003. Schroder J. Chemical Control of Ticks on Cattle. Tick Vector Biology: Medical and Veterinary Aspects. Springer, Berlin. 1992. Soberanes CN, Santamaría VM, Fragoso SH, García VZ. Primer caso de resistencia al amitraz en la garrapata del ganado Boophilus microplus en México. Tec Pecu Méx. 2002; 40: 81-92. Sorensen DR, Leirdal M, Soiud M. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice. J Mol Biol 2003; 327: 761-766. Wang H, Nuttall PA. Immunoglobulin-binding proteins in ticks: new target for vaccine development against a blood-feeding parasite. Cell Mol Life Sci 1999; 56:286-295. Willadsen P, Kemp DH. Vaccination with concealed antigens for tick control. Parasitol Today 1998; 4:196-198. Willadsen P. The molecular revolution in the development of vaccines against ectoparasites. Vet Parasitol 2001; 101:353-367.

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COMISION DE PARASITICIDAS (SAGARPA-INFARVET-CNOG): ANTECEDENTES Y SITUACION ACTUAL. Parasiticides Committee (SAGARPA-INFARVET-CNOG): Past and Current Situation. Soberanes Céspedes, N. Presidente de la Comisión de Parasiticidas (SAGARPAINFARVET-CNOG). Cámara Nacional de la Industria Farmacéutica (CANIFARMA). Sección Veterinaria INFARVET (Industria Farmacéutica Veterinaria). Av. Cuauhtemoc 1481, Santa Cruz Atoyac, México, D.F. 03310. PALABRAS CLAVE: parasiticidas, pesticidas, ixodicidas. Antecedentes En México la mayoría de las explotaciones de bovinos dedicados a la producción de carne y de doble propósito estabulados y en pastoreo se encuentran en las regiones subtropicales en donde la garrapata Boophilus microplus es el ectoparásito más importante. La resistencia de las garrapatas hacia los ixodicidas ocurre en todas ó casi todas las áreas en donde el ganado ha sido tratado con productos garrapaticidas para el control de este ectoparásito. En México la resistencia de la garrapata B. microplus se detectó en los ixodicidas organofosforados entre 1981 a 1985 en las Huastecas Veracruzana, Hidalguense y Potosina (Aguirre et al. 1986), por lo cual las autoridades de salud animal en el país, permitieron a partir de 1985 el registro y uso de piretroides y amitraz, nuevas familias químicas de ixodicidas. Para 1993, después de 8 años de uso continuo y sistemático con piretroides, se detectaron los primeros casos de resistencia a organofosforados y piretroides en los estados de Tabasco, San Luís Potosí, Veracruz y Chiapas confirmando que el problema se encontraba difundido en áreas de alto riesgo (Ortiz, et al. 1995). (fuente: CENAPA 2005).

En respuesta al hallazgo de estos casos de doble resistencia a organofosforados y piretroides en la garrapata B. microplus, en noviembre de 1993 se inicio un Programa Nacional Para el Control de la Resistencia, mediante la creación de un Comité con la participación de la Industria Farmacéutica, la Confederación Nacional Ganadera y del Gobierno Federal denominado Grupo de Ixodicidas SAGAR-CANIFARMA-CNOG.

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Primeras actividades del Grupo de Ixodicidas La primera acción de este grupo fue establecer un fondo para llevar a cabo la programación de actividades tendientes al control y manejo de las garrapatas resistentes a los ixodicidas las cuales fueron: ƒ ƒ

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Envío de comunicados oficiales y de seguimiento a los subdelegados de ganadería, señalando los predios afectados, familias de ixodicidas a las cuales fueron resistentes y susceptibles. Establecimiento del programa de monitoreo para el diagnóstico de resistencia orientado a zonas de alto riesgo con la finalidad de confirmar los casos e identificar su dispersión (FCNCG, 1983).

Publicación de un tríptico para el manejo adecuado de los garrapaticidas con un tiraje de 50 mil y un cartel con los ixodicidas autorizados por la SAGAR para su uso en México con un tiraje de 2 mil para su distribución en los estados con el problema de resistencia. Publicación de la NOM-EM-04-ZOO-1994. Norma Oficial Mexicana de Emergencia, Campaña Nacional Contra La Garrapata Boophilus spp el 14 de julio de 1994, para evitar la dispersión de la resistencia mediante estrategias para su control.

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La Dirección General de Salud Animal (DGSA) estableció las líneas de las amidinas en los baños de línea oficial ubicados en el Norte y Golfo del país, para evitar la movilización de animales infestados con garrapatas resistentes hacia zonas libres. La industria farmacéutica Veterinaria (INFARVET), que comercializa amitraz impartió cursos de capacitación para el uso adecuado de estos productos a los inspectores encargados de estos baños.

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Programa permanente de platicas por la DGSA y el Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal (CENAPA) con el apoyo de la Industria Farmacéutica Veterinaria (INFARVET) productora de ixodicidas, dirigido a médicos veterinarios Oficiales, Acreditados en Control de Garrapata y a ganaderos de los estados con problemas de resistencia a los ixodicidas para informar sobre la situación nacional, su prevención y manejo.

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Curso especial de Aprobación en control de garrapata para médicos veterinarios del Grupo de Ixodicidas SAGAR-CANIFARMA-CNG. Trabajos para el desarrollo e implementación de la técnica de enzimas esterasas para el diagnóstico de resistencia a ixodicidas en la garrapata por parte del INIFAP CENID-PAVET en coordinación con el CENAPA (Rosario, et. al 2003; Rosario, et. al 2005; Soberanes, et al. 2005). Simultáneamente esta última institución, realizó la caracterización de las cepas resistentes de garrapatas colectadas en el país y la constatación de ixodicidas para el control de cepas resistentes (Ortiz, et. al 1995; Santamaría, et. al 1999). Intercambio de información técnica sobre el control de la resistencia de las garrapatas entre el CSIRO de Australia y la Dirección General de Salud Animal (DGSA).

Publicación de la Norma Oficial Mexicana NOM-019-ZOO-1994. Campaña Nacional contra la Garrapata Boophilus spp el 19 de mayo de 1995. Organización del III Seminario Internacional de Parasitología Animal “Resistencia y control de garrapatas y moscas de importancia veterinaria” para analizar la problemática de la resistencia, métodos y nuevos productos para el control de garrapatas resistentes del 11 al 13 de Octubre de 1995 en Acapulco, Gro., México. Organización de Seminarios Regionales sobre resistencia y control de garrapatas y moscas de importancia veterinaria en Cd. Victoria, Tamaulipas; Palenque y Reforma, Chiapas entre otros lugares en zonas de riesgo. Visitas por personal Oficial de nivel central ó estatal a predios en donde existen garrapatas resistentes, con la finalidad de verificar el cambio de ixodicida al cual las garrapatas son susceptibles. Cursos sobre identificación taxonómica de garrapatas y manual del mismo, impartido a médicos veterinarios de Comités de Fomento y Protección Pecuaria de los estados por parte de CENAPA. Publicación del manual de procedimientos para el baño de inmersión, el baño de aspersión y otro sobre el uso adecuado del amitraz para su divulgación a ganaderos, médicos veterinarios oficiales y Acreditados en Control de Garrapata en zonas de riesgo. Monitoreo de predios con sospecha de garrapatas resistentes a los ixodicidas en zonas de riesgo en los estados del pacifico.

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Boletín Informativo “Moscas y Garrapatas” con información sobre prevención y manejo de garrapatas y moscas resistentes.

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Implementación en CENAPA de la técnica para la determinación del amitraz y del hidróxido de calcio mediante la técnica de espectrofotometría. Organización del IV Seminario Internacional de Parasitología Animal “Control de la Resistencia en Garrapatas y Moscas de Importancia Veterinaria y Enfermedades que Transmiten” del 20 al 22 de octubre de 1999 en Pto. Vallarta, Jal., México. Organización del V International Seminar of Animal Parasitology “World Situation of Parasite Resistance in Veterinary Medicine” del 1 al 3 de octubre de 2003 en Mérida, Yuc., México.

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Cartel de productos autorizados para el control de la garrapata en México (2004).

Situación Actual.

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Considerando las acciones y logros obtenidos durante los 12 años de actividades de la Comisión de Ixodicidas (SAGARPA-INFARVET-CNOG), se planteo en marzo del 2005 la necesidad de de modificar el nombre de “Comisión de Ixodicidas” (SAGARPAINFARVAT-CNOG), que ha sido el grupo de técnicos de empresas farmacéuticas veterinarias que comercializan productos garrapaticidas y mosquicidas, así como de investigadores y técnicos del sector oficial por el de “Comisión de Parasiticidas” para que a su vez se modifiquen y amplíen también los objetivos y funciones de dicha Comisión en estrategias de control y manejo de la resistencia de los parásitos externos e internos de importancia veterinaria. Objetivos de la Comisión de Parasiticidas ƒ ƒ

Asesorar y capacitar en el uso adecuado de los productos para el control de los endoparásitos y ectoparásitos de los animales domésticos y en estrategias para el manejo de la resistencia a los antiparasitarios. Intervenir en la elaboración, revisión y actualización de las Normas, leyes y reglamentos inherentes a los aspectos relacionados con los antiparasitarios de uso pecuario.

Funciones de la Comisión de Parasiticidas ƒ ƒ

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Organizar eventos internacionales, cursos locales, pláticas técnicas sobre diferentes tópicos de la parasitología veterinaria dirigida a ganaderos y técnicos. Divulgar información técnica a través de manuales, boletines técnicos, trípticos, dípticos sobre el uso adecuado de los antiparasitarios en los animales domésticos.

Organizar cursos de capacitación sobre la biología de los parásitos, el uso adecuado y racional de los antiparasitarios y el manejo de la resistencia para disminuir las perdidas sanitarias y económicas en la ganadería nacional.

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Coordinar acciones referentes al control de parásitos y el manejo de la resistencia con los sectores oficiales, académicos, industriales y productores. Continuar con el apoyo para el monitoreo de la resistencia en garrapatas Boophilus microplus. Seguimiento a los parasiticidas no regulados en colaboración con las autoridades de SENASICA-SAGARPA. Presencia y participación de la Comisión de Parasiticidas en los principales congresos nacionales e internacionales de sanidad animal. Apoyar a la CNOG en cursos de capacitación y asesoría a los productores sobre estrategias en el uso de antiparasitarios y manejo de la resistencia.

Resultados Durante el 2005 se obtuvieron los siguientes resultados: Aprobación e impresión de 5,000 ejemplares del diptico sobre “Control de la garrapata Boophilus microplus para prevenir la resistencia a los garrapaticidas”.

Re-impresión de 10,000 ejemplares del “Cartel de productos autorizados para el control de la garrapata en México” en formato de tamaño carta.

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Participación en los siguientes eventos nacionales: XXX Aniversario del Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal (CENAPA) y del CENID-PAVET INIFAP en junio de 2005, en la XLI Reunión Nacional de Investigación Pecuaria, realizada del 14 al 18 de noviembre del año en curso en el estado de Morelos y en la mesa de Trabajo “El Registro de Parasiticidas” del Comité 19: Parasitología y Parasiticidas, durante la 13va. Reunión Anual del CONASA el 30 de noviembre del año en curso con el tema: “El punto de vista de la Industria Farmacéutica sobre la constatación y registro de parasiticidas”. Realización del “Curso teórico-práctico para el diagnóstico y control de hemoparasitos en rumiantes”. Cocoyoc, Morelos y CENAPA. 14 y 15-de junio-2005.

Colaboración técnica con personal de la SAGARPA en la participación que tuvieron dentro del “Taller sobre alternativas al uso del lindano” a realizarse del 4 al 5 de Octubre del 2005 en México, D.F. Realización del “Curso teórico-practico sobre diagnóstico y control de hemoparasitos en rumiantes” del 14 y 15 de junio del año en curso en el Hotel Hacienda Cocoyoc y en el Centro Nacional de Parasitología Animal (CENAPA) en el estado de Morelos, dirigido a técnicos de la Comisión de Parasiticidas y de los Comités de Fomento y Protección Pecuaria de los estados.

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El Comité de Parasiticidas del CONASA (Consejo Técnico Consultivo Nacional de Sanidad Animal), solicito y acepto a dos miembros de la Comisión de Parasiticidas de INFARVET a participar. Debido a un reporte de Re-emergencia en salud publica por Fasciola hepatica emitido por parte de la Organización Mundial de la Salud (OMS), se realizo el “Curso teórico-practico sobre diagnóstico, patogenia, zoonosis y control de trematodosis” del 10 al 11 de noviembre del año en curso en el estado de Veracruz, con instructores de la UNAM, CENAPA y BUAP dirigido a técnicos de la Comisión de parasiticidas y con la participación del Comité de Fomento y Protección Pecuaria del estado de Tabasco. Actualmente la Comisión de Parasiticidas la integran los siguientes laboratorios: 1. Bayer 2. Elanco 3. Fort Dodge 4. Intervet 5. Lapisa 6. Merial 7. Novartis 8. Ourofino 9. Pfizer 10. Revetmex 11. Schering-Plough 12. Virbac Conclusiones El establecimiento y operación de la Comisión de Parasiticidas permitirá seguir brindando asesoria al productor y al técnico privado ú organizado, mediante información técnica escrita ó a través de cursos teórico-prácticos de capacitación y actualización en temas referentes a la sanidad animal y la resistencia a los antiparasitarios, con la finalidad de aportar elementos técnicos, prácticos y viables que permitan disminuir el impacto sanitario y económico por efecto de las principales parasitosis que afectan la salud animal, para favorecer la productividad y la calidad de la ganadería en el país.

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Referencias Aguirre, J.A. y Santamaría, V.M. 1986. Purificación y caracterización toxicológica de garrapatas B. microplus resistentes a ixodicidas organofosforados y organoclorados. VII Reunión Anual Asoc. Méx. de Parasitología Veterinaria A.C. Cd. Victoria, Tamps. México. Fideicomiso Campaña Nacional Contra la Garrapata. 1983. Informe sobre los trabajos realizados con la cepa “Tuxpan” de B. microplus. Departamento de constatación. CNPA-FCNCG. Méx. Ortiz, E.M.; Santamaría, V.M.; Ortiz, N.A.; Soberanes, C.N.; Osorio, M.J.; Franco, B.R.; Martínez, I.F.; Quezada, D.R. y Fragoso, S.H. 1995. Caracterización de la resistencia de B. microplus a ixodicidas en México. Memorias III Seminario Internacional de Parasitología Animal. “Resistencia y control en garrapatas y moscas de importancia veterinaria” SAGAR-CANIFARMA-FAO-IICA-INIFAP. Acapulco, Gro. México Pp. 58-66. Santamaría, V.M.; Soberanes, C.N.; Ortiz, N.A.; Fragoso, S.H.; Osorio, M.J.; Martínez, I.F.; Franco, B.R.; Delabra, V.G.; Quezada, D.R.; Giles, H.I.; Ortiz, E.M. 1999. Análisis de la situación actual mediante el monitoreo de susceptibilidad a ixodicidas en Boophilus microplus de 1993 a 1999 y medidas preventivas para retardar la resistencia al amitraz en México. IV Seminario Internacional de Parasitología Animal. “Control de la resistencia en garrapatas y moscas de importancia veterinaria y enfermedades que transmiten”. CONASAG-INIFAP-INFARVET-IICA-AMPAVE-FILASA. Pto. Vallarta, Jalisco, México. Pp.103-117. Rosario, C.R.; Dominguez, G.D.; Hernandez, O.R.; Cornel, J.A.; Rodriguez, V.R.; AlonsoDíaz, A.M. 2003. Resistance to acaricides and esterase activity variation in Boophilus microplus tick strains from Yucatan, Mexico. V International Seminar of Animal Parasitology “World Situation of Parasite Resistance in Veterinary Medicine”. Mérida, Yuc., México. Pp. 150-156. Rosario, C.R.; Guerrero, D.F.; Miller, J.R.; Rodriguez, V.R.; Dominguez, G.D.; Cornel, J.A.; Hernandez, O.R.; George, E.J. 2005. Roles played by esterase activity and by a sodium channel mutation involved in pyrethroid resistance in populations of Boophilus microplus (acari: ixodidae) collected from Yucatan, Mexico. J. Med. Entomol. 42(6): 1020-1025. Soberanes, C.N.; Rosario, C.R.; Santamaria, V.M. and Garcia, V.Z. 2005. General esterase activity variation in the cattle tick Boophilus microplus and its relationship with organophosphate resistance. Téc. Pec. Méx. 43(2):239-246.

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