Centro de Investigación en Materiales Avanzados, S. C.

DOCTORADO EN CIENCIA DE MATERIALES

TESIS:

“Síntesis enzimática y propiedades térmicas de Poli(lactonas) y sus copolímeros obtenidos vía polimerización por apertura de anillo”

Presenta:

M. en C. Wilberth Antonio Herrera Kao

Asesores: Dra. Tania E. Lara Ceniceros (CIMAV-Monterrey) Dr. Manuel Aguilar Vega (CICY)

Apodaca, Nuevo León, Noviembre del 2014.

Índice

Índice de tablas -------------------------------------------------------------------------------- vii Índice de Figuras ----------------------------------------------------------------------------- viii Resumen ----------------------------------------------------------------------------------------- 1 Abstract ------------------------------------------------------------------------------------------ 2 Introducción -------------------------------------------------------------------------------------- 3 Hipótesis ------------------------------------------------------------------------------------------ 7 Justificación -------------------------------------------------------------------------------------- 8 Objetivo general ------------------------------------------------------------------------------- 10 Objetivos específicos ----------------------------------------------------------------------- 10 Capítulo I 1.1.

Polímeros y biopolímeros ---------------------------------------------------------- 11

1.2.

Las enzimas --------------------------------------------------------------------------- 13

1.2.1. Especificidad y selectividad de la enzima -------------------------------------- 17 1.2.2. Especificidad y selectividad en el sustrato ------------------------------------ 18 1.2.3. Factores importantes que determinan la selectividad ---------------------- 19 1.2.4. Clasificación de las enzimas ------------------------------------------------------ 19 i

1.3.

Síntesis de poliésteres catalizados por enzimas ---------------------------- 22

1.4.

Polimerización enzimática por apertura de anillo ---------------------------- 22

1.4.1. Mecanismo de la polimerización por apertura de anillo catalizada por enzimas -------------------------------------------------------------------------------- 24 1.4.2. Ventajas del la Polimerización por apertura de anillo ---------------------- 25 1.5.

Cándida antárctica, lipasa tipo B (CALB) -------------------------------------- 26

Capítulo II. Materiales y métodos 2.1. Reactivos --------------------------------------------------------------------------------- 29 2.2. Síntesis de los polímeros y copolímeros ------------------------------------------ 30 2.2.1. Síntesis de las lactonas usando Lipasa Pancreática Porcina, LPP ----- 30 2.2.2 Síntesis de lactonas con lipasa tipo B de Cándida antárctica (CALB) --- 33 2.2.3. Síntesis de los copolímeros -CL/PDL con lipasa tipo B de Cándida antárctica (CALB) ----------------------------------------------------------------------------- 35 2.2.4. Síntesis de los polímeros con grupo lateral con lipasa tipo B de Cándida antártica (CALB) inmovilizada utilizando una síntesis en dos etapas ----------- 36 2.3. Caracterización por espectroscopia de Infrarrojo con transformada de Fourier, FTIR ----------------------------------------------------------------------------------- 37 2.4. Determinación del peso molecular por GPC ------------------------------------- 38 2.4.1. Cinética de polimerización --------------------------------------------------------- 38 ii

2.5. Resonancia Magnética Nuclear, RMN -------------------------------------------- 38 2.6. Caracterización térmica --------------------------------------------------------------- 39 2.6.1. Determinación de la temperatura de descomposición, Td por análisis termogravimétrico, TGA --------------------------------------------------------------------- 39 2.4.2. Determinación de la temperatura de transición vítrea, T g, y de fusión, Tm por análisis de Calorimetría Diferencia de Barrido, DSC --------------------------- 39 Capítulo III. Resultados y discusiones 3.1. Resultados de la Síntesis de las lactonas usando Lipasa Pancreática Porcina, LPP ----------------------------------------------------------------------------------- 40 3.2 Resultados de la Síntesis de las lactonas usando Lipasa Cándida antárctica (Novozyme 435, N435) -------------------------------------------------------- 41 3.2.1. Resultados de peso molecular y porcentaje de conversión de Polilactonas ------------------------------------------------------------------------------------- 42 3.2.2. Conversión del polímero en función del tiempo ------------------------------- 44 3.2.3. Perfil cromatográfico del sistema de reacción de -CL -BTL------------- 45 3.2.4. Características físicas de Poli( -caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL, obtenidos por síntesis enzimática ---------------- 49 3.3. Caracterización de los polímeros obtenidos ------------------------------------- 50

iii

3.3.1. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR de Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL ------------------------------- 50 3.3.2. Caracterización por Resonancia magnética nuclear, RMN de Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL ------------------------------- 52 3.3.3. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR, de poli(lactonas) con grupo lateral ------------------------------------------------------------------------------ 54 3.4. Caracterización por análisis térmico de los polímeros obtenidos ---------- 56 3.4.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL-------------------------------- 56 3.4.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA para Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL ------------------------------- 60 3.4.3. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA para Poli( butirolactona), PBTL, Poli(decanolactona), PDCL y Poli(5-dodecanólido) P5DDCL ---------------------------------------------------------------------------------------- 62 3.5. Polimerización por apertura de anillo en dos pasos de lactonas con grupo lateral --------------------------------------------------------------------------------------------- 63 3.5.1. Polimerización por apertura de anillo en dos pasos incrementando la concentración de enzima en lactonas con grupo lateral ---------------------------- 64 3.6. Síntesis de copolímeros de -CL-co-PDL mediante un proceso de polimerización por apertura de anillo ---------------------------------------------------- 66

iv

3.6.1. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR, de copolímeros de

-CL-co-PDL ------------------------------------------------------------------------------ 68

3.6.2. Caracterización por Resonancia magnética nuclear, RMN de copolímeros -CL-co-PDL ----------------------------------------------------------------------------------- 69 3.6.3. Caracterización por análisis térmico de los copolímeros obtenidos ----- 72 3.6.3.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para copolímeros -CL-co-PDL ------------------------------------------------------------------ 72 3.6.3.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA, para copolímeros -CL-co-PDL ----------------------------------------------------------------------------------- 74 3.7. Propiedades térmicas para mezclas físicas de -CL/ PDL 50:50 ---------- 75 3.7.1. Análisis de calorimetría diferencial de Barrido, DSC, para una mezcla física de P -CL/ PPDL 50:50 --------------------------------------------------------------- 75 3.7.2. Análisis termogravimétrico, TGA, para una mezcla física de P -CL/ PPDL 50:50 ------------------------------------------------------------------------------------ 77 3.8. Síntesis de lactonas a dos diferentes temperaturas 70°C y 90ºC por polimerización por apertura de anillo ---------------------------------------------------- 78 3.8.1. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR de Poli(pentadecanólido), PPDL obtenido a 70°C y 90°C ------------------------------ 79 3.8.2. Caracterización por resonancia magnética nuclear, RMN de Poli(pentadecanólido), PPDL obtenido a 70°C y 90°C ------------------------------ 81

v

3.8.3. Difracción de Rayos X para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenido a 70°C y 90°C ------------------------------------------------------------------------------------ 83 3.8.4. Caracterización por análisis térmico para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70°C y 90°C --------------------------------------------------------------------- 84 3.8.4.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70°C y 90°C ------------------------------ 84 3.8.4.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA, para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70°C y 90°C ------------------------------ 88 Conclusiones ----------------------------------------------------------------------------------- 90 Referencias ------------------------------------------------------------------------------------ 93

vi

Índice de tablas

Tabla 2.1. Propiedades físicas de los monómeros………………………………30 Tabla 2.2. Concentraciones de reactivos en el sistema de reacción usada en la Síntesis de las lactonas catalizada por Lipasa Pancreática Porcina, LPP……32 Tabla 3.1. Síntesis de varias lactonas por polimerización por apertura de anillo a 75°C utilizando novozyme 435…………………………………………………...42 Tabla 3.2. Síntesis de copolímeros a partir de -CL y PDL por polimerización por apertura de anillo a 75°C utilizando novozyme 435…………………………66

vii

Índice de Figuras

Figura 1.1. Representación esquemática de una lipasa visualizando la estructura secundaria y la estructura terciaria que proporciona la conformación general……………………………………………………………………………...... 13 Figura 1.2. Representación esquemática de una reacción enzimática visualizando el corte de una enzima que parecería tener forma globular y mostrando su sitio activo cuya forma permite la interacción con el sustrato que debe ajustarse a la misma geometría……………………………………………...14 Figura 1.3. Gráfica de las energías de las diferentes fases de una reacción. Los sustratos precisan mucha energía para alcanzar el estado de transición, pero una vez alcanzado, se transforman en productos. La enzima estabiliza el estado de transición, reduciendo la energía necesaria para formar los productos……………………………………………………………………………...15 Figura 1.4. Mecanismo de polimerizacion por apertura de anillo propuesto catalizado por Cándida antárctica; lipasa tipo B………………………………… 24 Figura 1.5. Ilustración de la enzima CALB……………………………..……….. 27 Figura 1.6. Mecanismo de reacción de Cándida antárctica; lipasa tipo B…… 28 Figura 2.1. Sistema de reacción de polimerización por apertura de anillo catalizado por N435………………………………………………………………… 33 Figura 3.1. Conversión de monómero durante la polimerización enzimática en un paso………………………………………………………………………………. 44 Figura 3.2. Perfil de GPC del producto de polimerización de

-Caprolactona

catalizado por N435 a diferentes tiempos………………………………………. 46 Figura 3.3. Perfil de GPC de la reacción de polimerización de -Butirolactona catalizada por N435 a diferentes tiempos……………………………………… 47 Figura 3.4. Aspecto de los polímeros obtenidos por polimerización por apertura de anillo catalizado por N435 a partir de lactonas sin grupo lateral…………. 50 Figura 3.5. Espectros de FTIR de polímeros obtenidos a partir de lactonas sin grupo lateral mediante polimerización por apertura de anillo…………….….... 51 viii

Figura 3.6. Espectro 1H NMR de a) poli( -caprolactona), P -CL y b) poli(pentadecanólido), PPDL, en CDCl3…………………………………..……… 52 Figura 3.7. Espectro de FTIR de productos obtenidos de lactonas con grupo lateral mediante polimerización por apertura de anillo de un paso………….... 54 Figura 3.8a. Termogramas de DSC para P -CL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso; segunda, R2, y tercera, R3, prueba de calentamiento……………………………………………………………………….. 56 Figura 3.8b. Termogramas de DSC del comportamiento de la cristalización para P -CL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso; primera, R1, y segunda, R2 corrida de enfriamiento………………………..…… 57 Figura 3.9a. Termogramas de DSC para PPDL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso; segunda, R2, y tercera, R3, prueba de calentamiento……………………………………………………………………….. 58 Figura 3.9b. Termogramas de DSC del comportamiento de la cristalización para PPDL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso; primera, R1, y segunda, R2 corrida de enfriamiento…………………………….. 59 Figura 3.10. Termogramas de TGA de la degradación térmica de P -CL and PPDL obtenidos por polimerización por apertura de anillo de un paso………. 61 Figura 3.11. Termogramas de TGA de la degradación térmica de productos obtenidos de lactonas con grupo lateral, P -BTL, PDCL y P5DDCL, por polimerización enzimática por apertura de anillo de un paso…………………………………………………………………………..………. 62 Figura 3.12. Espectros de FTIR de poli( -butirolactona) con Novozime 435 mediante un proceso de síntesis de 2 etapas con 30, 40 y 60% de N435…… 64 Figura 3.13. Aspecto de los copolímeros obtenidos por polimerización por apertura de anillo catalizado por N435 a partir de lactonas sin grupo lateral…………………………………………………………………………………. 67 Figura 3.14. Resultados de FTIR de copolímeros con concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol %.................................................... 68 Figura 3.15. RMN de copoliésteres con concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol %............................................................................ 70

ix

Figura 3.16. Termogramas de DSC de copoliésteres con concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol % en el segundo calentamiento…. 73 Figura 3.17. Termogramas de TGA de copoliésteres con concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol % en el segundo calentamiento…. 74 Figura 3.20. Termogramas de DSC de una película obtenida por mezcla física con una concentración de 50/50 % en peso de P CL/PPDL……………...………………………………………………………..….… 76 Figura 3.21. Termogramas de TGA de la degradación térmica para la película de P -CL/PPDL en un concentración de 50/50 % en peso mezclando físicamente los polímeros………..…………………………………………….…

77

Figura 3.22. Espectro de FTIR para poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70°C y 90ºC…………………………………………..……….…………………….. 80 Figura 3.23. Espectro de RMN para poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70ºC (abajo) y 90ºC (arriba)………………………………………………..……… 82 Figura 3.24. Difracción de rayos x de PPDL obtenido por polimerización por apertura de anillo a 70ºC y 90°C)…………………………………………………………………………………. 84 Figura 3.25. Termogramas de DSC para PPDL obtenido por polimerización enzimática a 70ºC y 90°C………………………………………………………………………………… 85 Figura 3.26. Termogramas de DSC del comportamiento de cristalización para PPDL obtenido por polimerización enzimática a 70ºC y 90°C……………………………………………………………………………….…. 87 Figura 3.27. Termogramas de la pérdida de masa por TGA para PPDL obtenido a dos diferentes temperaturas 70ºC y 90°C………………………………………………………………………...……...… 88 Figura 3.28. Termogramas de la primera derivada para PPDL obtenido a dos diferentes temperaturas 70ºC y 90°C……………………..……………………… 89

x

Resumen En este trabajo se sintetizaron dos diferentes polilactonas y sus copolímero a partir de la -caprolactona, -CL, y el pentadecanolido, PDL utilizando como catalizador una lipasa tipo B de Cándida antárctica (CALB) inmovilizada sobre una resina acrílica macroporosa, y que tiene por nombre comercial (Novosyme 435), N435. Los homopolímeros de P -CL y el PPDL alcanzaron un porcentaje de conversión de un 96% con pesos moleculares entre 26,076 g/mol con un índice de polidispersidad de 1.5 para la fracción soluble. La Tm obtenida por DSC para estos polímeros fue de 69°C con un porcentaje de cristalinidad de 55% para la P -CL y 93°C con un porcentaje de cristalinidad de 78% para la PPDL. En el caso de los copolímeros alcanzaron un porcentaje de conversión de un 96% con pesos moleculares entre 40 y 41,000 g/mol para 75 y 50% de -CL y 31, 000 g/mol para el 25% de -CL, con un índice de polidispersidad de 1.2 para la parte soluble. Por otro lado, copolímeros con 75 y 25% molar de

-CL muestran una sola Tm a 60 y 70°C respectivamente mientras que un

50% molar muestra dos Tm’s a 60 y 71°C y presentan una temperatura de degradación por encima de 350°C para todos los copolímeros. Evidencias de FTIR mostraron la correcta síntesis y obtención de los homopolímeros, pues muestran una absorción muy intensa a 1725 cm-1 para la P -CL, 1733 cm-1 para el PPDL y 1733 cm-1 de los copolímeros pertenecen a las vibraciones de estiramiento de –C=O del grupo carbonilo del éster. Un incremento en la temperatura de reacción a 90°C propicia que el PPDL presente un peso molecular y una cristalinidad menor que la PPDL preparada a 70°C además, de que por FTIR se observo una fase amorfa producida por la presencia de grupos OH terminales. La PPDL sintetizada a 90°C presenta múltiples eventos de fusión y cristalización a bajas temperaturas que no se observan en la PPDL obtenida a 70°C. Las diferencias en el comportamiento de cristalización se pueden atribuir a la presencia de la fase amorfa de la PPDL sintetizada a 90°C debido al incremento de los grupos OH terminales que rompen la estructura cristalina.

1

Abstract Polymerization of several lactones was carried out by either one or two steps polymerization methods employing novozyme 435 (N-435) as catalyst. Polymerization of lactones without side groups reached conversions of 96% at 12 h with molecular weights above 26076 g/mol for the soluble fraction. Thermal analysis

showed

that

these

polymers

have

a

Tm

of

69

for

the

poly(caprolactone), PCL, with a cristallinity of 55% and a T m at 93°C and 78% crystallinity for Poly(pentadecanolide), PPDL. On the other hand, the data obtained indicate that the lactone monomers bearing side groups produce only oligomers regardless of the steps used in the polymerization which is attributed to steric hindrance induced by the side groups of lactones. On the other hand, copolymers of

-caprolactone,

-CL, and pentadecanolide, PDL with 75/25,

50/50 and 25/75 mol % concentrations were synthesized employing novozyme 435 (N-435) as catalyst. They showed have the same percent conversion that the homopolymers at 24 h reaction; although the molecular weight of the soluble phase was higher. Thermal analysis showed that these copolymers with 75 mol % and 25 mol % of -CL only show a single melting peak at 63 and 79°C respectively while the copolymer with 50 mol % of -CL show two melting peaks at 61 and 71°C. The poly(pentadecanolide), PPDL, synthesized by enzymatic ring opening polymerization at 90ºC, presents lower molecular weight and crystallinity than the one prepared at 70ºC. It was detected by FTIR that PPDL synthesized at 90ºC presents a large amorphous phase with more terminal OH groups. A difference in the melting and crystallization behavior was detected by differential scanning calorimetry, DSC, where the melting of the PPDL synthesized at 90ºC presents multiple melting and crystallization events at lower temperature than those exhibit by PPDL synthesized at 70ºC which presents a well defined single melting and crystallization event. The differences in melting and crystallization behavior are attributed to the presence of a larger amorphous phase in PPDL synthesized at 90ºC due to increased number of terminal OH groups that disrupt the crystalline structure. Thermal stability is also higher in PPDL synthesized at 70ºC since the onset of decomposition starts 50ºC above that observed in PPDL obtained at 70ºC. 2

Introducción En los últimos años la obtención de plásticos biodegradables a partir de materiales naturales, ha sido uno de los grandes retos en diferentes sectores: industrial, agrícola y de materiales para servicios varios. Los poliésteres alifáticos tales como los polihidroxialcanoatos, PHA´s, y las polilactonas son poliésteres termoplásticos naturales que pueden ser obtenidos de fuentes naturales renovables pues son producidos por un amplio rango de microorganismos y en algunos casos por plantas [1-6]. Ellos presentan la ventaja de ser biodegradables, un hecho que ha recibido una amplia atención, además de que puede ser una muy buena opción para producir polímeros que permitan sustituir en gran medida a los polímeros sintéticos provenientes del petróleo [7, 8]. El polihidroxibutirato, (PHB) un miembro de la familia de los PHA´s fue el primer poliéster biodegradable descubierto en 1927 por Legmoine en bacterias del género Bacillus megaterium [9]. Posteriormente, en 1993, el grupo de Uyama, Kobayashi y colaboradores [10] y el grupo de Kani [11] reportaron independientemente la obtención de poliésteres alifáticos a partir de lactonas, especialmente

-caprolactona y

-valerolactona por polimerización

por apertura de anillo catalizado por lipasas. Estos polímeros han sido obtenidos además por procesos de fermentación y procesos químicos [12], aunque también se reporta la polimerización por apertura de anillo catalizada por enzimas. En este sentido, los parámetros de investigación ensayados han sido el efecto del origen de la enzima [13, 14], concentración del monómero y catalizador [15] temperatura de reacción [16, 17,18], tipo de solvente [19, 20], el uso de líquidos iónicos [21,22, 23] y el uso del contenido de agua [24]. 3

Recientemente, los reportes de la literatura han hecho énfasis en que la polimerización por apertura de anillo es una alternativa muy prometedora debido a que usa materiales ambientalmente benignos comparado con la polimerización química, el cual, emplea catalizadores organometálicos [25]. La polimerización enzimática por apertura de anillo también ha mostrado ser un método efectivo para el diseño y la síntesis de materiales poliméricos ambientalmente aceptables [26]. Por otro lado, la alta biocompatibilidad mostrada por estos polímeros hace que ellos sean adecuados para varias aplicaciones farmacéuticas y médicas tales como suturas quirúrgicas, andamios para ingeniería de tejidos y sistemas de liberación de fármacos, entre otros. Sin embargo, para estas aplicaciones los residuos organometálicos generados por el catalizador químico no son tolerados debido a su toxicidad. Por lo tanto, el uso de enzimas para la síntesis de polímeros usados en aplicaciones biomédicas se ha perseguido en las últimas décadas debido a que los polímeros obtenidos no son tóxicos y las reacciones pueden ser realizadas bajo condiciones benignas y amigables [27]. Los biopolímeros obtenidos por polimerización por apertura de anillo catalizada enzimáticamente, han recibido mucha atención debido a que son biodegradables, biocompatibles y además, son ambientalmente amigables. Adicionalmente, ellos presentan propiedades similares en comparación a los polímeros sintéticos tales como el polietileno y el polipropileno [9,28, 29]. Sin embargo, existen varias deficiencias para el uso comercial de estos polímeros, entre ellos se encuentran el costo de producción pues es relativamente caro comparado con la producción de otros polímeros, y son algo quebradizos para ser usados por debajo de su temperatura de transición vítrea; además de que se degradan térmicamente con mayor 4

facilidad por debajo de su punto de fusión. Para reducir esta debilidades varios copolímeros con diferentes tipos de unidades de poliésteres alifáticos como por ejemplo poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato), PHBV, ha sido biosintetizado [30]. La síntesis enzimática de copoliésteres de poli(12 hidroxidodecanoato)-co12-hidroxiesterato), poli( -pentadecanolactona)-co-poli(trimetilen carbonato), poli(R)-3-hidroxibutirato)-co-poli( -caprolactona), copolímeros de etil glicolato y -pentadecanolactona y varios otros han sido sintetizados por la polimerización por apertura de anillo usando Cándida antártica B inmovilizada en un soporte acrílico, novozime 435. Sin embargo, solamente algunos de estos copolímeros han demostrado buenas propiedades termoplásticas [28, 31, 32, 33]. Por otra parte, la síntesis de los copolímeros de

-pentadecanolactona,

-PDL y -

caprolactona -CL usando Novozime 435 ha sido reportado por Ceccorulli G. et al and Kumar A. et al, sin embargo, los pesos moleculares obtenidos fueron entre 20,000 y 38,000 g/mol [34,35]. Basado en esta perspectiva, en el presente trabajo se estudio la polimerización por apertura de anillo de lactonas, en particular de lactonas con y sin grupo lateral, catalizado por dos tipos de lipasas; la Cándida antárctica (CALB) inmovilizada en una resina acrílica, cuyo nombre comercial es Novozyme 435, (N435) y una lipasa pancreática porcina nativa, (LPP) para preparar lactonas con diferentes tamaños de cadena. El propósito de usar diferentes tipos de lactonas es para comparar el efecto del grupo lateral en la síntesis y sobre las propiedades químicas y térmicas de los polímeros obtenidos. Por otro lado, se reporta la síntesis y caracterización de copolímeros de -caprolactona, -CL y un pentadecanolido, PDL, con diferentes concentraciones de lactonas. Dado 5

que los resultados obtenidos en las lactonas con grupo lateral no fue el esperado en sistemas de un paso, también fue necesario estudiar el efecto del contenido de agua y la concentración de enzima en un sistema dos pasos.

6

Hipótesis

Es factible obtener polímeros biodegradables a partir de lactonas con diferentes tamaños de anillos que posean estructuras morfológicas y propiedades fisicoquímicas diferentes mediante la polimerización enzimática por apertura de anillo catalizada por lipasas variando la temperatura del medio de reacción y utilizando condiciones de reacciones menos drásticas y ambientalmente seguras que los procesos químicos.

7

Justificación En los últimos años se ha observado una tendencia creciente no solo en el desarrollo de nuevos métodos o técnicas de obtención sino también en la búsqueda, desarrollo y empleo de nuevos polímeros que nos permitan la sustitución temporal o permanente de los polímeros convencionales ya existentes. Esto, es debido a los inconvenientes asociados con el uso de los polímeros convencionales, no solo desde el punto de vista ambiental, sino también con sus métodos de obtención y la disminución de las reservas petroleras aunado a la creciente demanda en el campo biomédico. Ante esta perspectiva surgen los biopolímeros o polímeros biodegradables los cuales puede ser obtenidos polimerización por apertura de anillo catalizado por enzimas, la cual es una alternativa muy prometedora debido a que usa materiales ambientalmente benignos comparado con la polimerización química, el cual, emplea catalizadores organometálicos o por medios bacterianos cuyo costo de producción es relativamente alto. Por otra parte, estos constituyen una alternativa ecológica pues presentan la ventaja de ser biodegradables, además de que resultan ser una muy buena opción para producir polímeros que permitan sustituir a los polímeros sintéticos tales como el polietileno y el polipropileno pues ofrecen propiedades similares a estos polímeros. Por otra parte, la alta biocompatibilidad mostrada por estos polímeros hace que ellos sean adecuados para varias aplicaciones farmacéuticas y médicas además, de que son completamente degradados en compuestos que no dañan el medio ambiente pues sus cadenas poliméricas se convierten en CO2, CH4 y H2O,

biomasa y otros componentes básicos . El lograr el control de la polimerización 8

enzimática por apertura de anillo, de monómeros para producir polímeros biodegradables, será un avance significativo que permitiría aumentar las capacidades de producción y reducir los costos de preparación de estos materiales.

9

Objetivos Objetivo general Sintetizar y caracterizar las propiedades térmicas de polímeros y copolímeros de poli(lactonas) obtenidos por polimerización enzimática a partir de diferentes lactonas. Objetivos específicos  Sintetizar polímeros y copolímeros a partir de 5 diferentes lactonas utilizando lipasa pancreática porcina y/o la lipasa tipo B de Cándida antárctica

inmovilizada

sobre

una

resina

acrílica

macroporosa

(Novozyme 435).  Determinar el efecto de la estructura del monómero de lactona sobre el rendimiento de la reacción, peso molecular y morfología de la poli(lactona) obtenida.  Determinar el efecto del tipo y concentración de la lipasa sobre el rendimiento de la reacción, peso molecular y morfología de la poli(lactona) obtenida.  Determinar el efecto de la temperatura de reacción sobre el rendimiento, peso molecular y morfología de la poli(lactona) obtenida.  Determinar las propiedades térmicas de los polímeros y copolímeros obtenidos.  Desarrollar películas a partir de las poli(lactonas) obtenidas

10

Capítulo 1

1.1.

Polímeros y biopolímeros

Los polímeros son moléculas grandes formadas por la repetición de subunidades idénticas, similares o complementarias

llamadas monómeros

[36]. Estos polímeros pueden originarse de fuentes naturales (o pueden ser producidos sintéticamente por métodos químicos. Así, los polímeros “naturales” (también llamados biopolímeros), entre los que se encuentran el almidón, el hule, la seda y el DNA, son producidos por procesos en los que se realizan múltiples pasos bioquímicos en una célula viva. Por otra parte, los polímeros sintéticos fueron comercializados por primera vez en 1890 y desde entonces, la biblioteca de los polímeros sintéticos se ha ampliado drásticamente, lo que los ha llevado a obtener una posición dominante en nuestra vida diaria por su aplicación en toda clase de materiales, tales como ropa, materiales de construcción, recubrimientos, adhesivos y muchas otras aplicaciones [37,38]. Entre la clasificación de polímeros sintéticos se encuentran los biopolímeros sintéticos también llamados biomateriales, los cuales son producidos a partir de fuentes de recursos naturales obtenidos de las plantas u organismos vivos. Así, los polímeros sintéticos biodegradables son una clase de polímeros diseñados para descomponerse una vez que cumple la función para la que fueron creados. Por otra parte, estos constituyen una alternativa

ecológica

pues presentan la ventaja de ser biodegradables, hecho que ha recibido una amplia atención, además de que resultan ser una muy buena opción para producir polímeros, que permitan sustituir en gran medida, a los polímeros sintéticos provenientes del petróleo tales como el polietileno y el polipropileno 11

pues pueden ofrecer propiedades similares a estos polímeros [7, 8, 39]. Por otro lado, desde el punto de vista industrial, los biopolímeros resultan ser amigables con el medio ambiente pues comienzan a degradarse por la acción enzimática de los microorganismos tales como bacterias, hongos y algas o por reacciones químicas con el medio ambiente. La biodegradación convierte sus cadenas poliméricas en CO2, CH4 y H2O, biomasa y otros componentes básicos [40]. Las características de biodegradabilidad los hace fuertes candidatos para ser usados como materiales de embalaje (bolsas de basura, espumas de relleno suelto, contenedores de alimentos, papel laminado, etc), tejidos no desechables (telas de ingeniería) y productos de higiene (hisopos de algodón, etc); bienes de consumo y en aplicaciones biomédicas [41, 42, 43]. Los biomateriales son materiales que han sido modificados para ser usados solos o formando partes de sistemas más complejos, en medicina humana o veterinaria;

para dirigir el curso de un procedimiento de diagnostico o

terapéutico, mediante el control de las interacciones con componentes de los sistemas vivientes [44]. Por lo general, se dividen en biomateriales poliméricos, metálicos y cerámicos y son ampliamente usados en varios campos biomédicos, desde lentes de contacto, dializadores de riñón, injertos cardiovasculares para marcapasos cardiovasculares y liberadores de fármacos con el propósito de mejorar la calidad de vida del ser humano [45, 46].

12

1.2.

Las enzimas

Las enzimas son moléculas de naturaleza estructural y proteica que catalizan reacciones químicas.

Figura 1.1. Representación esquemática de una lipasa visualizando la estructura secundaria y la estructura terciaria que proporciona la conformación general.

Siempre que sean termodinámicamente posible: una enzima hace que una reacción química, que es energéticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones las enzimas actúan sobre unas moléculas llamadas sustratos los cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos tal como se muestra en la Figura 1.2.

13

Productos Sustrato

Enzima

Complejo enzima-sustrato

Figura 1.2. Representación esquemática de una reacción enzimática visualizando

el corte de una enzima que parecería tener forma globular y

mostrando su sitio activo cuya forma permite la interacción con el sustrato que debe ajustarse a la misma geometría.

A las reacciones mediadas por enzimas se les llama reacciones enzimáticas. Debido a que las enzimas son extremadamente selectivas con sus sustratos y su velocidad crece solo con algunas reacciones, el conjunto o set de enzimas sintetizadas en una célula determina el tipo de metabolismo que tendrá cada célula. Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación

G de una reacción, de tal forma que aceleran

sustancialmente la tasa de reacción tal como se muestra en la Figura 1.3. Las enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en las que intervienen, ni modifican, por tanto, el equilibrio de la reacción, pero si consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reacción que se produce bajo el control de una enzima o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho más rápido que la correspondiente reacción no catalizada. 14

Figura 1.3. Gráfica de las energías de las diferentes fases de una reacción. Los sustratos precisan mucha energía para alcanzar el estado de transición, pero una vez alcanzado, se transforman en productos. La enzima estabiliza el estado de transición, reduciendo la energía necesaria para formar los productos.

Al igual de lo que ocurre con otras reacciones, las enzimas no son consumidas por las reacciones que catalizan, ni alteran su equilibrio químico, sin embargo, las enzimas difieren de otros catalizadores por ser más específicas. Por otra parte la actividad de la enzima puede ser afectada por otras moléculas como son los llamados

inhibidores enzimáticos los cuales son moléculas que

disminuyen o impiden la actividad de las enzimas, mientras que los llamados activadores son moléculas que incrementan dicha actividad. Así mismo, gran cantidad de enzimas requieren de cofactores para su actividad [47].

15

Las enzimas son generalmente proteínas globulares que pueden presentar tamaños muy variables, desde 62 aminoácidos como en el caso de la 4oxalocrotonato tautomerasa hasta los 2500 presentes en la sintetasa de ácidos grasos. La actividad de la enzima es determinada por su estructura tridimensional, que a su vez es determinada por la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, aunque la estructura determina la función, predecir una nueva actividad enzimática basándose únicamente en la estructura de una proteína es muy difícil y un problema aun no resuelto. Casi todas las enzimas son mucho más grandes que los sustratos sobre los que actúan y solo una pequeña parte de la enzima, alrededor de 3 o 4 aminoácidos están directamente involucrados en la catálisis. La región que contiene estos residuos encargados de catalizar la reacción es denominada centro activo. Suelen ser muy específicas tanto del tipo de reacción que catalizan así como del sustrato involucrado en la reacción. La forma, la carga y las características hidrofílicas e hidrofóbicas de las enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. También pueden mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y quimioselectividad. Casi todas las enzimas conocidas son proteínas. Sin embargo, las proteínas no tienen un monopolio absoluto sobre la catálisis. Las proteínas son una clase de macromoléculas, catalizadores altamente efectivos para una enorme diversidad de reacciones químicas debido a su capacidad para unirse específicamente a un amplio rango de moléculas. Utilizando todo su repertorio de fuerzas intermoleculares, las enzimas atraen las sustancias en una orientación óptima, el preludio para hacer y romper enlaces químicos. Ellas catalizan la reacción mediante estabilización de estados de transición, la especie de mayor energía en vía de reacción. Estabilizando selectivamente un 16

estado de transición, una enzima determina cual de las varias posibles reacciones toma lugar actualmente. Las enzimas son altamente específicas en las reacciones que ellas catalizan y a la vez para escoger sus reactantes, los cuales son llamados sustratos. Una enzima generalmente cataliza una sola reacción química o un juego de reacciones muy relacionadas [48].

1.2.1. Especificidad y selectividad de la enzima El término especificidad y selectividad es usado mucho en enzimología y a menudo se mezclas de una manera confusa. Muchas preguntas surgen cuando se habla de este concepto. Sin embargo, en una reacción específica muchas de las enzimas muestran una especificidad muy marcada para la reacción que ellas catalizan. Esta especificidad en la reacción puede explicarse por el hecho de que las enzimas estabilizan los diferentes estados de transición de la reacción ya que tienen diferentes aminoácidos catalíticos en su sitio activo. Por ejemplo, el ácido glutámico puede ser usado como sustrato por una transaminasa dando el correspondiente -ceto-ácido y un nuevo aminoácido. Y puede ser usado por una deshidrogenasa dando como resultado una reacción de desaminación donde son producidos un

-ceto ácido y amonio. Una

descarboxilasa da lugar a su correspondiente amina y dióxido de carbono [49]. Por otro lado, cuando una enzima cataliza dos diferentes tipos de reacciones, se habla entonces de selectividad de la reacción. En la literatura, esto se conoce o ha sido llamado promiscuidad catalítica y ha sido dividida en dos tipos diferentes la accidental (reacción secundaria de tipo silvestre) o inducida (nueva reacción establecida por una o más mutaciones). 17

Un ejemplo de una

enzima que muestra una promiscuidad catalítica accidental es la Cándida antárctica lipasa del tipo B. Esta lipasa tiene, además de su actividad hidrolítica, la habilidad de catalizar las reacciones de Michael

(también

llamadas adición de Michael la cual consiste en la adición de un enolato, una cetona o un aldehído sobre el carbono

de un compuesto carbonílico

-

insaturado) para la formación de enlaces C-S. En algún punto la mutación catalítica de la serina que se encuentra en la posición 105 a alanina incrementa la actividad de la adiciones de Michael [50,51].

1.2.2. Especificidad y selectividad en el sustrato La especificidad al sustrato es el término que se utiliza para describir la especificidad o eficiencia de la enzima hacia cierto sustrato. Esta especificidad es determinada por la constante de especificidad (kcat/Km). Dos enzimas pueden ser comparables por su especificidad hacia cierto sustrato solo si catalizan el mismo tipo de reacción o tienen el mismo mecanismo por ejemplo la quimiotripsina (endopeptidasa de serina) y la quimosina (endopeptidasa aspártica) catalizan la misma reacción de tal forma que puedes ser comparadas por su especificidad de sustrato [52]. En cuanto a la selectividad del sustrato, las enzimas muestran frecuentemente esta selectividad debido a que pueden distinguir entre los diferentes sustratos. El valor de la selectividad entre los dos sustratos A y B es expresado por la razón entre la constante de especificidad de los dos sustratos comparados (kcat/Km)A/(kcat/Km)B.

18

1.2.3. Factores importantes que determinan la selectividad Los factores más importantes que determinan la selectividad son las restricciones espaciales, interacciones electrostáticas, la hidrofobicidad del área alrededor del sitio activo y el medio con que se estabiliza el estado de transición. Así, las enzimas discriminan entre diferentes grupos químicos, quimioselectividad, (la Cándida antárctica lipasa del tipo B es 105 veces más selectiva para alcoholes que para tioles en reacciones de trans acilación). En el caso de la regio-selectividad la enzima puede tener selectividad para uno o dos grupos funcionales similares en una molécula de sustrato. Y en cuanto a la estero (enantio) selectividad las enzimas muestran selectividad entre estéreoisómeros de una molécula de sustrato. Esto significa que uno de los isómeros reacciona más rápido que otro [47].

1.2.4. Clasificación de las enzimas Se pueden distinguir dos tipos de polimerización enzimática, en vivo y en vitro. Así, la polimerización enzimática en vivo incluye la formación de DNA y proteínas, la formación de hilo de araña [53] y la formación de poli(4hidroxibutirato) [54]. Sin embargo, para la producción de estos polímeros se requieren que se lleve a cabo un metabolismo mucho más complejo, el cual da como resultado, polímeros puros y bien definidos. A diferencia de lo anterior, las enzimas pueden ser aisladas de organismos vivientes tales como bacterias y aplicadas en medios acuosos o más aún en medios orgánicos para promover reacciones específicas sin la necesidad de toda la célula del organismo. Este 19

proceso enzimático es el llamado catálisis in vitro. En la actualidad, las enzimas son aplicadas en muchos procesos (orgánicos) industriales en un orden que permita reducir el número de pasos de la reacción o para producir quiralidad en el producto final de la reacción. En la naturaleza las enzimas pueden dividirse en 6 clases [48, 55].

I

Óxido-reductasa

Cataliza las reacciones redox por transferencia de electrones.

II

Transferasas

Cataliza la transferencia de un grupo funcional, por ejemplo, de un grupo metilo a un grupo glicosídico desde un compuesto (donador) a otro compuesto (receptor).

III

Hidrolasas

Cataliza la hidrólisis de varios enlaces en orden para transferir grupos funcionales a agua.

IV

Liasas

Cataliza las rupturas de los enlaces C-C, C-O, C-N y otros enlaces de tal modo que por hidrólisis u oxidación.

V

Isomerasas

Cataliza por racemizacion (proceso químico que consiste en la conversión de un compuesto L en D o de D en L) o epimeración (En un compuesto ópticamente activo que contiene dos o más centros asimétricos, un proceso en el que solamente uno de estos centros es alterado por alguna reacción para formar un epímero) de centros quirales. Las

20

isomerasas son divididas de acuerdo a sus centros quirales. VI

Ligasas

Cataliza el acoplamiento de dos moléculas con una hidrólisis concomitantemente de un enlace di fosfato a un ATP o un trifosfato similar.

De estas seis clases de enzimas únicamente 3 han sido reportadas para catalizar o inducir polimerización in vitro, las óxido-reductasas, las transferasas y las hidrolasas. De estas tres clases las hidrolasas son las enzimas que más se han investigado para síntesis in vitro. Esta clase incluye a las glicosidasas las cuales son usadas en la síntesis de polisacáridos, las proteasas que son usadas para la formación de enlaces péptidos y las lipasas que son usadas para las síntesis de esteres grasos en la naturaleza. Este último, es particularmente interesante en la síntesis de polímeros. Se sabe que las lipasas pueden catalizar reacciones en un medio orgánico debido que ellas presentan actividad en una interface agua-grasa en la célula y no requieren un cocatalizador. Por otro lado, pueden ser usadas para reacciones de policondensación y poli transesterificación, polimerizaciones por apertura de anillo, PPAA [56] y reacciones de modificación de polímeros. De aquí a que el uso de la palabra enzima se refiere solamente a la lipasa. Por otra parte, la aplicación de enzimas en la química de polímeros presenta muchas ventajas: las reacciones de polimerización pueden llevarse a cabo bajo condiciones suaves con respecto a la presión, temperatura y pH, lo que hace

a las

reacciones enzimáticas muy eficientes energéticamente [55]. También resultan ser altamente selectivas: quimio, regio y enantioselectivas (todo puede ser 21

inducido enzimáticamente) abriendo una nueva dirección hacia la síntesis precisa de polímeros. Las enzimas son consideradas como catalizadores “verdes”, no tóxicos que pueden satisfacer las demandas y requisitos comerciales, ecológicos y biomédicas cada vez mayores. La aplicación de las lipasas no se limita a su entorno original o papel natural: las lipasas pueden catalizar la hidrólisis pero también pueden catalizar una reacción opuesta como la condensación.

1.3.

Síntesis de poliésteres catalizados por enzimas.

Los poliésteres alifáticos han sido ampliamente investigados debido a su viabilidad sintética, la disponibilidad de productos con pesos moleculares suficientemente altos para su uso como materiales a granel y su capacidad para someterse a la degradación hidrolítica y biológica. Las hidrolasas y en particular las lipasas han resultado ser muy exitosas en la síntesis de poliésteres mediante dos métodos: por policondensación o polimerización por apertura de anillo. Las lipasas catalizan la policondensación de hidroxiácidos [57] y la policondensación de diácidos o anhídridos con dioles [58]. Esteres cíclicos por polimerización por apertura de anillo [59], di esteres cíclicos [60] y carbonatos cíclicos [61] también han sido polimerizados por enzimas.

1.4.

Polimerización por apertura de anillo enzimática

El primer reporte de la polimerización por apertura de anillo apareció en 1993 cuando Kani y colaboradores y Kobayashi y colaboradores reportaron 22

independientemente la polimerización por apertura de anillo de -caprolactona ( -CL) usando una lipasa [62]. Posteriormente, la polimerización por apertura de anillo de varias lactonas con tamaños de anillos cortos y largos (de 4 a 17 átomos de carbono), han sido eficientemente catalizados por diferentes lipasas [63]. A diferencia de la catálisis química [64], lactonas con anillos de 16 átomos de carbono han sido polimerizadas con gran eficiencia por las enzimas [39]. Por otra parte, poliésteres quirales también han sido polimerizados por polimerización por apertura de anillo de lactonas racémicas sustituidas [65]. Además, copolímeros al azar fueron enzimáticamente obtenidas por la copolimerización de diferentes lactonas [66] y lactonas con lactatos [67]. También en la literatura se reporta que la polimerización por apertura de anillo catalizado por lipasa, ha sido usada para injertar poliésteres sobre la cadena principal de poliestireno [68].

23

1.4.1. Mecanismo de la polimerización por apertura de anillo catalizada por una enzima. La polimerización por apertura de anillo enzimática es una forma de transesterificación donde los esteres cíclicos (lactonas) son usadas como sustratos y son abiertas por la enzima. En la Figura 1.4. Se muestra el mecanismo de la trans-esterificación enzimática por polimerización por apertura de anillo [55, 69].

Enzima libre

ET1

Acil enzima

ET2

Figura 1.4. Mecanismo propuesto de polimerización por apertura de anillo catalizado por Cándida antárctica; lipasa tipo B.

El sitio activo de la lipasa es generalmente formado por una triada catalítica que consiste en serina, Ser, histidina, His, y aspartato, Asp, que son electrónicamente estabilizadas durante la reacción [70]. La polimerización de 24

por apertura de anillo catalizada enzimáticamente, (ePAA), puede ser dividida dos pasos: Iniciación en donde un ataque nucleofílico es necesario para abrir el anillo de la lactona y la propagación donde la lactona abierta actúa como un nucleófilo, por su grupo hidroxilo terminal, para la apertura del anillo de una nueva lactona. El mecanismo de la ePAA es ilustrado en el esquema de la Figura 1.4 donde una lactona (Marrón) es atacada por la serina catalítica de la enzima pasando por el primer estado de transición (ET1) formando el complejo acil-enzima. El grupo saliente en este caso es el hidroxilo terminal de la lactona el cual permanece en la misma molécula. El iniciador (Azul) o la cadena de propagación (verde) atacaría al complejo acil-enzima pasando por el segundo estado de transición (ET2) formando la enzima libre, la lactona iniciada o la cadena propagada [69, 71].

1.4.2. Ventajas del la Polimerización por apertura de anillo La polimerización por apertura de anillo enzimática o química presenta una importante ventaja sobre la polimerización por condensación, mientras que el peso molecular de los polímeros resultantes puede ser controlado usando una concentración controlada de la relación monómero/iniciador en la poli condensación no se puede controlar. Por otro lado, presentan ventajas sobre las reacciones en los cuales se usan catalizadores químicos convencionales. Usando la ePAA, la presencia de catalizadores de ácido fuertes o altas temperaturas no son necesarias en el proceso de polimerización [72].

25

1.5.

Cándida antárctica, lipasa tipo B (CALB)

La levadura de Cándida antárctica produce dos diferentes tipos de lipasas, A y B [73]. Las dos lipasas son muy diferentes; la lipasa A es muy termoestable y más activa con triglicéridos mientras que la lipasa del tipo B es mucho más activa en la hidrólisis de un amplio intervalo de esteres [74]. Cándida antárctica lipasa tipo B (CALB) es una proteína globular que pertenece a la familia de las hidrolasas

[75]. Su cadena polipéptica está compuesta de 317 aminoácidos

y su peso molecular es de 33 KDa. La estructura cristalina fue determinada por medio de cristalografía de rayos x en 1994 por Uppenberg et al [76]. El sitio activo de CALB está situado en el núcleo de la proteína y está compuesto de dos canales uno que aloja el acilo y el otro que aloja los residuos de alcohol de sustrato, siendo el primer canal el más espacioso. Esta característica hace que la enzima sea más selectiva hacia sustratos que contengan alcohol. El sitio de unión tiene una forma de embudo y está compuesto de una secuencia de aminoácidos altamente hidrofóbicos que envuelven la cavidad de las paredes internas. Esta enzima presenta un mecanismo de reacción igual al que presenta la serina de las proteasas con una triada catalítica (Serina: Ser 105, Histidina: His 224 y Aspartato: Asp 187) tal como se observa en la Figura 1.5; además presenta un agujero llamado oxi-anión compuesto por Treonina:Tre 40 y Glutamina:Gln 106 [70].

26

Figura 1.5. Ilustración de la enzima CALB

El mecanismo de reacción llevado a cabo por la lipasa es ilustrado en la Figura 1.6 en donde observa la reacción de trans-acilación. Así, un éster carboxílico (sustrato 1) se une al sitio activo y el carbón del carbonilo del éster es entonces atacado por la ser 105 catalítica (nucleófilo) pasando al primer estado de transición (ET1). Este ataque es promovido por la His 224 que actúa generalmente como una base y acepta un protón de la Ser 105. Durante el ataque el doble enlace del C=O se convierte en un enlace sencillo y el átomo de oxigeno se transforma en un oxianion formando tres enlaces de hidrógeno con el agujero oxianion (dos para la Tre 40 y uno para Gli 106). El alcohol (primer producto) deja el sitio activo y el complejo acil-enzima se forma. Un nucleófilo (alcohol) lleva a cabo un nuevo ataque sobre el carbón del carbonilo del complejo acil-enzima pasando al segundo estado de transición (ET2), llevándose a cabo una reacción de trans-acilación y formando el producto (producto 2) el cual es liberado regenerándose la enzima [70].

27

ET1

Enzima libre

Acil-Enzima ET2

Figura 1.6. Mecanismo de reacción de Cándida antárctica; lipasa tipo B.

28

Capítulo 2 Parte experimental

2.1. Reactivos. La

-butirolactona,

-BTL, -decanolactona, -DCL,

-caprolactona,

-CL, 5-

Dodecanólido, 5DDCL y el pentadecanólido, PDL, utilizados como monómeros en la síntesis de los polímeros en este trabajo fueron obtenidos de Aldrich Inc., y fueron usados sin tratamiento alguno. También fueron usadas como catalizadores dos diferentes tipos de enzimas: una lipasa pancreática porcina, LPP, en su forma nativa y la lipasa tipo B de Cándida antártica (CALB) inmovilizada sobre una resina acrílica macroporosa y que tiene por nombre comercial (Novosyme 435), N435 ambas obtenidas de Aldrich Inc. Además, se utilizó tolueno grado reactivo como medio orgánico, metanol el cual actúa como iniciador aunque también fue para precipitar el polímero y cloroformo para disolver el polímero formado. En la Tabla 2.1 se muestran los monómeros usados en este trabajo y sus propiedades.

29

Tabla 2.1. Propiedades físicas de los monómeros Nombre

Código

Estado físico

Peso molecular (g/mol)

Pureza (%)

-Caprolactona

-CL

Líquido

114.4

97

Pentadecanólido

PDL

Sólido

240.38

98

-Butirolactona

-BTL

Líquido

86.09

98

-Decanolactona

-DCL

Líquido

170.25

99

5DDCL

Líquido

198.30

98

5-Dodecanólido

Estructura química

2.2. Síntesis de los polímeros y copolímeros 2.2.1. Síntesis de las lactonas usando Lipasa Pancreática Porcina, LPP. El procedimiento para la síntesis de los polímeros por polimerización por apertura de anillo, (PAA), usando como catalizador a la lipasa pancreática porcina, LPP ha sido descrita previamente. El procedimiento para la síntesis de los polímeros por polimerización por apertura de anillo, (PAA), usando como catalizador a la lipasa pancreática porcina, LPP ha sido descrita previamente. En una polimerización enzimática típica, la LPP en forma de polvo (3 g) fue depositada en un matraz erlenmeyer junto 1.63 ml de monómero ; 0.016 ml de metanol y 20 ml n-hexano. Posteriormente, se sello el matraz con una septa y 30

se burbujeo nitrógeno por 30 min. El matraz fue calentado hasta 60°C en un baño de aceite por un tiempo de 500 horas. Una vez detenida la reacción, la enzima fue removida por filtración y lavada una vez con 20 ml de n-hexano y 2 veces con 20 ml de Cloroformo. Luego, se combinaron el filtrado y la solución de lavado y fueron diluidos con 800 ml de metanol frio. Posteriormente, la solución obtenida fue concentrada con un rotavapor, sin embargo, no se formó precipitado como se

esperaba por lo que la solución se concentró con un rotavapor. Dado que el resultado obtenido no fue el esperado se realizó nuevamente la reacción disminuyendo la concentración de la enzima a un 10% (0.163g) con respecto a la concentración del monómero y se fijó una concentración de 2:1 de n-hexano con respecto a la concentración de monómero. La disminución de la enzima fue con el propósito de hacer más diluida la solución de reacción. Aun cuando se ajustaron estos dos parámetros los resultados fueron similares a los obtenidos anteriormente, no se

formó precipitado como se esperaba . Este método de reacción fue probado con todas las lactonas; ( -butirolactona,

-BTL,

-decanolactona,

-DCL y el 5

Dodecanólido, 5DDCL), que contenían un grupo lateral obteniéndose nuevamente productos de bajo peso molecular. Ante estos resultados se optó por probar con tolueno como medio orgánico, pues en la literatura se reporta que puede dar muy buenos resultados cuando se usa como medio orgánico en reacciones catalizadas por enzimas. Para tratar de tener una concentración adecuada de tolueno; esta se fijó una concentración de 2:1 con respecto a la concentración de monómero, pues se observó que con una concentración 1:1 la solución era muy concentrada. Se mantuvo la concentración de la lipasa pancreática porcina a un 10% con respecto a la concentración del monómero, la concentración de lactona y la de los otros reactivos así como también la temperatura y el tiempo de reacción. Este método de reacción fue probado nuevamente con todas las lactonas; 31

-butirolactona,

-BTL,

-

decanolactona, -DCL, y el 5 Dodecanólido, 5DDCL que contenían un grupo lateral, además, se incluyeron dos lactonas sin grupo lateral, la -caprolactona,

-CL y el pentadecanólido, PDL, sin embargo, los productos presentaban las mismas características; eran ceras y aceites y con un rendimiento de la reacción entre 4 y 6%. En la Tabla 2.2 se muestran la concentración de solventes usados

como medio orgánico y enzima en la síntesis de lactonas. Tabla 2.2. Concentraciones de reactivos en el sistema de reacción usada en la síntesis de las lactonas catalizada por Lipasa Pancreática Porcina, LPP. Tipo de enzima LLP nativa 3g

Solvente del medio n-hexano 20 ml

10%(0.163g)

n-hexano (2:1)

Monómero -butirolactona

Temperatura ºC 60

-butirolactona

60

-decanolactona

60

5-dodecanólido

10%(0.163g)

Tolueno 2:1

60

-butirolactona

60

-decanolactona

60

5-dodecanólido -caprolactona

60 60 60

Pentadecanólido *Lipasa pancreática porcina, LPP fue de 10% en peso con respecto al monómero.

32

2.2.2. Síntesis de lactonas con lipasa tipo B de Cándida antárctica (CALB). El procedimiento para la síntesis de los polímeros por apertura de anillo, (PAA), usando como catalizador a la lipasa Novozyme 435, la cual se encuentra en forma de pequeñas esferas, ha sido descrita previamente [77]. En una polimerización enzimática

típica, tal como muestra en el Esquema 1, la

Novozyme 435 (10 % en peso con respecto al peso del monómero, 0.25g) fue secado en un matraz de 25 ml junto con malla molecular (3Å). Después del secado, el matraz fue removido de la estufa y cerrado con una septa bajo atmósfera de nitrógeno y subsecuentemente se le adicionó 5.0 ml de tolueno usando una jeringa y el sistema fue mantenido en agitación. El matraz fue calentado hasta 70°C en un baño de aceite después de que se le agregaron 2.5 g de lactona al sistema (Ver Figura 2.1).

Figura 2.1. Sistema de reacción de polimerización por apertura de anillo catalizado por N435. Después de 24 horas, una solución viscosa constituida por enzima y polímero en tolueno fue obtenida; la polimerización fue detenida adicionando un exceso 33

de cloroformo y la enzima fue removida por filtración. El exceso de cloroformo en el filtrado fue removido por evaporación y el polímero en la solución concentrada fue precipitado en metanol frio. El polvo blanco obtenido fue redisuelto en cloroformo y precipitado nuevamente con metanol. Este proceso se repitió 2 veces para purificar el producto. Finalmente, el producto obtenido fue secado a 60°C por 24 horas a vacío y posteriormente caracterizado. O

O

O N435

H

O

C

Toluene, 70°C

(CH2)14

OH n

Esquema 1. Polimerización por apertura de anillo catalizado por novozyme N435 de pentadecanólido, PDL en tolueno a 70°C.

Este método de reacción fue probado con todas las lactonas; -butirolactona, -BTL, -

(±)-decanolactona, -DCL, y el 5 Dodecanólido, 5DDCL que contenían un grupo lateral, y dos lactonas sin grupo lateral, la

-caprolactona,

-CL y el

pentadecanólido, PDL. De todas las lactonas las

-butirolactona,

-BTL, -(±)-

decanolactona, -DCL, y el 5-Dodecanólido, 5DDCL que contenían un grupo lateral, presentaron un producto con las mismas características obtenidas con la LPP; ceras y aceites y con un rendimiento de la reacción entre 4 y 6%, mientras que las dos

lactonas sin grupo lateral, la -caprolactona, -CL y el pentadecanólido, PDL resultaban ser un polvo blanco y con un rendimiento entre 96 y 98%. En la Tabla 2.3 se muestran la concentración de solventes usados como medio orgánico y enzima en la síntesis de lactonas. 34

Tabla 2.3. Concentraciones de reactivos en el sistema de reacción usada en la síntesis de las lactonas catalizada por Lipasa Cándida antártica, CALB (Novozyme 435). Tipo de enzima Novozyme 435 10%(0.25g)

Solvente del medio Tolueno 2:1

Monómero 2.5 g -butirolactona

Temperatura ºC 70

-decanolactona

70

5-dodecanólido -caprolactona

70 70 70

Pentadecanólido *Novozyme 435 fue de 10% en peso con respecto al monómero.

2.2.3. Síntesis de los copolímeros -CL/PDL con lipasa tipo B de Cándida antárctica (CALB). Los copolímeros fueron sintetizados bajo el mismo procedimiento descrito en la sección anterior debido a que mostró la formación del polímero y un buen rendimiento. La diferencia estriba en que una vez secado el matraz con la enzima se adicionó el pentadecanólido, PDL, por ser un monómero sólido y posteriormente, el matraz fue cerrado con una septa bajo atmósfera de nitrógeno. Subsecuentemente, se le adicionó 5.0 ml de tolueno usando una jeringa y el sistema fue mantenido en agitación. El matraz fue calentado hasta 70°C en un baño de aceite después de que se le agregó la -CL al sistema. Las concentraciones de los monómeros fueron 75/25, 50/50 y 25/75 % en mol de CL/PDL. Después de 24 horas, una solución viscosa de enzima y polímero en tolueno fue obtenida; la polimerización fue detenida adicionando un exceso de cloroformo y la enzima fue removida por filtración. El exceso de cloroformo en el filtrado fue removido por evaporación y el polímero en la solución 35

concentrada fue precipitado en metanol frio. El polvo blanco obtenido fue redisuelto en cloroformo y precipitado nuevamente con metanol. Este proceso se repitió 2 veces para purificar el producto. Finalmente, el producto obtenido fue secado a 60°C por 24 horas a vacío y posteriormente caracterizado.

2.2.4. Síntesis de los polímeros con grupo lateral con lipasa tipo B de Cándida antártica (CALB) inmovilizada utilizando una síntesis en dos etapas. Usando el procedimiento anterior se encontró que las lactonas con grupo lateral dieron un porcentaje de rendimiento muy bajo, por lo tanto, este fue modificado debido a que en la literatura reporta que un incremento en la concentración de agua produce un incremento en el peso molecular [23]. Las reacciones de polimerización de las lactonas con grupo lateral fueron realizadas por medio de una síntesis de dos pasos: En el primer paso la reacción fue realizada adicionando novozyme 435 (10% en peso con respecto al monómero), 18 % v/v de metanol, 6% v/v de agua y el monómero (2.5g) en un matraz erlenmeyer. Subsecuentemente, nitrógeno gas fue burbujeado por 30min. El matraz fue entonces agitado y calentado a 60°C en un baño de aceite. Después de 12 horas una solución viscosa de enzima y polímero fue obtenida y el proceso de polimerización fue detenido. En el segundo paso de polimerización 10 ml de tolueno previamente secado en malla molecular y 5 g de malla molecular (3Å) fueron adicionados y de nueva cuenta, fue burbujeado nitrógeno gas por 30 min. El matraz fue nuevamente agitado y calentado a 60°C en un baño de aceite por 24 horas. Al término de la reacción la solución 36

obtenida fue disuelta en cloroformo y la solución resultante fue filtrada para remover la enzima. El exceso de cloroformo en el filtrado fue removido por evaporación y el polímero en la solución concentrada fue precipitado en metanol frío. El producto obtenido (cera) fue re-disuelto en cloroformo y precipitado nuevamente con metanol y recuperado. Este proceso se repitió 2 veces para purificar el producto. Finalmente, el producto obtenido fue secado a 60°C por 24 horas a vacío y posteriormente caracterizado. Usando el procedimiento anterior de nuevamente se encontró que las lactonas con grupo lateral dieron un porcentaje de rendimiento muy bajo entre un 8 a 4%, por lo tanto, este fue modificado variando la concentración de la enzima en 30, 40 y 60 % en peso con respecto al peso del monómero.

2.3. Caracterización por espectroscopia de Infrarrojo con transformada de Fourier, FTIR Las pruebas de espectroscopia de infrarrojo para los monómeros y los polímeros obtenidos fueron realizadas en un espectroscopio de infrarrojo con transformada de Fourier, FTIR, Nicolet 8700 de Thermo scientific utilizando 100 barridos, una resolución de 4 cm-1, con una velocidad 0.6329, en absorbancia. Las muestras fueron depositadas sobre pastillas de KBr previamente preparadas para tal fin.

37

2.4. Determinación del peso molecular por GPC El peso molecular y la polidispersidad de la fracción soluble de las muestras fueron medidos en un cromatógrafo de líquidos de permeación en gel, GPC (por sus siglas en inglés), usando un cromatógrafo de líquidos de alta presión, HPLC de la serie 1100 de Agilent equipado con un detector de índice de refracción a 25°C, usando 2 columnas Zorbax (300S y 60S) acopladas en serie en un intervalo de 5x102 a 1x105 g/mol. Como fase móvil se uso tetrahidrofurano, THF, y utilizando un de volumen de elución de 1 ml/min. La curva de calibración para el análisis de GPC fue construida usando estándares de poliestireno. 2.4.1 Cinética de polimerización. La cinética de polimerización de la reacción fue seguida tomando una alícuota del sistema de reacción a diferentes tiempos de polimerización y fueron disueltos en THF. Estas muestras no fueron precipitadas con metanol frio. La enzima fue removida por filtración y la solución fue analizada por GPC. La conversión del polímero fue calculada del área bajo la curva del pico para cada polímero y monómero obtenido por GPC.

2.5. Resonancia Magnética Nuclear, RMN Los espectros de resonancia

magnética nuclear (RMN) de protones (H1)

fueron obtenidos en un espectrómetro Varian de 600 MHz Premium compact NMR Magnet System de Agilent Technologies. Los cambios químicos

38

obtenidos fueron reportados en partes por millón para el espectro de H 1. El tetrametil silano (TMS) fue usado como referencia interna.

2.6. Caracterización térmica. 2.6.1. Determinación de la temperatura de descomposición, T d por análisis termogravimétrico, TGA La estabilidad térmica o temperatura de descomposición, T d, fue determinada en una balanza termogravimétrica, TGA-7, de Perkin Elmer, utilizando un intervalo de temperatura de 40 a 650°C, con una rampa de calentamiento 10°C/min en atmósfera de nitrógeno.

2.6.2. Determinación de la temperatura de transición vítrea, T g, y de fusión, Tm por análisis de Calorimetría Diferencia de Barrido, DSC. La temperatura de de transición vítrea, T g, y de fusión, Tm, fueron determinadas en un calorímetro diferencial de barrido, DSC-7, de Perkin Elmer, utilizando un intervalo de temperatura de -60 a 110°C, utilizando una rampa de calentamiento 10°C/min en atmósfera de nitrógeno. La prueba se mantuvo isotérmicamente a Tfinal por 5 min y luego se enfrió de 110 a -60°C a 5°C/min. Este procedimiento fue repetido para determinar si se registra algún cambio en la fusión del polímero. En el caso de los copolímeros estos fueron analizados calentando de -60 a 110°C a una rampa de calentamiento de 10°C/min.

39

Capítulo 3 Resultados y discusiones 3.1. Resultados de la Síntesis de las lactonas usando Lipasa Pancreática Porcina, LPP. Las reacciones preliminares utilizando el n-hexano y como medio orgánico y butirolactona, -BTL, no formaron precipitado como se esperaba. Este resultado

fue atribuido a que la concentración de enzima era muy alta y dejaba a la solución muy concentrada impidiendo una buena agitación. Dado que el resultado obtenido no fue el esperado, se realizó nuevamente la reacción disminuyendo la concentración de la enzima a un 10% (0.163g) con respecto a la concentración del monómero y se fijó una concentración de 2:1 de n-hexano con respecto a la concentración de monómero. La disminución de la concentración de enzima fue con el propósito de hacer más diluida la solución de reacción y tener una mejor agitación pues la agitación entra en juego debido a que al ser insoluble la enzima en el solvente esta tiende a aglomerarse reduciendo la superficie del área de efecto del catalizador en el sistema. Sin embargo, aun cuando se ajustaron estos dos parámetros los resultados fueron similares a los obtenidos anteriormente. Aun cuando no hubo un buen resultado, este método de reacción fue probado con todas las lactonas;

-butirolactona,

-BTL,

-decanolactona, -DCL y el 5-Dodecanólido,

5DDCL, cuya particularidad es que todas contenían un grupo lateral. Ante estos resultados se optó por probar con tolueno como medio orgánico, pues en la literatura se reporta que puede dar muy buenos resultados cuando se usa como medio orgánico en reacciones catalizadas por enzimas, además de que monómero y polímero son fácilmente solubles en él. Para tratar de tener una concentración adecuada de tolueno; 40

esta se fijó en una concentración de 2:1 con respecto a la concentración de monómero, pues se observó que con una concentración 1:1 la solución era muy concentrada. Se mantuvo la concentración de la lipasa pancreática porcina a un 10% con respecto a la concentración del monómero, la concentración de lactona y la de los otros reactivos así como también la temperatura y el tiempo de reacción. Este método de reacción fue probado nuevamente con todas las lactonas; -butirolactona, -BTL, -

decanolactona, -DCL, y el 5-Dodecanólido, 5DDCL que contenían un grupo lateral, además, se incluyeron dos lactonas sin grupo lateral, la -caprolactona,

-CL y el pentadecanólido, PDL, sin embargo, los productos presentan las mismas características; ceras y aceites con peso moleculares de entre 500 y 600 g/mol y con un rendimiento de la reacción entre 4 y 6%. La baja conversión se atribuyó la baja

actividad de la enzima al encontrarse en su forma nativa aunque también puede deberse a la presencia de los grupos laterales en la estructura química de las lactonas, pues estas, disminuyen la habilidad para polimerizar de la lactona debido a que produce un impedimento estérico.

3.2. Resultados de la Síntesis de las lactonas usando Lipasa Cándida antárctica (Novozyme 435, N435). Dado que el resultado obtenido con la LPP no fue el esperado, se realizaron nuevamente reacciones de polimerización por apertura de anillo, ROP (por sus siglas en ingles) a partir de las lactonas sin y con grupo lateral catalizadas por N435 inmovilizada sobre una resina acrílica macroporosa. La ventaja de usar una enzima inmovilizada es el de permitir incrementar la estabilidad, la

41

reutilización, la operación continua, y la posibilidad de mejor control de las reacciones y por ende, se pueden esperar factores económicos favorables.

3.2.1. Resultados de peso molecular y porcentaje de conversión de polilactonas. Los resultados de peso molecular y conversión para polímeros obtenidos por polimerización por apertura de anillo, ROP (por sus siglas en ingles) a partir de las lactonas sin y con grupo lateral catalizadas por N435 son mostradas en la Tabla 3.1. Tabla 3.1. Síntesis de varias lactonas por polimerización por apertura de anillo a 75°C utilizando novozyme 435 Polímero

Código

Estado físico

Mw

Conversion

(g/mol)

(%)

Poli( -caprolactona)

P -CL

Sólido

25,523*

94

Poli(pentadecanólido)

PPDL

Sólido

26,630*

96

P -BTL

Cera

716

8

Poli(decanolactona)

PDCL

Aceite

450

4

Poli(5-dodecanólido)

P5DDCL

Aceite

430

2

Poli( -butirolactona)

*Fracción soluble Como se puede observar en la tabla, las lactonas sin grupos laterales tales como la -caprolactona, -CL y el pentadecanólido, PDL, presentan un alto 42

porcentaje de conversión y peso molecular en la fracción soluble comparado con las lactonas con grupos laterales tales como la -butirolactona, -BTL, decanolactona, -DCL, y la 5-dodecanólido, 5DDCL. La característica principal de los productos obtenidos por polimerización enzimática de un paso es que tanto la poli( -caprolactona), P -CL y el polipentadecanólido, PPDL, fueron un polvo blanco después de la precipitación mientras que, contrario a lo esperado; el mismo procedimiento de polimerización para lactonas con grupo lateral produjeron ceras o aceites.

Por otro lado, las lactonas sin grupo lateral

mostraron un porcentaje de conversión de un 96% mientras la -butirolactona, -BTL, -decanolactona, -DCL, y el 5-dodecanolido, 5DDCL mostraron un porcentaje de entre 2 y 8% dependiendo del tamaño del grupo lateral, siendo el porcentaje más bajo para la lactona con el grupo lateral más largo. Por otra parte, se observó que la poli( -caprolactona), P -CL, y el poli(pentadecanólido), PPDL, fueron parcialmente solubles en cloroformo, CHCl 3 y tetrahidrofurano, THF y el peso molecular determinado para la fracción soluble fue de 25,253 y 26,630 g/mol respectivamente. Estos valores fueron más altos que los obtenidos por Uyama et al para PPDL quien reportó 20,000 g/mol usando Cándida cylindracea como catalizador [78]. En contraste, los productos obtenidos de

-butirolactona,

-BTL,

-decanolactona,

-DCL, y el 5-

dodecanólido, 5DDCL fueron solubles en THF y el

peso molecular

determinado fue de entre 716 y 430 g/mol respectivamente. Es importante hacer notar que el peso molecular fue tomado únicamente de la fracción soluble y los resultados fueron comparados con estándares de poli(estireno). La baja conversión alcanzada con

-BTL, -DCL, y 5DDCL se atribuyó a la 43

presencia de los grupos laterales en la estructura química de las lactonas, pues estas, disminuyen la habilidad para polimerizar de la lactona debido a que produce un impedimento estérico tal como se reporta en la literatura [79].

3.2.2. Conversión del polímero en función del tiempo. En la Figura 3.1. Se muestra la conversión del polímero en función del tiempo para -BTL y -CL en la polimerización de un paso. En esta figura se observa que el porcentaje de conversión para -BTL fue de 70% después de 2.5 horas de reacción.

100

-CL

90 80

-BTL

Conversion (%)

70 60 50 40 30 20 10 0 0

5

10

15

20

25

Tiempo (h)

Figura 3.1. Conversión de monómero durante la polimerización enzimática en un paso.

44

En contraste, el porcentaje de conversión de la

-CL se incrementa

rápidamente hasta que esta alcanza un 93% después de 2.5 h. A partir de este tiempo, la conversión se incrementa lentamente hasta que alcanza un valor máximo de 96% después de 12 h. Se encontró que aun cuando la

-BTL

muestra un 78% de conversión solamente se obtuvieron oligómeros y este comportamiento ha sido atribuido al impedimento estérico inducido por los grupos laterales presentes en las lactonas. En el caso de la -CL, el producto se logró rápidamente durante las primeras 12 h a diferencia de lo reportado en la literatura donde las reacciones se llevaron a cabo hasta por 256 horas [23]. Por otro parte, es importante hacer notar que el cálculo del volumen de muestra para determinar la conversión fue tomado en muestras que aun retenían a todos los componentes (incluyendo polímero, oligómeros de bajo peso molecular, monómero de anillos abiertos y monómero residual) únicamente se removió la enzima durante la extracción. En el caso del PPDL, el muestreo fue más difícil debido a que la muestra se solidifica rápidamente incrementando su insolubilidad en el solvente.

3.2.3. Perfil cromatográfico del sistema de reacción de -CL -BTL. En la Figura 3.2 se presenta el perfil cromatográfico del sistema de reacción en diferentes estados de polimerización para -CL por el método de reacción de un paso. Se puede observar que durante los primeros 30 min de polimerización solamente se producen oligómeros, monómeros de anillos abiertos y monómero residual, tal como se observa por la presencia de señales de baja 45

intensidad a

10.18, 10.56

y 10.8 minutos de volumen

de

elución

respectivamente; este comportamiento concuerda con lo sugerido por Bankova et al para P -CL [80].

-CL 24 H 16 H 12 H 8H 4H 2H 1H 0.5 H

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

11.0

11.5

Volumen de elucion (min)

Figura 3.2. Perfil de GPC del producto de polimerización de catalizado por N435 a diferentes tiempos.

-Caprolactona

Estos resultados sugieren que durante el estado inicial de la polimerización, la reacción predominante fue la apertura de los anillos de los monómeros para producir oligómeros de cadenas cortas. Después de la primera hora, aparece una cantidad considerable de polímero con un peso molecular alto desplazando la señal del valor máximo del tiempo de retención de entre 9.7 y 9.2 min. En la misma figura, se puede observar que después de 12 horas una gran cantidad de oligómeros se han convertido en polímero y el remanente consiste 46

de

oligómeros de cadena corta. La intensidad de la señal asignada al monómero disminuye sugiriendo que el monómero ha sido transformado a polímero. Después de 24 horas, la composición de la mezcla de reacción no cambia implicando que la reacción ha alcanzado su máxima conversión. En el caso de -BTL, el perfil cromatográfico de la reacción es mostrado en la Figura 3.3. En esta figura, podemos observar que no hay un cambio significativo durante los diferentes estados de polimerización puesto que el producto obtenido fueron solamente oligómeros de bajo peso molecular los cuales son observados como señales de baja intensidad entre 10.29 y 10.6 min de volumen de elución y que corresponden a la formación de oligómeros, monómeros de cadena abierta y monómero.

-BTL

24 H 16 H 12 H 8H 4H

2H 1H 30 min 9.6

9.8

10.0

10.2

10.4

10.6

10.8

11.0

Volumen de elucion (min)

Figura 3.3. Perfil de GPC de la reacción de polimerización de -Butirolactona catalizada por N435 a diferentes tiempos. 47

Estos resultados sugieren que en el estado inicial la reacción dominante es la apertura del anillo de algunos monómeros para producir oligómeros de cadena corta. Sin embargo, se puede observar que después de 2 horas de polimerización la intensidad de la señal que aparece en 10.6 min, atribuida al monómero, se incrementa mientras la señal asignada a los oligómeros en 10.29 min permanece sin cambiar. Esto indica que durante el estado inicial de la reacción hay una población combinada de monómeros y oligómeros. La insolubilidad de polímero obtenido en estas pruebas puede ser atribuida a la alta cristalinidad del polímero obtenido. El mecanismo por el cual se lleve a cabo la reacción de polimerización por apertura de anillo catalizado por la lipasa se muestra en el esquema 3.1.

Esquema 3.1. Mecanismo de polimerización por apertura de anillo catalizado por la lipasa

De acuerdo a este mecanismo la lipasa cataliza la hidrólisis del enlace del éster por medio de una triada catalítica compuesta de un nucleófilo de serina residual 48

activado por un enlace de hidrógeno y relacionado con la histidina y el aspartato o glutamato. Esta triada es la responsable de la reacción por apertura de anillo de las lactonas.

El residuo de serina participa en el ataque

nucleofílico de la lactona para formar un complejo activado de enzimamonómero, (CEM). La iniciación de la reacción, se da un por un ataque nucleofílico del agua que está presente en dentro de la enzima (o por un alcohol primario) sobre el carbono acilo del complejo (CEM) para producir un hidroxi ácido carboxílico. Durante la propagación, el ataque nucleofílico se da en el grupo hidroxilo terminal del

-hidroxi ácido carboxílico en (CEM)

conduciendo así, a la formación de la cadena del polímero siendo.

3.2.4. Características físicas de los de Poli( -caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL obtenidos por síntesis enzimática. En la Figura 3.4. Se muestra algunos aspectos físicos de los polímeros obtenidos. Se observa que ambos polímeros son sólidos blancos tal como se esperaba.

49

PPDL

P -CL

Figura 3.4. Aspecto de los polímeros obtenidos por polimerización por apertura de anillo catalizado por N435 a partir de lactonas sin grupo lateral.

3.3. Caracterización de los polímeros obtenidos 3.3.1. Caracterización por espectroscopia de infrarrojo, FTIR de Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL. En la Figura 3.5. Se muestra el espectro infrarrojo, FTIR, de los homopolímeros de poli( -caprolactona), P -CL, y del poli(pentadecanólido), PPDL, obtenidos. En la figura se observa la presencia de una banda a 2917 y 2848 cm-1 que indica la presencia de vibraciones de estiramiento asimétricas y simétricas de – CH2- respectivamente. Se observa que estas bandas son más intensas para el PPDL que para la P -CL debido a que los grupos metileno se encuentran en mayor concentración en la cadena principal.

50

Absorbancia

PPDL

P -CL

4000

3500

3000

2500

2000

Número de onda cm

1500

1000

500

-1

Figura 3.5. Espectros de FTIR de polímeros obtenidos a partir de lactonas sin grupo lateral mediante polimerización por apertura de anillo.

En esta figura también se encuentran bandas de absorción características a 1725 cm-1 para P -CL y a 1733 cm-1 para PPDL asignadas a vibraciones de estiramiento de –C=O del grupo carbonilo de ester. La presencia de esta banda nos permite confirmar la formación del polímero tal como sugirió Messersmith y colaboradores para P -CL [81]. Las bandas que aparecen a 1467 y 1463 cm-1 se atribuyen a las vibraciones de flexión de C-H. La banda a 1398 cm-1 fue asignada a la flexión simétrica de grupos metilo. La banda de absorción a 1243 cm-1 se asigno a vibraciones de estiramiento asimétricas de C-O-C. Las bandas a 1193 y 1195 cm-1 fueron asociadas con vibraciones de estiramiento de OC-C. La banda de absorción a 1108 cm-1 es asignada a estiramiento acoplado de C-O de esteres C-O. 51

3.3.2. Caracterización por Resonancia magnética nuclear, RMN de Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL . En la Figura 3.6. Se muestra el espectro de RMN de protones, 1H de la poli(caprolactona), P -CL y el poli(pentadecanólido), PPDL, el cual es muy similar al reportado en la literatura, [82,83] pero obtenido usando otros métodos de polimerización. El espectro de P -CL exhibe señales a 4.00, 2.24, 1.58 y 1.32 ppm, el cual son característicos de estos polímeros. Las primeras dos señales son tripletes debido a protones de metilenos unidos a oxígenos ( CH2) y grupos carbonilos ( -CH2) de la cadena principal, respectivamente. La señal a 1.58 ppm ha sido relacionada con protones de - y -CH2 mientras que la señal que aparece a 1.32 ppm ha sido asociada a -CH2 (ver Figura 3.6a).

*

HOCH2CH2CH2CH2CH2C

OCH2CH2CH2CH2CH2C

O

O

OR n

*

* *

a)

*

HOCH2CH2(CH2)10CH2CH2C

OCH2CH2(CH2)10CH2CH2C

O

O

OR n

* b) 4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

Chemical Shift (ppm)

Figura 3.6. Espectro

1

H NMR de a) poli( -caprolactona) P -CL y b)

poli(pentadecanólido), PPDL, en CDCl3. 52

Por otro lado, el espectro de PPDL mostró valores de cambios químicos muy cercanos al de P -CL (3.98, 2.21 y 1.54 ppm). Las señales de tripletes que aparecen a 3.98 ( -CH2) y 2.21 ( -CH2) fueron asignados a hidrógenos de metilenos unidos al oxígeno y grupo carbonilo, respectivamente (de una manera muy similar a la P -CL) y la señal a 1.54 fue relacionada a - y -CH2. También, se observó una señal amplia y clara en el intervalo de 1.13-1.32 ppm y fue asignada al resto de los metilenos -CH2 presentes en la unidad repetitiva del polímero (ver Figura 3.6b). Las asignaciones para ambos polímeros fueron corroborados integrando las diferentes señales de RMN. En adición,

las

señales típicas de la P -CL, el espectro de RMN de protones muestra un pequeño triplete en el intervalo de 3.55-3.65 (*) ppm el cual puede ser atribuido a protones de metilenos de CH2OH de grupos terminales del polímero, los cuales se distinguen claramente debido al bajo peso molecular de la P -CL sintetizada tal como fue reportado por Kiersnowski et al [84]. En el espectro de RMN de la P -CL también fue detectada una señal no esperada en 1.19 (*) ppm y un multiplete centrado en 0.8 ppm ((*)). Es posible que estas señales estén relacionadas con protones de grupos metilo localizados en el extremo final de la cadena el cual puede provenir de los residuos de sistema del iniciador y/o del mecanismo del agente de transferencia de cadena como fue sugerido por Yang et al [82]. El espectro de PPDL también muestra señales relacionadas con protones de CH2OH de grupos terminales de el polímero tal como fue reportado por Jedlinski et al [83].

53

3.3.3.

Caracterización

por espectroscopia

de

infrarrojo,

FTIR,

de

poli(lactonas) con grupo lateral. En la Figura 3.7 se muestra el espectro de FTIR de la poli( -butirolactona), P BTL, poli(decanolactona), PDCL y el poli(5-dodecanólido), P5DDCL, obtenidos de lactonas con grupos laterales por el método de polimerización por apertura de anillo. Como se puede observar, hay un amplio pico a un número de onda de 3450 cm-1 de gran intensidad el cual puede ser asociado a la presencia de ácidos carboxílicos y/o a grupos –O-H formando puentes de hidrógeno, sugiriendo así la presencia de H2O tal como se ha sido reportado en la literatura. Sin embargo, estas bandas también pueden ser atribuidas a grupos con un alto contenido de –OH debido a la presencia de una gran cantidad de oligómeros formados durante la reacción.

1733

P5DDCL

Absorbancia

1776

PDCL 1735

P -BTL

4000

3500

3000

2500

2000

1500

Numero de onda cm

1000

500

-1

Figura 3.7. Espectro de FTIR de productos obtenidos de lactonas con grupo lateral mediante polimerización por apertura de anillo de un paso. 54

Estos oligómeros tienen una estructura terminal con un alto contenido de –OH por un lado y grupos carboxílicos por el otro tal como sugirió Chappell et al con otro sistema [85]. Este comportamiento fue observado únicamente en lactonas que tienen grupo lateral. Las señales de absorbancia que aparecen en la región de 2800-3000 cm-1 en particular a 2969, 2928 y 2858 cm-1 son debido carbónhidrógeno, C-H, vibraciones de estiramiento de grupos metilo (-CH3), y metilenos (-CH2). La bandas de absorbancia observadas a 1735 cm-1 en el P BTL es atribuido a la vibración de estiramiento de C=O del carbonilo del éster [86, 87]. En el caso de la PDCL y P5DDCL las bandas de absorción observadas a 1776 y 1733 cm-1 atribuidas a vibraciones de estiramiento de C=O del grupo carbonilo concuerdan con las bandas observadas en los espectros de FTIR obtenidos para los monómeros (no mostrados aquí) indicando que la reacción no se llevo a cabo. Las bandas de absorción que aparecen entre 1467 y 1150 cm-1 pueden ser asignadas a vibraciones de flexión de C-H y vibraciones de estiramiento de carbono-oxígeno del grupo carbonilo.

Los picos que aparecen a 1057 cm-1 son debido al modo de

vibración de estiramiento de carbón-oxígeno, C-O, del grupo hidroxilo terminal. Estos resultados corroboran lo observado en la secciones 3.2.1, 3.2.2. y 3.2.3. La baja conversión alcanzada con

-BTL, -DCL, y 5DDCL se atribuyó a la

presencia de los grupos laterales en la estructura química de las lactonas, pues estas, disminuyen la habilidad para polimerizar de la lactona debido a que produce un impedimento estérico. Por otro lado, también existe la posibilidad atribuirse a la fuente de la lipasa, el tipo de soporte y el protocolo de inmovilización de la enzima.

55

3.4. Caracterización por análisis térmico de los polímeros obtenidos. 3.4.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para Poli( -caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL . Técnicas

de

calorimetría

diferencial

de

barrido,

(DSC)

y

análisis

termogravimétrico, TGA) fueron usados para caracterizar los polímeros sintetizados. Termogramas de DSC de los polímeros sintetizados por el método de reacción por apertura de anillo catalizado por lipasa a partir de lactonas sin grupo lateral tales como poli( -caprolactona), P -CL, muestran solamente un pico de fusión a 60°C en un segundo calentamiento tal como muestra la Figura 3.8a. Este valor de temperatura concuerda con el reportado en la literatura para P -CL obtenida por sistemas de reacción similares [88,89].

40

60ºC

Poli( -caprolactona), P -CL 35

Endo

30

25

R2

20

R3

15

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

Temperatura ºC

Figura 3.8a. Termogramas de DSC para PCL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso; segunda, R2, y tercera, R3, prueba de calentamiento. 56

Durante las pruebas se observó que después del primer calentamiento, en el enfriamiento, la cristalización presenta un pico a 44°C tal como se muestras en la Figura 3.8b. Se aprecia que esta permanece sin cambio en la segunda corrida indicando con ello una buena estabilidad térmica.

R

1

2

Endo

R

44ºC Poli( -caprolactona),P -CL

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

Temperatura ºC

Figura 3.8b. Termogramas de DSC del comportamiento de la cristalización para PCL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso; primera, R1, y segunda, R2 corrida de enfriamiento.

Por otro lado, el análisis calorimétrico del poli(pentadecanólido), PPDL, obtenido bajo el sistema de reacción de un paso muestra un pico de fusión a 93°C aunque también muestra un pequeño hombro a 85°C en una segunda prueba de calentamiento tal como muestra la Figura 3.9a. El valor de temperatura de fusión obtenido para PPDL es similar al valor reportado en la 57

literatura para este polímero obtenido por otro sistema de reacción por Jedlinski et al [83].

60 93ºC

Poli(pentadecanólido) PPDL 55 50

Endo

45 40 35 30 R2

25 R3

20 -60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Temperatura ºC

Figura 3.9a. Termogramas de DSC para PPDL obtenida de polimerización por apertura de anillo de un paso; segunda, R 2, y tercera, R3, prueba de calentamiento.

En la misma figura observamos que después del primer calentamiento el valor de temperatura del pico de fusión no cambia con un ciclo de calentamientoenfriamiento. Por otra parte, el pico de cristalización aparece a 81°C tal como muestra la Figura 3.9b y tampoco se observan los cambios con los calentamientos subsecuentes indicando así una buena estabilidad. Se sugiere que, la razón por la que la T g de este polímero no se observa en los termogramas, es debido a que aparece a una temperatura por debajo de -60°C.

58

R1

Endo

R2

81.ºC

Poli(pentadecanólido), PPDCL -60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Temperatura ºC

Figura 3.9b. Termogramas de DSC del comportamiento de la cristalización para PPDL obtenida de polimerización por apertura de anillo; primera, R1, y segunda, R2 corrida de enfriamiento.

El porcentaje de cristalinidad obtenido por medio del análisis de las entalpias de fusión es de 55% para la PCL y 78% para la PPDL. El grado de cristalinidad (Xc) para cada polímero fue calculado directamente de los datos obtenidos del termograma de DSC usando la siguiente ecuación:

Xc=( Hf/ H°f)*100 Donde

(1)

H°f es la entalpia de fusión endotérmica de la P -CL 100% cristalina

(142 J/g) y para la PPDL es (116 J/g) tal como se reportaron en la literatura [83, 90].

59

Por otra parte, la P -BTL, PDCL y P5DDCL producidos por polimerización por apertura de anillo, no muestran Tg ni tampoco punto de fusión. Esto es atribuido a la naturaleza oligomérica de los productos

de la reacción tal como se

observó por GPC y FTIR lo cual corrobora que, en las lactonas que tienen grupo lateral presentes en el monómero se produce un efecto estérico impidiendo la polimerización de las lactonas tal como se reporta en la literatura para otros sistemas [79].

3.4.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA para Poli( caprolactona), P -CL y Poli(pentadecanólido), PPDL . Los termogramas de TGA de los polímeros sintetizados de lactonas que no tienen grupo lateral presente, P -CL y PPDL, son desplegados en la Figura 3.10. Así, los polímeros muestran una degradación térmica inicial a una temperatura de 300°C. En la figura se observa que la caída más pronunciada en la curva de pérdida de peso ocurre a 450°C para la P -CL mientras que para el PPDL ocurre a 480°C. La estabilidad térmica mostrada por los polímeros es similar al reportado en la literatura para productos obtenidos por polimerización de reacciones químicas o procesos de fermentación [89, 90, 91].

60

100

P -CL

Pérdida de masa %

80

PPDL

60

40

20

0 100

200

300

400

500

600

Temperatura ºC

Figura 3.10. Termogramas de TGA de la degradación térmica de P -CL and PPDL obtenidos por polimerización por apertura de anillo de un paso.

3.4.3. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA para Poli( butirolactona),

P -BTL,

Poli(decaolactona),

PDCL

y

el

Poli(5-

dodecanólido) P5DDCL. A diferencia de la poli( -caprolactona), P -CL y el poli(pentadecanólido), PPDL, los polímeros obtenidos de lactonas que tienen un grupo lateral tales como P BTL, PDCL y P5-DDCL muestran valores menores de temperatura de degradación tal como se muestra en la Figura 3.11.

61

100

Pérdida de masa %

80

PDCL

60 PDDCL

40 P -BTL

20

0 100

200

300

400

500

600

Temperatura ºC

Figura 3.11. Termogramas de TGA de la degradación térmica de productos obtenidos de lactonas con grupo lateral, P -BTL, PDCL y P5DDCL por polimerización enzimática por apertura de anillo.

En esta figura se observa que estos polímeros tienen una temperatura de degradación térmica inicial localizada entre 100 y 150°C. Sin embargo, el termograma muestra que a diferencia del PDCL; P -BTL y PDDCL muestran 3 perfiles de degradación. Así, el primer perfil de degradación térmica, para P BTL, inicia a 150°C y termina alrededor de 242°C y puede atribuirse a la degradación de oligómeros. Por otra parte, el P5DDCL muestra este perfil en entre 150°C y 255°C. La pérdida de peso a esta temperatura es alrededor de un 40%. El segundo perfil de degradación ocurre entre 242°C y 275°C para P BTL y entre 255°C y 500°C para PDDCL y puede ser atribuido a la presencia de oligómeros y producto de alto peso molecular. 62

3.5. Polimerización por apertura de anillo en dos pasos de lactonas con grupo lateral. Para incrementar el porcentaje de conversión y el peso molecular de las lactonas que tienen grupo lateral se realizaron pruebas de polimerización por apertura de anillo intentando un método en dos pasos, tal como se señala en la sección 2.2.4. del capítulo 2. Tomando en cuenta que la actividad de las enzimas en un medio no acuoso depende grandemente del contenido de agua en el sistema de reacción tal como sugiere Dong et al para -PCL [23], la regulación del contenido inicial de agua es importante para el éxito en la obtención tanto de una rápida velocidad de polimerización inicial y un alto porcentaje de conversión así como de productos con un alto peso molecular. Esto es debido a que el aumento en la concentración de agua le permite a la enzima mantenerse flexible y accesible a los monómeros durante la reacción. Considerando lo anterior, el contenido de agua en el primer paso de la reacción fue incrementado a 3.8%. En este primer paso se observó que la viscosidad se incrementa notablemente al no tener solvente y el producto no presenta un peso un incremento en el peso molecular. El agua producida en el sistema fue removida en el segundo paso adicionando malla molecular al sistema reacción y la viscosidad disminuye con la adición de solvente. Se observó que, al igual que en las reacciones de un paso, las tres lactonas no fueron consumidas eficientemente por la novozyme 435 y las características de los productos obtenidos fueron similares a aquellas obtenidas por la reacción de polimerización de un paso.

63

3.5.1. Polimerización por apertura de anillo en dos pasos incrementando la concentración de enzima en lactonas con grupo lateral. En otro intento por incrementar el porcentaje de conversión y el peso molecular de las lactonas que tienen grupo lateral, se realizó una polimerización por apertura de anillo en dos pasos incrementando la concentración de la enzima en 30, 40 y 60 % en peso con respecto al peso del monómero, tal como se señala en la sección 2.1.2.3 del capítulo 2. En la Figura 3.12. Se observa que el incremento en la concentración de enzima de 30, 40 o a 60 % ocasiona que la intensidad de la banda entre 2500 a 3600 cm-1 también se incremente. La presencia de esta banda puede atribuirse a la formación de ácidos carboxílicos

1734

Absorbancia

Poli( -butirolactona)

60 %

40%

30%

4000

3500

3000

2500

2000

1500

Número de onda cm

1000

500

-1

Figura 3.12. Espectros de FTIR de poli( -butirolactona) con Novozime 435 mediante un proceso de síntesis de 2 etapas con 30, 40 y 60% de N435.

64

Las absorciones en 2986, 2924 y 2847 cm-1 corresponden a los estiramientos de C-H de los metilos y metilenos presentes en la cadena. La absorción muy intensa a 1738 cm-1 pertenecen a las vibraciones de estiramiento de –C=O del carbonilo del éster. La formación de ácidos carboxílicos se observa que depende fuertemente de la concentración de la enzima. Es probable que un incremento en la concentración de la enzima incremente el contenido del agua en el sistema ocasionando con ello un incrementando en el contenido de ácidos carboxílicos. Estos resultados concuerdan con lo sugerido por algunos autores que reportan que el control de la estructura del polímero

depende fuertemente de la

actividad del agua. Así, cuando el agua actúa como otro aceptor acilo que inicia

el

crecimiento

de

la

cadena

o reacciona

con

otros

ésteres

intramoleculares causan degradación de la cadena. Ambas reacciones pueden ampliar la distribución del peso molecular y alterar la composición de de los grupos terminales de las cadenas. Estas reacciones competitivas causadas por el agua dan como resultado la formación de polímero con grupos carboxílicos terminales por ejemplo, cadenas de polímero que carecen de funcionalidad para iniciar una subsecuente polimerización por radicales [92, 93, 94]. Se observó que, al igual que las reacciones de un paso, las tres lactonas con grupos laterales no fueron consumidas eficientemente por la novozyme 435 y las características de los productos obtenidos fueron similares a aquellas obtenidas por la reacción de polimerización de un paso. La baja conversión alcanzada con -BTL, -DCL, y 5DDCL se atribuyó a la presencia de los grupos laterales en la estructura química de las lactonas, pues estas, disminuyen la 65

habilidad para polimerizar de la lactona debido a que produce un impedimento estérico. Por otro lado, también existe la posibilidad atribuirse a la fuente de la lipasa, el tipo de soporte y el protocolo de inmovilización de la enzima. 3.6. Síntesis

de copolímeros de

-CL-co-PDL por polimerización por

apertura de anillo. Los resultados de peso molecular y porcentaje de conversión de copolímeros obtenidos a partir de lactonas por medio de polimerización por apertura de anillo catalizado por N435 son mostrados en la Tabla 3.2.

Tabla 3.2. Síntesis de copolímeros a partir de -CL y PDL por polimerización por apertura de anillo a 75°C utilizando novozyme 435 Polímero

Estado físico

Mw

Conversion

(g/mol)

(%)

P -CL

Sólido

25,523*

94

75 -CL/25PDL

Sólido

40,107*

94

50 -CL/50PDL

Sólido

41,205*

94

25 -CL/75PDL

Sólido

31,630*

96

PPDL

Sólido

26,630*

96

* Fracción soluble Como se puede ver

los copolímeros presentan porcentajes de conversión

similares a los homopolímeros. Por otro lado, se puede observar que el peso molecular obtenido únicamente de la fracción soluble es más alto comparado con los homopolímeros. La principal característica de los productos de la 66

copolimerización enzimática es que son un polvo blanco después de la precipitación tal como se observa en la Figura 3.13

75 -CL/25PDL ( mol %)

50 -CL/50PDL ( mol %)

25 -CL/75PDL ( mol %)

Figura 3.13. Aspecto de los copolímeros obtenidos por polimerización por apertura de anillo catalizado por N435 a partir de lactonas sin grupo lateral.

Estos copolímeros mostraron ser parcialmente solubles en cloroformo y tetrahidrofurano, THF y los pesos moleculares medidos en la fracción soluble fueron de 40,107, 41,205 y 31,630 g/mol respectivamente. Estos valores resultaron ser más altos que los obtenidos por Ceccorully et al y Kumar et al para -CL/PDL quienes reportaron 22,300 g/mol usando Cándida antárctica como catalizador [34,35]. Bouyahyi et al también reportó 11, 300 g/mol usando un catalizador orgánico para mismo copolímero [95].

67

3.6.1.

Caracterización

copolímeros de

por espectroscopia

de

infrarrojo,

FTIR,

de

-CL-co-PDL.

Absorbancia

0P -CL

25P -CL

50P -CL

75P -CL

100P -CL

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

-1

Numero de onda cm

Figura 3.14. Resultados de FTIR de copolímeros con concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol %.

En la Figura 3.14 se muestra el espectro de FTIR de los homopolímeros y copolímeros obtenidos. Las bandas de absorción que aparecen a 2919 y 2850 cm-1 son asignadas a las vibraciones de estiramiento asimétrico y simétrico de –CH2- respectivamente. Se observa que estas bandas son más intensas conforme se incrementa la concentración de PDL en el copolímero debido a que los metilenos se encuentran en mayor concentración en la cadena principal. En esta figura también se encuentran bandas de absorción características de los ésteres a 1725 cm-1 para la PCL y a 1733 cm-1 para todas 68

las concentraciones donde hay presencia de PDL. Estas bandas fueron asignadas a vibraciones de estiramiento de –C=O del carbonilo del ester; además, la presencia de esta banda nos permite confirmar la formación de los poliésteres como sugiere Ma et al y Gumel et al para P -CL[88 90]; sin embargo, esto no nos permite predecir el tipo de copolímero formado. Las bandas que aparecen a 1470 y 1463 cm-1 fueron asignadas a vibraciones de flexión de C-H. Las bandas a 1367 cm-1 fueron asignadas vibraciones de flexión simétricas de grupos metileno. Las bandas de absorción en 1242 y 1220 cm-1 son debidos vibraciones de estiramiento asimétrica y simétrica de C-O-C respectivamente. La banda a 1197 cm-1 fue asociada con vibraciones de estiramiento de OC-O. Las bandas de absorción entre 1108-958 cm-1 fueron asignadas vibraciones de acoplamiento de C-O y C-C.

3.6.2. Caracterización por Resonancia magnética nuclear, RMN de copolímeros -CL-co-PDL. La Figura 3.15 muestra el espectro de RMN de los copolímeros obtenidos usando polimerización por apertura de anillo. El espectro de los copolímeros muestra señales a 4.00, 2.24, 1.58 y 1.32 ppm las cuales son características de estos polímeros.

69

O

O H

[OCH2CH2(CH2)10CH2CH2C] [OCH2CH2(CH2)10CH2CH2C] O

O H

OR

[OCH2CH2CH2CH2CH2C] [OCH2CH2(CH2)10CH2CH2C] OR n m

[OCH2CH2CH2CH2CH2C] [OCH2CH2CH2CH2CH2C]

R

* 0 -CL 25 -CL 50 -CL 75 -CL 100 -CL

5

*

* 4

3

2

* 1

0

Cambio quimico (ppm)

Figura 3.15. RMN de copoliésteres con concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol %.

Las dos primeras señales son multipletes debido a protones de metilenos unidos a oxígeno ( -CH2) y grupos carbonilos ( -CH2) de la cadena principal respectivamente. La señal que se observa a 1.58 ppm ha sido relacionada a protones de - y -CH2 mientras que la señal de1.32 ppm ha sido asociada a CH2 (ver la Figura 3.15). Se observa que la señal asociada a -CH2 incrementa su intensidad conforme se incrementa la concentración de PDL. Por otro lado, se observa que un incremento en la concentración de PDL no muestra un efecto considerable en los valores del cambio químico, pues resulta ser similar al obtenido para el homopolímero de PPDL. Las señales de tripletes que aparecen a 3.98 ( -CH2) y 2.21 ( -CH2) fueron asignados s hidrógenos de 70

metilenos unidos al oxígeno y grupo carbonilo, respectivamente (de una manera muy similar a la P -CL) y la señal a 1.54 fue relacionada a - y -CH2. También, una señal amplia en el intervalo de 1.13-1.32 ppm fue claramente observada y fue asignada al resto de los metilenos -CH2 presentes en la unidad repetitiva del polímero (ver Figura 3.6b). Las asignaciones para ambos polímeros fueron corroboradas integrando las diferentes señales en el espectro de RMN. En adición a las señales típicas de la PCL, el espectro de RMN de protones de este polímero muestra un pequeño triplete en el intervalo de 3.553.65 (*) ppm el cual puede ser atribuido a protones de metilenos de CH 2OH de grupos terminales del polímero, siendo estos perceptibles debido al bajo peso molecular del polímero sintetizado tal como fue reportado por Kiersnowski et al [84]. Esta señal se observó que se incrementa con el incremento en la concentración de PDL. En el espectro de RMN también fue detectada una señal no esperada en 1.19 (*) ppm y un multiplete centrado en 0.8 ppm ((*)). Es posible que estas señales estén relacionadas con protones de grupos metilo localizados en el otro lado de la cadena terminal el cual puede provenir de los residuos de sistema del iniciador y/o del mecanismo del agente de transferencia de cadena como fue sugerido por Yang et al [82]. El espectro de PPDL también muestra señales relacionadas con protones de CH2OH de grupos terminales del polímero tal como fue reportado por Jedlinski et al [83].

71

3.6.3. Caracterización por análisis térmico de los copolímeros obtenidos. 3.6.3.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para copolímeros -CL-co-PDL. Las técnicas de calorimetría diferencial de barrido, (DSC) y análisis termogravimétrico, TGA) fueron usados para caracterizar los copolímeros sintetizados. Así, la Figura 3.16 muestra el termograma de DSC de los copolímeros sintetizados a partir de -caprolactona, -CL y pentadecanólido, PDL a concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 mol % en el segundo calentamiento. En la figura se observó que los copolímeros con 75 % mol y 25 % mol de

-CL solamente muestran un pico de fusión a 63°C y 79°C

respectivamente. El valor de temperatura de estos picos aparecen intermedios al valor de temperatura de los picos de los homopolímeros; ambos cambian sistemáticamente a valores de temperatura menores con una disminución en el contenido de las unidades de PDL en el copolímero. Este comportamiento puede atribuirse a que las unidades de comonómeros están distribuidos al azar para estas concentraciones tal como sugiere Ceccorulli et al [34].

72

92.84ºC

Endo

79ºC

PPDL

61.7ºC 59.7ºC

71ºC

25 -CL/75PDL 60ºC 50 -CL/50PDL 75 -CL/25PDL

P -CL

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Temperatura ºC

Figura 3.16. Termogramas de DSC de copoliésteres con concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol % en el segundo calentamiento.

Por otra parte, se observó que el copolímero que contiene 50 % mol de -CL muestra un comportamiento de fusión complejo y que difiere de los otros copolímeros discutidos anteriormente. Este copolímero muestra dos picos de fusión una a 61°C y otra a 71°C respectivamente y a temperaturas intermedias al de los homopolímeros. Estos múltiples endotermas de fusión pueden ser atribuidos a la fusión de estructuras en bloque presentes en estos copolímeros. La formación de copolímeros al azar puede ser explicado porque, cuando una unidad repetitiva de -CL o PDL se encuentra en el extremo final de la cadena en crecimiento otro de los monómeros se puede adicionar con una probabilidad igual para formar un copolímero al azar.

Por otra parte, probablemente la

reacción de trans-esterificación del copolímero al 50% mol ocasione un reacomodo progresivo de las unidades del comonómero a lo largo de la cadena 73

del copolímero yendo de copolímeros al azar esencialmente a copolímeros con una distribución en bloque.

3.6.3.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA, para copolímeros -CL-co-PDL. La Figura 3.17 muestra los termogramas de copolímeros sintetizados a partir de -caprolactona, -CL y pentadecanólido, PDL a concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 mol %. Los termogramas de los homopolímeros son mostrados como referencia.

100 PPDL

Pérdida de masa %

25 -CL

80

50 -CL 75 -CL

60

40

20

P -CL

0 100

200

300

400

500

600

700

Temperatura ºC

Figura 3.17. Termogramas de TGA de copoliésteres con concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75 de -CL/PDL en mol %.

En la figura de observa que el copolímero con 75% mol de -CL tiene una temperatura degradación térmica inicial a 250°C ligeramente por debajo de la temperatura de degradación de los homopolímeros. En contraste, el copolímero 74

con un 50% mol de -CL muestra dos perfiles de degradación térmica. Así, el primer perfil inicia a 250°C y termina alrededor de 345°C y puede ser atribuido a la degradación de -CL. La pérdida de peso a esta temperatura es alrededor de un 25%. El segundo perfil de degradación ocurre entre 345°C y 500°C y este puede ser atribuido a la degradación térmica del PDL. Por otra parte, estos dos perfiles de descomposición pueden ser atribuidos a la degradación de las estructuras en bloque presentes en estos copolímeros. El copolímero con un 25 % mol de -CL de nuevo mostró una temperatura de degradación térmica inicial a 300°C a la misma temperatura mostrada por los homopolímeros. El comportamiento térmico de los copolímeros con una concentración 75 y 25 % mol de

-CL puede ser atribuido al hecho de que las unidades de

comonómeros se encuentran distribuidas al azar a estas concentraciones tal como se observó por DSC.

3.7. Propiedades térmicas para mezclas físicas de P -CL/ PDL 50:50. 3.7.1. Análisis de calorimetría diferencial de Barrido, DSC para Mezcla física de P -CL/ PPDL 50:50. La Figura 3.18 muestra el termograma de DSC para una película obtenida a partir de poli( -caprolactona), P -CL y poli(pentadecanólido), PPDL en un concentración de 50/50 % en peso.

75

45 88.15ºC

M:P -CL/PPDL 50/50

40 53.43ºC

Endo

35

30 56.93ºC

77.27ºC

25

20

15 -60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Temperatura ºC

Figura 3.20. Termogramas de DSC de una película obtenida por mezcla física en un concentración de 50/50 % en peso de P -CL/PPDL.

Así, en la figura se observa que la mezcla física de estos dos polímeros resultó ser inmiscible, pues el termograma muestra claramente dos picos de fusión una a 53°C que corresponde a la P -CL y otra a 88.1°C que corresponde al PPDL. No obstante que la mezcla muestra ser un sistema inmiscible esta muestra un ligero corrimiento en el valor de temperatura de fusión con respecto al valor de los polímeros individuales (60°C para la P -CL y 93°C para la PPDL).

76

3.7.2. Análisis termogravimétrico, TGA, para Mezcla física de P -CL/ PPDL 50:50. Los termogramas de TGA de la mezcla física de polímeros sintetizados de lactonas sin grupo lateral tales como P -CL y PPDL son desplegados en la Figura 3.21.

100 0

-5 60

40 -10

Primera derivada

Pérdida de masa %

80

20 Película

0

-15 413ºC

Mezcla:P -CL/PPDL 50/50

100

200

300

400

500

600

Temperatura ºC

Figura 3.21. Termogramas de TGA de la degradación térmica para la película de P -CL/PPDL en un concentración de 50/50 % en peso mezclando físicamente los polímeros. En la figura se observa que los polímeros muestran una sola degradación térmica que inicia a una temperatura de 250°C. También, se observa que la caída más pronunciada en la curva de pérdida de peso ocurre a 450°C. La estabilidad térmica mostrada para esta mezcla es similar a la obtenida para los homopolímeros por separado. El hecho de que no se observe la degradación por separado en el termograma puede deberse a que ambos polímeros se degradan casi a la misma temperatura. 77

3.8. Síntesis de lactonas a dos diferentes temperaturas 70 y 90ºC por polimerización por apertura de anillo. La -CL y PDL fueron sintetizadas utilizando el método de polimerización por apertura de anillo de un paso utilizando las mismas concentraciones de enzima, monómero y solvente, sin embargo, la temperatura de reacción fue incrementada a 90°C por 24 horas. Lo que se observó como resultado de la reacción fue que la -CL no mostró reacción alguna a diferencia del PDL que presentó un porcentaje de conversión de aproximadamente un 98%. Debido a que la PPDL obtenidos a 70 y 90ºC resultaron se parcialmente solubles en CHCl3 estos fueron probados en un GPC de alta temperatura. Así, la PPDL obtenida a 70ºC presentó un Mn y Mw de 2,115 y 5,760 respectivamente con un índice de polidispersidad de 2.72 mientras que la PPDL obtenida a 90ºC presentó un bajo peso molecular; Mn= 2,115 y Mw =5,760 con un índice de polidispersidad de 2.29 similar al que presenta la PPDL obtenida a 70ºC. El incremento en la temperatura de reacción reduce el peso molecular del polímero obtenido pero sin afectar la distribución. En la literatura se reporta que en general el peso molecular promedio del polipentadecanólido, PPDL, en una reacción catalizada por la novozyma 435 disminuye conforme se incrementa la temperatura de polimerización debido a un incremento en el número de cadenas. Este comportamiento es consistente con los resultados encontrados en éste trabajo, pues la reacción a 90°C da como producto un PPDL con un peso molecular más bajo. Sin embargo, el hecho de que la distribución de peso molecular no sea afectada es un indicio de que el mecanismo de reacción de la apertura del anillo y la adición de monómero durante la polimerización enzimática es mantenido pero el número de cadenas formadas en la reacción 78

es más alto. Por otro lado, los resultados de peso molecular obtenidos no son comparables con los reportados en la literatura en términos de peso molecular absoluto debido a que estos, son comparados con estándares de poliestireno, además de que fueron disueltos en 1,2,4-triclorobenceno un solvente usado para polioleofinas a alta temperatura, sin embargo, se observa que algunos valores son similares a los reportados para PPDL obtenida a 70ºC [89, 96].

3.8.1.

Caracterización

por

espectroscopia

de

infrarrojo,

FTIR

de

Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C. En la Figura 3.22a se muestra el espectro de FTIR para PPDL obtenidas a 70 y 90ºC, en donde se observa que ambos espectros son muy similares. Ambas muestras presentan bandas de absorción a 2917 cm-1 y 2849 cm-1 atribuidas a vibraciones de estiramiento de -CH2- asimétricas y simétricas respectivamente. Estas bandas muestran ser las señales más intensas en el espectro debido a que los grupos metileno están presentes en un número más grande que otros grupos en la estructura del polímero. El espectro también muestra bandas a 1733 cm-1 relacionado con las vibraciones de estiramiento de –C=O del carbonilo del ester. Las bandas que aparecen a 1472 y 1463 cm-1 pueden ser atribuidas a las vibraciones de flexión de C-H del grupo metileno mientras que las bandas que aparecen a 1197 y 1180 cm-1 fueron asociadas a las vibraciones de estiramiento del C-O del grupo ester. Absorciones a 731 y 719 cm-1 son causadas por vibraciones de flexión del –(CH2)n- cuando n ≥4. Por otra parte, se observa que aun cuando el espectro de FTIR obtenida a 70ºC es muy similar al obtenido a 90ºC, una inspección más detallada del espectro mostraron algunas diferencias importantes como la apariencia de una banda 79

pequeña y amplia centrada en 3435 cm-1 y la presencia de un hombro en la banda del carbonilo que aparece a 1738 cm-1 tal como se observa en la Figura 3.22 b que corresponde a al espectro de PPDL sintetizado a 70 y 90ºC.

1.2

a)

2917

2849 1733

Absorbancia

1.0

1197,1180

0.8 1472,1463 0.6

3435

731,719

0.4

90‫؛‬C 0.2

70‫؛‬C

0.0

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

-1

Numero de onda cm

1.2

1733

b)

1738

1.0

Absorbancia

0.8

0.6

90‫؛‬C 0.4

0.2

70‫؛‬C 0.0 1740

1720

1700

-1 Numero de onda cm

Figura 3.22. Espectro de FTIR para polipentadecanólido, PPDL obtenida a 70 y 90ºC. La primera banda que puede atribuirse a la vibración de estiramiento O-H que puede ser atribuida ya sea a agua o grupos hidroxilos terminales de la cadena 80

polimérica. Después de un proceso de secado muy cuidadoso, la banda permanece en el espectro por lo que esta puede ser atribuida a OH de grupos terminales de PDL tal como fue reportado por Jedlinski et al [83]. Por otro lado, la banda que aparece traslapada y compuesta de dos picos localizados a 1733 y 1738 cm-1 que exhibe la PPDL obtenida a 90ºC, puede ser atribuida al estiramiento C=O de la fase cristalina y amorfa respectivamente, Las asignaciones hechas para las lactonas de este trabajo concuerda

con lo

reportado en la literatura para polihidroxialcanoatos [97,98,99]. Por otro lado, tal como se muestra en la sección de caracterización térmica, la PPDL sintetizada a 90ºC presente una baja cristalinidad; es más amorfo que el PPDL obtenido a 90ºC;

lo

cual

permite

sugerir

que

la

aproximación

usada

en

polihidroxialcanoatos puede ser aplicada en la PPDL.

3.8.2. Caracterización por resonancia magnética nuclear, RMN de Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C En la Figura 3.23 se muestra el espectro de PPDL sintetizado a 70 y 90ºC el cual es muy similar al reportado en la literatura pero obtenido usando otros tipos de polimerizaciones [83,100].

81

*

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

Cambio quimico (ppm)

Figura 3.23. Espectro de RMN para polipentadecanólido, PPDL obtenida a 70ºC (abajo) y 90ºC (arriba).

El espectro muestra señales a 3.98 y 2.21 ppm y pueden ser atribuidos a protones de metilenos unidos a oxígeno ( -CH2) y al carbonilo ( -CH2), respectivamente. La señal a 1.54 ppm atribuidos a protones de

- y -CH2

mientras que una señal amplia que aparece en el intervalo de 1.13-1.32 ppm fue asignada al resto de los metilenos ( -CH2) presentes en la unidad repetitiva del polímero. Estas asignaciones fueron corroboradas integrando las diferentes señales de resonancia en el espectro de RMN. En el espectro también se 82

observan pequeñas señales típicas de PPDL en el intervalo de 3.55-3.65 (*) ppm el cual es atribuido a los protones de metileno de de grupos terminales de CH2OH en el polímero. Este pico es distinguible debido al bajo peso molecular del polímero sintetizado de acuerdo a lo reportado por Jedlinski et al. [83]. Este hecho confirma la existencia de los grupos hidroxilo en el polímero observado por FTIR.

3.8.3. Difracción de Rayos X para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C En la Figura 3.24 se muestran los resultados obtenidos por difracción de rayos x. Estos resultados indican que la temperatura de reacción no afectan el tipo de cristales formados pues ambos polímeros muestran la misma forma de pico (110) y (200) a 2 =21.6º y 24.1º para PPDL polimerizado a 90ºC. Se observa una pequeña diferencia en el pico de difracción (110) que aparece a 21.0º y 24.2 2 para la PPDL polimerizada a 70ºC. La fracción cristalina calculada por la integración de las áreas de los picos fue de 54% y 49% de cristalinidad para PPDL polimerizada enzimáticamente a 70°C y 90°C respectivamente. Estos valores son muy similares a los reportados en la literatura por difracción de rayos x [83,89] el cual fueron 50 y 64%. La diferencia en el porcentaje de cristalinidad indica que el incremento en la temperatura de polimerización afecta disminuyendo la fracción cristalina del polímero formando cristales con pequeñas diferencias debido a un incremento de los OH de grupos terminales en el PPDL polimerizado a 90°C tal como fue confirmado por FTIR y 1HNRM.

83

21.6

90‫؛‬C

Intensidad

70‫؛‬C

24.1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

2

Figura 3.24.Difracción de rayos x de PPDL obtenido por polimerización por apertura de anillo a 70 y 90°C).

3.8.4. Caracterización por análisis térmico para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C. 3.8.4.1. Caracterización por calorimetría diferencial de barrido, DSC para para Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C. Análisis

de

calorimetría

diferencial

de

barrido,

DSC

y

análisis

termogravimétrico, TGA fueron utilizados de nueva cuenta para caracterizar al poli(pentadecanólido), PPDL, sintetizados a dos diferentes temperaturas 70 y 90°C. Los termogramas de DSC de estos polímeros sintetizados muestran diferencias no solamente en la forma de la transición sino también en los valores del punto de fusión dependiendo de dependiendo de la temperatura de síntesis tal como se observa en la figura 3.25.

84

10

PPDL 8

Endo

6

4

90‫؛‬C 70‫؛‬C 2

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Temperatura ‫؛‬C

Figura 3 25. Termogramas de DSC para PPDL obtenido por polimerización enzimática a 70 y 90°C.

Así, mientras la PPDL sintetizada a 70°C muestra un apreciable endoterma de fusión a 94.0°C y un pequeño hombro a 82.2°C, en el segundo calentamiento, la PPDL sintetizada a 90°C muestra un endoterma muy amplio con tres picos de fusión a 83.2°C, 76.3°C y 70.4 y un pequeño hombro a 82.2°C, en el segundo calentamiento, la PPDL sintetizada a 90°C muestra un endoterma muy amplio con tres picos de fusión a 83.2°C, 76.3°C y 70.4°C y un pequeño hombro a 56°C.

Se observó que el punto de fusión obtenido en la PPDL

sintetizada a 70°C es muy similar al reportado en la literatura por Levedev et al, Jedlinski et al y Focarete et al [83, 89,101]. En el caso de la PPDL obtenida a 90°C la presencia de los tres picos de a más bajas temperaturas que la de PPDL obtenida a 70°C es debido a la formación de cristales de tamaños más pequeños. Es importante señalar que este comportamiento cristalino que presenta el PPDL obtenido a 90°C no ha sido reportado anteriormente y puede 85

ser atribuido a la presencia de un gran número de grupos OH terminales en la cadena por el bajo valor reportado para Mn. Para corroborar estos resultados el polímero fue purificado 3 veces para prevenir impurezas. Por otra parte, las mediciones de DSC para la medición de la fusión y cristalización fueron realizadas por duplicado en la misma muestra. De igual forma, este mismo procedimiento fue repetido bajo las mismas condiciones en otra muestra obteniéndose los mismos resultados para el comportamiento de la cristalización y fusión y a misma temperatura. Por otra parte, nosotros hemos observado que el porcentaje de cristalinidad también muestra diferencias dependiendo de la temperatura de síntesis. El grado de cristalinidad (X c) de cada polímero de este trabajo fue calculado usando directamente de los datos del termograma de DSC mediante la siguiente ecuación:

Xc=( Hf/ H°f ) * 100

Donde

(2)

Hf es la entalpia de fusión medida por DSC y

H°f es la entalpia de

fusión endotérmica para el PPDL 100% cristalino (116 J/g) tal como se reportó en la literatura [83, 89,101]. El porcentaje de cristalinidad determinado por DSC fue de 74.9° para PPDL sintetizado a 70°C y 69.5% para PPDL sintetizada a 90°C. El comportamiento de cristalización realizado bajo un proceso de enfriamiento lento (5°C/min) es mostrado en la Figura 3.26. En el termograma se observa que aunque ambas muestras de PPDL muestran picos exotérmicos atribuibles 86

al proceso de cristalización, la muestra sintetizada a 90°C presenta 2 o 3 eventos traslapados (un pico de cristalización apreciable a 72°C seguido de un pequeño pico a 64.4°C y un pequeño hombro a 44.2°C) mientras que el producto obtenido a 70°C muestra solamente un pico a 80.5°C. Este ultimo valor es similar al reportado por Namekawa et al [100] a 86°C. La presencia de varios eventos de cristalización indica que el bajo peso molecular en el PPDL sintetizado a 90°C da lugar a la formación de cristales más pequeños, el cual como se mencionó anteriormente, funden a bajas temperaturas. Sin embargo, como se observó en la medición de difracción de rayos x presentan el mismo arreglo cristalino.

De nueva cuenta, es importante señalar que este

comportamiento de cristalización que presenta el PPDL obtenido a 90°C no ha sido reportado anteriormente.

Endo

15

10

90‫؛‬C

5

70‫؛‬C PPDL 0 -40

-20

0

20

40

60

80

100

Temperatura ‫؛‬C

Figura 3.26. Termogramas de DSC del comportamiento de cristalización para PPDL obtenido por polimerización enzimática a 70 y 90°C.

87

3.8.4.2. Caracterización por análisis termogravimétrico, TGA,

para

Poli(pentadecanólido), PPDL obtenida a 70 y 90°C. Los termogramas de TGA de PPDL sintetizado a dos diferentes temperaturas 70 y 90°C son desplegados en la Figura 2.27.

100 90

70‫؛‬C

Perdida de masa %

80

90‫؛‬C

70 60 50 40 30 20 10

PPDL

0 100

200

300

400

500

600

Temperatura ‫؛‬C

Figura 3.27. Termogramas de la pérdida de masa por TGA para PPDL obtenido a dos diferentes temperaturas 70 y 90°C. En esta figura se observó que los termogramas obtenidos muestran una sola pérdida de masa, sin embargo, también se observa que mientras que el PPDL sintetizado a 70°C muestra una temperatura de degradación térmica inicial a 250°C, la PPDL sintetizada a 90°C muestra esta temperatura a 200°C. La disminución en el onset de la temperatura de descomposición es atribuida a especies de bajo peso molecular en el PPDL obtenido a 90°C aun cuando en los termogramas las descomposiciones finales a 450 ° C se traslapan unas con otras. Por otra parte, aun cuando los termogramas obtenidos muestran una sola pérdida de peso, la primera derivada de las curvas de TGA revela dos

88

fenómenos centrados en 425 y 475°C traslapándose aparentemente una con otra tal como se muestra en la Figura 3. 28.

0

70‫؛‬C

Primera derivada

90‫؛‬C -5

-10

-15

PPDL 50

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650

Temperatura ‫؛‬C

Figura 3.28. Termogramas de la primera derivada para PPDL obtenido a dos diferentes temperaturas 70 y 90°C.

El análisis realizado para PPDL sintetizado a 2 diferentes temperaturas 70 y 90°C muestran valores similares a aquellos reportados por Focarete et al, pero con un valor Td ligeramente más alto (438 y 484°C), el cual puede ser debido al hecho de que la cristalinidad de las muestras preparadas por nosotros es ligeramente más alta que aquellas reportadas en la literatura [89]. También se ha apreciado que la temperatura de 90°C utilizada en la síntesis de PPDL disminuye ligeramente la estabilidad térmica del polímero formado.

89

Conclusiones

Se realizaron reacciones de polimerización por apertura de anillo de butirolactona, -BTL,

-decanolactona, -DCL,

-caprolactona,

-CL,

5-

dodecanólido, 5DDCL y el pentadecanólido, PDL utilizando una enzima comercial inmovilizada sobre una resina acrílica, novozyme 435, N435 y una lipasa pancreática porcina, LPP, en su forma nativa. De las cinco lactonas seleccionadas para la polimerización solamente la

-caprolactona, -CL y el

pentadecanólido, PDL produjeron polímeros con alto peso molecular. Los resultados obtenidos muestran que las lactonas sin grupos laterales tales como -caprolactona, -CL y el pentadecanólido, PDL, son susceptibles de reaccionar en presencia de la novozyma 435 para producir poliésteres. Además, se logran productos de alto peso molecular rápidamente durante las primeras 12 horas. Se ha encontrado que los polímeros obtenidos de estas lactonas presentan alta propiedades térmicas y un peso molecular similar a los reportados para los mismos polímeros obtenidos por medio de reacciones con catalizadores químicos o por fermentación. Por otro lado, las lactonas que tienen grupos laterales tienen rendimientos pobres dando como resultado de la reacción principalmente oligómeros con terminaciones en ácidos carboxílicos con ambas enzimas. Se ha determinado que no es posible incrementar el peso molecular aun cuando se modifique la reacción a un sistema de dos pasos o se incremente la concentración de enzima. La polimerización por apertura de anillo para lactonas que tienen grupos laterales produce productos de peso molecular con bajos rendimientos y baja estabilidad térmica atribuible a un 90

impedimento estérico producido por el grupo lateral impidiendo la reacción de la lactona catalizada por la enzima. Los copolímeros biodegradables sintetizados de la

-caprolactona, -CL y el

pentadecanólido, PDL en concentraciones de 75/25, 50/50 y 25/75% mol mostraron tener un peso molecular más alto que el de los homopolímeros y que los reportados en la literatura obtenidos por reacciones químicas. Se encontró que los copolímeros con 75 y 25 % mol obtenidos presentan propiedades intermedias a los homopolímeros y tienen un comportamiento al azar mientras que los copolímeros con 50% mol tiene un comportamiento más complejo que los posiciona como copolímero en bloque, además, de que muestran un

Hf y

un grado de cristalinidad menor que de los copolímeros con un 25 % mol de CL. Los resultados obtenidos para las polimerizaciones catalizadas por la lipasa pancreática porcina muestran que todas las lactonas tienen rendimientos pobres dando como resultado de la reacción principalmente oligómeros terminados en ácidos carboxílicos. Se ha determinado, que no es posible incrementar el peso molecular aun cuando se modifique la reacción a un sistema de dos pasos o se incremente la concentración de enzima. La polimerización por apertura de anillo para lactonas con grupos laterales produce productos de peso molecular con bajos rendimientos y baja estabilidad térmica atribuible a la baja actividad de la enzima. La película obtenida de una mezcla física a partir de poli( -caprolactona), P -CL y poli(pentadecanólido), PPDL en un concentración de 50/50 % en peso mostró 91

ser inmiscible. No obstante, presentó un ligero corrimiento en el valor de temperatura de fusión y valores de

Hf y un grado de cristalinidad menor con

respecto al valor de los polímeros individuales. Se determinó que un incremento en la temperatura de reacción a 90°C impide la reacción de la

-caprolactona, -CL, aunque si permite la reacción del

pentadecanólido, PDL. Por otro lado, un incremento de la temperatura de síntesis de 70 a 90°C para la PPDL afecta el peso molecular disminuyéndolo casi a la mitad sin afectar la polidispersidad del polímero. Se ha encontrado que la región amorfa es detectable por FTIR y este es indicado por el hombro que aparece a 1738 cm-1 de C=O. Sin embargo, la principal diferencia entre la PPDL sintetizada a 70 y 90°C es el porcentaje de cristalinidad y punto de fusión y cristalización detectado por DSC. La PPDL polimerizada a 70°C presenta una cristalinidad más alta con un solo pico de fusión centrado en 86°C mientras que la PPDL presenta un endoterma múltiple a más baja temperatura. Es importante mencionar que este comportamiento no ha sido reportado en la literatura. Se observa también un solo evento de cristalización para la PPDL sintetizada a 70°C y múltiples picos para la PPDL obtenida a 90°C. El hecho de que varios eventos de cristalización aparezcan en el PPDL sintetizada a 90°C indica la presencia de un bajo peso molecular dando lugar a la formación cristales más pequeños.

92

Referencias 1. Delamarre, S.C. and Batt, C.A. 2006. Appl. Microbial. Biotechnol. 71:668679. 2. Mahishi, L.H and Rawal, S.K. 2002. World J.

Microbiol. Biotechnol.

18:805-810. 3. Zhang, S., Norrlöw, O., Wawrzynczyk, J., and Szearjcer, E. 2004. Appl. Environm. Microbiol. 70:6776-6782. 4. Tabandeh, F. and Vasheghani, E. 2003. Iranian Polym. J. 12:37-42. 5. Grothe, E. and Chisti, Y. 2000. Bioproc. Eng. 22:441-449. 6. Wang, F. and Yup Lee, S. 1997. Appl. Environm. Microbiol. 63:37033706. 7. Vogel, C., Morita, S., Sato, H., Noda I., Ozaki Y., Siesler, H. 2007. Appl. Spectrosc. 61:755-763. 8. Erceg, M., Kovacic, T., Klaric, I. 2005. Polym. Degrad. Stab. 90:313-318. 9. Brigham, C.J. and Sinskey, A.J. 2012. Intern. J. Biotechnol. for wellness Indust. 1:53-60. 10. Yeniad, B., Naik, H. and Heise, A. 2011. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 125:69-95. 11. Lecomte, P. and Jérôme, C. 2012. Adv. Polym. Sci. 245:173-218. 12. Jedlinski, Z., Kurcok, P. and Kowalczuk, M. 1985. Macromol. 18:26792683. 13. Kobayashi, S., Takeya, K., Sudu, S., Uyama, H. 1998. Macromol. Chem. Phys. 199:1729-1736.

93

14. Hunsen, M., Azim, A., Mang, H., Wallner, S., Ronkvist, A., Xie, W. and Gross, R. 2007. Macromol. 40:148-150. 15. Cordova, A., Iversen, T., Hult, K., Martinelle, M. 1998. Polymer. 39:65196524. 16. Mei, Y., Kumar, A., Gross, R. 2002. Macromol. 35:5444-5448. 17. Kumar, A. and Gross R. 2000. Biomacromol. 1:133-138. 18. Ajay Kumar and Richard A. Gross. 2000. Biomacromolecules. 1:133-138. 19. Loeker, F., Duxbury, C., Kumar, R., Gao, W., Gross, R. and Howdle, S. 2004. Macromol. 37:5444-5448. 20. Thurecht, K.J., Heise, A., De Geus, M., Villarroya, S., Zhou, J., Wyatt, M.F., and Howdle, S.M. 2006. Macromol. 39:7967-7962. 21. Cordova, A., Iversen, T., Hult, K., Martinelle, M. 1998. Polymer. 39:65196524. 22. MacDonald, R.T., Pulapura, S.K., Svirkin, Y.Y., Gross, R., Kaplan, D.L., Akkara, J., Swift, G. and Wolk, S. 1995. Macromol. 28:73-78. 23. Dong, H., Cao, S.G., Li, Z., Han, S.P., You, D. and Shen, J.C. 1999. J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 37:1265-1275. 24. De Geus, M., Peeters, J., Wolffs, M., Hermans, T., Palmans, A., Koning, C.E. and Heise, A. 2005. Macromol. 38:4220-4225. 25. Ana Pascual, Jose R. Leiza, David Mecerreye. 2013. European Polymer Journal. 49:1601–1609. 26. Suzuki, Y., Ohura, T., Kasuya, K., Toshima, K., Doi, K., and Matsumura, S. 2000. Chem. Lett. 29:318-319. 27. Hans, M., Keul, H., and Moeller, M. 2009. Macromol. Biosci. 435:239247. 94

28. Focarete, M.L., Gazzano, M. and Scandola, M. 2002. Macromol. 35:8066-8071. 29. Cai, J., Liu, C., Cai, M., Zhu, J., Zuo, F., Hsiao, B., and Gross, R. 2010. Polymer. 51:1088-1099. 30. Chum, Y.S. and Kim, W.N. 2000. Polymer. 41:2305-2308. 31. Ebata, H., Toshima, K., and Matsumura, S. 2008. Macromol. Biosci. 8:38-45. 32. Dai, S. and Li, Z. 2008. Biomacromolecules. 9:1883-1893. 33. Mazzocchetti, L., Scandola, M., and Jiang, Z. 2011. European polymer journal. 47:942-948. 34. Ceccorulli, G., Scandola, M., Kumar, A., Kalra B., Gross R. 2005. Biomacromolecules. 6:902-907. 35. Kumar A. Kalra B, Dekhterman A., and Gross A. 2000. Macromolecules 33:6303-6309. 36. Bilmeyer, F. 1971. Textbook of Polymer Science. John Wiley and Sons Inc. New York. p:416. 37. Young, R.J.; Lovell, P.A. 1991. Introduction to Polymers. Segunda ed. Nelson Thornes Ltd:Cheltenham. p:443. 38. Finch, C.A. 1981. Chemistry and Technology of Water-Soluble Polymers. Plenum Press, New York, p:81. 39. Bisht, K. S., Henderson, L. A., Gross, R. A., Kaplan, D. L., Swift, G. 1997. Macromolecules. 30:2705. 40. Gross. R., Kalra, B. 2002. Science. 297:803. 41. Albertsson, A.-C., Varma, I. K. 2003. Biomacromolecules. 4:1466. 42. Vert, M. 2005. Biomacromolecules. 6:538. 95

43. Edlund, U., Albertsson, A.-C. 2002. Adv. Polym. Sci. 157:67. 44. Quanyong Liu, Lei Jiang, Rui Shi, Liqun Zhang 2012. Progress in Polymer Science. 37:715– 765. 45. Langer R, Peppas NA. 2003. Advances in biomaterials, drug delivery and bionanotechnology AIChE J. 49:2990–3006. 46. D. Arcos Æ I. Izquierdo-Barba Æ M. 2009. J Mater Sci: Mater Med. 20:447–455. 47. David L Nelson and Michael M. Cox. 2000. Lehninger Principles of Biochemistry, Chapter 8: enzymes, Third edition, worth Publishers. p: 243-292. 48. Lubert Stryer. 1988. Biochemistry. Chapters 8: Introduction to enzymes and 9: mechanism of enzymatic action. Third edition. W.H. Freeman and Company. p: 177-228. 49. Wolfenden, R., Snider, M. 2001. Acc. Chem. Res. 34:938. 50. Hult, K., Berglund, P. 2007. Trends. Biotechnol. 25:231. 51. Carlqvist, P., Svedendahl, M., Branneby, C., Hult, K., Brinck, T., Berglund, P. 2005. ChemBioChem. 6:331. 52. Bornscheuer, U., Kazlauskas, R. Angew. 2004. Chem. Int. Ed. 43:6032. 53. Schulz, S. Angewandte 1997. Chemie International Edition in English, 36:314-326. 54. Saito, Y. Nakamura, S. Hiramitsu, M. Doi, Y. 1996. Polymer International. 39:169-174. 55. Kobayashi, S., Uyama, H., Kimura, S. 2001. Chem. Rev. 101:3793.

96

56. Takahiko Nakaoki, Ying Mei, Lisa M. Miller, Ajay Kumar, Bhanu Kalra, M. Elizabeth Miller, Ole Kirk, Morten Christensen and Richard A. Gross. 2005. Industrial Biotechnology. 1:126-135. 57. Okumura, S., Iwai, M., Tominaga, T. 1984. Agric. Biol. Chem., 48:2805. 58. Taniguchi, I., Nakano, S., Nakamura, T., El-Salmaway, A., Miyamoto M., Kimura, Y. 2002. Macromol. Biosci. 2:447. 59. Uyama, H., Takeya, K., Kobayashi, S. 1993. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. 69:203. 60. Matsumura, S., Mabuchi, K., Toshima, K. 1997. Macromol. Rapid Commun. 18:477. 61. Matsumura, S., Tsukada, K., Toshima, K. 1997. Macromolecules, 30:3122. 62. Uyama, H.; Kobayashi, S. 1993. Chemistry Letters. 22:1149-1150. 63. Matsumura, S. 2006. Adv. Polym. Sci. 194:95. 64. Zhong, Z., Dijkstra, P., Feijen, J. 2000. Macromol. Chem. Phys. 201:1329. 65. Svirkin, Y. Y., Xu, J., Gross, R. A., Kaplan, D. L., Swift, G. 1996. Macromolecules. 29:4591. 66. Kumar, A., Gross, R., A. 2000. Macromolecules 122:1767. 67. Wahlberg, J., Persson, P. V., Olsson, T., Hedenström, E., Iversen T. 2003. Biomacromolecules. 4:1068. 68. Duxbury, C., Cummins, D., Heise, A. 2007. Macromol. Rapid. Commun. 28:235. 69. Henderson, L.A.; Svirkin, Y.Y.; Gross, R.A.; Kaplan, D.L.; Swift, G. 1996. Macromolecules. 29:7759-7766. 97

70. Judit E. Puskas, Mustafa Y. Sen and Kwang Su Seo, 2009. Journal Polymer Science: Part A: Polymer chemistry. 47:2959-2976. 71. Uyama, H.; Suda, S.; Kobayashi, S. 1998. Acta Polymerica. 49:700-703. 72. Varma, K. I., Albertsson, A.-C., Rajkhowa, R., Srivastava, R. K. 2005. Prog. Polym. Sci. 30:949. 73. Hoegh, I., Patkar, S., Halkier, T., Hansen, M., T. 1995. Can. J. Bot. 73:S869. 74. Anderson, E., Larsson, K., Kirk, O. 1998. Biocat. Biotrans. 16:181. 75. Ollis, D., Cheah, E., Cygler, M., Dijkstra, B., Frolow, F., Franken, S. M., Harel, M., Remington, J., Silman, I., Schrag, J., Sussman, J. L., Verschueren, K. H.G., Goldman, A. 1992. Protein Eng. 5:197. 76. Uppenberg, J., Hansen, M. T., Patkar, S., Jones, T. A. 1994. Structure 2:293. 77. De Geus, M., Van der Meulen, I., Goderis, B., Van Hecke, K., Dorschu, M., Van der Werf, H., Koning, C. E. and Heise, A. 2010. Polym. Chem. 1:525-533. 78. Uyama, H., Kikuchi, H., Takeya, K. and Kobayashi, S. 1996. Acta Polymerica. 47:357-360. 79. Nomura, R., Ueno, A. and Endo, T. 1994. Macromol. 27:620-621. 80. Bankova, M., Kumar, A., Impallomeni, G., Ballistreri, A. and Gross, R.A. 2002. Macromol. 35:6858-6866. 81. Messersmith, P., and Giannelis, E. 1993. Chem, Mater. 5:1064-1066. 82. Yang, X., Wang, L., Yao, L., Zhang, J., Tang, N., Wang, C., Wu, J. 2011. Inorg. Chem. Comm. 14:1711-1714.

98

83. Jedlinski Z, Juzwa M, Adamus G, Kowalczul M. 1996. Macromol Chemi & Phys. 197:2923-2929. 84. Kiersnowski, A., Dabrowski, P., Budde, H., Kressler, J. Piglowski, 2004. Europ. Polym. J. 40:2591-2598. 85. Chappell, J., Meyn, A., Ngim, K. 2004. J. Forensic. Sci. 49:1-7. 86. Chen, C., Fei, B., Peng, S., Zhuang, Y., Dong, L., and Feng, Z. 2002. J. Appl. Polym. Sci. 84:1789-1796. 87. Payan, M., Doherty, W. and George, G. 2010. Ind. Crops Prod. 32:656661. 88. Ma, J., Li, Q., Song, B., Liu, D., Zheng, B., Zhang, Z. and Feng, Y. 2009. J. Molecular Catal. B: Enzym. 56:151-157. 89. Focarete, M.L. Scandola, M., Kumar, A. and Gross, R.A. 2001. J. Polym. Sci:Part B:Polym Physc. 39:1721-1729. 90. Gumel, A.M., Annuar, M.S.M., Chisti, Y. and Heidelberg, T. 2012. Ultrasonics Sonochemistry. 19:659-667. 91. Shamala, T.R., Divyashree, M.S., Davis R., Kumari, K.S., Vijayendra, S. and Raj, B. 2009. Indian J. Microbiol. 49:251-258. 92. Lori A. Henderson, Yuri Y. Svirkin, and Richard A. Gross. 1996. Macromolecules. 29:7759-7766. 93. Mei, Ying, Ajay Kumar and Richard Gross. 2003. Macromolecules. 36:5530-5539. 94. Matthijs de Geus, Joris Peeters, Martin Wolffs, Thomas Hermans, Anja R.A.

Palmans,

Cor

E.

Koning

Macromolecules. 38:4220-4225.

99

and

Andreas

Heise.

2005.

95. Bouyahyi, M., Pepels, M., Heise, A. and Duchteau R. 2012. Macromolecules. 45:3356-3366. 96. Nemekawa S., Uyama H., Kobayasi S. 2001. Macromol Chemie Phys. 202:801-806. 97. Xu J, Guo B-H, Yang R, Wu Q, Chen G-Q, Zhang Z-M. 2002. Polymer. 43:6893-6899. 98. Padermshoke A, Katsumoto Y, Sato H, Ekgasit S, Noda I, Ozaki Y. 2005. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 61:541-550. 99. Sato H, Dybal J, Murakami R, Noda I, Ozaki Y. 2005. J Molecular Struc, 744-747, 35-46. 100.

Nakayama Y, Watabane N, Kusaba K, Sasaki K, Cai Z, Shiono T,

Tsutsumi C. 2011. J Appl Polym Sci. 121:2098–2103. 101.

Levedev B, and Yevstropov A. 1984. Die Makromolekulare

Chemie. 185:1235-1253.

100