NOVA Lite® ANCA Kits/Substrate Slides Para Diagnóstico In Vitro Codice Prodotto: 708295, 708297 508295, 508297, 508295.10, 508297.20 Complejidad de CLIA: Alto

Aplicación Este producto (kit o portas) es para el uso en el screening y titulación de anticuerpos citoplasmicos anti-neutrófilos circulantes (ANCA). Estos anticuerpos son marcadores importantes para el diagnóstico y tratamiento de granulomatosis 1 de Wegener y otras enfermedades vasculares.

Sumario y Explicación de la prueba Las enfermedades vasculares necrotizantes, incluyendo la granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, síndrome de Churg Strauss, glomerulonefritis idiopática extracapilar y el síntoma de vasculitis sistémica son un grupo de enfermedades relacionadas y que varían considerablemente el historial clínico y consecuentemente presentan problemas de diagnóstico. La granulomatosis de Wegener es una enfermedad vascular grave caracterizada por granulomas necrotizantes del tracto respiratorio y glomerulonefritis focal. Es importante un diagnóstico rápido ya que una terapia inmunodepresora tiene un mayor efecto sobre el estado del riñón, pero los síntomas iniciales de la 2 enfermedad así como los resultados de exámenes histológicos de biopsias son frecuentemente no-específicos. En 1982 Davies et al describieron la presencia de anticuerpos citoplásmaticos antineutrofilos (ANCA) en el suero de 3 pacientes con glomerulonefritis necrotizante. Van de Woude et al mostró en 1985 que 25 de 27 pacientes con granulomatosis de Wegener presentaban citoplásmaticos clásicos (c-ANCA) en patrones de inmunofluorescencia 1 indirecta. Los patrones clásicos de c-ANCA en neutrófilos de fijación de etanol muestran un coloreado granular citoplasmático característico con una débil fluorescencia en los lóbulos nucleares. El mayor antígeno objetivo de cANCA es la proteinasa III, una serinoproteasa. En 1988 Falk et al describieron un segundo patrón de fluorescencia de ANCA (perinuclear, p-ANCA) en pacientes con 4 vasculitis sistemica. Se considera como el principal antígeno objetivo p-ANCA la mieloperoxidasa, aunque otros antígenos diferentes (p.ej. lactoferrina, elastasa, catepsin G) se asocian a un grado menor. El patrón de fluorescencia del p-ANCA muestra una coloración perinuclear bastante marcada. Muchas muestras testadas a ANCA, pueden ser también positivos para anti-dsDNA, anti-histones y otros autoanticuerpos antinucleares (ANA) y que pueden simular a los patrones de fluorescencia ANCA. Muestras de pacientes positivos de ANA también pueden dar positivo de p-ANCA. Obviamente es crítica la distinción de los patrones de fluorescencia c-ANCA real y p-ANCA de otros artefactos no-ANCA. Esta distinción se puede conseguir utilizando una combinación de portas con neutrófilos fijados con etanol y formalina. La fijación de neutrófilos con etanol da lugar a unas granuloproteínas citoplásmicas cargadas positivas y que emigran al 5 núcleo de DNA negativo, dando como resultado una coloración perinuclear (p-ANCA). Se previene una migración, si los neutrófilos se tratan con un fijador como la formalina. De esta forma las granuloproteínas citoplásmicas quedan en el citoplasma y las muestras positivas de p-ANCA real mostrarán un c-ANCA citopásmico granular. Las muestras positivas de ANA testadas con neutrófilos fijados con formalina, se convierten en negativas o muestran una muy baja intensidad de coloración. Muestras con granulocito específico ANA (GS-ANA) que producen una reacción nuclear o perinuclear con neutrófilos fijados con etanol se convierten en negativas si son testadas con neutrófilos fijados en formalina. El mejor método para el screenig de ANCA es la fluorescencia indirecta sobre portas con neutrófilos. INOVA utiliza neutrófilos humanos purificados por afinidad, cuya fabricación garantiza unos patrones de fluorescencia óptimos. Muestras que den ANCA o ANA positivo o que muestren unos patrones de fluorescencia atípicos, deberán ser tituladas.

Procedimiento de trabajo

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El test se basa en la inmunofluorescencia indirecta. Tanto las muestras como los controles correspondientes se incuban con neutrófilos como substrato y mediante lavado se eliminan los anticuerpos que no han reaccionado y después se aplica el conjugado de fluorescencia apropiado. El conjugado no ligado se elimina mediante lavado. Los portas son examinados bajo un microscopio de fluorescencia dando las muestras positivas una fluorescencia de verde manzana en aquellas zonas del neutrófilo donde se ha ligado el autoanticuerpo.

Reactivos 1.

Portas con substrato de neutrófilos fijados con formalina (6 ó 12 pocillos).

Sólo kits 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Dos o más sueros de control positivo que contienen azida sódica 0,09% (p.ej. p-ANCA, c-ANCA, ANA), Prediluido y listo para el empleo. Suero de control negativo que contiene azida sódica 0,09%. Prediluido y listo para el empleo. Conjugado de fluoresceína con Azul de Evans IgG anti-humano de cabra purificado por afinidad. Contiene azida sódica 0,09%. Prediluido y listo para el empleo. Azul de Evans 1%. Opcional. Tampón PBS II en forma liquida y concentrado 40 veces. Medio de montaje que contiene un agente “anti-fading” Cubreobjetos

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Advertencias/Precauciones Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. Esta prueba solo deberá efectuarse para el propósito indicado y por personal de laboratorio adecuadamente instruido. Se recomienda encarecidamente seguir las instrucciones de uso. El material de partida para la elaboración de los calibradores y controles proviene de sangre humana (sólo los kits). Cada una de las muestras ha sido examinada y está libre de anticuerpos del virus del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (HIV 1 &2), Hepatitis C así como antígenos superficiales de Hepatitis B (HBsAG). No obstante, hasta la fecha no existen métodos seguros para la exclusión de estos agentes infecciosos ni de otros. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y sólo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Algunos kits contienen de azida sódica 0,09% y deben tratarse según las medidas de seguridad correspondientes. Debe evitarse tanto la ingesta como el contacto con la piel y las mucosas. En caso de contacto, aclarar con abundante agua y consultar a un médico. La azida sódica puede formar azidas metálicas explosivas en contacto prolongado con tubos de plomo o cobre. Tras la eliminación aclarar con gran cantidad de agua con el fin de evitar depósitos de azida.

Condiciones de Almacenaje El kit sin estrenar es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el envase almacenándolo entre 2-8ºC. ¡NO CONGELAR! Tras la extracción de los portas de su embalaje deberán ser empleados inmediatamente. El tampón PBS II diluido es estable hasta 4 semanas a una temperatura entre 2-8ºC. El kit de conjugado de fluoresceína debe ser resguardado de la luz solar, fluorescente o UV y almacenarse a una temperatura entre 2-8ºC. Todos los demás reactivos deben almacenarse entre 2-8ºC.

Recolección de Muestras Las muestras de suero se deben recolectar mediante extracción intravenosa y dejar coagular de forma natural. Separar rápidamente el suero del coagulo con el fin de evitar hemólisis. El suero puede conservarse a 2-8°C durante un máximo 10 de 7 días antes del ensayo, o para periodos más largos, distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperatura inferior. Evitar repetidas congelaciones y descongelaciones. No utilizar muestras de suero contaminado microbiológicamente o con partículas, ni tampoco sueros hemolíticos o lipémicos ya que puede darse un titulo inferior o patrones de fluorescencia poco claros.

Procedimiento Materiales Suministrados (kits) 708295 10 1 1 1 1 2 1 1 1 1

ANCA Neutrophil Slide – 6-well (Portas con ANCA neutrófilos fijados con formalina de 6 pocillos) 1mL p-ANCA Positive Control (Control positivo p-ANCA, prediluido) 1mL ANA Positive Control (Control positivo ANA, prediluido, sólo FK017) 1mL IFA System Negative Control (IFA Sistema control negativo, prediluido) 7mL anti Human IgG AFF Fluorescein with Evans Blue (Conjugado de fluoresceína IgG anti-humano de cabra purificado por afinidad con Azul de Evans) 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrado 40 veces) 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans 1%) 3mL Mounting Medium (Medio de montaje) 10 Coverslips (Cubreobjetos) Instrucciones de empleo

708297 20 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1

ANCA Neutrophil Slide – 12-well (Portas con ANCA neutrófilos fijados con formalina de 12 pocillos) 1mL p-ANCA Positive Control (Control positivo p-ANCA, prediluido) 1mL c-ANCA Positive Control (Control positivo c-ANCA, prediluido) 1mL ANA Positive Control (Control positivo ANA, prediluido) 1mL IFA System Negative Control (IFA Sistema control negativo, prediluido) 15mL anti Human IgG AFF Fluorescein with Evans Blue (Conjugado de fluoresceína IgG anti-humano de cabra purificado por afinidad con Azul de Evans) 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrado 40 veces) 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans 1%) 10mL Mounting Medium (Medio de montaje) 20 x Coverslips (Cubreobjetos) Instrucciones de empleo

Material suministrado (portaobjetos) 10 20

ANCA Neutrophil Slides – 6-well (Portas de 6 pocillos con neutrófilos fijados con formalina) ANCA Neutrophil Slides – 12-well (Portas de 12 pocillos con neutrófilos fijados con formalina)

Material necesario no incluido 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Agua destilada para diluir el concentrado de PBS II. Recipientes para el PBS II. Pipetas y tubos de reacción desechables. Cmara húmeda para los pasos de incubación Microscopio de campo oscuro con filtros para una longitud de onda de excitación de 495nm y emisión de 515nm. Botella de plástico para un prelavado con PBS II.

Si solo se utilizan portas con substrato, también se necesitaran los siguientes materiales (INOVA los códigos de artículo se indican entre paréntesis): control positivo p. ej. c-ANCA (508191), p-ANCA (508291) control negativo (508007), conjugado IgG anti-humano FITC (508113) o IgGAM anti-humano FITC (AF002) PBS II (508998), Azul de Evans (504049, opcional), medio de montaje de neutrófilos (508001, 508005, 508006), cubreobjetos. 2

Procedimiento de Ensayo Control de calidad Cada vez que se realice una serie de análisis deberán usarse controles positivo y negativo. 1. Dilución del concentrado PBS II. Diluir el PBS II concentrado con agua destilada (1 parte PBS II + 39 partes de agua destilada) y mezclar. Nota: Preparar la totalidad del kit, solo si va a utilizarse en un plazo de un mes a partir de la fecha de preparación. 2. Dilución muestras de pacientes Screening: Diluir las muestras de paciente 1/20 mezclando 10µL de suero con 190µL de tampón PBS II. Titulación: Hacer diluciones en serie de pruebas positivas del screening con PBS II (p.ej. 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640, etc.) Ejemplo: Mezclar 100µL de la dilución 1/20 con 100µL de PBS II, obteniendo así una dilución de 1/40. Repetir sucesivamente para más diluciones. 3. Portas de substrato: Atemperar el/los porta/s de substrato a temperatura ambiente (18-28°C), por 30 minutos aproximadamente antes de sacarlo/s de la/s bolsa/s. Marcar los portas adecuadamente, colocarlos en la cámara húmeda y añadir una gota de control positivo y negativo de cada kit en los pocillos correspondientes. Añadir 25µL de muestras diluídas de paciente en los pocillos restantes. 4. Incubación de los portas. Incubar los portas durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-28ºC). 5. Lavado con PBS II. Extraer el/los portas de la cámara húmeda y aclarar con cuidado con el frasco lavador. ¡No dirigir el chorro directamente a los pocillos! Después, sumergir en PBS II los portas en la bandeja de tinción y agitar suavemente durante 10 minutos. 6. Adición de conjugado de fluorescencia: Sacudir el exceso de PBS II. Volver a introducir los portas en la cámara húmeda e inmediatamente, cubrir cada pocillo con una gota del conjugado de fluorescencia correspondiente. ¡NO DEJAR LOS POCILLOS SIN TAPAR MÁS DE 15 SEGUNDOS. Si se llegara a secar el substrato, los resultados se verían seriamente afectados! 7. Incubación de los portas: Incubar los portas a oscuras durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-28ºC). 8. Lavado con PBS II: Lavar los portas según se describe en el punto 5. Coloración opcional: añadir 2-3 gotas de Azul de Evans 1% por cada 100mL de PBS II previamente a la inmersión. 9. Colocación del cubreobjetos: Sacar de uno en uno los portas del PBS II. Secar rápidamente alrededor de los pocillos y añadir una gota del medio de montaje a cada pocillo. Cubrir con cuidado el porta con el cubreobjetos evitando la formación de burbujas. ¡En caso de formarse burbujas, no intente quitarlas! 10. Visión de los portas bajo el microscopio de fluorescencia: Los portas deberán guardarse a una temperatura de 2-8ºC y visionarse lo más pronto posible.

Control de Calidad Sobre neutrófilos fijados con formalina las muestras c-ANCA y p-ANCA muestran una tinción granular citoplasmática Sobre neutrófilos fijados con formalina no deber verse positividad de ANA. El control negativo no debe mostrar ninguna aparente fluorescencia. Si los controles no aparecen como se ha descrito, la prueba no es válida y debe repetirse.

Interpretación de los Resultados Negativo Una muestra se considera negativa cuando la fluorescencia del neutrófilo especifico es igual o menor a la del pocillo con el control negativo. Positivo Una muestra se considera positiva cuando se observa una fluorescencia citoplásmica. Nota: Cada laboratorio debe establecer sus propias normas y fijar cuando un resultado positivo es clínicamente relevante. Interpretación de los patrones c-ANCA (Coloreado cytoplasmático) En las c-ANCA muestras positivas de los portas de fijación con fijación de Portaobjetos fijados formalina, pueden observarse un coloreado granular generalizado del citoplasma. p-ANCA (Patrón perinuclear) En los portas de fijación con formalina, p-ANCA se observará un coloreado granular del citoplasma, no distinguiéndose el patrón de los sueros positivos de c-ANCA. Patrón ANA En las muestras positivas de los portas con fijación de formalina la mayoría de los antígenos nucleares han sido destruidos, por lo que las muestras positivas de ANA no mostrarán fluorescencia o bien una muy débil fluorescencia comparada con el control positivo de p-ANCA.

Limitaciones del Procedimiento 1.

2.

3.

Las muestras inactivadas por calor, hemolíticas o desfibrinizadas incompletamente, pueden causar una coloración de fondo alta que hace una interpretación difícil. Se deberán recoger muestras frescas y repetir el test. Las muestras problemáticas deberán ser diluidas con PBS II conteniendo 2% de albúmina o suero bovino, con el fin de reducir la coloración de fondo. La sensibilidad de la prueba está influida por la fuente de luz, filtros así como la óptica de las distintas marcas de microscopios de fluorescencia. El buen funcionamiento del microscopio está significativamente influido por un correcto mantenimiento, centrándose especialmente en la lámpara de mercurio y el cambio de la lámpara después del tiempo recomendado. Los resultados positivos de IFA deberían ser confirmados por los enzimoinmunoensayos (EIA) de 11,12 mieloperoxidasa (MPO) y proteinasa 3 (PR3). Los portas ANCA fijados por formalina también pueden contribuir a la determinación de la especificidad de anticuerpos, sobretodo en muestras con niveles moderados y elevados.

3

4.

5.

6. 7.

8.

Los sueros positivos de ANCA no siempre dan positivos en el ELISA para mieloperoxidasa (MPO) o serinoproteinasa 3 (PR3) ya que también otros antígenos granulares primarios producen los patrones clásicos de p- o c-ANCA positivos. Estos antígenos incluyen la elastasa, la lactoferrina, catepsina G, proteína catiónica 57 y otras proteínas no identificadas aún. Los anticuerpos contra la musculatura lisa (actina) pueden reaccionar con neutrófilos humanos fijados con 7 etanol al igual que los aloanticuerpos (NB1) Los actino-anticuerpos o anticuerpos contra la musculatura lisa muestran más bien una coloración homogénea y no el patrón típico moteado basto de los c-ANCA. Los aloanticuerpos también reaccionan con el citoplasma de los neutrófilos dando un patrón de fluorescencia moteado fino. Típicamente, sólo el 40% o menos de las células muestran una fluorescencia. Los sueros pueden contener más de un anticuerpo, p.ej. c-ANCA y p-ANCA o bien c-ANCA y ANA. En enfermedades infecciosas del intestino o en la colitis ulcerosa pueden existir también anticuerpos que 8 reaccionan con los neutrófilos. Estos sueros muestran en los neutrófilos fijados con etanol un patrón del pANCA una fluorescencia perinuclear muy marcada. Los sueros sobre neutrófilos fijados con formalina aparecen negativos o dan una fluorescencia muy débil. Este test no es suficiente para un diagnóstico por sí solo, sino que debe utilizarse como un medio más. Debe tenerse en cuenta el cuadro clínico así como otros análisis o biopsias.

Los portaobjetos comercializados por separado se clasifican como “reactivos específicos para los analitos”. Salvo que se trate de componentes del kit NOVA Lite® ANCA IFA, las características analíticas y de rendimiento no están establecidas.

Características de rendimiento Valores Esperados Grupo de pacientes Personas sanas Enfermedad de Crohn Colitis ulcerosa Colangitis primaria esclerosante con enfermedades inflamatorias del intestino Cirrosis biliar primaria Hepatitis autoinmune Granulomatosis de Wegener Polyarteritis nodosum *

No. 30 80 46

% positivos p-ANCA c-ANCA 0 0 25 0 46 0

17

58

0

25 15 30 5

28 33 0 0

0 0 100 100

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Toda la información antes indicada es derivada de Seibold et al , excepto la marcada con *, que se obtuvo de estudios realizados en The Binding Site Ltd.

Precisión Se realizaron pruebas con 10 muestras de suero (3 positivas de p-ANCA, 3 positivas de c-ANCA, 2 positivas de ANA y 2 negativas) 9 veces (con tres lotes diferentes 3 veces con cada uno). Se encontraron leves diferencias en los patrones de fluorescencia (basado en la escala de 1+ (fluorescencia débil) hasta 3+ (fuerte intensidad).

Estudio de comparación Se testaron 100 muestras de suero clínicas y 40 muestras normales de donantes adultos sanos (20 masculinas y 20 femeninas) con kits de The Binding Site y con portas de un competidor. Los resultados son:

Competitor

The Binding Site c-ANCA p-ANCA ANA Neg. p-/c-ANCA 60 3 0 0 0 c-ANCA 3 27 0 0 0 p-ANCA 0 0 0 0 1 p-/c-ANCA 0 0 6 0 0 ANA 0 0 0 40 0 Neg. 134 sueros de 140 testados dieron resultados idénticos con ambos métodos. Para los patrones de c-ANCA la sensibilidad relativa fue del 95% y la especificidad relativa del 96%, siendo la concordancia relativa el 96%. Para los patrones de p-ANCA la sensibilidad relativa fue del 90%; la especificidad relativa del 97% y la concordancia relativa del 96%. En las 6 muestras que dieron patrones diferentes mostraron una fluorescencia o muy débil o muy marcada en uno o ambos kits haciendo una difícil interpretación.

Resumen del Procedimiento 1. 2. 3. 4.

Diluir el PBS II con agua destilada. Diluir las muestras 1/20 con PBS II Dejar que los portas alcancen temperatura ambiente (18-28°C). Sacar la porta del embalaje y colocar en una cámara húmeda. Aplicar 25µL de controles positivos y negativos así como suero diluido en los pocillos correspondientes. 5. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-28°C). 6. Lavar los portas con la botella de lavado con PBS II. 7. Sumergir los pocillos durante 10 minutos. 8. Secar alrededor de cada pocillo y retornar a la cámara húmeda e inmediatamente cubrir cada pocillo con una gota de conjugado. 9. Incubar portas otros 30 minutos. 10. Lavar según descrito en punto 7. 11. Secar alrededor de los pocillos y añadir el medio de montaje y cubrir con el cubreobjetos. 12. Evaluar los portas bajo el microscopio de fluorescencia. NOVA Lite es una marca registrada de INOVA Diagnostics, Inc.Copyright 2011 Todos los derechos reservados© 4

Referencias 1. 2. 3. 4.

5. 6. 7.

8. 9. 10. 11.

12.

Van der Woude F.J. et al (1985) Autoantibodies against neutrophils and monocytes: Tool for diagnosis and marker of disease activity in Wegener’s granulomatosis. Lancet I, 425-9. Goeken J. A. (1991) Antineutrophil cytoplasmic antibody – a useful serological marker for vasculitis, J. Clin. Immunol. 11, 161-174. Davies D. J. et al (1982) Segmental necrotizing glomerulonephritis with antineutrophil antibody: possible arbovirus aetiology? Br. Med. J. 285, 606. Falk R. J. and Jenette J. C. (1988) Antineutrophil cytoplasmic auto antibodies with specificity for myeloperoxidase in patients with systemic vasculitis and idiopathic neutotizing and crescentic glomerlonephritis N. Engl. J. Med. 318, 1651-7. Charles L. A., Falk R. J. and Jenette J. C. (1989) Reactivity of antineutrophil cytoplasmic autoantibodies with HL-60 cells. Clin. Immunol. Immunpathol. 53, 243-253. Weller T. H. and Coons A. H. (1954) Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med 86, 789-794. Stroncek D. F. et al (1993) Neutrophil alloantibodies react with cytoplasmic antigens: a possible cause of false – positive indirect immunofluorescence assays for antibodies to neutrophil cytoplasmic antigens. Am. J. Kidney Dis. 21, 368-373. Hardarson S. et al (1992) Antineutrophil cytoplasmic antibody in inflammatory bowel and hepatobiliary diseases. Clinical Microbiology and Immunology 99, No. 3. Seibold, F. et al (1992) Clinical significance of antibodies against neutrophils in patients with inflammatory bowel disease and primary sclerosing cholangitis. Gut 33, 657-662. rd Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3 Edition) 2004. Ed A Milford Ward. J Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. Savige J, Gillis D, Benson E, Davies D, Esnault V, Falk RJ, Hagen EC, Jayne D, Jennette JC, Paspaliaris B, Pollock W, Pusey C, Savage CO, Silvestrini R, van der Woude F, Wieslander J, Wiik A. International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA) Am J Clin Pathol. 1999 Apr;111(4):507-13. Review. Savige J, Dimech W, Fritzler M, Goeken J, Hagen EC, Jennette JC, McEvoy R, Pusey C, Pollock W, Trevisin M, Wiik A, Wong R; International Group for Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA). Addendum to the International Consensus Statement on testing and reporting of antineutrophil cytoplasmic antibodies. Quality control guidelines, comments, and recommendations for testing in other autoimmune diseases. Am J Clin Pathol. 2003 Sep;120(3):312-8. Review.

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December 2012 Revision 1

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