TEMA III: CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

INTRODUCCION Antes de que la cromatografía en fase reversa fuera inventada por A. P. J. Martin (1), las separaciones cromatográficas de muestras neutras se realizaban con columnas con fase estacionaria polar y fase móvil menos polar. Tales separaciones se conocen actualmente como “fases normales”. Como la cromatografía en fase reversa (RP HPLC) emplea una columna con una fase estacionaria menos polar y una fase móvil más polar, ambas fases se pueden considerar intercambiadas o “revertidas”, de allí el nombre de fase reversa. La figura 1 muestra una comparación entre las dos técnicas:

Las fases estacionarias ligadas representan el siguiente avance más importante de la cromatografía líquida de “alta resolución”. Las primeras columnas C18 se prepararon uniendo covalentemente polioctadecilsiloxano a partículas de sílica. Al poco tiempo, a dichas partículas se les incorporaron grupos C18 individuales en lugar del polímero. Estas columnas tuvieron cada vez más aceptación por sus ventajas y a partir de la década del 70 su uso creció exponencialmente: cientos de separaciones se publicaron entre 1976 y 1979, incluyendo separaciones de productos solubles en agua de interés bioquímico y compuestos ionizables. A fines de los 70 con la RPC se logró la separación de péptidos y proteínas. Hoy en día, la RPC es el modo dominante de HPLC y constituye el modo principal de las separaciones por cromatografía líquida- líquida. Fases Estacionarias para RP-HPLC: La fase estacionaria de la columna determina la retención y la selectividad y debe ser estable, debe dar resultados reproducibles y picos angostos. La mayoría de las fases estacionarias son de naturaleza orgánica y pueden estar ligadas covalentemente a una partícula de soporte o depositada mecánicamente (menos frecuente) sobre la misma. En algunos casos la superficie de una partícula no modificada es la fase estacionaria, por ejemplo la sílica gel que se emplea en cromatografía de fase normal. Las fases estacionarias ligadas se obtienen por reacción de los grupos silanoles (OH) de la superficie de las partículas del soporte (sílica gel) con reactivos organosilanos según la siguiente reacción:

X3-Si-R + Si-OH → (organosilano)

(silanol)

Si-O-Si (X2)-R + HX (fase estacionaria)

El grupo funcional X es generalmente -Cl ó –OEt y/o –CH3 en cuyos casos el producto de la reacción es HCl o ETOH.

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Previo a la reacción anterior, el sustrato o soporte de sílica se trata con ácido acuoso (HCl 0.1 mol L-1) para maximizar la concentración de grupos silanoles. La sílca gel que contiene entre 4.8-5.4 grupos silanoles por nm2 da un producto final con una alta densidad de fase ligada, los ligandos son resistentes a la hidrólisis y tiene una baja adsorptividad para compuestos básicos. La reacción se realiza colocando a reflujo la sílica con un solvente inerte y el reactivo organosilano. En condiciones anhidras, con organosilanos monofuncionales y en presencia generalmente de un catalizador, se obtiene una fase ligada monomérica como se muestra a continuación: un único reactivo organosilano como el clorodimetiloctadecilsilano reacciona con un solo grupo

(R= C18) silanol de la superficie de la sílica para formar una columna C18 monomérica. Con cantidades controladas de agua un organosilano difuncional o trifuncional reacciona para dar una fase ligada polimérica como se muestra en las siguientes reacciones:

Se han empleado muchas reacciones de tipo sílica-silanos (organosilanos) para preparar columnas de HPLC poliméricas que contienen una concentración elevada de fase estacionaria, casi el doble comparadas con las fases monoméricas. En las fases polimerizadas horizontalmente los át de Si de los organosilanos están conectados entre si y a la sílica por át de oxígeno formando enlaces siloxanos: Si-O-Si. Estas fases exhiben una gran estabilidad a pH altos y bajos.

Fig. 2 a y b (Snyder et al., 2010) En la fig 2a se ilustran fases polimerizadas vertical y horizontalmente.

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Fig. 2 c y d (Snyder et al., 2010) Las fases monoméricas (fig. 2c) son las que más se usan para columnas de fase reversa y se preparan por la reacción del dimetilcloro o dimetiletoxisilano con el soporte de sílica: una molécula de silano reacciona con un grupo silanol. La ventaja de esta reacción 1 a 1 es que resulta una fase estacionaria “menos densa” que las poliméricas y de muy alta eficiencia debido a la rápida difusión del soluto en la misma. La fase monomérica 2d estéricamente protegida es una variación de la 2c en la que los grupos metilos son reemplazados por grupos i-propilo o i-butilo. Estos grupos laterales y voluminosos impiden la hidrólisis del organosilano ligado, como se muestra en la fig. 2e en comparación con la 2f. Cada enlace Si-O-Si es protegido individualmente por el tamaño de los grupos laterales voluminosos. La protección estérica es muy útil en separaciones que se realizan a pH bajo (pero no a pH elevado), ya que a pH bajo se cataliza la ruptura del enlace O-Si. Este tipo de fases (estéricamente protegidas) están disponibles comercialmente con una gran variedad de ligandos, e.g. C8, C18, ciano, fenilo. La separación de muestras biológicas como péptidos y proteínas (muestras iónicas) se realiza con fases móviles de pH bajo, de manera que las fases estacionarias estéricamente protegidas son especialmente útiles para este tipo de muestras. Debido a la protección estérica, estos empaquetamientos tienen menor concentración de ligandos en la superficie y exhiben menor retención comparadas con las fases difuncionales. Por otra parte, dichas fases difuncionales son muy estables a pH altos.

Fig. 2 e y f (Snyder et al., 2010) Las columnas monoméricas y poliméricas difieren en muchos aspectos. Las poliméricas son más estables que las monoméricas tanto a pH altos como bajos. Esto se debe a que la

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cobertura “densa” de la superficie de las primeras reduce la transferencia de masa entre el soluto y la fase estacionaria. Pero por otra parte, dan resultados menos reproducibles en términos de retención y selectividad debido a que el grado de polimerización con los organosilanos es variable. Después de la reacción de ligado ambas fases se lavan con una serie de soluciones orgánicas y acuosas para eliminar el reactivo adsorbido e hidrolizar los grupos funcionales reactivos remanentes que forman parte del esqueleto de los ligandos. Las fases estacionarias en modo reverso son más útiles para muestras que son insolubles o moderadamente solubles en agua. Algunos ejemplos son: hidrocarburos aromáticos, aceites, esteroides, plásticos, polímeros, alcaloides y otros compuestos de peso molecular alto. Probablemente las más usadas de todas son las columnas octadecil (C18). Sin embargo, se pueden reemplazar eventualmente por columnas octil (C8), que poseen una cadena alquílica más corta y más flexible y que ofrecen ventajas separativas para glicósidos, ácidos urinarios, ácidos carboxílicos, sulfonamidas, hormonas tiroideas, colorantes azoicos, entre muchos otros compuestos polares. En ambos casos, C8 y C18, contienen cadenas alquílicas, pero evidencian diferencias distintivas entre ambas. Mientras C8 tiene mejor selectividad para compuestos moderadamente polares, C18 es usada exitosamente para separar compuestos no polares lipofílicos. Si bien los ligandos más comunes son grupos alquilos como C3, C8, C18, etc., su composición química es variada como se muestra en la tabla 1. Cuando el ligando es propilfenil o hexilfenil se llaman columnas fenilo. Si el ligando es C3-CN, la columna es una ciano.

Tabla 1 (Snyder et al., 2010) Las fases EPG (embedded-polar-group) se emplean cada vez más para fases móviles básicas debido a su elevada selectividad y estabilidad. Los ligandos de estas fases son amida,

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carbamato, urea. La naturaleza del ligando determina principalmente la selectividad de la columna. Cuando se fabrican las fases ligadas quedan grupos silanoles superficiales sin reaccionar. Estos grupos silanoles residuales son capaces de adsorber moléculas polares que afectan las propiedades cromatográficas de la fase estacionaria. En las separaciones en fase reversa usualmente la interacción de los silanoles con grupos polares causa efectos no deseados como “tailing”, resolución pobre y retención excesiva. La cantidad de grupos silanoles libres en las fases ligadas no polares se reduce mediante el proceso de end-capping en el que la mayoría de los silanoles libres reacciona con un agente de silanización pequeño como el trimetilclorosilano que alcanza la superficie de la silica y cubre las áreas de silanoles que no habían reaccionado previamente (Fig.3).

Fig. 3c y d. Silanización con trimetilclorosilano (end-capping) (Snyder et al., 2010) Fase móvil para RP HPLC En separaciones por fase reversa se emplean solventes polares y / o sus mezclas. Para evitar confusiones, emplearemos el término fuerza del solvente tanto en fase normal como en fase reversa para indicar el poder de elución que posee dicho solvente. Esto es, a mayor fuerza del solvente, los compuestos eluyen más rápidamente (menor tiempo de retención), tanto si nos referimos a Fase Normal o a Fase Reversa. En cambio, si hablamos de polaridad del solvente, en el caso de fase normal, a mayor polaridad, mayor es la fuerza del solvente, menor tR y en fase reversa a mayor polaridad, menor es la fuerza del solvente, mayor tR. En la tabla 2 se observan algunos solventes empleados en fase reversa, y sus propiedades.

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Entre los solventes orgánicos más empleados, se encuentran el acetonitrilo y el metanol, que poseen la mayor fuerza o poder de elución. Poseen baja viscosidad y no absorben luz UV. El isopropanol es un disolvente con alto poder de elución, sin embargo, no es de los más empleados debido a su incrementada viscosidad que resulta en baja transferencia de masa del soluto entre las fases y elevación de presión aún en bajos flujos. Para describir cuantitativamente la polaridad de los disolventes, Zinder desarrolló el índice De polaridad P’. (Tabla 1) En esta escala, los valores de polaridad varían de 10.2 para un Compuesto muy polar como el agua hasta 0,2 para los muy poco polares. Cualquier índice De polaridad que se desee entre esos límites se puede conseguir mezclando dos disolventes adecuados. De este modo, la polaridad P’AB de una mezcla de disolventes A y B está dada por: P’AB= ФAPA+ФBPB Donde Ф son las fracciones en volumen de cada solvente y P’ son los parámetros de Polaridad de cada solvente. Las moléculas polares de una muestra interaccionan más fuertemente con una fase móvil polar, por lo tanto estos compuestos son menos retenidos y eluyen antes de la columna (< tR). Los compuestos menos polares prefieren la fase estacionaria no polar, se retienen más tiempo en ella y demoran más en eluir de la columna (> tR). Así, moléculas de tamaño similar eluyen de una columna de fase reversa aproximadamente en orden decreciente de polaridad. El % de un solvente orgánico (B) en la fase móvil final para lograr una separación debe dar valores de k para el /los solutos entre 1 y 10, al mismo tiempo que se maximiza la selectividad con la fuerza del solvente. Un valor % adecuado de B se logra procediendo de la siguiente manera: se comienza con un 80% de B y luego se empieza a reducir su % hasta que el valor de k sea 1 ≤k ≤ 10. ( figura 4)

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En la figura 5 se muestra que el Ph-CN más polar (1) eluye primero en el cromatograma, seguido del anisol (2) y finalmente el tolueno (3) que es el menos polar.

Fig. 5. Retención en RPC en función de la temperatura, polaridad del soluto, fase móvil y columna. Condiciones: (a-c) columna de 150 × 4.0-mm (5-μm) Symmetry C18; (d) columna de 150 × 4.6-mm (5-μm) Zorbax StableBond cyano; 2.0 mL/min;fase móvil: acetonitrilo/agua. El % y la temperatura se indican en la figura (en negrita se indican los cambios a partir de [ a]). (Snyder et al., 2010) La retención en RPC es principalmente el resultado de las interacciones entre la molécula de soluto con la fase móvil o con la fase estacionaria. Un incremento del % del solvente orgánico en la fase móvil disminuye la polaridad de la misma e incrementa la fuerza de las interacciones entre el soluto y las moléculas del solvente. El resultado es que disminuye la retención de todas las moléculas del soluto cuando se aumenta el % del solvente orgánico. Esto se ilustra en la fig.

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5 cuando la fase móvil tiene 60% de ACN comparada con (a) que tiene un 40%. Por otra parte un aumento de la temperatura debilita las interacciones entre las moléculas del soluto y la fase móvil y la estacionaria. En consecuencia disminuye la retención (c y a). Finalmente la disminución de la hidrofobicidad debilita las interacciones entre el soluto y la columna y disminuye la retención (d y a). Ionización y retención en HPLC en fase reversa (RP HPLC) Se analizará la dependencia del valor de k de un analito ionizable vs. el pH de la fase móvil. Para compuestos básicos se tendrá el gráfico de la figura 6:

La dependencia de k de un componente básico con respecto al pH de la fase móvil puede subdividirse en tres regiones: A-Analito totalmente protonado (forma catiónica), da lugar a baja retención. El analito está en su forma hidrofílica. No existe interacción con la fase estacionaria hidrofóbica. Pero presenta algunas ventajas: picos agudos y tiempo de análisis corto. B-Protonación parcial. El analito coexiste en sus dos formas: protonada y no protonada en la fase móvil en equilibrio, causando formas pobres de picos. El 50% del analito protonado origina picos anchos y asimétricos, el valor de pH en el punto de inflexión no corresponde al pK del analito en solución acuosa. Cada 10% de solvente orgánico incrementa el pH de la fase móvil en 0.3 unidades. Ya que el analito en su forma neutra tiene mucha mayor retención, sus moléculas tienden a permanecer mayor tiempo en la fase estacionaria. Esto causa un desplazamiento del equilibrio de ionización en la fase estacionaria hacia la formación de moléculas desprotonadas incrementando el tiempo de retención. En general, pequeños cambios del pH de la fase móvil provoca grandes cambios en los tiempos de retención. C-El analito está en su forma neutra (hidrofóbica) y muestra mayores tiempos de retención. Los picos son generalmente simétricos

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La figura 6a muestra el perfil de la curva cuando se trata de un analito ácido. Cuando se trabaja con analitos ácidos, por ej. una mezcla de ácido benzoico y ácido sórbico (Fig. 6) presentes en productos alimenticios proteicos, a pH 2 o 3 (Fig. 6c) hay una tendencia de la muestra a precipitar debido a la disminución de la solubilidad de los ácidos orgánicos en agua requiriendo altas concentraciones de solventes orgánicos para una separación práctica en las condiciones de RP HPLC. Para analitos ácidos, el tiempo de retención disminuye a medida que aumenta el pH. A pH superiores al pKa del analito, el analito porta una carga negativa y se comporta como una molécula extremadamente polar. A pH inferiores a su pKa, el analito es neutro e hidrofóbico y el tiempo de análisis se alarga demasiado. Cuando el ácido se introduce en una fase móvil neutra, sin buffer (Fig. 6e), se obtienen picos anchos, mal resueltos como consecuencia de que están parcialmente ionizados en solución. Como se muestra en la Fig. 6d, la adición de un buffer fosfato a pH 7 elimina el ensanchamiento de banda y crea condiciones para una adecuada separación.

CONCLUSIÓN: Cuando en la muestra se hallan presentes compuestos ionizables, y el pH de la muestra difiere significativamente del pH de la fase móvil sin buffer, se obtienen picos anchos y mal resueltos. Análisis comparativo de las Figuras 6 y 6a

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Efectos en la región A 1. Los analitos básicos muestran poca retención (analito en su forma iónica). 2. Los analitos ácidos muestran tiempos de retención muy grandes (analito en su forma neutra)

Efectos en la región B 3. Tanto para analitos ácidos como básicos existe una pérdida significativa de la eficiencia. Los picos resultan anchos, con “tailing” o “fronting”. 4. Cambios menores en el pH o en la composición de la fase móvil varía significativamente los tiempos de retención. 5. Cambios menores en la composición de la fase móvil pueden causar cambios drásticos en la selectividad.

Efectos en la región C 6. Retenciones grandes para analitos básicos, lo que requiere trabajar con altas concentraciones de solventes orgánicos en donde el ajuste del pH es ineficiente. 7. La silica es soluble a pH básico. Si la columna aun contiene grupos silanoles accesibles, el pH básico produce degradación de la sílica que lleva a pérdida de eficiencia debido a la formación de volúmenes muertos. 8. Si la mezcla de analitos contiene compuestos ácidos, éstos están en su forma aniónica a pH alto. Estos aniones son altamente solvatados, no pueden penetrar en los poros y pueden ser completamente excluidos de la fase estacionaria, eluyendo tempranamente Los buffers elegidos deben poseer las siguientes características. 9. Capacidad amortiguadora en el rango de pH de 2 a 8. 10. Transparencia óptica. 11. Compatibilidad con eluyentes orgánicos. 12. Capacidad de mejorar las velocidades de equilibrios. 13. Potencial para enmascarar los grupos silanoles de la superficie del adsorbente. La Tabla 3 lista una serie de rangos de pH de algunas soluciones tampones.

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Con respecto a la preparación de la fase móvil, se deben tener en cuenta, como se explicó anteriormente, la filtración y desgasado de los solventes antes de ser empleados. MECANISMOS DE SEPARACION A partir del desarrollo de empaquetamientos de fase reversa químicamente ligados, los mecanismos de separación han sido objeto de continua controversia. Esto se debe, principalmente, a la diferencia de la base fisicoquímica de la separación en fases polares y no polares. En modo normal, el factor predominante de la retención se debe a la interacción entre el soluto y la fase estacionaria; sin embargo, en las de modo reverso, la selectividad se debe, principalmente, a los efectos producidos por el solvente. Las interacciones de solutos no polares con fase estacionaria no polares son débiles y no selectivas (fuerzas del tipo Van der Waals). Aunque la naturaleza de los grupos funcionales presentes en las moléculas controlan su selectividad, la separación de solutos muy semejantes está gobernada por fenómenos de solubilidad en la fase móvil. Las interacciones del soluto en cromatografía en fase reversa pueden deberse esencialmente a tres diferentes mecanismos. 1.

Partición entre la capa hidrocarbonada sobre la superficie de la fase estacionaria y la fase móvil. Este mecanismo se observa con fases poliméricas. 2. Partición entre la fase móvil y la fase estacionaria modificada. Esto ocurre cuando el modificador orgánico está adsorbido sobre sitios altamente activos del empaquetamiento. 3. Adsorción de los solutos sobre la superficie hidrocarbonada. No se puede aseverar estrictamente cuando el mecanismo es de adsorción o de partición. Varios autores consideran al mecanismo como una mezcla de adsorción y partición. Antes de comenzar con la discusión a cerca de cual es el posible mecanismo de interacción, se debe tener en claro la diferencia entre adsorción y partición. Adsorción se refiere a los procesos en los cuales las moléculas de solutos y de solventes compiten por sitios activos sobre la superficie del adsorbente. La región interfacial (superficie adsorbida – fase móvil) donde tiene lugar la interacción, puede ser una monocapa o multicapa. En la partición, la región interfacial es usualmente despreciada, y la interacción ocurre por

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partición del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria que recubre el soporte y que está íntimamente relacionada con la solubilidad. El principal problema en distinguir entre adsorción y partición se debe al conocimiento insuficiente de la topología exacta de la superficie de las fases ligadas. Se puede imaginar a la fase ligada aferrada a la superficie del soporte como un cepillo alquílico, donde cada cadena hidrocarbonada representa una cerda del cepillo. Esta fase reversa no tiene las propiedades típicas ni de un líquido capaz de particionar ni de un adsorbente químico. Teoría Solvofóbica: Es la teoría que se emplea para describir la selectividad en RP HPLC. De acuerdo a este modelo, las moléculas de soluto, total o parcialmente hidrofóbicas, son excluídas o rechazadas por el solvente polar hacia la fase líquida hidrocarbonada, con la cual forma un complejo reversible, el cual depende de las fuerzas dispersivas débiles no específicas, que lo generan.

La información sobre la energía asociada a las interacciones con la fase estacionaria se ve en la figura siguiente donde se grafica ln del k ‘vs. número de átomos de carbono del compuesto a cromatografiar. Se puede ver que los alquilbencenos presentan retenciones mucho más fuertes que las fenonas. La presencia del grupo carbonilo hace más polar a esta molécula comparada con el alquilbenceno y, por lo tanto, se reduce la fuerza de las interacciones con la superficie hidrofóbica. La retención de los alquilparabenos es la más pequeña de las tres series debido a que es el más polar de los compuestos analizados y, por lo tanto, no muestra ninguna interacción significativa con la fase estacionaria

Las tres series homólogas muestran dependencia lineal y son paralelas una a la otra. Esto significa que cada grupo metileno (-CH2-) introduce el mismo incremento energético en las interacciones de la molécula con la fase estacionaria.

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Efectos de los solventes en RP HPLC: Los dos parámetros más importantes de los solventes que influyen en el factor de capacidad son: la tensión superficial y la constante dieléctrica. Sin embargo, el efecto de la constante dieléctrica sobre solutos no polares es pequeña y puede ser despreciada. Para especies ionizadas, el efecto de la constante dieléctrica del medio es mayor debido a los equilibrios secundarios (supresión de la ionización). En fase reversa el solvente base empleado es el agua; la fuerza del eluyente se modifica con el empleo de modificadores orgánicos (solventes orgánicos), siendo metanol y acetonitrilo los más usados.

Variando la composición del eluyente se puede ajustar los tiempos de retención de los compuestos de la mezcla a valores adecuados, teniendo el cuidado de mantener el factor de capacidad entre 1 y 10. Las dependencias típicas de la retención con la composición del eluyente se muestran en la Fig. 7. Como se puede observar, la dependencia es no lineal debido a la adsorción de las moléculas del solvente. Las cantidades en exceso de acetonitrilo cercanos a los sitios activos de la fase estacionaria disminuyen las interacciones de los compuestos a purificar y, por lo tanto, su retención, lo que lleva a una línea cóncava en la figura. En general, cambiando la composición de la fase móvil cambia la retención de los compuestos en márgenes muy amplios: desde elución en el volumen muerto (junto con el solvente) hasta retención por horas. Al mismo tiempo, el cambio en la composición de la fase móvil no cambia la separación en el mismo orden que cambia la retención. La tabla muestra los datos numéricos de dos puntos del gráfico.

Disminuyendo la proporción de MeCN de 90 a 30% cambia 22 veces (de 1.7 a 37.5 mL) la retención del etilbenceno. Al mismo tiempo, la selectividad de la separación de etilbenceno y tolueno cambia sólo 1.6 veces y la resolución 7 veces. Se debe, entonces, balancear siempre

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la ganancia de selectividad y resolución con el incremento grande de tiempo que esas mejoras pueden significar Efectos de la superficie de la fase estacionaria La química de la superficie de la fase estacionaria es el factor más importante que afecta la retención en cromatografía en fase reversa. Si la superficie de la sílica está densamente cubierta por grupos ligados, presenta sólo interacciones dispersivas (hidrofóbicas) y muestra retenciones típicas de una fase reversa “pura”. Esto es particularmente cierto para compuestos polares o ionizables.

Se observa en la Fig. 8 que, al disminuir la proporción de acetonitrilo en la fase móvil disminuye la competencia del eluyente con el ácido dodecanoico por los sitios de adsorción y, por lo tanto, mayor la retención. El ácido dodecanico es un compuesto polar e ionizable y no muestra ninguna interacción específica (polar o iónica) con los grupos C-18. Todos los picos son simétricos, lo que indica que sólo tiene interacciones dispersivas con la columna El cromatograma de la Fig. 9 muestra el comportamiento del mismo ácido con una columna de fase reversa Hypersil-C1 (150 x 4.6 mm). La densidad de la fase ligada es mayor que en la C-18 de la Fig. 8 pero los ligandos son 18 veces más cortos. Sólo la mitad de los grupos –OH de la silica original han reaccionado con el trimetilclorosilano. La otra mitad permanece libre y es, por lo tanto accesible al ácido dodecanoico debido al pequeño tamaño de los grupos ligados

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Como se puede observar en la Fig. 9, con 100 % de MeCN el ácido no aparece hasta los 25 min. La retención disminuye con el incremento en la proporción de agua de la fase móvil. Este comportamiento es típico con la retención en fase normal. Por lo tanto, se puede decir que con muy bajo contenido en agua prevalecen las interacciones polares con la superficie de la fase estacionaria. La simetría del pico observada con un 5% de agua demostraría que esa proporción de agua sería suficiente para suprimir las interacciones polares del ácido dodecanoico con los silanoles residuales, disminuyendo, por consiguiente, el tiempo de retención. Elución por gradiente: En la fig. 10 vemos un problema general de elución. El problema ocurre cuando una muestra contiene una gran variedad de componentes, los cuales no pueden ser completamente eluídos por una única fase móvil débil, como se muestra en el primer caso o bien es incompletamente separada si se usa una fase móvil de fuerza muy elevada como en el segundo caso. Probando utilizar una mezcla de polaridad media, se pueden optimizar los picos centrales pero no los primeros ni los últimos.

Para una resolución óptima de todos los picos, se debe comenzar con un bajo porcentaje del solvente fuerte, con lo que se consigue la separación de los compuestos menos retenidos. Los compuestos menos polares se ubican en la cabeza de la columna, o se mueven muy lentamente. Cuando se incrementa gradualmente el porcentaje del solvente “fuerte” (por ejemplo, hexano en FN o acetonitrilo o MeOH en FR), los compuestos más retenidos se desplazan más y más rápidamente. Esto es lo que se conoce como elución por gradiente. Puede compararse con el gradiente de temperatura en CG. Resumiendo: El principal objetivo de una elución por gradiente es eluir los componentes fuertemente retenidos más rápidamente, pero resolviendo bien los compuestos menos retenidos. Antes de continuar con esta discusión debe enfatizarse un concepto importante. Es común referirse a solventes “débiles” y “fuertes” que pueden llevar a confusión, porque estos términos se definen sobre la base de la naturaleza de la fase estacionaria. A menudo, este tipo de elución no solo representa una mejora en la separación, sino que es indispensable cuando es necesario eluir todos los componentes de la columna. Como se ilustra en la Fig.11, en un análisis isocrático, el 4° componente, el ácido phidroxibenzoico, no eluye de la columna por lo menos hasta los 30 min. En cambio, si se

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emplea una elución con gradiente, comenzando con 100% de isooctano y agregándole continuamente cloroformo a una razón de 5% / min., el ácido p-hidroxibenzoico emergerá antes de los 18 min como un pico agudo hacia la columna.

Izquierda: isocrático Isooctano-cloroformo 1:9 Derecha: elución por gradiente comenzando con isooctano y agregando cloroformo a 5%/min. 1:4-metoxibenzaldehído; 2:3-etoxi-4-hidroxibenzaldehído; hidroxibenzaldehído; 4:ácido 4-hidroxibenzoico

3:3-metoxi-4-

Fig. 12. Mejora de la eficiencia de la separación mediante la elución con gradiente. Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1% Permaphase ODS. Muestra: 5 μL de bencenos clorados en isopropanol. Detector: fotómetro de UV (254 nm). Condiciones: temperatura 60ºC, presión 80 kg/cm2. (a) elución con gradiente: MeOH 40%/agua 60% e incremento de la proporción de MeOH a una velocidad de un 8%/min (b) Elución isocrática con MeOH 50%/agua 50%

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Si se grafica el porcentaje del componente A (solvente débil) en la mezcla binaria A + B vs. tiempo se obtiene una curva de gradiente que especifica el cambio en la composición de la fase móvil durante el análisis. La Fig. 13 muestra los tres tipos posibles:

Fig. 13.- El cambio en la composición de la fase móvil puede ser lineal (II) o seguir patrones no lineales (I y III) En general, se sigue un cambio lineal (II) cuando no existen problemas especiales de separación en una zona particular del cromatograma, pero la razón del gradiente de elución es facilitar la elución de los picos sucesivos. Los gradientes convexos (I) se siguen si algunos componentes están agrupados al final del cromatograma mientras que un gradiente cóncavo (III) facilita la separación de los primeros picos Se hace la corrida en un corto tiempo, por ejemplo, 10 min con la fase móvil elegida en la columna seleccionada, desde un 10% a un 100

Fases móviles ternarias: Todas las consideraciones previas sobre mezclado de fases móviles se referían a fases móviles binarias. Recientemente, varias investigaciones mostraron ejemplos de necesidades aparentes de control continuo de mezclado proporcional de tres eluyentes, esto es, el uso de fases móviles ternarias. Existen dos tipos principales de aplicaciones donde el uso de fases móviles ternarias resulta beneficiosa. La 1° aplicación está relacionada con muestras que poseen componentes con polaridades muy diferentes, donde los compuestos más fuertemente retenidos no puede ser eluído con ningún solvente que sea miscible con el solvente más débil, necesario para permitir la separación de los componentes de la muestra menos retenidos. En este caso, se inicia el programa de gradiente comenzando sólo con el solvente de menor fuerza como fase móvil, y se introduce lentamente un solvente de fuerza intermedia para eluir los compuestos moderadamente retenidos; luego, un tercer solvente fuerte es añadido al 2°. En la práctica, estos perfiles de fase móviles requieren programaciones relativamente complejas, especialmente si deben repetirse las condiciones analíticas. En la mayoría de los casos, pueden llevarse a cabo eluciones satisfactorias empleando sistemas binarios, si el

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solvente de mayor fuerza está compuesto por una mezcla de un solvente de fuerza intermedia y uno de mayor fuerza. La 2° aplicación está relacionada con casos en donde se emplean buffers, como en análisis donde se requieren control de pH, par iónico o supresión de la ionización. En tales casos, se usa un 3er componente para suplir una cantidad constante de buffer, independientemente de la variación de concentración de los dos solventes primarios. Estas técnicas también pueden aproximarse a sistemas binarios cuando se añade la misma cantidad de buffer a cada uno, siempre y cuando el buffer sea soluble en ambos. Si se consideran los efectos complejos del mezclado de dos solventes y el subsecuente reequilibrio, el empleo de un 3er solvente en el sistema representa un grado de dificultad extra. Mientras el uso de fases móviles ternarias puede lograr algunos efectos especiales, su propia optimización es una tarea compleja. También, su uso requiere una instrumentación bastante compleja. Scouting Una de las decisiones básicas que ser debe tomar en lo concerniente a la fase móvil, a la columna y al detector es elegir las condiciones óptimas para llegar a una separación completa de todos los componentes en el menor tiempo posible. Hay muchas maneras para ello. La metodología que veremos a continuación es, creemos, una de las más fáciles de llevar a cabo. Se hace la corrida en un corto tiempo, por ejemplo 10 min con la fase móvil y la columna que se hayan elegido, desde un 10% a un 100% del solvente menos polar de la mezcla con un gradiente lineal. Seguramente la línea de base en la primera corrida será irregular, por lo que se debe repetir hasta lograr una línea de base aceptable. Luego se repite el gradiente, pero ya inyectando la muestra. Esto permite ver rápidamente sí: 1. 2. 3.

Los compuestos de interés se detectan a un nivel adecuado si los mismos son retenidos si eluyen de la columna

Si las respuestas a estas preguntas son afirmativas, seguimos con la selección de la concentración de la fase móvil o el gradiente. En la Fig. 14 se muestran los cinco tipos generales de cromatogramas que se pueden obtener:

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Si los picos están estrechamente agrupados como en los cromatogramas A-C, la mejor separación se obtiene con condiciones isocráticas, por ej. usando una mezcla binaria de concentración constante durante toda la corrida. Debemos tener en cuenta que hay un lapso de tiempo de aproximadamente 3’ entre el momento que la bomba envía una concentración determinada y la concentración en la columna. El programa de gradiente indicado por la línea quebrada representa el perfil de concentración nominal y no la concentración actual en la columna en el tiempo correspondiente, por lo que se debe hacer la corrección. Para obtener la concentración actual uno tiene que calcular la concentración de la fase móvil cuando los picos emergen de la columna. Para los casos A - C, se selecciona el punto medio entre los dos picos. La concentración se calcula estableciendo el tiempo que ha pasado desde el comienzo del programa de gradiente y restando el tiempo de respuesta ( 3’). Por conveniencia, el gradiente lineal se expresa en % /min. Por ej. , si se ha programado que el cambio de 10 a 100% de acetonitrilo se haga en 10’, la velocidad del gradiente será:

Cromatograma A: El punto medio entre los dos picos da un valor en tiempo de 2.34’. Este es menor que el tiempo de respuesta, por lo tanto se podrá usar como fase móvil acetonitrilo – agua 1:9. Cromatograma B: El tiempo correspondiente a la media entre los dos picos es 4.7’. Restando los 3’ de respuesta tenemos 1.7’. En este tiempo, la concentración de acetonitrilo cambia de 10% a 10% + (1.7 x 9) % = 10 + 15.3% = 25.3% y, por lo tanto la fase móvil debe tener una composición de acetonitrilo – agua de 25.3 : 74.7. Cromatograma C: El tiempo correspondiente a la media entre los dos picos es 8.7’. Restando los 3’ de respuesta tenemos 5.7’. En este tiempo, la concentración de acetonitrilo cambia de 10% a 10% + (´5.7 x 9) % = 61.3% y, por lo tanto la fase móvil debe tener una composición de acetonitrilo – agua de 61.3: 38.7. Si el cromatograma es similar a los cromatogramas D y E, o sea, los picos eluyen en un amplio rango de concentración de fase móvil, debemos utilizar gradiente de elución para una óptima separación. Tenemos tres posibilidades: 4. 5.

Si los picos están regularmente distribuidos se recomienda un gradiente lineal. Si los picos están amontonados hacia el final del gradiente (como en D) debemos hacer un cambio rápido al comienzo y uno más lento hacia el final. Esto se logra con un perfil de gradiente convexo. 6. Si la mayoría de los picos aparecen al comienzo del cromatograma (caso E) se recomienda un perfil de gradiente cóncavo, o sea, un cambio lento en la primera parte, o bien, disminuir la fuerza del solvente inicial. Otra información importante es la forma de los picos. La aparición de picos con “tailing” puede ser el resultado de columnas en mal estado o de muestras ionizables. Si la columna está empacada mal o ha sido usada a altas presiones por tiempos prolongados, pueden haberse formado “volúmenes muertos” en donde el flujo de la fase móvil disminuye resultando en el ensanchamiento de las bandas. La otra razón del “tailing” podría ser la parcial ionización de la muestra si la misma está compuesta por compuestos ácidos o básicos. En estos casos se deben agregar buffers a la fase móvil. El agregado de buffer debe analizarse cuidadosamente con el fin de evitar exceder el límite de pH de la columna. Además debemos tener en cuenta que el

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agregado de algunos buffers pueden reducir la vida de la columna aún cuando se controle el pH. BIBLIOGRAFÍA 1- G A Howard and A P J Martin, Biochem J., 46,532 (1950) 2- L R Snyder, J K Kirkland and J W Dolan (2010) Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition. John Wiley & Sons

Dra. Susana Borkosky Dra. Nancy Vera

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