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Trabajo Práctico Nº 1: Microscopía ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES: - “X”: Las lentes aumentan la imagen de los objetos observados. La “X” indica la cantidad de veces que la lente aumenta el tamaño de la imagen obtenida. Ejemplo: un valor de 20X indica que la lente aumenta 20 veces el tamaño de la imagen en relación al tamaño real del objeto. - Unidades: Las unidades usadas habitualmente para medir objetos (metro, centímetro) no son útiles para medir células. Por lo tanto, se usan submúltiplos del metro como el micrómetro (µm), el nanómetro (nm) y el ángstrom (Å), que permiten asignar valores numéricos de pocas cifras a estructuras muy pequeñas. 1 µm = 1x10-3 mm 1 nm = 1x10-6 mm 1 Å = 1x10-7 mm - Poder de resolución (PR): Es la posibilidad de distinguir a dos objetos separados muy cercanos entre sí, por lo que representa la mínima distancia que debe haber entre dos objetos para que sean percibidos como objetos separados. Cuanto mayor sea el PR, menor será la distancia entre dos puntos a la cual pueden distinguirse como tales. El ojo humano tiene un PR aproximado de 100 µm, las células eucariotas miden entre 10-100 µm de diámetro (salvo excepciones) y las células procariotas entre 1-5 µm. - Aumento: Es la proporción entre el tamaño de la imagen obtenida al microscopio y el tamaño real del objeto. El aumento total (AT) es el producto del aumento del ocular por el objetivo. Ejemplo: si se observa una hifa de un hongo usando un objetivo de 40X y un ocular de 10X, la muestra se observará con un AT = 400 veces. Y si la hifa tiene un diámetro de 0,45 µm, el tamaño final observado es de 0,45 µm x 40 x 10 = 180 µm = 0,18 mm. - Campo observado: Es la porción del preparado incluida en la imagen. El tamaño del campo observado es inversamente proporcional al AT del microscopio y, por eso, las lentes de menor aumento son útiles para explorar al preparado. - Índice de refracción (n): El índice de refracción de un medio es el cociente entre la velocidad de la luz en el vacío (300.000 km/s) y la velocidad de la luz en ese medio. No tiene unidades y siempre es mayor o igual que 1. 4

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INTRODUCCIÓN:

Durante mucho tiempo las personas no imaginaron la existencia de las células porque el ojo humano es incapaz de percibir objetos menores a 0,1 mm y las células, en general, tienen un tamaño menor. Para poder observarlas se necesitan instrumentos adecuados: los microscopios. Las lentes, llamadas así por ser parecidas a las lentejas, se conocen desde la antigüedad. A principios del siglo XVII se iniciaron las primeras experiencias con ellas. Antes de esa fecha, se daba por sentado que los seres vivos más pequeños eran insectos diminutos, pero gracias al descubrimiento del microscopio, la Biología amplió sus conocimientos al permitir observar y descubrir estructuras hasta entonces invisibles al ojo humano. Los “microscopios” pueden ser simples o compuestos. Los microscopios simples están representados por la lupa simple y por la lupa binocular. La lupa simple está formada por una lente biconvexa o plano convexa. El objeto de observación se ubica entre el foco y la lente, obteniéndose una imagen virtual derecha y aumentada. El aumento máximo que se puede conseguir es de 20X y generalmente son lupas de uso manual. Las lupas binoculares están compuestas por un solo sistema de lentes convergentes montados sobre una estructura fija. El objeto se observa mediante la luz que se refleja en su superficie. Este tipo de microscopio es muy útil para observar objetos opacos que debido a su tamaño deben ser observados con poco aumento. El PR es cercano a 50 µm. El Microscopio Óptico Compuesto (MOC) es el más usado, utiliza luz visible y se pueden obtener imágenes aumentadas hasta 2.000 veces el tamaño real de los objetos. Desde 1660 hasta hoy, el MOC fue fundamental para conocer lo invisible y, aunque su PR y de magnificación aumentó con el tiempo, el factor que limitó su uso es la longitud de onda de la luz. Su PR es cercano a 0,8 µm. En 1930 apareció el Microscopio Electrónico (ME), cuya ventaja sobre el MOC fue un PR mayor (~ 1Å) lo que generó una mejor definición y magnificación de lo observado, pudiéndose observar ADN, virus y pequeñas organelas por primera vez. El esquema sirve para comparar el poder de resolución entre los diferentes microscopios:

lupa binocular ojo humano

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MICROSCOPIOS

1. Microscopio Estereoscópico de disección o Lupa Binocular: Puede aumentar el tamaño de un objeto entre 40-60 veces y permite una visión ampliada y en relieve de objetos opacos y transparentes que por ser pequeños, aunque visibles a simple vista, necesitan poco aumento. En biología se lo utiliza para ver en detalle a pequeños individuos y sus partes, como ser: artrópodos, algas, hongos, huevos de anfibios, etc. Este tipo de microscopio tiene 2 objetivos y 2 oculares y la imagen que se obtiene es virtual, tridimensional y derecha.

2. Microscopio Óptico Compuesto (MOC): Permite observar células y reconocer algunas de sus partes, pero para observar estructuras celulares menores y sus detalles se necesita mayor aumento y, sobre todo, mayor PR. La imagen que se obtiene es virtual, bidimensional e invertida. El MOC está formado por un sistema óptico destinado a iluminar y a magnificar el objeto examinado y un sistema mecánico para sostener al sistema óptico y al objeto que se va a examinar. Sistema Mecánico. También llamado estativo o montura está formado por: - Tubo: que sostiene a los oculares y objetivos y los mantiene separados por la distancia de trabajo correcta. - Revólver: que porta a los objetivos y permite colocarlos en la posición de trabajo alternativamente. - Brazo: que une el tubo con la platina. - Tornillo de cremallera, de avance rápido o macrométrico: que mueve la platina verticalmente acercando de modo rápido el objeto al objetivo. - Tornillo de ajuste fino o micrométrico: que permite enfocar con precisión al mover a la platina muy lentamente. - Platina: que sostiene el preparado a observar, el que se coloca sobre una perforación que hay en el centro de la platina y que deja pasar la luz que se proyecta de la lámpara de iluminación. - Pinzas: que sostienen al preparado con firmeza sobre la platina. - Base o pie: que sirve de soporte al microscopio y por su peso da estabilidad al aparato.

Sistema Óptico. Está formado por 2 lentes (objetivo y ocular) y por el aparato de iluminación que facilita la observación.

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El objetivo formado por un sistema de lentes convergentes de distintos aumentos, aumenta la imagen del objeto proyectándola sobre el ocular. Hay 2 tipos de objetivos que se diferencian por su composición o por el modo de utilización. Los objetivos a seco, en donde hay aire entre la lente y el preparado, siendo los más usados los de 4, 10, 20, 40 y 45X. Los objetivos de inmersión deben presentar entre la lente y el preparado un medio transparente con un índice de refracción superior al del aire (n = 1) y parecido al del vidrio (n = 1,5). Los más usados son los de 100X.

-

El ocular que recibe la imagen reflejada por el objetivo, aumenta aún más la imagen del objeto y la proyecta sobre el ojo del observador. Está compuesto por 2 lentes: la inferior o colectora y la superior o lente ocular.

-

El aparato de iluminación está ubicado debajo de la platina y está compuesto por: - El condensador que concentra los rayos luminosos sobre el preparado. - El diafragma que regula la cantidad de luz que va a pasar a través del preparado. Está ubicado inmediatamente por debajo del condensador.

3.Microscopio Electrónico (ME): Con el ME se logra mayor PR porque usa un haz de electrones para iluminar la muestra, obteniéndose imágenes hasta 500.000 veces más grandes. Por eso, las imágenes formadas no pueden ser captadas por el ojo humano y deben ser proyectadas en una pantalla. Hay dos tipos de microscopios electrónicos: El Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) y el Microscopio Electrónico de Transmisión (MET), que son similares en cuanto a la fuente de energía, el tubo y el sistema de lentes. En el MEB el haz de electrones recorre la superficie del espécimen escaneándola y al reflejarse proyecta en la pantalla de televisión las irregularidades de la superficie dando una imagen tridimensional del objeto. En el MET el haz de electrones se proyecta a través de una fina capa de material atravesándola y produciendo una imagen bidimensional sobre una pantalla fluorescente, por lo que el brillo de la imagen es proporcional al número de electrones que son trasmitidos a través del material.

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NORMAS BÁSICAS PARA EL CUIDADO Y MANEJO DEL “MOC”:

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Para transportar el microscopio se recomienda utilizar siempre las dos manos, sujetándolo por el brazo con una mano y sosteniéndolo del pie con la otra.

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Se debe transportar en posición vertical para evitar la caída del ocular.

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No enchufar el microscopio directamente en la línea trifásica, la lámpara se conecta a través de un transformador adaptado a la red de tensión de 220 V.

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Antes de iniciar la observación, compruebe que los oculares, objetivos y preparados estén limpios. En caso de ser necesarios usar papel “tissue” para limpiarlos.

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Ningún líquido debe mojar al microscopio. Las preparaciones que se colocan deben estar siempre secas.

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Seleccionar al inicio de la observación el objetivo de menor aumento y cambiar de forma gradual los objetivos.

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Los tornillos macro y micrométrico y el revólver deben moverse siempre con cuidado y sin apresuramientos para evitar rayar o romper las lentes.

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Finalizada la observación, volver a ubicar el objetivo de menor aumento y retirar el preparado de la platina.

-

Al finalizar las observaciones, el microscopio debe quedar: o En su lugar definitivo sobre la mesada cubierto con su funda, dentro de su caja o dentro del armario. o Con las luces apagadas. o Con el objetivo de menor aumento en posición. o Con el condensador al tope superior. o Con la platina alta. o Con el diafragma abierto. o Con los objetivos limpios.

OBJETIVOS: -

Conocer las partes que integran la Lupa Binocular y el MOC.

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Conocer las normas básicas para su cuidado y manejo.

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Interpretar las imágenes que se obtienen usando ambos instrumentos ópticos.

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Observar diferentes células para comparar tamaños relativos y escalas.

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MATERIALES: Biológicos:

De laboratorio:

Insectos

Tijeras, pinzas y agujas de disección

Preparado N1: Bacterias

Cajas de Petri

Preparado N2: células epiteliales humanas (en clase)

Porta y cubreobjetos Papel de diario Pipetas Pasteur y pinzas Azul de metileno Alcohol 70% Aceite de inmersión Lupa binocular y MOC

ACTIVIDADES: 1.

Lupa Binocular: a.

Observe la lupa dispuesta sobre la mesada, reconozca los distintos elementos que la componen y rotule el siguiente esquema:

1- brazo; 2- pie; 3- tornillo de enfoque; 4- anillo de aumento; 5- oculares; 6- objetivo; 7- platina.

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b.

Coloque un insecto en la caja de Petri, observe e identifique sus partes con distintos aumentos. Dibuje SIEMPRE la misma parte observada (una antena, una pata o un ala) sin olvidar de rotular y de indicar el aumento utilizado en cada caso.

c.

Aumento mínimo

Aumento medio

Aumento máximo

______________

_____________

_______________

Mientras examina al insecto muévalo hacia todas las direcciones con cuidado. ¿Hacia qué dirección se mueve la imagen en cada caso?

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d.

Responda: ¿Cuáles son la finalidad del objetivo y del ocular?

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2.

Microscopio Óptico Compuesto:

a.

Observe el MOC dispuesto sobre la mesada, reconozca los distintos elementos que lo componen y rotule el siguiente esquema:

1

8 9 2 101

3 1 4

11

5 12

6

13

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b.

Observación al microscopio y técnica de enfoque:

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Recorte un trozo de diario de alrededor de 3 mm que incluya la letra a, g, e, m o t.

-

Coloque el trozo de papel en el centro de un portaobjetos con el lado impreso hacia arriba.

-

Coloque 1 o 2 gotas de agua sobre el papel.

-

Cubra con el cubreobjetos.

-

Coloque el preparado sobre la platina del microscopio.

-

Mueva el preparado hasta que la letra elegida quede centrada en la abertura de la platina.

-

Busque el objetivo de menor aumento y póngalo sobre el tope del revólver, el objetivo hará ruido al colocarlo en la posición correcta.

-

Abra el diafragma en su totalidad y levante el condensador al máximo.

-

Ascienda la platina lentamente, usando el tornillo macrométrico, hasta que el objetivo quede cerca del preparado, mirando siempre por el ocular hasta que aparezca la imagen más o menos clara.

-

Ajuste la imagen con el tornillo micrométrico rotándolo suavemente hacia delante y hacia atrás hasta hacer foco.

-

Si todavía no pudo ver imagen alguna, es porque se ha pasado de la posición correcta de foco.

-

Vuelva a enfocar desde el principio. 11

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-

Una vez enfocado el preparado, compare la posición de la imagen en el ocular con respecto a su posición real. ¿La letra está invertida o en la misma posición en que estaría si la observara a simple vista? --------------------------------------------------------Esquematice y rotule.

-

Mirando por el ocular, mueva lentamente el portaobjetos hacia la derecha e izquierda usando los tornillos de desplazamiento de la platina. ¿Para qué lado se mueve la imagen?

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Mirando por el ocular, aleje el portaobjetos de usted moviéndolo hacia delante y hacia atrás usando los tornillos de desplazamiento de la platina. ¿Para qué lado se mueve la imagen?

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c. -

Aumento: Ahora gire el revólver para cambiar al próximo objetivo, enfoque usando solo el tornillo micrométrico. ¿El campo de observación es mayor o menor que con el objetivo anterior? ¿Por qué?

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Grabado en cada objetivo y ocular hay un número que indica el grado de aumento de cada uno. El aumento total (AT) es igual al producto del aumento del objetivo por el del ocular. Encuentre los números de aumento sobre el ocular y los objetivos y calcule el AT para cada combinación.

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3.

Células: a.

Observe el preparado de Bacterias usando el MOC pasando desde el objetivo de menor aumento (4-10X) hasta el objetivo de mayor aumento (100X). Esquematice lo que observa.

b.

Para las células epiteliales humanas: limpie con alcohol el portaobjetos, con la espátula o cuchara raspe la pared interna de la mejilla y extienda el material recogido en el portaobjetos. Coloque una gota de agua y una de azul de metileno. Aplique el cubreobjetos. Observe al microscopio y dibuje las estructuras que observa.

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Compare ambos preparados. ¿Qué diferencias observa entre ambos preparados? --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

4.

Observe el preparado de insecto usando el MOC, indique el aumento utilizado y dibuje las estructuras que observa.

5.

Microscopios: Complete la siguiente tabla:

Característica

Ser Humano

Lupa binocular

MOC

MET

MEB

PR

AT

Tipo de imagen

Estructuras observables

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6.

Indique con qué tipo de microscopio puede observar las siguientes estructuras:

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BIBLIOGRAFÍA:

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Biología. GTP. Ingeniería en Alimentos. Universidad Nacional de Luján.

-

Curtis H. y S. N. Barnes. 2008. Biología. 7º Edición. Editorial Panamericana. Buenos Aires.

-

Curtis H. y S. N. Barnes. 2001. Biología. 6º Edición. Editorial Panamericana. Buenos Aires.

-

Introducción a la Biología. GTP. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura. Universidad Nacional del Nordeste.

-

Introducción a la Biología. GTP. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura. Universidad Nacional de Mar del Plata.

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