TRABAJOS PRÁCTICOS 2-3 (2009) DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD Los trabajos prácticos se realizarán en grupos de 3 o 4 personas de acuerdo al número de alumnos de la comisión. Se disponen 4 mesadas en las cuales hay organizados 16 kits en total para realizar la determinación de proteínas por Bradford. Cada grupo procesa las dos Muestras incógnitas (A y B). Cada kit consiste en: - Gradilla con 7 tubos para pipetear la curva de calibración y las muestras incógnitas (A y B). - Cinco pipetas: - de 1 o 2 ml : - una para el Agua - una para el Testigo - una para la Muestra A - una para la Muestra B - de 5 o 10 ml para el reactivo de Bradford. Cada dos grupos (enfrentados en mesada) hay: - Tres tubos de ensayo conteniendo: - Testigo (para pipetear la curva) - Muestra incógnita A - Muestra incógnita B - Un frasco color caramelo con el reactivo de Bradford. - Dos frascos con Agua. PROTOCOLO Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los tubos. Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de concentración conocida. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una curva de calibración (gráfico A595 vs mg de proteína). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las muestras. La concentración de la muestra testigo es 250 mgr/ml. Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la muestra, se determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibración. Cada grupo procesa Muestras A y B. Protocolo: Tubo
Pipetear en el orden de la tabla: - Primero el AGUA con la pipeta rotulada H2O. - El TESTIGO con otra pipeta rotulada T, respetando el orden de los tubos: 1, 2, 3 y 4. - Luego con otra pipeta rotulada A o B (según corresponda) la MUESTRA INCÓGNITA en su tubo correspondiente. -Por último, el reactivo de Bradford con la pipeta rotulada R. Mezclar el contenido de los tubos. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Observar el color de la curva de calibración y comparar con el color de la muestra incógnita con la curva. De esta manera estimar los valores de proteínas de la muestra incógnita. Luego leer en el fotocolorímetro tanto la curva y como la muestra incógnita Completar la tabla con los valores de absorbancia y realizar el gráfico A595 vs mg de proteína. Interpolar en el gráfico el valor de absorbancia de las muestras incógnita en dicha curva y determinar mg de proteína de las muestras y en luego determinar su concentración en g/100 ml. Analizar si existe concordancia con el valor estimado visualmente. Al finalizar el trabajo práctico es IMPORTANTE que todo el material quede limpio y en su lugar. Se enjuagarán las pipetas con agua. Para limpiar los tubos de Bradford los alumnos contarán con una pizeta con etanol. Primero se descartará el contenido de los tubos en las piletas. Luego se enjuagarán los tubos con un poco de etanol y por último con abundante agua.
DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Glu-oxidasa Glucosa + O2 + H2O
ácido glucónico + H2O2
H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato
peroxidasa
quinonimina roja
PROTOCOLO TUBO 1(blanco) 2 3 4
H 2O (ml) 1 0.8 0.6 0.4
TG (ml) 0.2 0.4 0.6
MUESTRA (ml) -
REACTIVO (ml) 1 1 1 1
5 Muestra (A o B)
-
1
1
1 1
A) B) C) D)
Mezclar el contenido de los tubos sin formar espuma Incubar 15 min a temperatura ambiente Ajustar con el BLANCO el cero del fotocolorímetro a 500nm Leer las A 500nm de los tubos de la CURVA DE CALIBRACION o de los tubos de las MUESTRAS INCÓGNITAS (A o B). E) Realizar la curva de calibración (gráfico A vs [glucosa]). La concentración del testigo es de 250 mg%. Calcular la concentración de glucosa de cada uno de los puntos F) Interpolar el valor obtenido de la A500nm de las muestras incógnita en dicho gráfico y determinar el valor de glucemia de las muestras. Analizar el resultado del valor de la muestra, utilizando la curva.
ELISA (Chagatest de Wiener lab) Fundamento: 1- La muestra se coloca en el soporte (cubeta o pocillo) en el que se encuentra inmovilizado el antígeno (antígenos citoplasmáticos y de membrana de T. cruzi). Si la muestra contiene el anticuerpo específico se formará un complejo antígeno-anticuerpo que quedará unido a la cubeta. Luego de la incubación la fracción no unida se elimina por lavado. 2- Se agrega el segundo anticuerpo (conjugado), que es un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana conjugado con la enzima peroxidasa. Si la muestra contenía anticuerpos específicos que formaron complejo con el antígeno y quedaron adheridos a la cubeta, entonces el anticuerpo conjugado se unirá a los anticuerpos. Luego de la incubación, el exceso de conjugado se elimina por lavado. 3- Se agrega el sustrato enzimático. Si se unió el conjugado, entonces la peroxidasa producirá la reacción enzimática dando un color celeste. Los sustratos son el Revelador A (peróxido de hidrógeno) y el Revelador B (tetrametibencidina). La reacción se detiene con el stopper (ácido sulfúrico) con lo que el color celeste vira a amarillo. Protocolo: 1. Por grupo se utilizan dos pocillos para procesar: una Muestra 1 (paciente A) una Muestra 2 (paciente B) Rotular los pocillos con Número de GRUPO y Número de Muestra. Mantener cubiertos con cinta los pocillos sin usar y solo descubrir los que se vayan a usar en esa determinación. Si el pocillo está rotulado, significa que ya ha sido usado. 2. Con el frasco gotero agregar 2 gotas de MUESTRA 1 en uno de los pocillos previamente rotulado como (1). 3. Con el frasco gotero agregar 2 gotas de MUESTRA 2 en uno de los pocillos previamente rotulado como (2). 4. Cubrir con cinta los pocillos para evitar la evaporación e incubar durante 30 minutos a 37°C en baño termostático. Fijarse que los pocillos estén en contacto con el agua, pero que no se hundan por completo. Se pueden colocar sobre una placa de Petri plástica que flota en el líquido del baño.
5. Descartar el líquido de los pocillos en el recipiente de descarte. Lavar con BUFFER DE LAVADO. Para ello, colocar un poco de este buffer en cada pocillo y después descartar con firmeza el líquido en el recipiente. Repetir este lavado 4 veces más (5 lavados en total). Después del último lavado, eliminar por completo el líquido residual invirtiendo los pocillos y golpeándolos varias veces sobre papel absorbente. 6. Luego, agregar 1 gota de CONJUGADO en cada pocillo. 7. Mezclar con golpes laterales suaves. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a 37°C en baño termostático. 8. Descartar el líquido de los pocillos y lavar 5 veces con BUFFER DE LAVADO, como se realizó anteriormente. 9. Agregar en cada pocillo 1 gota de REVELADOR A y 1 gota de REVELADOR B. Mezclar con golpes laterales suaves. Puede llevarse a 37°C y es perar hasta el desarrollo de color celeste en la Muestra 1 (de 15 a 30 min). 10. Detener la reacción con 1 gota de STOPPER. El color celeste vira a amarillo. Evaluar a simple vista los resultados. El color es estable durante 30 minutos. CASOS CLÍNICOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS EN EL TRABAJO PRÁCTICO PACIENTE A1
El señor O.G. de 35 años nacido en la provincia de Chaco concurre al servicio de Clínica Médica a fin de realizarse un examen de rutina y serología para Chagas por un estudio catastral que están realizando en la fábrica donde trabaja. Antecedentes personales: fumador de 30 cigarrillos diarios desde hace 15 años. Peso: 95 kg, talla: 1, 67 m. Sin antecedentes familiares de importancia. Al interrogatorio refiere conocer la vinchuca y provenir de un área rural del norte de la provincia. En la consulta se le detecta TA: 160/95. Examen de laboratorio Sangre
Valores Normales
Glucemia: ______ Proteinemia total: _____ Colesterol total: 260 mg% Col HDL: 30 Col LDL: 200 TAG: 180 mg % Bilirrubina total : 1 mg% Bilirrubina Directa 0.15 mg % GOAT: normal GPT: normal Creatininemia: 1mg % Uremia: 25 mg% Uricemia: 6.5 mg %