UNIVERSIDAD DE COLIMA

DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLOGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGIA

EFECTO DE LA MELATONINA EXOGENA SOBRE EL ESTADO ENERGETICO HEPATICO EN ISQUEMIA/REPERFUSION. POSIBLE ROL DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA Y EL OXIDO NITRICO.

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLOGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGIA.

PRESENTA M. En C. SERGIO RODRIGUEZ REYNOSO DIRECTOR DE TESIS: DR. J DE JESUS MUÑIZ MURGUIA. Doctor en Ciencias Fisiológicas

COLIMA, COL. MAYO DEL 2001

INDICE

ABSTRACT

1

RESUMEN

2

I. ANTECEDENTES CIENTIFICOS

3

1. SINDROME DE ISQUEMIA /REPERFUSION

3

a). Introducción.

3

b). Fisiopatología de la Lesión por Isquemia.

4

c). Fisiopatología de la Lesión por Reperfusión.

10

2. FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA

12

a). Generalidades.

12

b). TNF -α en el Síndrome Isquemia/Reperfusión.

12

3. OXIDO NITRICO

15

a). Generalidades.

15

b). Oxido Nítrico en el Síndrome Isquemia/Reperfusión.

15

4. OXIDO NITRICO SINTASA TIPO II O INDUCIBLE.

17

a). Generalidades.

17

5. METABOLISMO OXIDATIVO Y RADICALES LIBRES.

18

6.GLANDULA PINEAL Y MELATONINA.

21

a). Generalidades.

21

b). La Melatonina como depurador de radicales libres y antioxidante.

21

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

27

III. JUSTIFICACION

28

IV. OBJETIVOS

29

1. GENERAL 2. PARTICULARES

V. HIPOTESIS

31

VI. MATERIAL Y METODOS

32

1. TIPO DE ESTUDIO.

32

2. UNIVERSO DE TRABAJO Y DISTRIBUCION EN GRUPOS.

32

3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL Y TECNICA QUIRURGICA.

34

a).- Características del sujeto de estudio.

34

b).- Preparación de los animales.

34

c).- Técnica quirúrgica.

34

4. VARIABLES

35

a).- Independiente.

35

b).- Dependientes.

35

c).- Definición, obtención y medición de las variables.

36

5. CRITERIOS

44

a).- Inclusión. b).- No Inclusión. c).- Exclusión. 6. ANALISIS ESTADISTICO.

45

VII. RESULTADOS

46

VIII. DISCUSION

60

IX. CONCLUSIONES

67

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

68

XI. ANEXOS

INDICE DE FIGURAS Y TABLAS. FIGURAS. Figura 1. Comportamiento metabólico del ATP durante isquemia/reperfusión y la generación del radical superóxido. 9

Figura 2. Mecanismo fisiopatológico de la lesión por isquemia/reperfusión. 11

Figura 3. El TNF-α y su mediación en la producción y liberación de otras citocinas durante isquemia/reperfusión. 13

Figura 4. Lesión celular por TNF -α durante isquemia/reperfusión y la mediación de radicales libres de oxígeno. 14

Figura 5. Producción de NO a tr avés de la vía inducida. 14

Figura 6. Estructura química de la melatonina. 21

Figura 7. Mecanismo depurador de la melatonina sobre el radical hidroxilo. 23

Figura8. Curva estándar de NaNO2. 41

Figura 9. Comportamiento de la proporción de cuerpos cetónicos en sangre arterial (AKBR) durante isquemia/reperfusión. 47

Figura 10. Comportamiento de las concentraciones de nitritos plasmáticos durante isquemia/reperfusión. 50

Figura 11. Correlación de los niveles plasmáticos de nitri tos y el AKBR. 51

Figura

12.

Expresión

de

la

oxido

nítrico

sintasa

inducible

durante

isquemia/reperfusión. 52

Figura 13. Análisis densitométrico del RNAm de la iNOS. 53

Figura 14. Comportamiento de los niveles plasmáticos de TNF -α durante isquemia/reperfusión. 54

Figura 15. Comportamiento de los productos de lipoperoxidación durante la reperfusión. 58 Figura 16. Sobrevida a 7 días. 59

TABLAS. Tabla 1. Cambios en las concentraciones de cuerpos cetónicos en sangre arterial durante isquemia/reperfusión. 49

Tabla 2. Pruebas de funcionalidad hepática durante isquemia/reperfusión. 57

ABSTRACT

The effect of exogenous melatonin on the hepatic energy status was evaluated during ischemia/reperfusion in a total liver ischemia model in the rat.

During I/R, a rise in plasmatic concentrations of tumor necrosis factor-α and nitric oxide, as well as a semicuantitative rise in the expression of iNOS mRNA were observed, which correlated with a functional and energetic derangement during

reperfusion,

parameters

that

were

significantly

ameliorated

by

exogenous melatonin, showing lower levels of the TNF-α and NO and by inhibition of iNOS’ genic expression.

It is concluded that exogenous melatonin is capable to maintain and preserve the energetic status during ischemia/reperfusion which is associated with reduced TNF -α and NO concentrations and by inhibition of iNOS’ genic expression. Further research is needed to determine the influence of the Redox mitochondrial status on thes e responses.

RESUMEN.

Se evaluó el efecto de la melatonina exógena sobre el estado energético hepático durante isquemia/reperfusión en un modelo de isquemia hepática total en rata. Se observó durante el fenómeno I/R un incremento en las concentraciones plasmáticas del factor de necrosis tumoral-α, del óxido nítrico y un ascenso semicuantitativo en la expresión de RNAm de la iNOS que correlacionó con un decremento tanto funcional como energético durante la reperfusión, parámetros que mejoraron de manera significativa con la administración de melat onina exógena, mostrando una disminución en los niveles de TNF - α, NO y la inhibición de la expresión génica de la iNOS.

Se concluye que la melatonina exógena es capaz de mantener y preservar el estado energético durante isquemia/reperfusión, asociado a la disminución en las concentraciones de TNF- α, NO y la inhibición de la expresión génica de la iNOS. Serán necesarias múltiples investigaciones para determinar la influencia del estado Redox mitocondrial en estas respuestas.

ANTECEDENTES CIENTIFICOS

SINDROME ISQUEMIA /REPERFUSION. INTRODUCCION. Uno de los más graves problemas en el campo de la cirugía vascular, la procuración y el transplante de hígado, es la lesión por isquemia/reperfusión, causante de daño funcional y estructural a las células.

La necesidad más urgente de los tejidos que experimentan el fenómeno isquémico es la rápida restauración del flujo sanguíneo normal, pero la reperfusión aunque necesaria, contribuye paradójicamente a la lesión del tejido.

La respuesta a la isquemia en cada órgano es diferente, también cada órgano y cada condición isquémica muestran diferentes grados de tolerancia. Además de las características distintivas de las células que conforman un órgano, el recubrimiento endotelial pre y postcapilar juega un papel relevante en la fisiopatología del síndrome isquemia/reperfusión. En las últimas dos décadas se han investigado ampliamente los fenómenos involucrados en el daño celular por isquemia/reperfusión. Se han establecido diferentes mecanismos para explicar la lesión tisular que ocurre durante el fenómeno. La hipoxia, la acidosis y las alteraciones energéticas son considerados los eventos más importantes implicados en la lesión durante el periodo isquémico y la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el reclutamiento de neutrófilos activados, en la lesión por reperfusión.

En términos generales, la lesión hepática por isquemia/reperfusión se debe principalmente a: (1) Pérdida de la viabilidad endotelial (Cadwell, 1989), (2)

Activación de las células de Kupffer (Jaeschke, 1991), (3) Adhesión de leucocitos y plaquetas a la pared sinusoidal (Takei, 1991; Cywes, 1993), (4) Activación del complemento (Tomasdottir, 1993) y (5) Coagulopatía sinusoidal (Arai, 1996).

FISIOPATOLOGIA DE LA LESION POR ISQUEMIA.

Cuando se interrumpe el suministro de sangre a un tejido, la isquemia lleva a hipoxia y se inicia una serie de eventos relacionados primariamente con la activación de plaquetas y liberación de sus mediadores vasoconstrictores: Tromboxano A2 (TxA2) y 5-hidroxitriptamina (5-HT) que restringen fuertemente el flujo sanguíneo al área de isquemia, además una serie de eventos químicos que llevan a disfunción, edema celular e intersticial y finalmente caos celular y muerte (Grace, 1994; Lefer, 1993).

Energía Celular.

Dentro de esta gran variedad de eventos que llevan a la muerte celular en anoxia, la disminución del trifosfato de adenosina (ATP) juega un papel central (Ozawa, 1992; Grace, 1994), ya que el sostén de los mecanismos de la vida dentro de la célula implica un balance entre las reacciones de producción y las reacciones de consumo energético (Yamada, 1977; Ozawa, 1992).

Muchos de los mecanismos biológicos de las células utilizan ATP como fuente de energía. La fuente más prolífica y eficiente del ATP es la producción aeróbica a través del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) seguido por la fosforilación oxidativa. El oxígeno que es requerido para estos dos procesos es suministrado al tejido por la hemoglobina que es transportada a través del cuerpo por las células rojas. Cuando el fenómeno isquémico limita esta distribución, las células recurren a un metabolismo anaeróbico, un proceso que es incapaz de mantener un adecuado nivel de ATP, lo que resulta en la formación de ácido láctico (Chien, 1997).

Acidosis Intracelular.

La isquemia provoca acidosis intracelular debido a la glucólisis anaeróbica y la acumulación de lactato. Se ha considerado que la acidosis tisular puede ser causa de daño a las células, ya que induce inestabilidad lisosomal, activación de enzimas lisosomales y provoca alteración de algunas propiedades mitocondriales. Aunque existe evidencia contradictoria que sugiere que un pH de 7.1-7.2 puede brindar protección contra la pérdida de la viabilidad celular durante el estado de anoxia por la inhibición de la fosfolipasa A y algunas proteasas, cuyo pH funcional óptimo es neutro o ligeramente alcalino, lo que se ha denominado, “El efecto paradójico del pH en la lesión por reperfusión” (Currin, 1991; Lemasters, 1995).

Edema Celular.

Una de las consecuencias de la reducción en la producción de ATP es la pérdida del gradiente iónico de las membranas celulares (bomba Na+-K+) y en el retículo sarcoplásmico (bomba Ca2+), los cuales requieren ATP para mantener bajas las concentraciones intracelulares de sodio y calcio y adecuadas las de potasio. Con la alteración de la membrana celular, los iones de sodio son movilizados al interior de la célula, llevando un volumen de agua para mantener el equilibrio osmótico entre el espacio intersticial y el espacio intracelular, provocando edema celular, choque osmótico, picnosis nuclear, edema lisosomal, dilatación y vesiculación del retículo endoplásmico y pérdida de la organización compartamental intracelular (Grace, 1994; Harris, 1997; Chien, 1997). El edema celular induce lesión a través de dos mecanismos: (1) Alteración en la geometría celular normal que distorsiona la relación espacial entre las enzimas de membrana y sus substratos en muchas vías metabólicas; y (2)

Compresión y edema capilar y edema endotelial, con incremento directo de la resistencia vascular, con disfunción en la microcirculación (Chien 1997).

Complejo Calcio-Calmodulina.

La entrada masiva de calcio al citosol provocado por la disfunción de la membrana celular, afecta de manera adversa numerosos sistemas enzimáticos celulares. La activación del complejo calcio-calmodulina causa disfunción de la membrana mitocondrial por daño en los fosfolípidos de esta estructura. Con la activación de la fosfolipasa A por el complejo calcio-calmodulina, se produce la fusión de la membrana interna y la membrana externa de la mitocondria, fractura de la membrana, daño en el citoesqueleto y efectos adversos en la respiración mitocondrial (Toledo-Pereyra, 1997) (Figura 1).

Tanto el edema celular como las alteraciones en el calcio provocan disfunción de la membrana mitocondrial que en condiciones de anoxia, causan alteraciones severas en la fosforilación oxidativa y baja producción de ATP, se incrementa la glucólisis anaeróbica en un intento de mantener las funciones celulares normales, el pH baja como resultado de la acumulación de iones de hidrógeno con la hidrólisis del ATP y la glucólisis, ocurre una rápida degradación del glucógeno, se acumula NADH y el TCA deja de funcionar como resultado de insuficiente NAD+, llevando a la falla de la capacidad homeostática celular. Este proceso representa un circulo vicioso que lleva a la destrucción celular de manera progresiva (Chien, 1997).

Sistemas Enzimáticos.

Se ha demostrado que la isquemia produce alteraciones conformacionales en la

estructura

terciaria

de

algunas

enzimas

glucolíticas

(glucocinasa,

fosfofructocinasa, fosfogliceraldehído deshidrogenasa, piruvato carboxilasa y

piruvato

deshidrogenasa),

provocando

su

inactivación.

Los

procesos

glucolíticos y gluconeogénicos en el hígado se inhiben y aparecen aberraciones en los niveles de glucosa en sangre (Toledo-Pereyra, 1997; Ozawa, 1992).

La glucólisis también puede ser bloqueada por la acción de productos intermediarios del metabolismo de los ácidos grasos que se acumulan como consecuencia del fenómeno isquémico. Por ejemplo, se ha demostrado que el citrato inhibe la fosfofructocinasa, una enzima primaria de la vía glucolítica y la acumulación de acetil CoA inhibe la piruvato deshidrogenasa, enzima responsable de la degradación final del piruvato en el TCA. Durante la isquemia, la fosforilación es suprimida debido a la incapacidad del difosfato de adenosina (ADP) para penetrar la membrana interna mitocondrial por la inactivación de la enzima difosfato de adenosina traslocasa. Otro importante sistema enzimático descativado es el de la Na+ -K+ ATPasa, que es importante en el mantenimiento de la integridad de la membrana, lo cual resulta en una redistribución masiva de los electrolitos en los espacios intra y extracelular, provocando edema celular y la pérdida de potasio (ToledoPereyra, 1997).

Nucleótidos de adenosina y generación de radicales libres.

En los últimos 10-15 años, se ha establecido la importancia de las especies reactivas de oxígeno (ROS) dent ro del fenómeno isquemia/reperfusión. El exceso en la producción de los ROS durante la reperfusión tiene su origen en la degradación del ATP celular durante la isquemia: Como consecuencia del cese de la fosforilación oxidativa, la utilización de ATP, que es el principal componente energético almacenado en el hígado, no es compensada por la refosforilación debido a la incapacidad del ADP para penetrar la membrana interna de la mitocondria por inhibición de la difosfato de adenosina traslocasa. El ADP es degradado a otros nucleótidos de adenosina fosforilados, como el monofosfato de adenosina (AMP), el cual es degradado a una serie de

compuestos no fosforilados: adenosina, inosina, hipoxantina, xantina y urato y disminuye la reserva total de nucleótidos (Harvey, 1988; Kamiike, 1982; Pontegnie 1977).

Durante la reperfusión del tejido isquémico, las células son reoxigenadas, y la hipoxantina formada durante la isquemia, reacciona con el oxígeno mediante la acción catalítica de la xantina oxidasa para convertirla a xantina, produciendo el radical superóxido en el proceso. El superóxido puede posteriormente originar la formación de radicales, tales como, el peroxinitrito, radical hidroxilo y el ácido hipocloroso. Los ROS pueden ocasionar daño directo a los tejidos en que son producidos y pueden ser también responsables de la interacción netrófilo-célula endotelial, con el subsecuente daño tisular (Harris, 1997) (Figura 1).

En términos generales, la isquemia normotérmica prolongada causa lesión irreversible y necrosis del hígado, evento que se caracteriza por la disminución de los niveles de ATP y nucleótidos totales, así como el retardo en la recuperación del ATP celular después de la reperfusión (Pontegnie, 1977). Se ha establecido como tiempo crítico de isquemia 4 h a 4ºC y de 1 h a 37ºC.

ISQUEMI

(-)

Na-K ATPasa

ATP

MITOCONDRIA (-) Adenosina Traslocasa

ADP

Ca ATPasa

AMP

.

OH

ADENOSINA

Fosfolipasa A

XANTINA DESHIDROGENASA

Fe+3 INOSINA

Complejo Ca-Calmodulina XANTIN OXIDASA

URATO + O 2- + H 2O 2

HIPOXANTINA

O2

Calmodulina

REPERFUSI

MEMBRANA CELULAR Ca++

Figura 1. Formación de radicales libres por la degradación del ATP después de isquemia y reperfusión y el posible papel del complejo calcio -calmodulina sobre la respiración y fosforilación mitocondrial durante la isquemia.

FISIOPATOLOGIA DE LA LESION POR REPERFUSION.

El restablecimiento del flujo sanguíneo al tejido isquémico, tiene dos consecuencias benéficas: el suministro de energía es restaurado y los metabolitos tóxicos son removidos. Esto es, la reperfusión es un prerequisito para la recuperación de la lesión isquémica, pero paradójicamente, el retorno de los metabolitos tóxicos a la circulación sistémica puede tener serias complicaciones metabólicas y se inicia una reacción que lesiona de manera grave y muy importante el tejido (Grace, 1994). En gran parte, la recuperación del daño isquémico durante la reperfusión depende de la capacidad celular

para la síntesis de ATP y la ausencia de recuperación se atribuye a disfunción y daño de la mitocondria (Pontegnie, 1977; Marubayashi, 1980; Kamiike, 1982; Hamamoto 1993).

La reperfusión lleva a reoxigenación y la liberación y activación de una variedad de mediadores de lesión e inflamación, incluyendo radicales libres derivados de oxígeno (radicales superóxido, radicales hidroxilo y peróxido de hidrógeno), los cuales reaccionan con las células endoteliales para promover la liberación de mediadores inflamatorios tales como el fac tor activador de plaquetas (PAF) o leucotrieno B4 (LTB4) (Grace, 1994); Inducen la expresión y activación de glicoproteínas de adhesión endotelial - moléculas de adhesión intercelular (ICAM 1 y 2) y moléculas de adhesión leucocitaria endotelial (ELAM) (Lefer, 1993). Estos radicales libres, en combinación con la activación de células de Kupffer estimulan la producción y liberación de algunas citocinas de reacción inflamatoria aguda, tales como el factor de necrosis tumoral- α (TNF-α) e interleucina-1(IL-1) (Shito, 1997). El óxido nítrico (NO) en conjunto con factores quimiotácticos (PAF, LTB4, C5a) y las citocinas TNF-α e IL-1, promueven el reclutamiento de polimorfonucleares (PMN) al sitio de reperfusión y adherencia al endotelio disfuncional. Esta adherencia es facilitada por las moléculas adhesivas ICAM-1 e ELAM-1 y promueven la diapedesis del PMN a través del mismo (Lefer, 1993).

SINDROME ISQUEMIA/REPERFUSION

ISQUEMIA

REPERFUSION

HIPOXIA

REOXIGENACION

ACTIVACION DE PLAQUETAS TX A2 5HT

ALTERACION DEL METABOLISMO

RECLUTAMIENTO P.M.N. TNF-a ICAM-1

DISFUNCION ENDOTELIAL PAF NO

TROMBOSIS + VASOCONSTRICCION

BAJA ENERGETICA

ADHERENCIA ENDOTELIAL DE P.M.N. LTB4

ADHERENCIA ENDOTELIAL DE P.M.N. OTROS FACTORES

DAÑO DIRECTO

DAÑO DIRECTO

DIAPEDESIS DE P.M.N. ELASTASA O2 H2O2

DIAPEDESIS DE P.M.N. CITOCINAS PAF

AUMENTO DEL DAÑO POR REPERFUSION

AUMENTO DEL DAÑO POR REPERFUSION

Figura 2. Esquema de los mecanismos fisiopatológicos de la lesión tisular por isquemia/reperfusión incluyendo isquemia solame nte y la vía de lesión por reperfusión. TxA2=Tromboxano; 5- HT=5 Hidroxitriptamina; PAF= Factor activador de plaquetas; LTB4= Leucotrieno B4; TNF-α=Factor de Necrosis Tumoral; ICAM-1= Molécula de adhesión intercelular-1; NO= Oxido Nítrico.

Dentro este fenómeno multifactorial, hasta este momento hemos establecido la dependencia de la viabilidad celular con el comportamiento energético durante la isquemia y la reperfusión. Conocemos que de la severidad del proceso isquémico dependerá la baja en la producción de ATP y el incremento en su degradación y sus consecuencias en la viabilidad celular, y que de la severidad en la degradación del ATP dependerá la generación de radicales libres de oxígeno durante la reperfusión. Estos radicales provocan la activación de macrófagos hepáticos y la producción de algunas citocinas, las cuales tienen efectos adversos sobre la recuperación energética durante la reperfusión, en este punto, cabe señalar la presencia de dos elementos, que por la relación existente en sus vías de síntesis y la similitud de los efectos producidos sobre el estado energético hepático tienen un papel preponderante en la mediación de la lesión por isquemia/reperfusión: El factor de necrosis tumoral -α y el óxido nítrico FACTOR DE NECROSIS TUMORAL -α α (TNF-α α ).

Generalidades Fue descrito originalmente como el agente responsable de la necrosis hemorrágica del sarcoma murino después de la administración de endotoxina (Carswell, 1975). Desde entonces, se le han atribuido múltiples alteraciones metabólicas en células malignas y no malignas. Dependiendo de la concentración de esta citocina, las respuestas sistémicas, de los tejidos y las células son extremadamente variables. A dosis bajas, El TNF-α actúa manteniendo e incrementando la reparación tisular y la microbiostasis. A altas concentraciones, el TNF -α lleva a necrosis tumoral, pero eventualmente también al daño del tejido normal. Finalmente, a muy altas concentraciones, causa choque letal similar al obs ervado en choque endotóxico (Stadler, 1992). El TNF-α reduce la perfusión tisular, cuyo mecanismo parece estar relacionado con la inducción de una enzima, la óxido nítrico sintasa (NOS). El TNF-α es capaz de reducir la presión sanguínea por relajación de la musculatura lisa vascular, actuando directamente o por estimulación de la producción de vasodilatadores, como el NO o la Prostaciclina y causa trombosis intravascular debido a la combinación de alteraciones endoteliales y de los fagocitos mononucleares, que promueven la coagulación y activación de neutrófilos que bloquean la vasculatura (Abbas, 1991).

TNF-α α en el Síndrome Isquemia/Reperfusión. Durante la isquemia hepática se produce degradación del ATP a productos no fosforilados y durante la reperfusión culmina con la generación de radicales libres de oxígeno, que aunado a la proliferación y traslocación bacteriana con un incremento en los niveles de endotoxinas en circulación portal intestinal ocasionado por el fenómeno de estasis vascular portal (Deitch, 1989), provoca activación de los macrófagos residentes en el hígado (células de Kupffer), lo cuales, participan en el desarrollo de la lesión por isquemia/reperfusión a través

de la producción de más ROS, producción y liberación de citocinas tales como la IL-1 y el TNF -α (Colletti, 1990; Jaeschke, 1991; Suzuki, 1994a)

La producción y liberación del TNF-α es uno de los eventos iniciales en la respuesta inflamatoria y lesión hepática-pulmonar por I/R (Shito, 1997; Suzuki, 1994a; Colletti, 1990a), capaz de desencadenar una cascada de liberación de citocinas que co-participan en la lesión de los hepatocitos (Diehl, 2000) (Figura 3) y actuando como estimulante continuo para la infiltración de PMN, así como su inducción para la generación de peróxido de hidrógeno y anión superóxido u otros metabolitos tóxicos, lo que aumenta la susceptibilidad de las células endoteliales vasculares al ataque mediado por PMN. (Suzuki 1994; García – Criado, 1997).

IL-1 IL-6 IL-12 IFN -γ

Hipoxia ROS’ LPS

Muerte celular

Inflamación

Figura 3. La hipoxia tisular, los radicales libres (ROS) y el Lipopolisacárido bacteriano (LPS) estimulan los macrófagos hepáticos, para la liberación de TNF-α, que induce la producción y liberación de otras citocinas que pueden causar lesión hepática.

Stadler et al. (1992) establecieron in vitro, que el tratamiento con TNF -α suprime la respiración mitocondrial de una manera concentración-dependiente, resultando en una reducción de la actividad del complejo I de la cadena respiratoria, al parecer asociado con la generación de intermediarios reactivos de oxígeno por el hepatocito (Figura 4).

Isquemia/Reperfusión

TNF- α

ROS

MUERTE

Lipoperoxidación

Figura 4. El TNF-α puede interactuar con uno de sus receptores en el hepatocito y promover la muerte celular mediado por la generación de radicales libres (ROS).

Como parte importante en la mediación del daño por isquemia/reperfusión, encontramos la relación que guarda con la expresión de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), enzima prooxidativa que se caracteriza por la producción de grandes cantidades de óxido nítrico (Nussler, 1993) (Figura 5).

Células Sanguíneas Célula Endotelial NOS constitutiva L-Arginina NO

NO

Célula Endotelial

iNOS

IL-1 TNF-α α

NO

Figura 5. En los vasos sanguíneos sanos, el NO es producido en la célula endotelial por la NOS constitutiva. Con la lesión del endotelio, hay reclutamiento y activación de varias células sanguíneas. Esta respuesta inflamatoria esta asociada con la liberación de citocinas, tales como la IL -1 y el TNF-α que estimulan la síntesis de la NOS inducible en la pared del vaso lesionado (Busse 1995).

OXIDO NITRICO (NO)

Generalidades

El Oxido Nítrico (NO), nombrada recientemente "La Molécula del Año", ha sido relacionado con numerosos fenómenos de comunicación intracelular en varias áreas tales como las neurociencias, fisiología e inmunología (Culotta, 1992).

El NO es un gas simple, con vida media biológica de 10-20 segundos, que posee un electrón desapareado (paramagnético; radical libre), lo que lo hace rápidamente reactante con otras moléculas y por ser lipofílico pasa fácilmente a través de las membranas para reaccionar con proteínas blanco dentro de la célula (Ignarro, 1990; Langrehr, 1993). Palmer et al. (1987) e Ignarro et al (1987) demostraron experimentalmente que la liberación del óxido nítrico por la célula endotelial producía la actividad biológica previamente acreditada al Factor Relajante Derivado del Endotelio (EDRF), que era producido por L-arginina y cuyos productos estables finales son los nitritos y nitratos.

Para la biosíntesis del NO son necesarios dos sistemas enzimáticos: la óxido nítrico sintasa constitutiva (cNOS), que requiere calcio y calmodulina para la expresión de su actividad y genera pequeñas cantidades de óxido nítrico y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) cuya expresión depende de la activación de varios tipos de células por citocinas y/o lipopolisacárido y se caracteriza por la producción de grandes cantidades de óxido nítrico (Nussler, 1993).

Oxido Nítrico en el Síndrome Isquemia/Reperfusión.

El papel del NO dentro del fenómeno isquemia/reperfusión es muy importante (Lefer, 1993; Kobayashi, 1995; Wang, 1995; Saito, 1996; Oishi, 1997; Ferrareso, 1997) pero controvertido. La célula endotelial continuamente produce una pequeña cantidad de NO, la cual se ve incrementada durante el episodio de isquemia por la producción estimulada a través de dos mecanismos, uno dependiente y otro independiente de receptores.

Durante la isquemia, el consumo celular de ATP lleva a la acumulación de

adenosina (Peralta, 1997), la cual es considerada en combinación con la 5hidroxitriptamina, como los agonistas fisiológicamente más importantes para estimular el mecanismo dependiente de receptores (Li, 1995; Busse, 1995). Estos componentes activan receptores específicos de la superficie de la célula endotelial, lo que lleva a un rápido incremento en la concentración intracelular de Ca2+ libre, conformación y activación del complejo calcio-calmodulina, que aunado a la activación de mecanismos independientes de receptor por la hipoxia, incrementan la producción de NO, el cual tiene un papel fisiológico bien establecido como vasodilatador y regulador del tono vascular, importante para mantener el suministro de sangre oxigenada a la célula durante el estado de hipoxia (Busse, 1995).

El NO tiene la capacidad de modular la interacción de los leucocitos y las células endoteliales (Osborn, 1990; Kubes, 1991; Gauhier, 1994; Lopez Neblina, 1995a), inhibir la agregación plaquetaria (Radomski, 1987; Furlong, 1987) y prevenir el rodamiento y la adhesión leucocitaria en isquemia mesentérica en rata, así como, tener un efecto benéfico sobre el riñón isquémico (Lopez-Neblina, 1995). Aunque estas funciones son consideradas como citoprotectoras, muchos otros autores aceptan la noción de que el óxido nítrico es tóxico y reportan efectos deletéreos, los cuales incluyen: inhibición de la síntesis de DNA; precipitación de la pérdida del hierro intracelular con la inhibición de ciertas enzimas hierro-sulfúricas, la aconitasa y complejo I y II del sistema transportador de electrones en la mitocondria (Hibbs, 1988; Stadler, 1991), y lesión celular durante la reperfusión con base en su reactividad con agentes radicales libres (Saran, 1990; Hogg 1992; Stamler, 1992; Padmaja 1993), ya que las altas concentraciones son tóxicas e interactúan con el superóxido (O2.-) para formar el peroxinitrito (ONOO), potente agente oxidante capaz de provocar lipoperoxidación (Beckman, 1990; Yang 1992). OXIDO NITRICO SINTASA TIPO II O INDUCIBLE (iNOS).

Generalidades

La síntesis de NO en las células de mamíferos a partir de la L-arginina es a través de las óxido nítrico sintasas (NOS).

La clasificación original de las NOS en NOS tipo I, II y III fue basada en sus características físicas y bioquímicas, regulación de su expresión (NOS constitutiva o NOS inducible), regulación por el calcio libre (NOS Ca2+ dependiente y NOS Ca2+ independiente) y sitio primario de producción (NOS cerebral, macrófagos y endotelial). La NOS tipo I se expresa en cerebro y nervios periféricos, mientras que la tipo III lo hace en células endoteliales. La expresión de ambas es similar ya que se consideran constitutivas y calciocalmodulina dependiente, aunque se derivan de dos genes diferentes (Schmidt, 1995) La NOS tipo II o inducible, es una enzima predominantemente del citosol que puede ser expresada por muchos tipos de células, incluidos los macrófagos, músculo liso, fibroblastos y hepatocitos después de su exposición a varios mediadores inflamatorios, tales como, las citocinas IL-1 y TNF -α.

La activación de muchos tipos celulares por una simple citocina es suficiente para causar la expresión de la iNOS, pero la combinación de dos o más estímulos produce un incremento en su expresión. Tales hallazgos sugieren que la presencia de diferentes citocinas en el sitio de la lesión vascular, puede resultar en la generación local de NO en cantidades suficientes para producir efectos biológicos en las células.

La enzima es considerada pro-oxidativa ya que una vez expresada alcanza su máxima actividad, generando grandes cantidades de NO, el cual, interactúa con el superóxido (O2. -) para formar peroxinitrito (ONOO). Otros de los efectos adversos relacionados con la expresión activada de la óxido nítrico sintasa inducida (iNOS), son: su efecto inhibidor del complejo I y II de la cadena respiratoria mitocondrial (Morris, 1993), su capacidad de reducir la síntesis de proteínas, prostaglandinas e Interleucina 6 (Billiard, 1989; Stadler, 1993), y de provocar alteraciones en el metabolismo del glucógeno y lipídico (McCallum, 1973; Sakaguchi, 1979).

Recientemente, Isobe et al. (1999) demostraron algunas alteraciones que

pueden contribuir a la lesión causada por el NO después de la inducción de iNOS, al establecer que la lesión hepática por isquemia/reperfusión es producida por la expresión centrilobular de la iNOS y puede ser atenuada al inhibir la misma.

En resumen, tanto el factor de necrosis tumoral-α como el óxido nítrico (NO) guardan relación en sus vías de síntesis y similitud en los efectos energétic os adversos sobre el hígado sometido a I/R y cuyo mecanismo parece estar asociado con la generación de intermediarios reactivos de oxígeno y nitrógeno por los macrófagos y los hepatocitos (Stadler, 1991, 1992).

METABOLISMO OXIDATIVO Y RADICALES LIBRES

Todos los organismos aeróbicos poseen un metabolismo basado en el oxígeno, necesario para la vida a pesar de que no todas sus acciones intracelulares tienen un resultado positivo. Aproximadamente el 1-2% del oxígeno inhalado por cualquier organismo acaba eventualmente transformado en un radical libre (especie química que existe de forma independiente con un electrón no pareado) debido a una escisión homolítica de enlace. Los radicales libres se caracterizan por ser muy reactivos y de vida media relativamente corta. Son capaces de dañar seriamente las biomoléculas ya que aceptan o donan electrones iniciando y propagando reacciones en cadena que transforman esas biomoléculas en compuestos oxidados muy reactivos. Los radicales libres causan lesión celular por inducción de lipoperoxidación, que resulta en daño estructural y funcional de la célula. La lipoperoxidación es un fenómeno complejo iniciado por la abstracción de un átomo de hidrógeno de un grupo metileno ubicado entre dos uniones no saturadas en una molécula de lípido. El resultado es la formación de un nuevo lípido radical libre con un carbono central, que en la presencia de oxígeno, produce peróxidos lipídicos o hidroperóxidos lipídicos. Otros componentes celulares que presentan riesgos de daño por los radicales libres, son las proteínas, ácidos nucleicos y especialmente aquellas que contienen moléculas con sulfuro y no saturadas (Grace, 1994).

El término “especies reactivas de oxígeno” (ROS) se emplea para incluir todos los radicales del oxígeno y a otros derivados que, aunque no contienen electrones desapareados, están implicados en la generación de radicales libres como son el peróxido de hidrógeno (H2O2), el singlete de oxígeno (1O2) o el ácido hipocloroso (HClO). De igual modo se habla de “especies reactivas de nitrógeno” (RNS), como son el óxido nítrico (NO) o los peroxinitritos (ONOO -).

Entre las ROS más dañinas cabe destacar el radical superóxido, que puede ser directamente tóxico e interactúar con otras moléculas para provocar lesión. El oxígeno molecular es reducido por un electrón, formando el radical superóxido, el cual actúa como oxidante cuando la molécula sometida al ataque es un buen donador de electrones. El superóxido reduce el F+3 a Fe+2, que en turno, reduce el peróxido de hidrógeno resultando en la formación del radical hidroxilo (.OH) (reacción de Haber-Weiss) (Beckman, 1990). O2- + Fe3+ Fe2+ + H2O 2

O2 + Fe2+ .

OH+ -OH + Fe3+

El radical hidroxilo es una de las ROS más dañinas, ya que es suficientemente tóxico para producir un serio daño al ADN. In situ, el .OH ataca el azúcar de las bases nitrogenadas, causando alteraciones en la secuencia de bases e incluso la rotura de las cadenas; lesiones que inician procesos mutagénicos y carcinogénicos (Meneghini, 1993).

El ADN mitocondrial es especialmente sensible a este ataque oxidativo debido a que cerca de él se produce una importante cantidad de radical superóxido (O2-.) procedente de la cadena de transporte electrónico (Shigenaga, 1994). De hecho, la mitocondria es el principal centro del metabolismo oxidativo celular. En ella se generan la mayoría de los radicales libres como consecuencia de la fijación del oxígeno que efectúa la cadena de transporte electrónico. A su vez, el hecho de que se produzcan radicales libres como consecuencia de la actividad de la cadena respiratoria hace que ella misma sea muy susceptible al daño de estos radicales. Además, surge la paradoja de que cuando la cadena

respiratoria se haya inhibida o a un nivel funcional bajo, la producción de O2-. es muy superior que cuando se encuentra activada. Los efectos citotóxicos de las RNS, especie generada por la óxido nítrico sintasa (NOS) son, en parte, debidos a los peroxinitritos (ONOO -), originados cuando éste reacciona con el O2-.. O 2-. +NO .

ONNO -+H+

ONOOH

HO.+NO 2

NO 3-

+H+ Los ONOO- son considerados hoy en día una especie más tóxica que el NO o el anión superóxido por sí solos. Los procesos citotóxicos desencadenados por los ONOO - incluyen el comienzo de la peroxidación lipídica, la inhibición de la respiración mitocondrial, la inhibición de las bombas de membrana, la disminución de glutation, el daño al ADN con la activación consecuente de la poli-(ADP ribosa)-sintetasa y la disminución concomitante de la energía celular (Crow, 1995).

La def ensa del organismo frente a estos radicales se basa en moléculas que los neutralizan, sofocan o depuran; son los llamados depuradores de radicales libres: Vitaminas C y E, β-caroteno y melatonina entre otros. También existen enzimas antioxidantes que trans forman los radicales en compuestos estables, como la catalasa, glutation peroxidasa (GPx), glutation reductasa (GRed) y superóxido dismutasa (SOD) (Sun, 1990).

MELATONINA.

Generalidades

La glándula pineal, considerada por Descartes como "el asiento del alma", ahora es conocida como la secretora de melatonina y se especula sobre su participación como un regulador de eventos sincronizados con el ciclo luz obscuridad.

La

pineal

secreta

una

hormona

llamada

melatonina

o

N-acetil- 5-

metroxitriptamina (Figura 6). La melatonina y las enzimas responsables de la síntesis de serotonina por N-acetilación y O-metilación están presentes en el tejido pineal de mamíferos y puede ser sintetizada por otras partes del cuerpo (Reiter, 1991, 1995a).

Figura 6. Estructura Química de la Melatonina

La melatonina como depurador de radicales libres y antioxidante. La melatonina es generalmente conocida por su capacidad para modular la función endócrina y circadiana (Reiter, 1980) y se han descrito efectos benéficos en el fenómeno isquemia-reperfusión, principalmente actuando como depurardor de radicales libres (Reiter, 1995,1996).

Es difícil establecer un mecanismo general de acción a nivel molecular que justifique la actividad de los antioxidantes tanto naturales como sintétic os. Sin embargo, podemos distinguir al menos tres tipos diferentes de mecanismos antioxidantes. El primero es la formación de una especie radical reactiva derivada del antioxidante (HA) al reaccionar éste con el radical (R), el carácter radical se transfie re al antioxidante, formándose el radical derivado del antioxidante. AH + R.

A. + RH

El segundo mecanismo implica la formación de una especie inerte o estable entre el radical y el antioxidante. El tercer mecanismo incluye a pequeñas moléculas que imitan las actividades enzimáticas de la SOD o la GPx. In vitro, la melatonina actúa como un depurador especialmente eficaz del .OH tóxico a través de la donación de un electrón (Tan, 1993; Reiter, 1996). El mecanismo por el cual la melatonina actúa como depurador de radicales libres no está claramente establecido. Se postula que el efecto esta mediado por la donación de un electrón, obteniendo como resultado el catión radical indólico. Cuando la melatonina detoxifica el OH, se transforma en un catión radical indólico de muy baja toxicidad. Este radical elimina un O2- y en el proceso se convierte en el metabolito no enzimático de la melatonina N1-acetil-N2 -formil-5metoxiquinuramina que es eliminado en la orina. Este hecho convierte a la melatonina en un depurador ideal dado que no sólo neutraliza el .OH sino que además el producto resultante es capaz de eliminar un radical superóxido (Figura 7).

.

MELATONINA

OH e-

.

OH

Fe 2+ H2O2

CATION RADICAL INDOLICO e-

SOD

.-

O2

O2.e1

2

N -acetil-N -formil5-metoxiquinuramina

O2.-

Figura 7. Mecanismo depurador de la melatonina sobre el radical Hidroxilo.

Ya que este radical O2- es el precursor de muchos de los radicales .OH generados in vivo, la melatonina tiene claramente una mayor influencia al reducir su producción. Por tanto posee un doble efecto respecto a cualquier depurador clásico de .OH. La capacidad antioxidante de la melatonina se extiende también a los radicales peroxilo (ROO), siendo dos veces más potente que la vitamina E en la inhibición de la peroxidación (Pieri, 1994). Aunque la eficacia de la melatonina como un depurador directo de este radical es aún discutible, existen pocas dudas sobre su gran efectividad como antioxidante lipídico (Reiter, 1995, 1995a; Melchiorri, 1996), una función que es llevada a cabo por la suma de las diversas acciones de la melatonina.

Además de su habilidad para eliminar los radicales .OH y peroxilo (ROO .), la melatonina también es capaz de proteger a las células de la toxicidad molecular desencadenada por el O2-. La interacción de la luz con productos fotosensibles genera este radical, una molécula responsable de algunos de los daños celulares asociados a la isquemia/reperfusión (Kukreja, 1993). Sin embargo, la melatonina no posee ninguna interacción directa conocida con el H2O2, agente oxidante débil generado en el proceso de reducción del oxígeno. A pesar del hecho de que la melatonina no es capaz de influir directamente sobre el H2O2, sí estimula la vía metabólica que lo convierte en una especie molecular no tóxica.

Se ha comprobado que la melatonina inhibe de forma dosis -dependiente la oxidación de la dihidrorodamina 123 por los ONOO-, y su potencia es comparable a dos depuradores eficaces típicos de estos radicales: el glutation y la cisteína (Gilad, 1997).

En general, en todos los sistemas in vitro en los que se ha realizado una comparación entre la melatonina y un depurador de radicales libres conocido,

la melatonina ha demostrado ser más efectiva y ha demostrado tener propiedades protectoras bajo una gran variedad de circunstancias, todas ellas involucran la presencia de radicales libres: reduce el daño en el DNA inducido por lipopolisacaridos (Swerynek, 1996), el daño en el DNA hepático de ratas expuestas al carcinógeno safrole in vivo (Tan, 1993a), protege contra el daño oxidativo

inducido

por

el

paraquat

(Melchiorri,

1995),

previene

la

lipoperoxidación inducida por el tetracloruro de carbono en el riñón (Daniels, 1995)

y

ha

demostrado

prevenir

la

lesión

oxidativa

inducida

por

lipopolisacaridos en ratas tratadas con fenobarbital (Sewerynek, 1995). Por todo esto es lógico pensar que la melatonina, como potente antioxidante y dada su elevada lipofilicidad que le permite el acceso con facilidad a la mitocondria, juega un papel muy importante como protector frente al daño oxidativo a nivel de este organelo, y más concretamente a nivel de la cadena de transporte electrónico.

En los estudios de Acuña-Castroviejo (no publicados), se comprueba que in vitro, la melatonina incrementa la actividad basal de los complejos oxidativos I y IV de la cadena respiratoria mitocondrial de forma concentración dependiente. Con el objeto de comprobar la interacción de la melatonina con la citocromo oxidasa (complejo IV), se observó que la melatonina recuperaba la actividad de esta enzima frente a la incubación con sal de cianuro (un potente inhibidor del complejo IV). Por otro lado, al medir los niveles mitocondriales de glutation y de actividad glutation peroxidasa, una de las enzimas de la maquinaria antioxidante, se encontró que, en presencia de dosis fisiológicas de melatonina, aumentaban los niveles de glutatión reducido, así como la actividad de la enzima. Un considerable cuerpo de evidencias se ha acumulado sugiriendo que la glándula pineal de los mamíferos puede influir sobre la función del sistema nervioso central y específicamente sobre la actividad de la cNOS la cual es inhibida por las concentraciones fisiológicas de melatonina (Pozo, 1994).

El óxido nítrico ha sido implicado como un mediador de citotoxicidad del

glutamato después de isquemia-reperfusión cerebral y la melatonina inhibe la producción de NO cerebral por supresión de la NOS cerebral y previene el incremento del GMP cíclico (Guerrero, 1995). De mucho interés resulta, que el ritmo del NO y del GMP cíclico correlacionan inversamente con el ritmo de la melatonina (Guerrero, 1996). Recientes estudios han demos trado que en hipotálamo (Bettahi, 1996) los niveles fisiológicos de melatonina reducen la actividad de la NOS. Así, la inhibición de la producción de NO puede constituir otro medio por el que la melatonina reduce el daño oxidativo bajo condiciones tales como la isquemia/reperfusión neuronal, donde el NO resulta ser importante en términos del daño resultante (Bredt, 1989). Así, muchas enzimas antioxidantes importantes parecen ser estimuladas por la melatonina; este hecho, en general, va a proteger a las células del daño oxidativo.

Debido a que la melatonina no es tóxica, rápidamente absorbida cuando se administra por cualquier medio, capaz de cruzar todas las barreras morfológicas y entrar en todos los compartimentos subcelulares, su utilidad como antioxidante parece ilimitada.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El síndrome isquemia/reperfusión es uno de los eventos fisiológicos y fisiopatológicos más fascinantes en el campo del transplante de hígado, falla hepática después de choque hemorrágico y en cirugía vascular hepática, el cual es causante de daño funcional y estructural a las células hepáticas. Representa un fenómeno complejo y cuyas consecuencias son destrucción tisular local y algunas veces la muerte. Dentro de la gran variedad de eventos que llevan a la muerte celular en anoxia y durante la reperfusión, la disminución del ATP, resultado del cese de la fosforilación oxidativa, juega un papel central. La melatonina ha demostrado tener propiedades protectoras bajo una gran variedad de circunstancias, todas ellas involucran la presencia de radicales libres, los cuales han demostrado ser altamente agresivos para la viabilidad celular a partir de la lesión de biomembranas por el fenómeno de la lipoperoxidación, inhibición de la respiración mitocondrial, reducció n de la actividad de bomba de membrana y falla en el estado energético celular. Por todo esto es lógico pensar que la melatonina, dada su elevada lipofilicidad que le permite el acceso con facilidad a la mitocondria, será capaz de ejercer su potente efecto antioxidante a nivel mitocondrial por una acción más específica a nivel de la maquinaria antioxidante mitocondrial y/o modular la producción de citocinas y moléculas de reacción inflamatoria aguda que han mostrado capacidad para interferir en el funcionam iento mitocondrial, manifestado con la preservación del estado energético, disminución de lipoperoxidacón de biomembranas y en la sobrevida de los animales sometidos a I/R hepática, estableciendo las posibles vías fisiológicas y metabólicas involucradas en el fenómeno. Se estableció el siguiente cuestionamiento en nuestro

proyecto:

¿La

melatonina

exógena

es

un

mediador

en

el

mantenimiento del estado energético hepático durante isquemia/reperfusión a través de la regulación de la producción de óxido nítrico y de la expresión del gen de la iNOS y este efecto mediador involucra el comportamiento del factor de necrosis tumoral -α que se considera uno de los elementos estimulantes de la vía inducida del óxido nítrico ?.

JUSTIFICACION

Uno de los más graves problemas en el campo del transplante de hígado, es la lesión por isquemia/reperfusión, que causa daño funcional y estructural a las células hepáticas. Se han hecho muchos esfuerzos para encontrar agentes que puedan prevenir la lesión hepática por isquemia/reperfusión, entre los cuales se pueden encontrar agentes que reponen a los citoprotectores de origen endotelial, tales como los análogos de la Prostaglandina I2 (PGI2); inhibidores de agentes pro-inflamatorios, tales como los antagonistas del factor activador de plaquetas (PAF) y agentes que inhiben neutrófilos o sus mediadores, tales como, agentes inmunodepresores como el FK506 y la ciclosporina A.

Se han descrito efectos benéficos de la melatonina en el fenómeno isquemia/reperfusión, principalmente actuando como depurador de radicales libres; consideramos de interés la búsqueda de mecanismos de acción, vías fisiológicas y aspectos moleculares posiblemente implicados en este efecto citoprotector desde el punto de vista energético, en lo cual están involucrados: el factor de necrosis tumoral-α, el óxido nítrico y el gen de la óxido nítrico sintasa inducible, entre otros. Para tal efecto establecimos los siguientes objetivos de estudio y la siguiente hipótesis de trabajo:

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL. 1. Determinar el efecto de la melatonina exógena sobre el estado energético hepático durante isquemia/reperfusión y el posible papel de TNF -α y NO.

OBJETIVOS PARTICULARES. 1.1. Determinar el comportamiento del estado energético durante la fase de isquemia y reperfusión con y sin melatonina exóge na. 1.2. Determinar los niveles de óxido nítrico (niveles plasmáticos de nitritos) y la expresión

de

la

iNOS

en

las

diferentes

etapas

del

fenómeno

isquemia/reperfusión. 1.3. Establecer el efecto de la melatonina exógena en los niveles de óxido nítrico (niveles plasmáticos de nitritos) y la expresión de la iNOS en las diferentes etapas del fenómeno isquemia/reperfusión. 1.4. Estudiar la posible correlación entre los niveles de NO y el estado energético hepático. 1.5. Determinar el comportamiento de las concentraciones plasmáticas del factor de necrosis tumoral-α en las diferentes etapas del fenómeno isquemia/reperfusión. 1.6. Establecer el efecto de la melatonina exógena sobre las concentraciones plasmáticas del factor de necrosis tumoral-α en las diferentes etapas del fenómeno isquemia/reperfusión. 1.7. Determinar la lipoperoxidación de biomembranas durante el fenómeno isquemia/reperfusión. 1.8. Establecer el efecto de la melatonina exógena en la lipoperoxidación de

biomembranas durante la reperfusión hepática.

1.9. Determinar las alteraciones en las pruebas de función hepática durante isquemia/reperfusión hepática.

1.10. Establecer el efecto de la melatonina exógena sobre las pruebas de función hepática durante isquemia/reperfusión.

1.11 Determinar la sobrevida de los animales sometidos a isquemia/reperfusión hepática.

1.12 Establecer el efecto de la melatonina exógena en la sobrevida de los animales sometidos a isquemia/reperfusión hepática.

HIPOTESIS

La melatonina exógena disminuye el daño por isquemia/reperfusión, mejorando el estado energético y funcional hepático, mediado por la regulación en la producción del factor de necrosis tumoral-α y óxido nítrico.

MATERIAL Y METODOS

El efecto de la melatonina exógena sobre el estado energético hepático fue evaluado con un modelo de isquemia/reperfusión hepática total en ratas. Es un estudio experimental que incluyó a 182 ratas macho de la cepa SpragueDawley (SD), las cuales fueron divididas en 2 grandes grupos: Grupo con solución salina (NS) o cont rol y grupo con melatonina (Mel) o experimental.

El fenómeno fue dividido en diferentes etapas para su estudio y para la observación del comportamiento de las variables en el tiempo: Etapa preisquémica, etapa de isquemia, fase inicial de reperfusión (60 minutos de reperfusión) y fase tardía de la reperfusión (120 minutos de reperfusión), quedando conformados 8 subgrupos. SUBGRUPO I Pre -isquemia NS: 18 ratas S.D. sometidas a cirugía simulada. Se administró 1 mL de solución salina IP 75 y 30 minutos antes de la toma de muestra. Seis ratas fueron utilizadas para la determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial, proporción de cuerpos cetónicos en sangre arterial (AKBR), nitritos y factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) en sangre, seis para la determinación de las pruebas de función hepática (PFH) y seis para la determinación de RNAm iNOS y productos de lipoperoxidación (LPO).

SUBGRUPO II Isquemia NS: 12 ratas SD sometidas a 60 minutos de isquemia hepática total. Se administró 1 mL de solución salina IP 75 y 30 minutos antes de iniciar la isquemia. Seis ratas fueron utilizadas para la determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial, AKBR, nitritos y TNF -α en sangre y seis para la determinación de PFH. SUBGRUPO III 60 minutos de Reperfusión NS: 18 ratas macho SD sometidas a 60 minutos de isquemia hepática total y 60 minutos de reperfusión. Se administró 1 mL de solución salina IP 75 y 30 minutos antes de iniciar la isquemia y justo antes de la reperfusión. Seis ratas fueron utilizadas para la

determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial, AKBR, nitritos y TNF-α en sangre, seis para la determinación de PFH y 6 para la determinación de RNAm iNOS y productos de lipoperoxidación (LPO).

SUBGRUPO IV 120 minutos de Reperfusión NS: 18 ratas macho SD sometidas a 60 minutos de isquemia hepática total y 120 minutos de reperfusión. Se administró 1 mL de solución salina IP 75 y 30 minutos antes de iniciar la isquemia, justo antes de la reperfusión y cada hora de reperfusión. Seis ratas fueron utilizadas para la determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial, AKBR, nitritos y TNF -α en sangre, seis para la determinación de PFH y seis para la determinación de RNAm iNOS.

GRUPO V pre-isquemia Mel: 18 ratas SD sometidas a cirugía simulada. Se administró 10 mg/kg de melatonina IP 30 y 75 minutos antes de la toma de la muestra. Seis ratas fueron utilizadas para la determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial, AKBR, nitritos y TNF-α en sangre, seis para la determinación de PFH y seis para la determinación de RNAm iNOS y productos de lipoperoxidación (LPO). Se evaluó el efecto de la melatonina sobre dichas variables en condiciones básales.

SUBGRUPO VI isquemia Mel: 12 ratas sometidas a 60 minutos de isquemia hepática total más la administración de 10 mg/kg de melatonina IP 75 y 30 minutos antes de iniciar la isquemia. Seis ratas fueron utilizadas para la determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial, AKBR, nitritos y TNF -α en sangre y seis para la determinación de PFH. SUBGRUPO VII 60 minut os de Reperfusión Mel: 18 ratas sometidas a 60 minutos de isquemia hepática total y 60 minutos de reperfusión más la administración de 10 mg/kg de melatonina IP 30 y 75 minutos antes de la isquemia y justo antes de la reperfusión. Seis fueron utilizadas para la determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial, AKBR, nitritos y TNF -α en sangre, seis para la determinación de PFH y seis para la determinación de RNAm iNOS y productos de lipoperoxidación (LPO).

SUBGRUPO VIII 120 minutos de Reperfusión Mel: 18 ratas sometidas a 60 minutos de isquemia hepática total y 120 minutos de reperfusión más la administración de 10 mg/kg de melatonina IP 30 y 75 minutos antes de la isquemia, justo antes de la reperfusión y cada hora de reperfusión. Seis ratas fueron ut ilizadas para la determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial, AKBR, nitritos y TNF -α en sangre, seis para la determinación de PFH y seis para la determinación de RNAm iNOS.

CARACTERISTICAS

Y

PREPARACION

DE

LOS

ANIMALES

EXPERIMENTALES. Se utiliz aron 182 ratas macho de la cepa Sprague-Dawley con un rango de peso de 250 a 300 g, criadas y manejadas en condiciones de bioterio, vigilando y respetando las normas internacionales con relación al uso de animales de laboratorio, con ciclos luz/obscuridad de 12/12 h y temperatura ambiente de 22ºC±1, las cuales fueron puestas en ayuno 12 h previo al acto quirúrgico, solo con agua ad libitum.

TECNICA QUIRURGICA.

CIRUGIA SIMULADA Fueron sometidas a la misma manipulación quirúrgica que los otros grupos, pero sin ser sometidas a isquemia caliente, sirviendo de grupo control para las determinaciones básales de cada una de las variables.

PROTOCOLO QUIRURGICO. Previa anestesia general con la administración de Droperidol 2.5 mg/kg y 80 mg/kg de ketamina vía intram uscular. Se practicó tricotomía amplia abdominal y cervical, antisepsia de la piel, apertura de cavidad peritoneal a través de la línea media, anticoagulación sistémica con heparina a dosis de 200 UI/kg vía intravenosa, se procedió a la disección de cada uno de las estructuras vasculares hepáticas (vena porta, arteria hepática) y del conducto biliar principal, se procedió a la realización de un “puenteo” porto-sistémico entre un

brazo cecal de la vena porta y la vena yugular izquierda para evitar estasis portal, para lo cuál se utilizó un tubo PE-90/C 15’’ (INTRAMEDIC, Polyethylene Catheter. Clay Adams. Parsippany, N.J. 07054)

La isquemia hepática total fue inducida ocluyendo la arteria hepática, la vena porta y el conducto biliar con un clip vascular. La recirculación hepática se restableció con la remoción del clip. El “puenteo” porto-yugular permaneció durante la fase de isquemia y fue removido al iniciar la reperfusión (Suzuki, 1991; Nishiyama, 1993), suturando la pared abdominal en dos planos con material absorbible. Durante todo el procedimiento se mantuvieron condiciones de temperatura con la colocación del animal sobre un colchón térmico.

VARIABLES

I. INDEPENDIENTE

1. Melatonina (Sigma Chemical Co. PO Box 14508 St Louis MO, USA). 10 mg/kg de peso IP 75 y 30 minutos antes de la isquemia, justo antes de la reperfusión y cada hora de reperfusión.

II. DEPENDIENTES 1 CUERPOS CETONICOS EN SANGRE ARTERIAL (AKB) a).- Acetoacetato (Ac -Ac). b).- ß-Hidroxibutirato (ß-OHB). c).-

Cuerpos

Cetónicos

totales

en

sangre

arterial

(Acetoacetato+ß-

sangre

arterial

Hidroxibutirato). d).-

Proporción

de

Cuerpos

Cetónicos

en

(AKBR=

Acetoacetato/ß-Hidroxibutirato). 2. DETERMINACION DE NIVELES PLASMATICOS DE NITRITOS

3. DETERMINACION DE ARNm DE LA OXIDO NITRICO SINTASA

INDUCIBLE (iNOS).

4. DETERMINACION DE LOS NIVELES PLASMATICOS DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL -α (TNF-α ).

5. DETERMINACION DE PRUEBAS DE FUNCION HEPATICA (P.F.H.): a).- Aspartato-aminotransferasa (AST). b).- Alanina-aminotransferasa (ALT). c).- Producción de Bilis. d).- Determinación de Glucosa en sangre.

6. DETERMINACION DE PRODUCTOS DE LIPOPEROXIDACION (LPO). a).- Malondialdehído (MDA) b).- 4-hidroxialquenos (4-HDA)

7. SOBREVIDA A 7 DIAS. DEFINICION Y MEDICION DE VARIABLES.

ESQUEMA DE MEDICACIÓN Y TOMA DE MUESTRA. Al grupo control se le administró 1 mL de solución salina vía intraperitoneal 75 y 30 min previos a la isquemia, justo antes de la reperfusión y cada hora durante la reperfusión. La obtención de la muestra se realizó en cada punto en el tiempo establecido. Al grupo experimental se le administró Melatonina (Sigma Chemical Co. PO Box 14508. St Louis MO, USA) a dosis de 10 mg/Kg intraperitoneal disuelto en 1mL de solución salina con una concentración de 1% de etanol (Sewerynek, 1996a), con el mismo esquema de aplicación. Determinación de Cuerpos Cetónicos en Sangre Arterial

El potencial REDOX (potencial de oxidación/reducción) de la mitocondria hepática es uno de los factores reguladores fundamentales del metabolismo hepático y puede ser evaluado midiendo la proporción de cuerpos cetónicos en sangre arterial (AKBR= Acetoacetato/ß-Hidroxibutirato). Esta proporción en el

hígado esta en equilibrio con la proporción entre la forma oxidada y forma reducida de dinucleótido adenin-nicotinamida libre (proporción NAD+/NADH libre) en la mitocondria. Cuando se asume que el acetoacetato y ßhidroxibutirato penetran libremente las membranas celulares, la proporción de acetoacetato/ß-Hidroxibutirato en sangre reflejan la proporción de NAD+/NADH libre mitocondrial.

Cambios en tal proporción establecen una descripción altamente sensible del estado energético intracelular del hígado, como es la carga energética hepática (ATP+1/2 ADP / ATP+ADP+AMP). (Tanaka, 1979; Taki, 1990; Asonuma, 1991; Yamaoka, 1993).

La proporción de cuerpos cetónicos en sangre arterial considerada normal es por arriba de 0.8 y valores inferiores son clasificados en 4 diferentes zonas que guardan relación con la severidad de la lesión hepática y asociación con falla orgánica múltiple (FOM): el estadio A o zona subnormal con un AKBR entre 0.7 y 0.8, el estadio B o zona de precaución entre 0.4 y 0.7, el estadio C o zona critica entre 0.25 y 0.4 y el estadio D o zona terminal cuando la proporción de cuerpos cetónicos se encuentra por debajo de 0.25 (Ozawa, 1992). ACETOACETATO.

Reactivos. 1. Fosfato de potasio dihidrogenado. 2. Fosfato dipotásico hidrogenado. 3. Acido Perclórico. 4. Hidróxido de Potasio. 5. Indicador Universal. 6. Acido Acetoacetico. 7. Nicotinamida-adenina dinucleótido (NADH). 8. 3-hidroxibutirato deshidrogenasa.

Principio.

3- HBDH

Acetoacetato +NADH + H+

D (-) hidroxibutirato + NAD

La disminución en la extinción a 340 nm debido a la oxidación de NADH es proporcional a la cantidad de Acetoacetato presente. β-HIDROXIBUTIRATO.

Reactivos. 1. TRIS-hidroximetil-aminometane. 2. Acido Perclórico. 3. Acido Hidroclórico. 4. Hidróxido de Potasio. 5. Indicador Universal. 6. Hidrato de Hidracina. 7. Etilenediaminetetra-ácido acetico. 8. Nicotinamida-adenina dinucleótido. (NAD). 9. Acido DL-3-Hidroxibutirico. 10. 3- Hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH).

Principio. 3- HBDH

D-(-)-3-Hidroxibutirato + NAD +

Acetoacetato + NADH + H+

El incremento en la extinción a 340 nm debido a la formación de NADH es una medida de la reacción. Protocolo.

Para la determinación de cuerpos cetónicos en sangre arterial se obtuvieron 4 mL de sangre a través de la arteria aorta. Los 4 mL de sangre arterial fueron adicionados con 4 mL de ácido perclórico al 6 % frío y mezclado inmediatamente. La suspensión fue centrifugada a 10,000 g durante 15 minutos entre 0 y 4ºC. El sobrenadante fue ajustado a pH de 6.0 y centrifugado nuevamente a 10,000 g durante 5 minutos entre 0 y 4ºC. El sobrenadante se utilizó para determinar la concentración de cuerpos cetónicos. El ß-

hidroxibutirato y acetoacetato fueron determinados por los métodos de Williamson y Mellanby (1974) y Mellanby y Williamson (1974), respectivamente (Tanaka, 1979).

Determinación de niveles plasmáticos de Nitritos.

Para la determinación del Oxido Nítrico (NO), compuesto con una vida media muy corta, se utilizó la determinación de nitritos en plasma, debido a que estos son los productos finales estables. Los nitritos reaccionan con la oxihemoglobina al entrar al sistema vascular, por esta razón los encontramos en pequeñas cantidades en plasma, suero y orina. La reacción de los nitritos con la oxihemoglobina resulta en la formación de nitrato y metahemoglobina; esto explica porque el NO sintetizado de la LArginina es detectado en plasma, suer o y orina como nitrato.

Reacción de Griess. Durante esta reacción los nitratos son sometidos a reacción de diazotización con la sulfanilamida para formar una sal diazonio de sulfanilamida, la cual puede acoplarse con la N-(1- Naftil) etilenediamina, un compuesto con un espectro de absorción característico. Los nitratos no pueden ser sometidos a reacción de diazotización con sulfanilamida y entonces deben ser primero reducidos cuantitativamente a nitritos para reaccionar con el reactivo de Griess. Los nitratos pueden ser reducidos a nitritos por 2 métodos, uno químicamente utilizando cadmio y otro utilizando nitrato reductasa bacteriana (Pseudomona oleovorans de ATCC No. 8062) acoplada con la reacción de Griess (Granger, 1995). Reactivos. 1. Buffer Na-HEPES. 2. Pseudomona Oleovorans. 3. Medio YMA. a. Buffer NaMOPS, pH 7.4, concentración de 25mM. b. NaHCO 3 a una concentración de 25 mM.

c. Penicilina G a una concentración de 100 unidades/mL. d. Gentamicina a una concentración de 10 µg/mL. e. D-Glucosa a una concentración final de 15.5 mM. 4. Reactivo de Griess. a. Sulfanilamida 1% en Acido Fosfórico al 2.5%. b. N-(1-Naftil) etilendamina en Acido Fosfórico al 2.5%. Protocolo.

Las muestras sanguíneas fueron tomadas de la aorta al final del tiempo establecido para cada grupo para la determinación de los niveles plasmáticos de nitratos y nitritos en tubos estériles. El plasma fue separado por centrifugación a 10,000 g por 10’ y almacenado a – 70ºC hasta que fue realizada su determinación. Se midió la absorbancia a 543 nm utilizando un espectrofotómetro DU 650 Beckman. El cálculo total de nitritos fue hecho después de realizar una curva estándar relacionando absorbancia con concentraciones conocidas de NaNO 2 y utilizando agua bidestilada como blanco (Figura 8).

CURVA ESTANDAR NaNO2 0,25

Absorbancia

0,2 0,15 0,1

y = 0,0019x + 0,0377 R2 = 0,9954

0,05 0 0

20

40

60

Concentración µM/L

80

100

120

2

Figura 8. Curva Estándar NaNO2 con concentraciones desde 0.1 hasta 100 µ M. r = 0.9954 y p