Universidad

de

Colima

FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS “PREVALENCIA DE LA RESISTENCIA PRIMARIA Y SECUNDARIA DEL MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS EN DERECHOHABIENTES DEL IMSS JALISCO, MÉXICO”

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRO EN CIENCIAS MÉDICAS

PRESENTA: DR. EVERARDO PAREDES MOLINA

ASESOR BÁSICO: D. en C. REBECA O. MILLÁN GUERRERO ASESOR CLÍNICO: M. en C. JORGE MOLINA PADILLA COASESORES: DR. ARMANDO SALAS LINO DR. JOSÉ DE JESÚS TRUJILLO LOPEZ DR. SERGIO AGUILAR BENAVIDEZ QFB. LUCRECIA MARTÍN DEL CAMPO PLACENCIA

COLIMA, COLIMA; NOVIEMBRE DE 2004.

INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL COORDINACIÓN DELEGACIONAL DE INVESTIGACIÓN UNIDAD DE INVESTIGACIÓN EPIDEMIOLÓGICA

Colima, Colima, a 22 de Noviembre de 2004.

DR. BENJAMÍN TRUJILLO HERNÁNDEZ COORDINADOR ACADÉMICO DE LA MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS UNIVERSIDAD DE COLIMA PRESENTE. Estimado Dr. Trujillo: En nuestro carácter de asesores informamos a usted que el DR. EVERARDO PAREDES MOLINA ha concluido la tesis titulada: “Prevalencia de la resistencia primaria y secundaria del Mycobacterium tuberculosis en derechohabientes del IMSS Jalisco, México”, la cual ha sido revisada y cumple con los requisitos establecidos para ser presentada para obtener el grado de Maestría en Ciencias Médicas.

Atentamente.

____________________________

____________________________

M. en C. JORGE MOLINA PADILLA COORDINADOR DELEGACIONAL

D. en C. REBECA O. MILLÁN G. INVESTIGADOR ASOCIADO “B”

DE INVESTIGACIÓN EN SALUD ASESOR CLÍNICO

ASESOR BÁSICO

INDICE Pág. I.- HOJA DE PRESENTACIÓN a) TÍTULO b) NOMBRE Y ADSCRIPCIÓN DEL INVESTIGADOR c) NOMBRE DE LOS ASESORES d) NOMBRE DE LAS UNIDADES Y DEPARTAMENTOS e) DOMICILIO Y TELÉFONO DEL INVESTIGADOR

1 2 2 3 3

II.- RESUMEN a) RESUMEN EN ESPAÑOL b) RESUMEN EN INGLES

4 5

III.-

MARCO TEÓRICO a) INTRODUCCIÓN b) DEFINICIÓN DEL PROBLEMA c) JUSTIFICACIÓN d) OBJETIVO GENERAL e) OBJETIVOS ESPECÍFICOS

III.-

6 9 9 10 10

MATERIAL Y MÉTODOS a) DISEÑO Y UNIVERSO b) CRITERIOS DE SELECCIÓN c) PROCEDIMIENTO

11 11 11

IV.-

RESULTADOS

13

V.-

DISCUSIÓN

15

VI.-

CONCLUSIONES

17

VII.- ANEXOS ANEXO No. 1 CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO ANEXO No. 2 ESTUDIO CLÍNICO EPIDEMIOLÓGICO ANEXO No. 3 CULTIVO DE MYCOBACTERIUM ANEXO No. 4 IDENTIFICACIÓN DEL MYCOBACTERIUM ANEXO No. 5 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANEXO No. 6 GLOSARIO DE TÉRMINOS

18 19 22 28 37 38

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

42

INDICE DE TABLAS Y FIGURAS Pag. 1. Tabla 1

Tratamiento para tuberculosis primario supervisado

8

2. Cuadro 1 Relación entre tratamiento previo y multidrogorresistencia

14

3. Cuadro 2 Comparación de la resistencia según investigaciones

16

PRESENTACIÓN

TÍTULO:

“PREVALENCIA DE LA RESISTENCIA PRIMARIA Y SECUNDARIA DEL MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS EN DERECHOHABIENTES DEL IMSS JALISCO, MÉXICO”

1

NOMBRE DE ADSCRIPCIÓN DEL INVESTIGADOR PRINCIPAL: EVERARDO PAREDES MOLINA Estudiante de la Maestría en Ciencias Médicas Médico Especialista en Epidemiología Adscrito al Hospital General de Zona N0. 10, Manzanillo; I. M. S. S. Colima.

NOMBRE DE LOS ASESORES: ASESOR CLÍNICO M. en C. JORGE MOLINA PADILLA Médico Especialista en Pediatría Coordinador Delegacional de Investigación en Salud. Adscrito a la Jefatura Delegacional de Prestaciones Médicas, IMSS Colima. ASESOR BÁSICO D. en C. REBECA O. MILLÁN GUERRERO Médico Especialista en Neurología Adscrito como Investig. Asoc. “B” H. G. Z. y M. F. No. 1, I. M. S. S. Colima. ASESORES EXTERNOS DR. ARMANDO SALAS LINO Coordinador Delegacional de Salud Comunitaria, I. M. S. S. Jalisco. DR. JOSÉ DE JESÚS TRUJILLO LOPEZ Coordinador Delegacional Auxiliar de Salud Comunitaria, I. M. S. S. Jalisco. DR. SERGIO AGUILAR BENAVIDEZ Jefe del Laboratorio Regional de Referencia Epidemiológica, I. M. S. S. Jalisco. QFB. LUCRECIA MARTÍN DEL CAMPO PLACENCIA Responsable del Área de Micobacteriosis en el LARRE, I. M. S. S. Jalisco.

2

NOMBRE DE LOS DEPARTAMENTOS Y/O UNIDADES PARTICIPANTES: Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Colima. Unidad de Investigación Epidemiológica, Hospital General de Zona y Medicina Familiar No.10, I. M. S. S. Colima. Coordinación Delegacional de Salud Comunitaria, I. M. S. S. Jalisco. Laboratorio Regional de Referencia Epidemiológica, I. M. S. S. Jalisco.

DOMICILIO Y TELÉFONO DEL INVESTIGADOR: Lic. Héctor Dueñas No. 257 Colonia Prados de la Villa Ciudad Villa de Álvarez C.P. 28989, Colima, México. Teléfono: (312) 3 96 46 44 Teléfono Celular: (312) 3 20 76 82 E-mail: [email protected]

3

RESUMEN:

OBJETIVO: Determinar la prevalencia de resistencia primaria y secundaria del Mycobacterium tuberculosis para antifímicos en los derechohabientes del I.M.S.S. de Jalisco, México.

MATERIAL Y MÉTODOS: Estudio descriptivo, durante el periodo de 1995 al 2002, se identificó los casos con tuberculosis activa y cultivo positivo, además de estudios de drogosusceptibilidad. Análisis estadístico: Medidas de tendencia central y de dispersión, porcentajes, y razón de momios con intervalos de confianza del 95%.

RESULTADOS: Se estudió 341 casos tuberculosis, analizando resistencia primaria en 132 casos nuevos sin tratamiento previo, y resistencia secundaria en 209 casos subsecuentes con tratamiento previo. La resistencia primaria y secundaria a cualquier medicamento es 34.1% y 89.0% respectivamente, para drogas de primera línea como Isoniacida 11.4%-67.0%, Rifampicina 10.8% y 59.4%, Pirazinamida 12.2% y 58.1%, Etambutol 15.4% y 66.2%, Estreptomicina 40.4% y 73.5% y de segunda línea como Ciprofloxacina 6.1% y 21.2%, la Multidrogorresistencia del 21.3% y 78.5%.

CONCLUSIONES: La prevalencia de resistencia primaria del Mycobacterium tuberculosis es alta, comparada con (INDRE-CDC28 y Sifuentes14) y mucho menor que Amaya Tapia4. La prevalencia de resistencia secundaria del Mycobacterium tuberculosis es muy alta y superior a lo que otros autores han reportado.

4

ABSTRACT:

OBJECTIVE: Determine the prevalence of primary and secondary resistance of the Mycobacterium tuberculosis for anti-tuberculosis drugs in the claimants of the I.M.S.S. of Jalisco, Mexico.

MATERIAL AND METHODS: Descriptive study, during the period of 1995 to 2002, the cases with active tuberculosis were identified with positive cultives, besides drogosusceptibilidad studies. Statistical analysis: Measures of central tendency and of dispersion, percentages, and odds ratios with intervals of confidence of 95%.

RESULTS: 341 cases of tuberculosis were studied, analyzing primary resistance in 132 new cases without previous treatment, and secondary resistance in 209 subsequent cases with previous treatment. The primary-secondary resistance to any medication was 34.1%-89.0% respectively, for drugs of first line like Isoniacid 11.4%-67.0%, Rifampicin 10.8%-59.4%, Pyrazinamide 12.2%-58.1%, Ethambutol 15.4%-66.2%, Streptomycin 40.4%-73.5% and of second line like Ciprofloxacin 6.1%-21.2%, the Multidrug resistance of 21.3%-78.5%.

CONCLUSIONS: The prevalence of primary resistance of the Mycobacterium tuberculosis is high, compared (INDRE-CDC28 and Sifuentes14) and smaller than Amaya Tapia4 report. The prevalencia of secondary resistance of the Mycobacterium tuberculosis is very high and superior to what others authors have reported.

5

MARCO TEÓRICO: INTRODUCCIÓN.La tuberculosis es una enfermedad infecciosa generalmente crónica causada por las especies del género Mycobacterium (M), M. tuberculosis y M. bovis que se transmite del enfermo al sujeto sano por la inhalación de material infectante o a través de la ingestión de leche de vaca contaminada, respectivamente.1 En el mundo ocurren 8 millones de casos nuevos por año y 2.9 millones de defunciones; 95% de los casos y 98% de las muertes se producen en países en desarrollo; se estimó en el año 2000 que se acumularon 90 millones de casos y 30 millones de defunciones, de las cuales 22,000 corresponderán a América del Norte y 1’210,000 a Latinoamérica y el Caribe. 2, 3 La tuberculosis se ha puesto epidémica de nuevo en muchas partes del mundo. Según el Centro de Prevención y Control de Enfermedades (CDC, EEUU), un aumento proyectado a 11.9 millones de casos para el 2005.4 En México la tuberculosis continúa siendo endémica; de acuerdo con los informes del Programa de Prevención y Control de la Tuberculosis, las tasas de incidencia han aumentado durante los últimos 10 años, de 14.4 casos por 100 000 habitantes en 1986 a 18.2 casos por 100 000 habitantes en 1996. Sin embargo, es probable que el número real de casos sea mucho más alto; se ha estimado que la tasa de morbilidad anual es de 50 casos por 100 000 habitantes y que en la última década se han presentado por lo menos 27 000 casos adicionales.5,6 Durante el año 2000 en México, había un total de 16,261 casos nuevos informados, mientras en 2001 el número informado de casos de tuberculosis era 15,296. Para el estado de Colima se reportaron como casos nuevos 123 en el 2000, y 113 para el 2001, y para el estado de Jalisco se notificaron 743 casos nuevos en el 2000, y para el 2001 fueron 625.7

Mycobacterium tuberculosis, en los tejidos animales, el bacilo tuberculoso se presenta en forma bacilar rectos y delgados, midiendo aproximadamente 0.4 x 3 micras. En medios artificiales se ven en formas cocoides y filamentosas. Mycobacteria no pueden ser clasificadas como organismos grampositivos o gramnegativos. Una vez teñidos con los colorantes básicos no se pueden decolorar en alcohol, independientemente del tratamiento con yodo. Los bacilos

6

tuberculosos están caracterizados por su resistencia al alcohol y a los ácidos, por ejemplo, el alcohol etílico a 95% con 3% de ácido clorhídrico (alcohol-ácido) decolora rápidamente a todas las bacterias excepto Mycobacteria. Esta resistencia al alcohol y a los ácidos depende de la integridad de la cubierta de cera. Se emplea la técnica de Ziehl-Neelsen para la identificación de las bacterias acidorresistentes. En el esputo o cortes de tejidos, puede demostrarse la existencia de Mycobacteria, mediante la fluorescencia amarillo-naranja después de teñir con colorantes derivados de fluorocromo. 8 Mycobacteria son aerobias estrictas y derivan su energía de la oxidación de muchos compuestos sencillos de carbono. El aumento de la tensión de CO2 estimula el crecimiento. Sus actividades bioquímicas no son características, y su velocidad de crecimiento es mucha más lenta que la mayoría de las bacterias. El tiempo de duplicación del bacilo tuberculoso es de 12 horas o más. Las formas saprofitas tienden a desarrollarse con mayor rapidez, proliferan bien a 22º C, producen más pigmento y son menos acidorresistentes que las formas patológicas.8

El tratamiento del enfermo con tuberculosis constituye la acción fundamental del programa de control y se utiliza la asociación de cuatro drogas (tabla 1); Se tiene por objetivo interrumpir la cadena de transmisión de la enfermedad, reducir las fuentes de infección lo más pronto posible, y lograr la curación del enfermo. 9 Para lograr el máximo efecto bactericida y esterilizante, así como la curación del enfermo, el tratamiento primario acortado debe ser estrictamente supervisado.9

La resistencia antimicrobiana en Mycobacterias es similar al proceso de resistencia que se presentan en bacterias gramnegativas y grampositivas, ya que desde el inicio del uso clínico de los antibióticos para el tratamiento de la infecciones tuberculosas ha sido un fenómeno conocido.10, 11

7

Tabla No. 1: Tratamiento para Tuberculosis Primario Acortado Supervisado.1 Fase intensiva:

Diaria de lunes a sábado hasta completar 60 dosis Administración en una toma.

Medicamentos separados Combinación fija

Administrar 4 grageas juntas

Isoniacida

300 mg.

75 mg.

Rifampicina

600 mg.

150 mg.

Pirazinamida

1.5 a 2 g.

400 mg.

Etambutol

1.2 g.

400 mg. 3 tabletas juntas

Fase de sostén:

Intermitente tres veces por semana, lunes, miércoles y viernes, hasta completar 45 dosis. Administración en una toma.

Medicamentos separados Combinación fija

Administrar 4 cápsulas juntas

Isoniacida

800 mg.

200 mg.

Rifampicina

600 mg.

150 mg.

La monoterapia con estreptomicina en los principios del tratamiento antituberculoso se acompañaba al principio de una mejoría drástica, tanto en la sintomatología como en la disminución o ausencia de bacilos ácido-alcohol resistente (BAAR). Esta rápida mejoría se presentaba de manera temporal, ya que en pocas semanas reaparecían los BAAR en el esputo y el deterioro clínico.5 Después de la recaída, Mycobacterium tuberculosis aislado de estos pacientes crecía en el laboratorio en presencia de concentraciones elevadas de estreptomicina. Este proceso se conoce como resistencia secundaria o adquirida, (M. tuberculosis inicialmente sensible que se torna resistente por el uso inadecuado de medicamentos antituberculosos), que junto con la llamada resistencia primaria (M. tuberculosis resistente en pacientes que no han recibido medicamentos antituberculosos) son, desde el punto de vista epidemiológico, las variedades de resistencia a antimicrobianos en M. tuberculosis.12, 13

8

Los datos disponibles sobre drogosusceptibilidad de M. tuberculosis en el país son los proporcionados por el Departamento de Mycobacterias del Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE). En 1 811 cepas analizadas entre 1989 y 1993 se encontró que la frecuencia de resistencia primaria era de 4.2 a 9%, y de resistencia secundaria, de 59.4 a 74.7%.28 En población hospitalaria, Sifuentes14 encontró resistencia antimicrobiana a Isoniacida en 19% y a Rifampicina en 12% en 84 aislados clínicos, y Olvera15 notificó resistencia de 62% a Isoniacida y 61% a Rifampicina en 232 pacientes retratados. Y más recientemente Amaya-Tapia4 refiere resistencia primaria a Isoniacida 48%, y Rifampicina 32%, y resistencia adquirida a Isoniacida 68% y a Rifampicina 57%. Estos datos señalan la importancia que puede tener la resistencia de M. tuberculosis en México y hacen evidente la necesidad de practicar estudios de farmacorresistencia.

DEFINICIÓN DEL PROBLEMA.“¿Cual es la prevalencia de resistencia primaria y secundaria del Mycobacterium tuberculosis en derechohabientes del Instituto Mexicano del Seguro Social del Estado de Jalisco, México?”

JUSTIFICACIÓN.En muchos países se ha establecido entre las líneas de investigación prioritarias, la enfermedad de la Tuberculosis, en México, existen pocos investigadores nacionales organizados (INDRE, INSP, INNSZ, INER) con infraestructura propia dedicada a dicho campo, por lo que es necesario contribuir ampliando redes de investigación para una enfermedad prevenible y mortal. El presente proyecto pretende conocer la prevalencia de la resistencia primaria y secundaria del Mycobacterium tuberculosis, dicho trabajo será una base para continuar investigando factores asociados modificables que disminuyan las causas de la resistencia. Diversos estudios han planteado los beneficios de la estrategia del Tratamiento Acortado Estrictamente Supervisado (TAES), para disminuir los abandonos a los tratamientos y evitar así múltiples recaídas que contribuyen a incrementar la resistencia, más la anterior estrategia no se ha podido cumplir en muchos estados del país, por lo que es necesario evaluar con mayor profundidad el fortalecimiento de una mayor intervención para el apego al tratamiento,

9

así como mejorar la calidad de vida del paciente, para tener mejor pronóstico al término del tratamiento, evitando recaídas aún con tratamientos completos.

Medir rutinariamente la

incidencia y prevalencia de la resistencia primaria, debería ser un indicador nacional de salud, para reorientar las estrategias para la prevención y control de la tuberculosis bacilífera, ya que se otorgaría con oportunidad un tratamiento adecuado al enfermo, una atención médica especializada, una vigilancia epidemiológica más estrecha, y la profilaxis adecuada a sus contactos, reconsiderando otros apoyos al programa para zonas de alta incidencia. Desarrollando una línea de investigación en tuberculosis en el estado de Colima, con el apoyo y la experiencia de investigadores del estado de Jalisco, se brindará un diagnóstico objetivo de las dimensiones del problema de salud pública, el cual será prioritario para la toma de decisiones en las estrategias para el control de esta enfermedad.

OBJETIVO GENERAL.Determinar

la

prevalencia

de

resistencia

primaria

y

secundaria

del

Mycobacterium tuberculosis en los derechohabientes del IMSS de Jalisco, México.

OBJETIVOS ESPECIFICOS.1.- Determinar la resistencia del Mycobacterium tuberculosis para Isoniacida, Rifampicina, Estreptomicina, Pirazinamida, Etambutol, Ciprofloxacina. 2.- Conocer la resistencia primaria y secundaria para cada uno de los antifímicos Isoniacida, Rifampicina, Estreptomicina, Pirazinamida, Etambutol, Ciprofloxacina.

.

10

MATERIAL Y MÉTODOS: DISEÑO Y UNIVERSO Se realizó un estudio descriptivo en los casos nuevos y subsecuentes de tuberculosis con cultivo positivo notificados por el Instituto Mexicano del Seguro Social en el Estado de Jalisco, México; durante el periodo comprendido de enero de 1995 a diciembre del 2002. El cálculo del tamaño de la muestra se realizó con la fórmula para un estudio descriptivo de una variable dicotómica, resultando 369 casos a estudiar.

CRITERIOS DE SELECCIÒN Se incluyeron casos con diagnóstico de tuberculosis pulmonar y extrapulmonar, con cultivo positivo, así como resultados de susceptibilidad farmacológica y casos con estudio clínico epidemiológico. Se excluyeron los casos con información incompleta para el análisis del estudio. Variables:

resistencia

a

isoniacida,

rifampicina,

pirazinamida,

etambutol,

estreptomicina y Ciprofloxacina, resistencia primaria y secundaria. El estudio tuvo un riesgo menor del mínimo y fue aceptado por el Comité Delegacional de Investigación del Instituto Mexicano del Seguro Social. El análisis estadístico fue con media, desviación estándar, porcentajes y razón de momios e intervalos de confianza al 95%.

PROCEDIMIENTO.El procedimiento de trabajo fue el siguiente 1.- Se identificaron

los casos con diagnóstico de tuberculosis pulmonar y

extrapulmonar (renal y ganglionar) con antecedente de cultivo positivo, en el Laboratorio Regional de Referencia Epidemiológica (LARRE) del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) en la Ciudad de Guadalajara, Jalisco; de enero de 1995 hasta diciembre de 2002, que correspondan al área geográfica de Jalisco, México. 2.- Tratándose de casos nuevos o subsecuentes de Tuberculosis captados en periodo prospectivo de inicio del estudio se invitó a través de Anexo No.1 Carta de Consentimiento Informado a participar en el estudio a todos los casos con solicitud de cultivo para Mycobacterium. 11

3.- Todos los casos de Tuberculosis con cultivo positivo de Mycobacterium captados en LARRE retrospectiva y prospectivamente, se reportó el Anexo No. 2 Estudio Clínico Epidemiológico por Médico Epidemiólogo de la Unidad Médica de Adscripción, o el Hospital del IMSS que identificó el caso. 4.- El procedimiento y técnica para cultivo de Mycobacterium tuberculosis se describe en el Anexo No. 3, así como el procedimiento y técnica para identificación del Mycobacterium se describe en el Anexo No. 4 y el procedimiento y técnica para las pruebas de sensibilidad se describe en el Anexo No. 5. 17, 18 5.- Se realizó una base de datos en Epi Info 2002 para el análisis estadístico del estudio.

12

RESULTADOS: Se estudiaron 341 casos de pacientes con tuberculosis activa (288 tuberculosis pulmonar, 46 tuberculosis renal y 7 tuberculosis ganglionar) con cultivo positivo para Mycobacterium tuberculosis, de los cuales 132 fueron casos nuevos de resistencia primaria y 209 casos subsecuentes de resistencia secundaria. Para la resistencia primaria el 50.0% correspondió para ambos géneros y para la resistencia secundaria el 53.1% para el sexo masculino y 46.9% el femenino, con relación a la edad: de 41.8 (±18.0) años para resistencia primaria y 43.2 (±17.0) años, para la resistencia secundaria; sin existir diferencia significativa entre ambos grupos estudiado. Con relación al tipo de tuberculosis, la tuberculosis pulmonar tuvo una resistencia primaria de 83.3% y de resistencia secundaria el 87.6%. y para la tuberculosis extrapulmonar 16.7% y 12.4% respectivamente. Se realizaron pruebas de drogosusceptibilidad a los antifímicos de primera línea y al fármaco más utilizado de segunda línea, y se calculó la prevalencia de la resistencia primaria y secundaria según el número de medicamentos, encontrando en el grupo de estudio de la resistencia primaria, una Multidrogorresistencia (MDR) que son de 2 y más fármacos es del 21.3% y en el grupo de estudio de la resistencia secundaria la MDR de 78.5%. Al analizar la resistencia farmacológica por medicamentos, la Estreptomicina mostró 40.4%, seguido de Etambutol 15.4% para la resistencia primaria y de para la Estreptomicina 73.5%, seguido de Isoniacida con 67.0% para la resistencia secundaria, (ver Cuadro No.1). Se observó la prevalencia de la Multidrogorresistencia según esquemas establecidos en los últimos años, en la combinación de medicamentos que presentaban resistencia simultánea, reportando una clara tendencia descendente de resistencia, al asociar mayor número de antituberculosos y observando

con la menor prevalencia la combinación de Isoniacida,

Rifampicina, Pirazinamida, y Etambutol que fue de 2.3% y 37.1% para resistencia primaria y secundaria respectivamente; Además que para estos cuatro antifímicos se determinó la mayor Razón de Momios RM = 24.7 con Intervalo de Confianza IC 95% = (7.3-101) que equivale a la probabilidad de fracaso al tratamiento de los casos subsecuentes en relación a los casos nuevos (ver Cuadro No.1).

13

Al observar la resistencia primaria y secundaria para la Estreptomicina que fue de 40.3% y 73.5% con una RM = 4.2 con IC 95% (2.1-8) siendo la probabilidad de fracaso al tratamiento de los casos subsecuentes en relación a los casos nuevos de tuberculosis.

Cuadro No.1 Relación entre Tratamiento Previo y Multidrogorresistencia a Drogas Primarias del Mycobacterium tuberculosis.

Medicamentos

Casos sin Tratamiento (n)

Resistencia Primaria No. (%)

Casos con Tratamiento (n)

Resistencia Secundaria No. (%)

Razón de Momios

IC 95%

Isoniacida (H)

132

15 (11.4)

209

140 (67.0)

15.8

8.2-31

Rifampicina (R)

129

14 (10.8)

207

123 (59.4)

12.0

6.2-24

Pirazinamida (Z)

131

16 (12.2)

205

119 (58.1)

9.9

5.3-19

Etambutol (E)

130

20 (15.4)

204

135 (66.2)

10.8

5.9-20

52

21 (40.4)

185

137 (73.5)

4.2

2.1-8

MDR (H, R)

129

6 (4.6)

207

105 (50.7)

21.1

8.5-56

MDR (H, R, Z)

129

4 (3.1)

205

84 (41.0)

21.7

7.4-72

MDR (H, R, Z, E)

129

3 (2.3)

205

76 (37.1)

24.7

7.3-101

Estreptomicina (S)

MDR = Multidrogorresistencia

14

DISCUSIÓN: La vigilancia de la resistencia a los medicamentos antituberculosos es una recomendación de los organismos internacionales y regionales de salud, como prioridad para identificar las áreas con surgimiento y diseminación del fenómeno de resistencia26. Es importante vigilar el posterior desenvolvimiento del fenómeno, y prevenir que surja, teniendo en cuenta las causas, y los factores de riesgo para la emergencia de la Multidrogorresistencia de los medicamentos antituberculosos19, 26. En nuestro grupo, en ambos tipos de resistencia, los pacientes estudiados no mostraron diferencias significativas entre ellos, con relación a sexo y edad. Las investigaciones de resistencia primaria y secundaria del M. tuberculosis a los diferentes medicamentos antituberculosos plantean resultados muy diversos según las poblaciones donde se estudian y las instituciones que la generan. En nuestro trabajo encontramos que la estreptomicina fue la más alta resistencia primaria, en forma semejante al reportado por Amaya-Tapia4 en el año 2000 (ver Cuadro No. 4). Lo anterior puede explicarse por la muestra seleccionada, la información proporcionada del paciente, el tamaño muestral y los controles de calidad empleados en los laboratorios. Por lo que el indicador más aceptable para evaluar la resistencia primaria sería la asociación de dos antifímicos más utilizados en los últimos años como son Isoniacida y Rifampicina para Amaya-Tapia4 que fue del 21% realizado en casos clínicos de Secretaria de Salud en Guadalajara, Jalisco; y en nuestro estudio del 4.6% en derechohabientes del Instituto Mexicano del Seguro Social Delegación Jalisco. Por lo que observar resistencia del Mycobacterium tuberculosis “in vitro” a cada uno de los medicamentos antifímicos es útil para el médico clínico en el seguimiento de su paciente, más en un estudio de prevalencia implica mayor utilidad la asociación de resistencia más frecuentes en nuestra población, y la prioridad de la vigilancia epidemiológica del programa de control de la tuberculosis. Llama la atención que la resistencia primaria a los antituberculosos se ha incrementado y la Isoniacida, principal medicamento profiláctico que se utiliza a nivel nacional, ya tiene una resistencia reportada del 7 al 48%, lo que significa una situación de alarma para el control de los contactos tuberculosos.

15

Cuadro No. 2 Comparación de la Resistencia Primaria y Resistencia Secundaria del Mycobacterium tuberculosis por Medicamentos según diversas investigaciones en México. Medicamentos

Sifuentes14 RP (n=47) RS (n=37)

INDRE/CDC28 RP (n=308) RS (n=99)

Amaya-Tapia4 RP (n=120) RS (n=137)

Paredes RP (n=132) RS (n=209)

Isoniacida

RP RS

9% 44%

11% 41%

48% 68%

11% 67%

Rifampicina

RP RS

6% 35%

2% 27%

32% 57%

11% 69%

Pirazinamida

RP RS

1% 18%

38% 48%

12% 58%

Etambutol

RP RS

19%

14% 14%

32% 54%

15% 66%

Estreptomicina

RP RS

2% 24%

11% 28%

42% 58%

40% 73%

Ciprofloxacina

RP RS

21% 30%

6% 21%

RP = Resistencia Primaria, RS = Resistencia Secundaria.

Con relación a la resistencia secundaria para los mismos medicamentos en este caso Estreptomicina e Isoniacida encabezan las de mayor resistencia Los estudios de drogosusceptibilidad a los casos con resistencia secundaria son imprescindibles para su control y vigilancia diagnóstica y terapéutica, pero su valor radica principalmente en medir la resistencia a fármacos de segunda elección, para tener mejores alternativas, en el estudio de Amaya-Tapia4 la resistencia al Ciprofloxacina es del 30% y nuestro reporte es del 21.2% pero pocos estudios integran otros medicamentos de segunda elección, además de que está limitado en nuestro mercado otras opciones y más en las Instituciones de Salud.

16

CONCLUSIONES: 1. La prevalencia de resistencia primaria del Mycobacterium tuberculosis es alta, comparada con otras investigaciones mexicanas de otras regiones distintas a la nuestra (INDRE-CDC28 y Sifuentes14) y mucho menor que Amaya-Tapia4 del mismo Estado de Jalisco. 2. La prevalencia de resistencia secundaria del Mycobacterium tuberculosis es muy alta y superior a lo que otros autores han reportado. 3. La estrategia

del Tratamiento Antifímico Estrictamente Supervisado TAES

recomendado por la OMS continua vigente, para modificar los factores asociados a la falta de apego al tratamiento antifímico, razón prioritaria del incremento de la prevalencia de resistencia del Mycobacterium tuberculosis.

17

ANEXOS: ANEXO No. 1

“CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO”

Por medio de este conducto, acepto participar en el proyecto de investigación: “PREVALENCIA DE LA RESISTENCIA PRIMARIA Y SECUNDARIA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS EN EL IMSS JALISCO, MÉXICO”

DEL

Registrado ante el Comité Delegacional de Investigación Médica del Instituto Mexicano del Seguro Social del Estado de Colima con el Folio No. 2002-101-009 Para lo cual se me ha explicado que mi participación consiste en proporcionar muestras de (expectoración, orina, líquido cefalorraquídeo, drenaje de fístula) según se halla localizada la infección de tuberculosis, dichas muestras se enviarán a un laboratorio especializado para su estudio, denominado Laboratorio Regional de Referencia Epidemiológica en la Ciudad de Guadalajara, Jalisco. Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los inconvenientes y molestias derivados de mi participación, así como es responsabilidad de los investigadores informarme sobre los riesgos y beneficios que resulten de la investigación. Nombre del Participante _____________________________________

Firma del Participante ________________________________

Testigo: _____________________________________

________________________________

Testigo: _____________________________________

_______________________________

18

ANEXO No. 2 INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL JEFATURA DE PRESTACIONES MEDICAS COORDINACION DELEGACIONAL DE SALUD COMUNITARIA ESTUDIO EPIDEMIOLOGICO DE TUBERCULOSIS FICHA DE IDENTIFICACION

NO LLENAR

Nombre: (Apellido paterno, materno, nombre)

Tipo de paciente: Fracaso Fecha de notificación Fecha de diagnóstico: Unidad tratante:

Caso Nuevo

Reingreso

Recaida

Referido

(dd/mm/año) Semana Epidemiológica (dd/mm/año) Edad Genero M RESIDENCIA DEL PACIENTE

Clave: F

Institución Semana epidemiológica reportada en transmisibles

Domicilio: Calle nombre y número

Colonia Municipio Telefono:

Localidad Entidad Federativa: lada

número

DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO SERVICIO QUE DECTECTO EL CASO: Consulta externa de medicina familiar Consulta externa de especialidad Examen de contactos Al estar hospitalizado por cualquier motivo MÉTODO DIAGNOSTICO Baciloscopia Cultivo Histopatología Criterios clínicos Criterio epidemiológico Otros ( especificar ) RESULTADOS DE LABORATORIO (BAAR) BK+ BK++ BK+++ Negativo Positivo No se realizo CULTIVO PARA DIAGNOSTICO Cultivo positivo Cultivo negativo No se realizo Se ignora LOCALIZACION DE LA INFECCION Pulmonar Meningea-SNC Intestinal Osea Renal Ojo Oído Tiroides Suprarrenal Ganglionar Otras (especificar) INICIO TRATAMIENTO: SI NO OTRAS ENFERMEDADES ASOCIADAS Ninguna VIH positivo SIDA Alcoholismo Diabetes Neoplasias Cirrosis hepática: Insuficiencia cardiaca

GRUPO DE EDAD < de 15 años > de 15 años total

Número de EPITB Folio:

ESTUDIO DE CONTACTOS DECLARADOS EXAMINADOS A B E F I J

Pesquisa

Criterios radiológicos

Se ignora

Genitourinaria Miliar

EPOC

Piel Pleural

Desnutrición Otras (especificar)

ENFERMOS C G K

QUIMIOPROFILAXIS D H L

19

ANEXO No. 2 (Continuación) SEGUIMIENTO DEL PACIENTE BACILOSCOPIA DE CONTROL ( La posible respuesta son : + , ++ , +++ , negativo, no se realizo ) TIEMPO Al primer mes Al segundo mes Al tercer mes Al cuarto mes Al quinto mes Al sexto mes Al terminar el tratamiento Se realizo cultivo:SI Negativo

NO No se realizó

RESULTADO

FECHA DE REALIZACION

Resultado de cultivo: Una cruz

Dos cruces

Tres cruces

Se ignora resultado

ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA Se realizo estudio de susceptibilidad: SI NO RESULTADO FARMACO Estreptomicina Rifampicina Piracinamida Isoniacida-INH Etambutol TIPO DE RESISTENCIA:

SENSIBLE

PRIMARIA

TRATAMIENTO Fecha de inicio de tratamiento: Tiempo de tratamiento ESQUEMA DE TRATAMIENTO: Primario supervisado Primario autoadministrado Otro (especificar)

RESISTENTE

NO REALIZADO

SECUNDARIA

Fecha de término de tratamiento (meses)

Reforzado

Fecha en la que se da de alta (dd/mm/año) CLASIFICACIÓN FINAL AL TÉRMINO DEL TRATAMIENTO: Curación y baciloscopia negativo Término tratamiento sin baciloscopia Defunción Abandono Traslado a otra unidad

Retratamiento

Fracaso

SOCIOEPIDEMIOLOGIA ESCOLARIDAD: No sabe leer ni escribir Primaria (años cursados) Secundaria (años cursados) Bachillerato (años cursados) Licenciatura Estudios técnicos (especificar) OCUPACION: Estudiante Desempleado Trabajo de oficina Hogar Otros (especificar) Ingreso promedio mensual $

20

ANEXO No. 2 (Continuación) EVALUACIÓN CLINICA DEL PACIENTE ANTECEDENTES TERAPEUTICOS Peso promedio en Kilogramos un año antes del diagnostico de Tuberculosis Peso actual en Kilogramos Talla en centímetros CUADRO CLINICO Fecha en la que el paciente inicio a notar síntomas y signos Fiebre

Sudoración nocturna

Perdida de peso Hematuria

(dd/mm/año)

Tos productiva

Hemoptisis

Fatiga

Somnolencia

Anorexia

Disnea

Dolor taráxico

Malestar general

Adenomegalias (especificar localización)

Otros síntomas (especificar)

Estuvo en contacto con alguna persona con diagnostico de tuberculosis: SI Estuvo en contacto con alguna persona tosedora SI NO Usted FUMA: SI NO Cuantos cigarrillos al día Había recibido ya tratamiento para tuberculosis: Completo usted ese tratamiento: SI

SI NO

NO

NO

POR QUE NO COMPLETO EL TRATAMIENTO: Cambio de lugar de residencia Lejanía del lugar donde vive a donde le administran el tratamiento Porque en mi trabajo no dispongo de tiempo Porque no quiero que se enteren que padezco tuberculosis por vergüenza Porque me hacen perder tiempo en el lugar donde me administran el tratamiento Siento que el personal médico encargado de mi tratamiento me trata mal o rechazan Estuve en tratamiento con medicina alternativa (especificar por ejemplo homeopatía, arbolaria, brujería etc.) No creo necesario recibir tratamiento Otra causa (especificar) Observaciones:

21

ANEXO No. 3

CULTIVO DE MYCOBACTERIUM17

CARACTERISTICAS GENERALES Son bacilos alcohol-ácido resistente. Aeróbicos, no forman esporas, inmóviles, ligeramente curvos ó rectos. Miden de 0 a 0.6  por 10.0 . No forman cápsula; presentan un alto contenido de lípidos en sus células y particularmente en la pared celular, los cuales son responsables de su difícil tinción a los colorantes comunes. En general son de lento crecimiento, requieren de 2 a 8 semanas. Las consideradas de rápido crecimiento desarrollan colonias visibles en menos de siete días.

La mayoría de las micobacterias crecen lentamente, requieren de 2 a 8 semanas en los medios de cultivo habituales como Lowenstein Jensen. Se puede detectar más rápidamente con métodos radiométricos como el BACTEC TB. Existe un grupo de micobacterias denominadas “de crecimiento rápido” que crecen en menos de 7 días y que pueden estar implicadas en patología humana como M. chelonae y M. fortuitum.

La temperatura para el crecimiento varía de 30°C a 45°C, sin embargo la mayoría de las especies patógenas para el humano crecen a 37°C, algunas como M. ulceran, M. haemophilum y M. marinum requieren temperatura de 30°C a 32°C para su aislamiento primario. La morfología varía con las especies:

1) Las colonias pueden ser rugosas con los bacilos compactados dentro de densos agregados simulando granos de azúcar ejemplo M. tuberculosis. 2) Pueden ser lisas y transparentes con los bacilos sin una agrupación característica ejemplo M. avium. 3) Pueden presentar pigmentación en presencia de luz (fotocromógenas). 4) Pueden presentar pigmentación tanto en luz como en la oscuridad (escotocromógenas).

22

5) O pueden no ser pigmentadas dependiendo de la especie. Se han encontrado alrededor de 25 especies de micobacterias que se asocian con enfermedad en humanos como se muestra en la siguiente tabla:

MICOBACTERIAS PATOGENAS AISLADAS DE HUMANOS17 GRUPO

OBLIGATORIA

FACULTATIVA

Patógenos Estrictos

M. africanum M. tuberculosis M. ulcerans M. leprae

M. bovis

Foto Cromógenos

EscotoCromógenos

No Cromógenos*

De crecimiento Rápido

POTENCIAL

SAPROFITOS

M. asiáticum M. kansasii M. marinum M. simiae

M. scrofulaceum M. szulgai

M. gordonae M. flavescens

M. avium M. haemophilum M. malmoense M. shimoidei

M. gastri M. nonchromogenicum M. triviale M. terrae

M. chelonae M. fortuitum

M. fallax M. smegmatis

M. agri M. aurum M. phlei M. vaccae

* Algunas cepas de M. avium son pigmentadas

23

PROCESAMIENTO GENERAL DE MUESTRAS17 Muestra estéril

Muestra no estéril

Centrifugar (3,000 x g x 15 min) Y usar sedimento ó filtrar con filtro De 0.22 u y cultivar el filtro

Digestión y descontaminación (NALC-NaOH)

Neutralizar (buffer ph 6.8 ó Agua estéril v / v ) y Centrifugar (3,000 x g x 15 min).

Preparar frotis y tinciones del sedimento Zielh-Neelsen y Auramina-Rodamina

Leer al microscopio y reportar

Suspender el sedimento en albúmina bovina 0.2% y sembrar

Medios líquidos: Middlebrook 7H9 BACTEC TB MGIT

Medios sólidos: Lowenstein-jensen Middlebrook 7H10

Incubar a 37°C 8 semanas Revisar 2-3 veces por semana*

Incubar a 37°C 8 semanas Revisar 1-2 veces por semana*

Si hay crecimiento confirmar con Zielh-Neelsen

Identificación y pruebas de sensibilidad

* Para M. ulcerans y M. marinum se deberá incubar a 31°C.

24

PROCESO DE MUESTRA DE EXPECTORACIÓN17 Expectoración

Agregar un volumen igual de NaOH-Citrato de Na con N-acetil-L-Cisteína, La cual se agregó en el momento de una concentración de 0.5 g por 100 ml.

Agitar suavemente y vaciar al tubo de centrifuga de 50 ml de polipropileno con tapón de rosca. (Si es muy espesa la muestra agitar en “vortex” o en forma manual fuertemente).

Dejar reposar hasta que transcurran 20 minutos a partir de cuando se agregó el NaOHCitrato.

Agregar un volumen igual o más de buffer de fosfatos pH 6.8. Mezclar y centrifugar a 3,000 x g x 15 minutos.

Se elimina el sobrenadante y del sedimento se hace frote con asa ó pipeta Pasteur estéril.

Agregar 1 ó 2 ml de albúmina bovina al 0.2% estéril e inocular en el medio de Lowenstein-Jensen.

NOTA: los sobrenadantes se desechan en un frasco con fenol al 5% y al vaciarlo se limpia el exterior del tubo con una gasa también con fenol al 5%, cuidando de que éste no entre en el tubo.

25

MEDIO DE CULTIVO PARA AISLAMIENTO DE MICOBACTERIAS17 MEDIOS DE CULTIVO CONVENCIONALES.

Al menos dos diferentes medios de cultivos sólidos deberán ser utilizados para cada espécimen uno a base de huevo como el Lowenstein-Jensen y un medio semisintético como el Middlebrook 7H10 que contiene sales cofactores, ácido oleico y glucosa (enriquecimiento) catalasa y biotina (estimula el crecimiento de los bacilos dañados) y glicerol. Los especimenes que han sido colectados asépticamente (ejemplo Líquido cefalorraquídeo) pueden también ser inoculados en caldo Middlebrook 7H9.

Los cultivos se incuban a 37C en la oscuridad con una atmósfera de 5 a 10% de CO2 y humedad alta. Si los cultivos se realizan de material de lesiones de piel en donde se sospecha la presencia de M. marinum deberá incubarse un segundo juego de medios de cultivo a 31°C, o a temperatura ambiente si no se dispone de una estufa a ésta temperatura.

Los cultivos macroscópica y por microscopía con Ziehl-Neelsen, si les crecen contaminantes se cosechan y se descontamina con NaOH para tratar de recuperar los cultivos que hayan estado positivos. Si no es posible se descartan y se reportan como cultivos contaminados y si se requiere deberán repetirse los cultivos. La mayoría de los cultivos de Mycobacterium de crecimiento lento se detectan entre 3 a 6 semanas y unos pocos aparecen en 7 a 8 semanas de incubación.

Cuando el crecimiento aparece debe detectarse velocidad de crecimiento, pigmentación y morfología colonial. Después de 9 semanas de incubación los cultivos en los que no se observa crecimiento podrán reportarse como negativos y descartarse.

26

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO17

MEDIO DE LOWENSTEIN-JENSEN. (Diferentes marcas): 1. Suspender 37.3 g del polvo (medio base) en 600 ml. de agua. 2. Agitar hasta completa homogenización. 3. Agregar 12 ml. de glicerina. 4. Ajustar a pH 4.8. 5. Calentar enseguida a ebullición, durante 1 minuto agitando frecuentemente. 6. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C Enfriar a 50°C. 7. Mientras tanto preparar en otro matraz un litro de huevo entero (yemas y claras), obteniendo asépticamente (matraz estéril con perlas o pedazos de vidrio). 8. Romper las yemas empleando perlas ó trozos de vidrio y preparar una suspensión homogénea. 9. Procurar que no formen burbujas. 10. Mezclar la base y el huevo. 11. Distribuir 10 ml en tubos estériles de 18 x 150 con tapón de rosca. (rinde aproximadamente para 160 tubos). 12. Coagular colocando los tubos inclinados a 85°C durante 45 minutos.

MEDIO MIDDLEBROOK 7H10: 1. Suspender 19 g en 900 ml de agua. 2. Agregar 5 ml de glicerol. 3. Ajustar el pH a 6.6. 4. Calentar hasta disolución completa. 5. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121°C. 6. Enfriar a 50°C y agregar 100 ml de Middlebrook OADC (enriquecimiento) en condiciones asépticas. 7. Se vacía en cajas con 5ml o en tubos de 18 x 150 con tapón de rosca. 8. Cuando se va a utilizar para pruebas de sensibilidad, se vacía en caja encima del disco con el antifímico correspondiente.

27

ANEXO No. 4

IDENTIFICACIÓN DEL MYCOBACTERIUM17 CLASIFICACIÓN

REINO:

PROCARYOTAE

Organismos cuyo nucleoide no presenta membrana nuclear, sin mitocondrias, sin aparato de Golgi, sin retículo endoplásmico y los ribosomas dispersos en el citoplasma.

CATEGORIA II:

PROCARYOTAE (ESCOTOBACTERIAS) Eubacterias generalmente Gram positivas que tienen pared celular.

GRUPO 21:

MYCOBACTERIA

FAMILIA:

MYCOBACTERIACEAE

GÉNERO:

MYCOBACTERIUM

ESPECIE TIPO:

M. tuberculosis

28

Existen otros tres géneros semejantes a MYCOBACTERIUM los que Podemos diferenciar de la siguiente manera:

DIFERENCIACIÓN DE MYCOBACTERIUM DE OTROS GENEROS17 MYCOBACTERIUM. Morfología: bacilos ocasionalmente ramificados en filamentos sin micelio aéreo. Crecimiento: 2-40 días Grado de ácido resistencia: usualmente son muy ácido resistente. Tinción por Gram: débil Reacción a la Penicilina: resistentes. NOCADIA. Morfología: micelio tardíamente se fragmenta en bacilos y cocos, en ocasiones, algún micelio aéreo. Crecimiento: 1-5 días. Grado de ácido resistencia: con frecuencia parcialmente ácido resistente. Tinción de Gram: usualmente fuerte. Reacción a la Penicilina: resistente. RHODOCOCCUS. Morfología: micelio corto se fragmenta en bacilos y cocos irregulares sin micelio aéreo. Crecimiento: 1-3 días. Grado de ácido resistencia: con frecuencia parcialmente ácido resistente. Tinción por Gram: usualmente fuerte. Reacción a la Penicilina: sensible. CORYNEBACTERIUM. Morfología: bacilos pleomórficos con frecuencia en forma de bastón, comúnmente agrupados angularmente y en empalizada. Crecimiento: 1-2 días Grado de ácido resistencia: a veces débilmente ácido resistentes. Tinción por Gram: fuerte. Reacción a la Penicilina: sensible.

29

IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES DE MICOBACTERIAS CLINICAMENTE IMPORTANTES17 De acuerdo a los métodos tradicionales las micobacterias son inicialmente identificadas por 3 criterios principales: a) Velocidad de crecimiento. b) Morfología colonial. c) Pigmentación. Con estos datos se seleccionan las pruebas bioquímicas adecuadas para completar la identificación, esta debe ser basada en tantas observaciones como sea posible y es prudente seleccionar sólo aquellas pruebas que se usen para la especie de que se sospecha. Muchas de las pruebas bioquímicas son cualitativas y se basan en reacciones de color.

Un buen crecimiento de la cepa es un importante prerrequisito para realizar adecuadamente estas pruebas.

Con objeto de facilitar la secuencia de identificación de las micobacterias se presenta a continuación un diagrama de flujo y para completar éste se presenta una tabla de identificación en donde están contempladas las especies de micobacterias aisladas de material clínico.

Una nota importante es que todas las pruebas bioquímicas deben hacerse con cultivos activos de 3 a 5 semanas y con crecimiento visible, las de crecimiento rápido de 1 a 2 semanas.

Si no se trabajan cultivos adecuado puede obtenerse falsos negativos.

30

PRUEBA DE LA ACUMULACIÓN DE NIACINA17 La prueba de la niacina (ácido nicotínico) es una excelente prueba para diferenciar a M. tuberculosis (que la da positiva) de otras micobacterias de crecimiento lento que la dan negativa. La acumulación de la niacina en el medio debido a la pérdida de una enzima que la convierte en otro metabolito es característica de M. tuberculosis.

REACTIVOS. A. Bromuro de cianógeno al 10% (al prepararlo se deberá evitar la inhalación y el contacto con piel y mucosas). Se deberá conservar en un frasco ámbar y en refrigeración. B. Anilina al 4% Agregar 4 ml de anilina a 96 ml de alcohol etílico al 95%, conservarlo en un frasco ámbar y en refrigeración. C. Hidróxido de sodio saturado.

PROCEDIMIENTOS: A un cultivo bien crecido en Lowenstein-Jensen se le agrega 0.5 ml a 1.5 ml de agua estéril con pipeta Pasteur, con ésa misma se desprenden las colonias de la superficie del agar para que liberen la niacina en el agua. Poner el tubo a 37°C durante 2 horas en baño María para que se complete la extracción. Se extraen tres gotas de agua y se depositan en un tubo de 13 x 100 o en una placa de porcelana, se agrega la misma cantidad de anilina

y de bromuro de cianógeno e

inmediatamente se observa el desarrollo de un color amarillo que indica presencia de la niacina. Posteriormente se agrega NaOH en exceso par eliminar la toxicidad del bromuro de cianógeno antes de desechar los tubos. Control de Calidad. Las cepas que pueden ser usadas como controles son: Control Positivo M. tuberculosis ATCC 25177 Control Negativo M. intracellulare ATCC 13950 y un tubo sin inocular.

31

PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS17 Las micobacterias difieren en sus habilidades para reducir los nitratos, ésta característica es utilizada para distinguir entre aquellos organismos que tienen morfología colonial similar. Se basa en la producción de la enzima nitroreductasa que reduce nitrato a nitrito y éste último es detectado por substratos que se combinan con el para formar un compuesto colorido. RECTIVOS: 1. Reactivo cristalino: Ácido Sulfanílico

1 parte

Clorhidrato de N-(1-naftil) etilendiamina)

1 parte

Ácido 1-tartárico

1 parte

La mezcla se macera en un mortero y se homogeniza adecuadamente. El reactivo se conserva en frasco ámbar a temperatura ambiente por 6 meses. 2. Substrato Caldo Nitrato: suspender 9 g de medio en 1,000 ml de agua, vaciar en tubos con rosca y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C. 3. Agua estéril. PROCEDIMIENTO: 1. Agregar 0.2 ml de agua destilada estéril a un tubo de 18 x 150 con tapón de rosca. Se mezclan dos asadas abundantes de un cultivo en Lowenstein-Jensen de 3 a 4 semanas de incubación. 2. Se agrega 2 ml del substrato caldo nitrato a la suspensión y mezclar. 3. Agitar suavemente e incubar por 2 horas a 37°C en baño María. 4. Retirar el tubo del baño María y agregar una pequeña cantidad del reactivo cristalino. Se puede usar una pequeña espátula para agregar los cristales. 5. Observar inmediatamente la aparición de un color rosa a rojo que indica la presencia de nitritos, demostrando la habilidad del organismo para reducir nitratos a nitritos. 6. Si no se observa color se agrega una pequeña cantidad de granalla de zinc al tubo negativo. Si aparece un color rojo indica que el nitrato no reducido se encontraba presente en el tubo y la bacteria fue nitroreductasa negativa. Control de calidad.- las cepas que pueden ser usadas como controles son: Control positivo M. intracellulare ATCC 13950 Control negativo M. kansasii ATCC 12478 y un tubo sin inocular.

32

PRUEBA DE CATALASA17 La producción de la catalasa, por algunas micobacterias, se detecta por la degradación del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. El oxígeno aparece como burbujas. Todas las micobacterias excepto algunas cepas resistentes a isoniacida de M. tuberculosis y M. bovis muestran actividad de catalasa. Sin embargo, varían en la cantidad de catalasa producida y en la estabilidad al calor de la enzima. Mycobacterium tuberculosis y algunas otras micobacterias pierden su actividad de catalasa cuando son calentadas a 68°C.

REACTIVOS: 1. Buffer de fosfatos 0.067 pH 7 2. Mezcla en igual volumen de Tween 80 al 10% y peróxido de hidrógeno al 30%, preparada recientemente. 3. Cultivo bien desarrollado de preferencia en Lowenstein-Jensen.

PROCEDIMIENTO: Determinación de actividad de catalasa estable al calor. 1. En un tubo de 18 x 150 se pone 0.5ml de buffer fosfatos y se suspenden algunas colonias en él. 2. Se pone el tubo en baño María a 68°C durante 20 minutos. 3. Se enfría la suspensión a temperatura ambiente y se le agrega 0.5 ml de la mezcla Tween-peróxido. 4. Observe la formación de burbujas (prueba positiva). 5. Mantenga los tubos durante 20 minutos antes de descartar la prueba como negativa.

Control de calidad. Las cepas que pueden ser usadas como controles son: Control positivo M. kansasii ATCC 12478 Control negativo M. tuberculosis ATCC 25177 y un tubo sin inocular.

33

PRUEBA DE ARILSULFATASA17 La prueba de arilsulfatasa de 3 días es usada para diferenciar especies de crecimiento rápido clínicamente importantes como M. chelonae y M. fortuitum que la dan positiva. Se determina la habilidad de la enzima arilsulfatasa para romper el disulfato de fenolftaleína tripotásica en fenolftaleína (forma un color rojo con bicarbonato de sodio) y otras sales. REACTIVOS: A. Prepare una solución stock de substrato de la manera siguiente: Agua destilada

50 ml.

Disulfato de fenolftaleína tripotásica

2.6 g.

1. Mezclar perfectamente la solución, se esteriliza por filtración y se conserva en refrigeración. 2. Prepare un matraz con 180 ml de medio Middlebrook 7H9 ó caldo Dubos Tweenalbúmina, esterilice en autoclave a 121°C por 15 minutos y deje enfriar a temperatura ambiente. 3. Agregar asépticamente un vial de 20 ml de Middlebrook-albúmina-dextrosa-citrato (ADC) al matraz. 4. Se agrega asépticamente 2.5 ml de stock de substrato al matraz para una concentración final de 0.001 M del substrato. 5. Se vacía en tubos estériles de 16 x 125 con tapón de rosca un volumen de 3 ml y se conservan a temperatura ambiente. B. Prepare la solución indicadora alcalina (carbonato de sodio 6N) de la siguiente manera: Carbonato de sodio anhidro

10.6 g.

Agua destilada

100 ml y mezclar.

PROCEDIMIENTO PARA PRUEBA DE ARILSULFATASA. 1. Se inoculan tubos con 0.1 ml del cultivo en caldo o un buen inóculo del cultivo de agar. 2. Después de 3 días de incubación a 35°C se agregan 6 gotas de carbonato de sodio al substrato. 3. Observe un inmediato cambio de color rosa o rojo después de la adición del carbonato lo que indica un resultado positivo para arilsulfatasa. Control de calidad.

34

Las cepas que pueden ser usadas como controles son: Control positivo M. fortuitum ATCC 6841 ó M. xenopi. Control negativo M. intracellulare ATCC 13950 y un tubo sin inocular.

PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE TWEEN 8017 Esta prueba nos ayuda en la identificación de micobacterias escotocromógenas y no fotocromógenas. El medio contiene Tween 80 (mononucleato de sorbitan polioxietileno) y rojo neutro, cuando el rojo neutro está unido al Tween 80 el medio es de color ámbar paja. Las lipasas producidas por las micobacterias rompen el Tween 80 en ácido oléico y sorbitol polioxietilado, entonces éste no permanece unido al rojo neutro y el medio cambia de color rojo a rosa en un pH de 7. El cambio de color no es debido a cambio en el pH.

REACTIVOS: Buffer fosfato 0.067 M ph 7

100.0 ml

Tween 80

0.05 ml

Solución stock de rojo neutro al 0.1% en solución acuosa

2.0 ml

Mezcle los tres reactivos y distribuya en tubos de 18 x 150 con 4 ml por tubo. Esterilice en autoclave a 121°C por 15 minutos. Conserve los tubos en refrigeración y protegidos de la luz. El substrato estable durante 2 semanas de 4 a 10°C.

PROCEDIMIENTO: 1. Emulsifique una asada del cultivo en un tubo del substrato. 2. Incube el cultivo de 35 a 37°C. 3. Observe el cambio de color de los tubos de ámbar a rojo en 1,5 y 10 días. 4. Si el número de días requeridos para el cambio de color es menor de 5 la prueba es positiva, si el cambio ocurre entre 5 y 10 días, la prueba es dudosa; si no hay cambio de color al décimo día la prueba es negativa. Control de calidad. Las cepas que se pueden utilizar como controles son: Control positivo M. kansasii ATCC 12478 Control negativo M. intracellulare ATCC 13950 y un tubo sin inocular.

35

PRUEBA DE LA UREASA17 Esta prueba muestra la capacidad de las micobacterias para hidrolizar la urea.

REACTIVOS: Caldo Urea: Se disuelve 2.9g de agar base de urea en 10 de agua estéril. Se esteriliza con filtro de membrana y se agregan 90 ml de agua estéril, se colocan 3 ml asépticamente en tubos con tapón de rosca y se almacena de 2 a 8°C. La vida media de este reactivo es de 1 mes si es almacenado a esta temperatura.

PROCEDIMIENTO: 1. Inocular con un cultivo activo de micobacterias dentro del tubo con caldo urea (el cultivo debe ser de 3 a 4 semanas máximo). 2. Emulsifique el cultivo en el tubo. 3. Incubar a 37°C por 5 días. La incubación mayor de 5 días puede dar falsos positivos. 4. Observar: cambio de color a rosa (+) y ningún cambio (-).

Control de calidad. Las cepas que pueden incluirse como controles son: Control positivo M. kansasii ATCC 12478. Control negativo M. intracellulare ATCC 13950 y un tubo sin inocular.

36

ANEXO No. 5

PRUEBA DE SENSIBILIDAD17 Los métodos convencionales de susceptibilidad en donde se mide la zona de inhibición no son adecuados para las micobacterias de crecimiento lento, pues la difusión de la droga a través del medio se efectúa antes que las micobacterias crezcan. El método generalmente aceptado en éste caso es el basado en el crecimiento del organismo en un medio con una concentración uniforme de droga, el más comúnmente usado es: -

Método de las proporciones de Cannetti (1963).

El método de la proporciones de Cannetti consiste en preparar una serie de 3 diluciones 1:10 a partir de una suspensión estandarizada de bacterias a un tubo N.1 de MacFarland. La última dilución se inocula en una serie de cajas con medio de cultivo Middlebrook 7H10 que contienen un disco impregnado con el antifímico el cual se coloca por debajo del medio para que se difunda en él, esto lo hace de una manera radial quedando homogénea la concentración del antifímico en el medio. Se inocula también una caja con medio pero sin disco, que servirá de control para ver la proporción de crecimiento en cada una de las cajas que contienen los medicamentos a probar. Para considerarse una cepa resistente al antifímico debe haber un número de colonias mayor al 1% con respecto al control, por el contrario se considera sensible si es menor al 1%.

DROGAS ANTIFIMICAS USADAS

CONCENTRACIÓN

Isoniacida

0.2 microgramos/ ml.

Estreptomicina

2.0

“

Etionamida

5.0

“

PAS

2.0

“

Rifampicina

1.0

“

Pirazinamida

25.0

“

Etambutol

5.0

“

Ofloxacina

2.0

“

Clorhidrato de Ciprofloxacina

2.0

“

Lamefloxacina

2.0

“

37

ANEXO No. 6

GLOSARIO DE TÉRMINOS: Antifímicos: Los medicamentos específicos para el tratamiento de la tuberculosis. Baciloscopía de esputo negativa: La ausencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en la lectura de 100 campos de frotis de la expectoración. Baciloscopía de esputo positiva: La demostración de cinco o más bacilos ácido-alcohol resistentes en la lectura de 100 campos del frotis de la expectoración. Caso confirmado: El enfermo cuyo diagnóstico de tuberculosis ha sido comprobado por baciloscopía, cultivo o histopatología. Caso no confirmado: El enfermo en quien sintomatología, signos físicos y elementos auxiliares de diagnóstico determinan la existencia de tuberculosis, sin confirmación bacteriológica. Caso de tuberculosis: El paciente en quien se establece el diagnóstico de la enfermedad clínicamente y se clasifica en confirmado y no confirmado por bacteriología o histopatología. Caso nuevo: El enfermo en quien se establece y se notifica por primera vez el diagnóstico de tuberculosis. Caso subsecuente: El enfermo en quien se establece y se notifica por segunda vez o más veces el diagnóstico de tuberculosis. Contacto: La persona que convive con un caso de tuberculosis. Cultivo negativo: La ausencia de colonias de bacilos ácido-alcohol resistentes después de noventa días de observación. Cultivo positivo: La demostración de colonias con características de Mycobacterium tuberculosis.

38

Curación: El caso de tuberculosis que ha terminado el tratamiento primario, desaparecen los signos clínicos y tiene baciloscopía negativa en dos muestras mensuales tomadas en ocasiones sucesivas, así como el caso en el que al término de su tratamiento regular, desaparecieron los signos clínicos y no expectora. Defunción por tuberculosis: La tuberculosis inicia la serie de acontecimientos que llevan a la muerte. Drogosusceptibilidad: Resultado de la técnica de cultivo que permite detectar si el crecimiento del bacilo tuberculoso es inhibido por un medicamento. Estudio de contactos: El examen de los convivientes del enfermo, en especial de aquellos que mantengan relación estrecha por tiempo prolongado. Examen bacteriológico: La baciloscopía o el cultivo de la expectoración o de otros especímenes. Fracaso: La persistencia a partir del 6o. mes de tratamiento regular, de bacilos en la expectoración o en otros especímenes en dos muestras mensuales sucesivas, confirmadas por cultivo. Monorresistencia: La presencia de resistencia farmacológica a un solo medicamento. Multidrogorresistencia: La presencia de resistencia farmacológica múltiple a dos o más medicamentos. Quimioprofilaxis primaria: La administración de isoniacida con objeto de prevenir la complicación de la primoinfección tuberculosa. Quimioprofilaxis secundaria: La administración de isoniacida con objeto de prevenir la aparición de tuberculosis. Reactor al PPD: La persona que presenta una induración intradérmica de 10 mm. o más a las 72 horas, en el sitio de la aplicación de 2 UT de PPD RT 23.

39

Recaída: La reaparición de bacilos en la expectoración o en otros especímenes, después de haber egresado del tratamiento por curación. Resistencia primaria: Mycobacterium resistente en pacientes que no han recibido medicamentos antituberculosos. Resistencia secundaria: Mycobacterium inicialmente sensible que se torna resistente por el uso inadecuado de medicamentos antituberculosos. Retratamiento: El que se instituye por el médico especialista a un caso de tuberculosis multitratado, o en el que fracasó el tratamiento de corta duración. Tosedor: Toda persona que tiene tos con expectoración o hemoptisis y puede producir una muestra de esputo. Tratamiento autoadministrado: El que se aplica el paciente por sí mismo o vigilado por otra persona, utilizando los medicamentos que le entrega la unidad de salud. Tratamiento primario: El que se instituye por primera vez a un caso de tuberculosis. Tratamiento regular: Cuando el paciente cumple el 90% o más de las citas programadas para la administración de los medicamentos. Tratamiento supervisado: El que se aplica en los establecimientos de salud proporcionado y vigilado por el personal que presta el servicio, garantizando la toma total de dosis del medicamento al enfermo tuberculoso. Tuberculosis: Enfermedad infecciosa generalmente crónica causada por las especies del género Mycobacterium, M. tuberculosis y M. bovis que se transmite del enfermo al sujeto sano por la inhalación de material infectante o a través de la ingestión de leche de vaca contaminada, respectivamente. Tuberculosis pulmonar: Enfermedad de la tuberculosis, con localización patológica en tejido pulmonar.

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Tuberculosis extrapulmonar: Enfermedad de la tuberculosis, con localización patológica principalmente en tejido renal, o tejido ganglionar para esta investigación. Vacunado con BCG: La persona a quien se ha aplicado BCG y presenta una cicatriz atribuible a la vacuna en el sitio de la inoculación.

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