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Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia
PROFESOR PATROCINANTE: Juan Carlos Paredes G. INSTITUTO : Ciencias Químicas FACULTAD : Ciencias
PROFESOR CO-PATROCINANTE: Armin Mella N. INSTITUTO : Bioquímica y Microbiología FACULTAD : Ciencias
“EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE PROPÓLEOS Y MIEL SOBRE CEPAS NATIVAS DE STAPHYLOCOCCUS COAGULASA NEGATIVO AISLADAS DE MASTITIS BOVINA"
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico.
ÍTALO ESTEBAN RODRÍGUEZ AZÓCAR VALDIVIA-CHILE 2012
AGRADECIMIENTOS
“…y en lo de forzales que estudien esta o aquella ciencia no lo tengo por acertado, aunque el persuadirles no será dañoso…” Miguel de cervantes- El Ingenioso Hidalgo Don Quijote de la Mancha.
Mis más profundos agradecimientos recaen en toda mi familia y mis más cercanos, en especial a mis padres quienes nunca dejaron de creer en mí y entregarme ese apoyo incondicional, a través de sabios consejos a lo largo de todos estos años. Agradezco también a todos aquellos que hicieron posible, de una u otra forma la realización de este trabajo: -
PROYECTO
FIA:
“Actividad
antibacteriana
del
propóleos
como
coadyuvante en el control de la mastitis bovina”, por el financiamiento. -
Profesor Juan C. Paredes por darme la posibilidad de trabajar con él.
-
Profesor Armin Mella N. por todo el apoyo, acogida y buena disposición a lo largo de todo el tiempo de trabajo.
-
Profesor Bernardo Carrillo L.
-
Profesor Ronald Jara G. por la buena disposición siempre.
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ÍNDICE GENERAL
1. RESUMEN ........................................................................................................ 3 2. SUMMARY ........................................................................................................ 4 3. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 5 3.1.
Propóleos ................................................................................................... 5
3.1.1.
Características del Propóleos .............................................................. 7
3.1.2.
Composición del propóleos .................................................................. 8
3.1.3.
Obtención del propóleos ...................................................................... 9
3.1.4.
Propiedades y usos ............................................................................. 9
3.1.5.
Propiedad antibacteriana del propóleos ............................................. 10
3.2.
Miel ........................................................................................................... 13
3.2.1.
Características de la miel ................................................................... 13
3.2.2.
Composición de la miel ...................................................................... 14
3.2.3.
Obtención de la miel .......................................................................... 15
3.2.4.
Propiedades y usos ........................................................................... 16
3.2.5.
Propiedades antibacterianas de la miel ............................................. 17
3.3.
Staphylococcus coagulasa negativo (SCN) .............................................. 19
3.4.
Mastitis bovina .......................................................................................... 21
4. HIPÓTESIS ..................................................................................................... 26 5. OBJETIVOS .................................................................................................... 26 5.1.
Objetivo general ....................................................................................... 26
5.2.
Objetivos específicos................................................................................ 26
6. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 27
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6.1.
MATERIALES ........................................................................................... 27
6.1.1.
Reactivos ........................................................................................... 27
6.1.2.
Equipos .............................................................................................. 27
6.1.3.
Material biológico ............................................................................... 28
6.1.4.
Otros .................................................................................................. 28
6.2.
MÉTODO .................................................................................................. 28
6.2.1.
Obtención de las muestras ................................................................ 28
6.2.2.
Determinación de actividad antibacteriana ........................................ 29
6.2.3.
Lectura e interpretación ..................................................................... 33
7. RESULTADOS ................................................................................................ 34 7.1. Determinación de actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos de propóleos............................................................................................................ 34 7.2. Determinación de actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos de la mezcla propóleos-miel .................................................................................... 36 7.3.
Determinación de la capacidad antibacteriana de la miel......................... 38
7.4. Análisis comparativo de actividad antibacteriana entre la solución de propóleos y mezcla propóleos-miel .................................................................... 39 8. DISCUSIÓN .................................................................................................... 42 9. CONCLUSIONES ........................................................................................... 47 10.
ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ........................................................ 48
11.
ANEXOS ...................................................................................................... 55
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1. RESUMEN
Las enfermedades infecciosas desde hace siglos han sido un problema, debido a lo agresivos que son sus agentes causantes y a la resistencia que han adoptado frente a los antibacterianos usados para su tratamiento. Es por este motivo que ha surgido la necesidad de buscar nuevas formas de atacar estos agentes mediante productos naturales.
El presente estudio se enfocó principalmente a ensayar las capacidades antibacterianas que poseen el propóleos, miel y la mezcla entre ambas frente a cepas Staphylococcus coagulasa negativo, uno de los principales agentes causantes de mastitis bovina.
Para realizar este ensayo se utilizaron tres soluciones: propóleos, miel y por último una mezcla de ambos productos. La capacidad antibacteriana de la solución de propóleos y mezcla propóleos-miel estuvo determinada por la medición del diámetro de halos de inhibición formados en un medio de cultivo por método de difusión en agar, mientras que la capacidad antibacteriana para miel estuvo determinada por la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) mediante una técnica de incorporación en agar. Los resultados demostraron que el propóleos es efectivo sobre la totalidad de las cepas estudiadas, la mezcla propóleos-miel no logró superar los resultados obtenidos con la solución de propóleos, por su parte la miel también demostró efectividad sobre la mayoría de las cepas.
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2. SUMMARY
Infectious diseases have for centuries been a problem because of how aggressive they are the causative agents and the resistance they have taken against the antibacterials used for treatment. For this reason it became necessary to seek new ways to attack these agents using natural products.
This study is mainly focused on testing the capacities they possess antibacterial propolis and honey against coagulase-negative Staphylococcus strains, one of the main causal agents of bovine mastitis.
To perform this test we used three solutions: propolis, honey and finally a mixture of both products. The antibacterial capacity of the solution of propolis and propolis-honey mixture was determined by measuring the diameter of inhibition zones formed in a culture medium by agar diffusion method, while the honey antibacterial capacity was determined by the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by agar incorporation technique. The results showed that propolis is effective on all strains studied, propolis-honey mixture failed to overcome the result obtained with the solution of propolis, honey meanwhile also demonstrated effectiveness against most strains.
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3. INTRODUCCIÓN
Inicialmente los productos naturales fueron la fuente exclusiva de medicamentos y muchos de ellos nacieron a partir de información popular, otros a través de un estudio sistemático, debe considerarse entre estos a los antibióticos, obtenidos algunos de muestras de suelo, otros prácticamente al azar y algunos de cultivos fungales. Sólo en estos últimos años se han desarrollado programas sistemáticos tendientes a buscar actividad farmacológica específica en sustancias químicas seleccionadas (Bardisa y col., 1993).
La importancia de los productos apícolas en la actualidad se encuentra en constante crecimiento debido a sus diversas y beneficiosas propiedades. Dentro de estos productos, destacan la miel y la jalea real debido a su capacidad nutritiva por lo que es muy utilizada en niños y ancianos, el veneno de abeja usado en apiterapia, el polen que se utiliza como regulador de la función intestinal, la cera que se ocupa en la fabricación de velas, barnices, pomadas, ungüentos, entre otros y el propóleos con diversas propiedades que se mencionarán más adelante (Herrero, 2004).
3.1.
Propóleos
El propóleos es una substancia cérea y resinosa derivada de resinas vegetales que las abejas melíferas (Apis mellifera) recogen en los exudados de yemas de algunas especies de Populus (álamo), Alnus (aliso), Betula (abedul),
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Prunus (cereso y ciruelo) y Fraxinus (fresno) (Alarcón, 1989). En una red de apiarios de Chile central, las especies más frecuentes son sauce criollo (Salix humboldtiana) y eucalipto blanco (Eucalyptus globulus) entre las plantas endémicas e introducidas, respectivamente (Peña, 2008).
La palabra propóleos deriva del griego pro- que significa “en defensa” y polis- “ciudad”. El propóleos es recolectado por las abejas con objetivos ostensiblemente profilácticos, por el uso que de él hacen para bañar toda la colmena antes de iniciar en ella sus actividades (Alarcón, 1989).
Las abejas elaboran el propóleos mezclando sustancias activamente secretadas o exudadas por heridas de ciertos vegetales, con ceras, sus secreciones salivales y otras sustancias en proporciones variables. El fin es barnizar la colmena, actúa como desinfectante, cierra grietas, reduce vías de acceso y consolida los componentes estructurales (Bedascarrasbure y col., 2006).
Sin embargo el propóleos no es sólo un material de construcción, sino que también es el “arma química” de las abejas contra los microorganismos patógenos. La presencia de esta sustancia al interior de la colmena proporciona un ambiente inadecuado para el crecimiento de bacterias y otros microorganismos (Kartal y col., 2003). También es empleado para recubrir los cadáveres de animales que se pueden haber introducido en la colmena como escarabajos, roedores, lagartijas, etc. (Bedascarrasbure y col., 2006). Estas observaciones,
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impulsaron diversas investigaciones referentes a sus propiedades como antibacteriano, las cuales confirmaron dicha propiedad (Cornejo, 1993).
3.1.1. Características del Propóleos En general se puede asumir que el propóleos está compuesto por: resinas (en su mayoría), ceras, impurezas, polen y otros. Estos parámetros están influenciados por varios factores como: el medio ambiente, la época del año, el método de recolección, ubicación geográfica de la colmena y el tipo de abeja (Bedascarrasbure y col., 2006).
El color del propóleos varía, puede ser ocre, rojo, pardo, marrón claro o verde, algunos son friables y firmes, mientras que otros son gomosos y elásticos (Salatino y col., 2005). Así como estas características físicas varían de un propóleos a otro, también varían la intensidad de sus propiedades farmacológicas. Dichas diferencias se deberían a la diversidad de compuestos que posee y principalmente a las diferentes cantidades en que cada uno de estos componentes se encuentra (Cornejo, 1993).
La temperatura influye en la recolección de las resinas por parte de las abejas, por lo cual la época del año interviene notablemente en la cantidad de propóleos producido por éstas, por esta razón la recolección se realiza de preferencia entre primavera y verano, cuando la temperatura está más cercana a
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su temperatura de fusión, aumentando su productividad (Bedascarrasbure y col., 2006).
3.1.2. Composición del propóleos El propóleos contiene una amplia variedad de compuestos químicos; se han identificado más de 300 (De Castro, 2001), tales como polifenoles (flavonoides, ácidos fenólicos y sus ésteres, aldehídos, alcoholes y acetonas fenólicas), terpenoides, esteroides, aminoácidos y compuestos inórganicos (García y col., 2010). Sin embargo la composición de este producto de la colmena es altamente variable y dependiente de la flora local en el sitio de recolección (Bankova y col., 2000). Así, algunos estudios han demostrado que los propóleos de las regiones templadas (Europa, Norte América, Oeste de Asia) poseen como principales constituyentes compuestos fenólicos (flavonoides ácidos cinámicos), los cuales son colectados a partir de los exudados de diferentes brotes de álamo (Populus spp.), abedul (Betula alba), castaño de Indias (Aesculus hippocastanum) y otros árboles. No obstante, en las regiones tropicales donde está ausente esta vegetación, las abejas visitan otras plantas lo que conduce a diferencias en la composición química. En Brasil, por ejemplo, se han encontrado terpenoides y derivados de ácidos p-cumárico (Marcucci, 1995), mientras que en Chile se identificaron lignanos en muestras de propóleos obtenidas de Santa Cruz (VI Región) (Peña, 2008).
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3.1.3. Obtención del propóleos El propóleos se recolecta colocando en la parte superior de la colonia, por debajo de la tapa, una malla de plástico con una luz de 3mm. Como las abejas no pueden pasar tienden a cerrar el espacio. Cuando la malla está propolizada se conserva a temperaturas frigoríficas durante un tiempo, se saca y se enrolla. La producción media alcanza los 50g por colonia por año (Guzzetti y Santi, 2006).
Con éste nivel de producción se puede llegar a obtener hasta 300g al año al optimizar la producción de este material (Jean-Prost, 1995).
Otro sistema de recolección es el raspado de cabezales y cajones, tradicionalmente es la forma de extracción más utilizada (Guzzetti y Santi, 2006).
La recolección se debe realizar con mucho cuidado para separar el propóleos de la cera y no raspar la madera o cartón arrastrando impurezas al momento de la extracción (Cornejo, 1993).
3.1.4. Propiedades y usos El uso del propóleos en medicina popular en diversas enfermedades data desde hace muchos años atrás, puesto que se ha demostrado que es más efectivo
que
algunos
microorganismos patógenos.
medicamentos
convencionales
sobre
diversos
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El uso del propóleos para combatir infecciones bacterianas tiene como ventaja la no causa efectos secundarios. Es usado también como antifúngico, citostático, antioxidante y antinflamatorio (Sheller y col., 1990).
La presencia de metabolitos secundarios en el propóleos son los que le confieren estas propiedades terapéuticas, tal es el caso de los aceites esenciales cuyas propiedades fundamentales son su gran poder antiséptico, desinfectante y antihelmíntico (Bankova y col., 2000).
3.1.5. Propiedad antibacteriana del propóleos Sin dudas esta fue una de las primeras propiedades observadas en el propóleos. Estudios antropológicos señalan que los egipcios, quienes lo llamaban “cera negra”, basados en esta propiedad lo emplearon en la técnica de embalsamar cadáveres. Se señalan como principales responsables de esta propiedad los flavonoides galangina y pinocembrina y derivados del ácido benzoico, ferúlico y cafeico (Bedascarrasbure y col., 2006).
El propóleos con el descubrimiento de la penicilina (1928) en el advenimiento de los antibióticos modernos, se empezó a dejar de lado y paradójicamente, en la actualidad esa tendencia ha comenzado a revertirse. Cuanto más se avanza en el descubrimiento de antibióticos más poderosos, más se necesita conocer las propiedades terapéuticas del propóleos, que a través de
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sus extractos parciales o totales se ha mostrado efectivo contra cepas de gérmenes patógenos que ya adquirieron resistencia a los antibióticos tradicionales y que curiosamente con el tiempo no han mostrado resistencia al propóleos (Asís, 1996).
Un estudio realizado en el departamento de Bioquímica de la Universidad de Oxford informa que algunos flavonoides desactivan la energía de la membrana citoplasmática, inhibiendo la motilidad bacteriana, haciéndola más vulnerable al ataque del sistema inmunológico y potenciando los antibióticos. Previamente se determinó
que
el
propóleos
desorganiza
el
citoplasma,
la
membrana
citoplasmática y la pared celular causando bacteriólisis parcial e inhibiendo la síntesis proteica. Queda claro que la acción antimicrobiana es compleja y no se puede realizar una simple analogía con otra forma de acción de ningún antibiótico clásico (Bedascarrasbure y col., 2006).
El mayor efecto antibacteriano del propóleos se observa frente a bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus, incluso en cepas meticilino resistentes (Marcucci, 1995). También muestra susceptibilidad el Streptococcus beta hemolítico muchas veces responsable etiopatogénico de la amigdalitis pultácea, impétigo y de la erisipela entre otras infecciones (Bedascarrasbure y col., 2006).
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El propóleos puede ser utilizado como colutorio, no presentaría actividad antiplaca significativa, sin embargo, su actividad antibacteriana es semejante a la clorhexidina, que es utilizado para estos fines y que ocasiona efectos adversos con su uso prolongado como coloración en la dentadura. Un estudio in vitro por difusión de placa de cultivo, señala que el extracto etanólico de propóleos peruano en solución al 0,8% tiene una mejor acción antibacteriana contra Streptococcus mutans y Lactobacillus casei (microorganismos productores de caries), comparado con clorhexidina al 0,12%.
Se han creado cremas a base de propóleos, las cuales han demostrado ser beneficiosas debido a que reducen significativamente el promedio de piezas afectadas y además por la alta concentración de calcio (Ca2+) que posee, lo cual aumenta la dureza del esmalte (Eguizábal y Moromi, 2007).
En el caso del impétigo estafilocócico o estreptocócico, el propóleos reduce sensiblemente el período de cicatrización en el menos un 30 a 40% comparado con el uso de antibiótico. Esto es atribuido a la capacidad del propóleos de estimular los fibroblastos a sintetizar colágeno y disponer las fibras en forma paralela, contribuyendo a una mejor cicatrización (Bedascarrasbure y col., 2006).
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3.2.
Miel
La miel es una sustancia alimenticia producida por las abejas domesticas (Apis mellifera L.) con el néctar de las flores o de las secreciones azucaradas procedentes de partes vivas de las plantas o que se encuentran sobre ellas, a las que añaden diversos fermentos y enzimas existentes en su tubo digestivo que transforman éstos azúcares (Guzzetti y Santi, 2006). El néctar que transporta en su buche se mezcla con su saliva que contiene invertasa, ésta es una enzima que permite transformar la sacarosa del néctar en fructosa y glucosa. La abeja pecoreadora pasa lo obtenido a una abeja almacenista, quién también lo deposita en su buche, aumentando la concentración de invertasa. El proceso continúa a través de distintas abejas almacenistas. La última de ellas deposita el fluido convertido en miel en una celda. Durante todo el proceso, el contenido de agua del néctar se reduce desde un 70-92% hasta un 17% aproximadamente. La invertasa se desintegra totalmente, por lo tanto, la miel sale sin ningún rastro de su paso por el buche (Kavcic, 2010).
3.2.1. Características de la miel Es un producto biológico de composición compleja y diversa, variando sus caracteres en función de su procedencia, las plantas que han proporcionado el néctar, el procedimiento de extracción, etc. Así por ejemplo al ser recién extraída presenta un aspecto casi líquido y su consistencia aumenta con el tiempo, antes de un año de su extracción suele presentar un aspecto granuloso y se transforma
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en una masa pastosa, granulada y opaca. Su color varía desde los tonos blancos hasta los pardos oscuros; existen mieles rojizas, amarillentas o verdosas, aunque predominan los tonos castaños claro o ambarinos. Se sabe que mientras más oscura es la miel, más rica es en fosfato de calcio y hierro, la miel de color claro es más rica en vitamina A y las mieles oscuras son ricas en vitamina B1 y C (Guzzetti y Santi, 2006).
En general el sabor de las mieles de color claro es más suave que las de color oscuro, que lo tienen más intenso. Independientemente de su color, la miel puede ser más o menos dulce, a veces picante y, en algunos casos, extremadamente amarga, hasta el punto de no poder consumirse (Guzzetti y Santi, 2006).
3.2.2. Composición de la miel La miel es una compleja mezcla de carbohidratos y de compuestos minoritarios, producidos en la naturaleza. Los azúcares y el agua representan los componentes químicos principales de la miel (>95%); entre los primeros, fructosa (38%) y glucosa (31%) son los constituyentes principales. Los azúcares representan la porción más grande de la composición de la miel (95-99% de sólidos de la miel) (Muñoz y col., 2007), además tiene otros carbohidratos (12%), minerales (0,169%), proteínas (169mg/100g) con un contenido de agua de alrededor de un 17,2% (Voidarou y col., 2011).
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La miel posee la mayoría de los elementos esenciales para el organismo humano. Se constata la presencia de fosforo, hierro, calcio, cobre, magnesio, azufre, yodo, cloro, potasio y un conjunto extraordinario de oligoelementos esenciales para el organismo tales como: manganeso, silicio, boro, cromo, aluminio, litio, níquel, plomo, estaño, titanio, zinc y cadmio. También se han encontrado vitaminas A, E y K. También han sido descubiertos trazas de vitamina C, B1 y B2 (Guzzetti y Santi., 2006).
3.2.3. Obtención de la miel Dependiendo de las regiones, de la bonanza de la estación y de la duración de la floración, la miel se recoge normalmente una o dos veces al año. Los procedimientos de extracción se pueden reducir básicamente a los tres siguientes: • Extracción por decantación o escurrimiento: Se procede a decantar los panales desoperculados que no contengan larvas. Esto se aplica inmediatamente después de haber sacado los panales, cuando la miel está aún caliente y escurre con facilidad. Se ponen los panales sobre un tamiz fino y se frotan contra él, la miel fluye y se recoge en recipientes colocados bajo el tamiz. • Extracción por fuerza centrifuga: Es prácticamente el único método utilizado en la actualidad. Se comienza desoperculando las celdas que contienen la miel con cuchillos especiales, después se colocan las celdas en centrífugas y se verifica la extracción. La fuerza centrífuga hace que la miel salga de las
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celdas, atraviese una tela metálica y caiga sobre un recipiente. Luego la miel es pasada por un tamiz. • Extracción por prensado. Se obtiene por el prensado de los panales sin larvas, sin calentamiento o calentamiento moderado (Guzzetti y Santi., 2006).
La producción promedio anual de miel en Chile durante el periodo 2004 fue de 15.000 ton. de estas se exportaron 13.095 ton. con un retorno promedio de US$22.262 y tan solo representa el 0,5% del comercio mundial con un consumo medio de 100g por persona muy por debajo de los 1200g promedio que consumen países tales como Alemania. En Chile solo hay alrededor 14.000 apicultores con un total de 331.525 apiarios (Muñoz y col., 2007).
3.2.4. Propiedades y usos Los egipcios sabían que nada se estropeaba envuelto en miel por lo que la utilizaban junto al propóleos para embalsamar a sus muertos. Los atletas griegos tomaban miel antes de competir como alimento energético rápido. También los romanos daban mucha importancia a la miel hasta el punto que formaba parte de la dieta diaria de quien pretendía vivir muchos años. Plinio el Viejo afirma que conoció a ciento veinticuatro personas que comían diariamente miel y que habían rebosado los cien años. La miel llegó a ser tan popular en el Imperio Romano que se servía con vino en todas las celebraciones. Con frecuencia incluso era exigida como tributo a los enemigos vencidos (Herrero, 2004).
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La
miel
tiene
muchas
propiedades
terapéuticas,
se
puede
usar
externamente por sus propiedades antibacterianas y antisépticas, así ayuda a cicatrizar y a prevenir infecciones en heridas o quemaduras superficiales. También es utilizada en cosmética en la fabricación de cremas, mascarillas de limpieza facial, etc., debido a sus cualidades suavizantes y astringentes (Tonini, 2010).
La miel también es rica en elementos minerales como calcio y zinc, que la hacen un producto idóneo para esfuerzos físicos, y muy aconsejable en alimentación geriátrica y en niños en edad escolar. Actúa como vasodilatador, diurético y laxante debido a su alto contenido de fructosa. (Guzzetti y Santi, 2006).
Su poder cicatrizante sobre las heridas y afecciones cutáneas han sido demostradas científicamente, y se comprobó que las abejas agregan a la miel una enzima llamada glucosa oxidasa, la que provoca que cuando la miel es aplicada, se produce la liberación de peróxido de hidrógeno que ayuda a la regeneración de tejido (Tonini, 2010).
En los últimos años, se han descrito que los compuestos fenólicos son responsables su emergente carácter antioxidante (Muñoz y col., 2007).
3.2.5. Propiedades antibacterianas de la miel Desde tiempo atrás, ha habido evidencia creciente de la capacidad antibacteriana de la miel, la cual fue reconocida hace más de un siglo y ha sido
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extensivamente estudiada. Investigaciones realizadas in vitro han sugerido la efectividad de la miel frente a bacterias patógenas (Fangio y col., 2007).
Debido a que la miel es una solución sobresaturada de azúcares, con una mezcla de fructosa y glucosa del 84% y se produce una interacción tan fuerte entre estas moléculas que quedan muy pocas moléculas de agua disponibles para el crecimiento de bacterias (Olaitan, 2007).
Un gran rango de especies bacterianas ha mostrado ser inhibida por la miel pero los estudios de susceptibilidad no son consistentes. Falta de identificación botánica de la miel utilizada en estos estudios, o para identificar su potencial antibacteriano, hace que la comparación de las sensibilidades reportadas sea poco fiable (Cooper, 2002).
En estudios recientes se ha reportado la sensibilidad de patógenos o de bacterias aisladas de las heridas infectadas frente a mieles de origen floral conocido y de actividad antibacteriana definida. Sin embargo la inhibición de bacterias resistentes a antibióticos no ha sido explorada completamente (Cooper, 2002).
Se ha informado que la miel tiene un efecto inhibidor sobre unas 60 especies de bacterias, incluyendo aerobios y anaerobios, Gram positivos y Gam negativos. La miel pura ha demostrado ser bactericida contra muchos
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microorganismos patógenos como Salmonella Spp, Shigela Spp, E. coli, Vibrio cholerae entre otros Gram negativos y Gram positivos (Olaitan, 2007).
La prevalencia actual de las especies de bacterianas resistentes a los antibióticos ha llevado a una re-evaluación de la utilización terapéutica de remedios antiguos, incluyendo la miel. Se ha encontrado que la miel posee mayor actividad antibacteriana que algunos antibióticos ampliamente utilizados (Olaitan, 2007).
3.3.
Staphylococcus coagulasa negativo (SCN)
Actualmente el género bacteriano más frecuente aislado a partir de cuadros de mastitis clínicas y subclínicas es Staphylococcus. Para su diagnóstico se ha clasificado en dos grupos, coagulasa positivo (Staphylococcus aureus) y Staphylococcus coagulasa negativo (SCN) en base a la capacidad de éstos de coagular plasma de conejo (Taponen y Pyörälä 2009).
Los Staphylococcus coagulasa negativos son un coco Gram positivo y son los organismos que más comúnmente se aíslan de las muestras de vacas individuales de todo el mundo. (Philpot y Nickerson 2000).
Son bacterias residentes de la piel y mucosas sanas que constituyen entre el 65 al 90% de los Staphylococcus ailados en la piel (CODEINEP 2011). Los
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SCN forman parte de la microflora normal de la piel de las vacas y son considerados patógenos oportunistas y es por esto último, que la epidemiología de las mastitis causadas por SCN no está del todo clara. Sin embargo, SCN se pueden aislar de la piel, punta y canal del pezón como también de otros sitios extramamarios (Taponen y Pyörälä 2009).
Las
especies
Staphylococcus
coagulasa
negativos
son
el
grupo
predominante de bacterias en los estudios de prevalencia de mastitis en todo el mundo. Varios estudios se han llevado a cabo para desarrollar y evaluar métodos para la identificación de SCN a nivel de especies, pero la relevancia del diagnostico en la práctica de las especies lácteas aún está por determinar. (Sampimon y col., 2009).
Las distintas especies de SCN pueden diferir en la sensibilidad bacteriana, factores de virulencia, respecto del hospedero a la infección y transmisión. Para determinar los factores de virulencia individual de cada especie de SCN se necesita una identificación exacta de la especie bacteriana involucrada y así de esta manera a futuro poder desarrollar medidas de manejo acorde a las características de cada especie (Heikens y col., 2005).
Los cuadros de mastitis producidos por SCN se caracterizan por ser generalmente subclínicos, pueden producir daño en el tejido glandular y llevar a
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una disminución de la producción láctea. Tanto vaquillas como vacas pueden ser afectadas por estos patógenos antes del parto (Taponen y Pyörälä, 2009).
La mastitis causada por diferentes cepas de Staphylococus son extremadamente difíciles de controlar por el tratamiento solamente, estos colonizan extremos del pezón o lesiones anormales del pezón. Sus toxinas destruyen las membranas de las células y pueden dañar directamente la leche producida en el tejido fino, la formación de cicatrices y abscesos dan cuenta de una respuesta pobre al tratamiento antibiótico. Las células alveolares y de los conductos, pueden ser destruidas, reduciendo así la producción de leche (Jones y col., 1998).
3.4.
Mastitis bovina
La Federación Internacional de Lechería (1999), define a la mastitis bovina como una enfermedad inflamatoria de la glándula mamaria, que tiene por objetivo la eliminación del agente patógeno y la restauración de la funcionalidad del órgano. Además, describe dos categorías principales de mastitis, la primera que es la mastitis clínica en la cual se manifiestan signos claros y observables en la ubre del animal o en la leche y la otra categoría, que es la mastitis subclínica en la cual no se producen signos visibles en la ubre, excepto cuando se usan herramientas de diagnóstico tales como: determinación de enzimas inflamatorias o recuento de células somáticas (RCS). Considerando que la mayoría de los casos
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son subclínicos, se estima que por cada caso de mastitis clínica existirían en promedio entre 20 a 40 casos subclínicos (AGROBIT, 1998).
La palabra mastitis deriva del griego, donde mastos significa “mama” e itis “inflamación del.” Esta inflamación de la glándula mamaria resulta de: Traumatismos o lesiones en la ubre, irritaciones químicas o, más comúnmente, de infecciones causadas por microorganismos, especialmente bacterias. (Philpot y Nickerson, 2000).
Más de 140 microorganismos diferentes pueden causar mastitis y todos proliferan en la vaca o su entorno. De todos ellos, las bacterias son, por lejos la mayor causa de infección intramamaria en vacas lecheras. (Philpot y Nickerson, 2000).
La mastitis es la enfermedad del ganado lechero más costosa. De hecho las pérdidas originadas duplican las generadas por problemas de fertilidad o reproductivos. También desde el punto de vista de la productividad, del riesgo de la enfermedad del comercio internacional y del bienestar del animal, la mastitis ocupa el primer lugar. La mayoría de los productores lecheros reconoce las pérdidas debidas a: los casos clínicos con que se encuentran, los animales que tienen que descartar y las cuentas pagadas por drogas y asistencia veterinaria. La pérdida menos evidente, pero a su vez más importante, es la merma de
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producción de leche debida a casos de mastitis subclinica. (Philpot y Nickerson 2000).
En
Chile
sólo el año 2010,
las
pérdidas estimadas fueron de
aproximadamente 30.000 millones de pesos al año, considerando solamente que hubo una producción nacional de 1.900 millones de litros (ODEPA 2010).
Pedraza (1991) determinó que la disminución en la producción de leche por lactancia en vacas con mastitis clínica puede llegar a un 14% al compararla con la de animales que no presentaban la enfermedad. A éstas pérdidas económicas hay que agregar los costos relacionados con eliminación prematura de vientres por mastitis crónica y los costos de reemplazo, perdidas por eliminación de leche contaminada con antibacterianos, costos de la terapia medicamentosa y los honorarios médicos veterinarios (Morse, 1991, citado por Valenzuela, 2010).
En el país al igual que en la mayoría de los países, los antibacteriano son la principal herramienta terapéutica en el tratamiento y control de mastitis causada por bacterias. La administración del antibiótico y el diseño de un protocolo adecuado van a depender del conocimiento que se tiene del microorganismo causante de la enfermedad, del antimicrobiano mismo (toxicocinética y toxicodinamia del fármaco) y también de la interacción del microorganismo con el fármaco (sensibilidad y resistencia al fármaco). Dentro de los antibióticos más
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utilizados en el país están la ampicilina, oxacilina, cefalotina, ceftiofur, eritromicina y pirlimicina, entre otros. (San Martin y col., 2002).
En un estudio realizado en cepas de Staphylococcus aureus aisladas de diferentes rebaños lecheros de Finlandia, se determinó un incremento de la resistencia del 36,9% a un 63,6% entre los años 1988 y 1995, (Myllys y col., 1998 citado por San Martín 2002). Sin embargo, Sawant y col 2009 postula que los Staphylococcus coagulasa negativos tienden a ser más resistentes que staphylococcus aureus y fácilmente desarrollan multirresistencia.
Una técnica altamente probada y una de las mejores medidas en el control de la mastitis, es el “dipping” (Carrillo, 2007), que tiene como finalidad eliminar los gérmenes transferidos durante la ordeña, prevenir la colonización en el pezón lo que elimina un recurso de nueva infección y al mismo tiempo por su acción residual, reduce el número de gérmenes presentes en la próxima ordeña. Entre los productos más utilizados en la desinfección del pezón están: yodóforo 0.5 al 1% y clorhexidina 0.5 al 1%. Se ha comprobado que éstos pueden llegar a reducir la infección hasta en un 50% (SISIB 2004). Sin embargo, la naturaleza por su parte desarrolló complejos antibacterianos, concentrados en las resinas que exudan, para proteger a los vegetales superiores, cuando aquellos son dañados. Son sustancias de compleja composición, que actuando en sinergismo se potencian y logran reducir la posibilidad de que los gérmenes generen resistencia. Esa es la naturaleza del propóleos. Recientemente el propóleos resurge con grandes
25
posibilidades para ser utilizado como un recurso terapéutico valioso, dentro del “arsenal” de los antibacterianos, ya que múltiples estudios bacteriológicos in vivo e in vitro confirman su acción bacteriostática y bactericida (Bedascarrasbure y col., 2006).
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4. HIPÓTESIS
El propóleos y la miel tienen propiedades antimicrobianas que son efectivas contra Staphylococcus coagulasa negativo aislados de casos de mastitis bovina.
5. OBJETIVOS
5.1.
Objetivo general
Determinar la sensibilidad in vitro de cepas de Staphylococcus coagulasa negativo aisladas de casos de mastitis bovina frente a la miel y propóleos.
5.2.
Objetivos específicos
• Determinar mediante pruebas in vitro la actividad biológica del extracto de propóleos sobre 49 cepas de Staphylococcus coagulasa negativo aislados de casos de mastitis bovina. • Determinar mediante pruebas in vitro la actividad biológica de la solución de miel sobre 49 cepas de Staphylococcus coagulasa negativo aislados de casos de mastitis bovina. • Determinar mediante pruebas in vitro la actividad biológica de una mezcla propóleos-miel sobre 49 cepas de Staphylococcus coagulasa negativo aislados de casos de mastitis bovina.
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6. MATERIALES Y MÉTODOS
Para la realización de este ensayo se utilizó una solución etanólica de propóleos proveniente de la XIV región de Chile.
Se utilizó también miel natural de ulmo de colmenares ubicados en la localidad de Puyehue de la ciudad de Osorno.
6.1.
MATERIALES
6.1.1. Reactivos Agua destilada, agua destilada estéril, agua deionizada estéril, etanol absoluto p.a SIGMA-AIDRICH, agar Mueller Hinton BD, base para agar sangre BD, sangre de cordero estérilizada.
6.1.2. Equipos Rotavapor EYELA Digital wáter Batch SB-1000, Balanza analítica AND GR-200, freezer -70°C NUAIRE NU-9483E, autoclave MARKET FORGE, Camara de flujo laminar ESCO CLASS II BCS, pie de metro digital REDLINE mechanics, baño de agua termorregulado YCW-04M, estufa de cultivo BINDER, microondas DAEWOO KOR-31MS,
gabinete de vortex mixer 230V EU LABNET, destilador de agua
LABTECH, deionizador de agua ELGA reservoir 75L, refrigerador congelador LG GM-343SC, microscopio OLYMPUS CX31, pro-pipeta DRUMMOND PIPET AID.
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6.1.3. Material biológico Para determinar la actividad antimicrobiana in vitro se utilizó la cepa de referencia Staphylococcus aureus ATCC 25923 y 49 cepas nativas de Staphylococcus coagulasa negativo aisladas de mastitis bovina, todas pertenecientes al cepario del laboratorio de mastitis bovina del Instituto de Microbiología de la Universidad Austral de Chile.
6.1.4. Otros También fueron utilizados botellas de vidrio de 1, 0,5 y 0,25L, tubos de ensayo, vasos precipitados, papel parafilm, papel aluza aluminio, matraces elermeyer, probetas de 250, 100 y 50mL, matraz balón, placas petri plásticas y de vidrio, torulas de algodón estéril, asas de siembra, pipetas, micropipetas, tips estériles, capilares, jeringas de 5mL, tubos eppendorf.
6.2.
MÉTODO
6.2.1. Obtención de las muestras Se trabajó con tres tipos de muestras: muestras de propóleos, mezcla propóleosmiel y miel.
Para la obtención de muestras de propóleos se utilizó una solución al 7% p/v preparada a partir de un extracto de propóleos usando como disolvente una mezcla etanol-agua.
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Para la obtención de la mezcla de propóleos-miel se mezcló la solución de propóleos al 7% p/v en proporción 1:1 con una solución de miel al 20% p/v.
Para la obtención de las muestras de miel se utilizó miel natural de ulmo proveniente de colmenares ubicados en Puyehue en la ciudad de Osorno, la cual se diluyó en agua hasta obtener concentraciones de 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 y 2%.
6.2.2. Determinación de actividad antibacteriana
• Masificación de cepas en estudio Para la determinación antibacteriana se masificó las cepas en estudio, cada una por separado, método utilizado por Obando (2011). Con la ayuda de un asa de siembra estéril se extrajo un inóculo de un cepario de bacterias Staphylococcus coagulasa negativo y se sembraron cada una en una placa petri diferente de agar sangre, previamente preparada (Anexo 1), utilizando el método de estrías. Cada placa petri utilizada contenía 25mL de agar sangre. Una vez sembradas, las placas fueron incubadas en una estufa a 37°C por 24h. Luego de desarrollados los cultivos, como se muestra en la figura 1, se mantuvieron sellados con parafilm en una cámara fría a 4°C.
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A
B
Figura 1. Placa petri con Staphylococcus aureus sembrado en agar sangre (A); Placa petri con SCN cepa 49 sembrado sobre agar sangre (B).
• Determinación de actividad antibacteriana de la solución de propóleos Una vez preparada la solución de propóleos al 7% p/v obtenida a partir de un extracto etanólico, se determinó la capacidad de inhibición del crecimiento de las bacterias anteriormente mencionadas utilizando el método empleado por Obando (2011) con algunas modificaciones, para cada extracto obtenido y un blanco de la siguiente manera: Se prepararon suspensiones de cada uno de los microorganismos masificados, extrayendo un inóculo de cada cultivo respectivo de la cepa control con un asa de siembra esterilizada en un mechero y se depositó en un tubo de ensayo con 3mL de agua destilada. Luego de agitar se corroboró que la turbidez de la suspensión correspondía a 0,5 de la escala de turbidez de McFarland. Posteriormente en una cámara de flujo laminar se extrajo con una tórula de algodón estéril, una pequeña porción de cada suspensión y fue sembrada en placas petri con agar Mueller Hinton (Anexo 1), a las cuales se les hizo tres pocillos con la ayuda de tips
31
amarillos estériles (Anexo 2). Las placas se dejaron secar por unos 15 minutos a temperatura ambiente, para luego inocular las alícuotas de los extractos a los cuales se les quiere medir actividad antibacteriana; fueron tres inóculos, de 5, 10 y 25uL, respectivamente. Se cerraron las placas y se mantuvieron a temperatura ambiente por 20 min, para que se sequen, luego fueron incubadas por 24 horas a 37°C en una estufa de incubación. Después de la incubación, la actividad antibacteriana quedó determinada por la formación del halo de inhibición alrededor del inóculo, al cual se le midió el diámetro en mm.
Con el objeto de descartar el efecto del etanol, sobre las bacterias estudiadas, se preparó paralelamente un control negativo utilizando en los tres inóculos una mezcla 1:1 de etanol-agua sobre la cepa Staphylococcus aureus ATCC 25923, a la cual se le hizo el mismo procedimiento antes descrito y fue incubado por 24 Hrs a 37°C. • Determinación de actividad antibacteriana de la mezcla propóleos-miel Primero se mezcló la solución de propóleos al 7% p/v en proporción 1:1 con una solución de miel al 20% p/v. Luego se procedió a realizar el procedimiento descrito en el punto anterior.
• Determinación de actividad antibacteriana de miel Se realizaron diluciones en agua hasta obtener concentraciones de 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 y 2%. Antes de realizar el test, para determinar la concentración
32
inhibitoria mínima de la miel para cada una de las cepas, se determinó mediante una técnica de incorporación en agar (Mueller Hinton), método utilizado por French y col., (2005), con modificaciones. Lo primero fue realizar un control positivo, para ello se utilizó 2 placas con agar Mueller Hinton, sin miel, a las cuales se les inoculó 10µL de la bacteria, que para este caso fue Staphylococcus aureus ATCC 25923. Luego en tubos de 25mL se hizo una serie de diluciones de miel con agua deionizada estéril en el rango 4-40% (v/v) de concentración final de miel, en incrementos de 2%. Paralelamente a este procedimiento se prepararon soluciones de 25mL de agar Mueller Hinton al doble de su concentración, las cuales posteriormente fueron llevadas a autoclave para obtener soluciones estériles. Una vez esterilizadas, se dejaron por 30 min a 50°C en un baño de agua termorregulado. Luego en probetas de 50mL se mezclaron para obtener las soluciones finales, donde se obtuvieron 2 placas por cada probeta, cada una con 25mL al 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 y 2% de concentración final de miel que fueron usados para los ensayos de susceptibilidad. Se esperó que solidifiquen a T° ambiente, para inocular 10µL de solución bacteriana usando una micropipeta en tres filas de tres puntos hechos cada uno con la ayuda de un capilar de vidrio. Las placas inoculadas fueron incubadas a 37°C por 16h en una estufa de incubación, luego de ver si hubo crecimiento o inhibición, la información fue guardada para cada posición de inoculación. Fue tomada como la concentración inhibitoria mínima la concentración más baja de miel en la que el crecimiento de bacterias fue completamente inhibido.
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6.2.3. Lectura e interpretación Luego de ser incubadas las placas, los datos fueron registrados por medio de una ficha de medición de datos. La lectura se basa en la presencia o ausencia de halo de inhibición. Para efectos de este trabajo, la presencia de halo de inhibición indicó sensibilidad y la ausencia indicó resistencia bacteriana. Esta lectura e interpretación se utilizó para la determinación de actividad antibacteriana de los tres tipos de muestras.
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7. RESULTADOS
7.1.
Determinación de actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos de propóleos
Se ensayó la solución de propóleos sobre 49 cepas de Staphylococcus coagulasa negativo, describiéndose los halos de inhibición en el Anexo 3. Para realizar este ensayo se utilizaron alícuotas de 5, 10 y 25uL del extracto etanólico de propóleos. Como se muestra en el gráfico 1, de un total de 49 cepas analizadas se pudo observar que el 100% de las cepas presentó halo de inhibición. En los ensayos realizados el diámetro del halo de varió entre 8,7 y 13,8mm con un resultado promedio de 10,6mm para la alícuota de 5µL.
Por otro lado, para la alícuota de 10µL el halo varió entre 10,2 y 17,2mm promediando 12,4mm de diámetro. Finalmente, para la alícuota de 25µL el halo varió entre 13,8 y 21,5mm obteniéndose para las 49 cepas un promedio de 16,2mm de diámetro de halo de inhibición. Si bien es cierto, los halos no fueron iguales en cada inóculo para cada cepa, se mantuvo una tendencia inhibitoria en todas las cepas. La figura 2 muestra un resultado positivo para la cepa control comparado con uno positivo de la cepa 19, en ambos casos hay presencia de halo de inhibición en los tres inóculos de solución de propóleos.
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Gráfico 1: Diámetro halos de inhibición vs cepa estudiada. (Diámetro medido en mm).
A
B
B
Figura 2. Control positivo cepa Staphylococcus aureus ATCC 25923 (A) comparado con el mejor resultado obtenido (B) de las 49 cepas SCN sobre agar Mueller Hinton.
36
7.2.
Determinación de actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos de la mezcla propóleos-miel
Se ensayó la mezcla propóleos-miel sobre 49 cepas nativas de Staphylococcus coagulasa negativo, describiéndose el halo de inhibición en el caso correspondiente (Anexo 4). En estos ensayos se aplicaron tres inóculos, de 5, 10 y 25uL respectivamente. Como se muestra en el grafico 2, del total de cepas estudiadas, para la alícuota de 5µL solo 3 cepas, correspondientes al 6% del total de cepas fue sensible presentando halos de inhibición que varían entre 8,5 y 9,9mm promediando un diámetro de halo para las 3 cepas de 9,2mm.
Por otra parte, para la alícuota de 10µL, 12 cepas correspondientes al 24,5% del total mostraron sensibilidad obteniéndose halos de inhibición que variaron entre 8,7 y 11,3mm con un promedio de diámetro de halo para las 12 cepas de 10,0mm. Finalmente para la alícuota de 25µL, 42 cepas que corresponden al 86% del total resultó ser sensible observándose halos de inhibición que variaron entre 10,2 y 15,5mm con un promedio de halo de 11,6mm para las 42 cepas.
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Gráfico 2. Diámetro de halos de inhibición vs cepa estudiada. (Diámetro medido en mm).
En la figura 3 se puede observar una comparación entre la cepa control, un resultado positivo (presencia de halo de inhibición) que se obtuvo sobre la cepa 56 y un resultado negativo (ausencia de halo de inhibición) sobre la cepa 66.
A
B
Figura 3. Cepa control (A), comparada con un resultado positivo (B) y un resultado A negativo (C).
C
38
7.3.
Determinación de la capacidad antibacteriana de la miel
Probada la solución de miel sobre 49 cepas nativas de Staphylococcus coagulasa negativo se describe el crecimiento o inhibición para el caso que corresponda (Anexo 5).
Para evaluar la capacidad antibacteriana de la miel se procedió a determinar la concentración inhibitoria mínima, ensayando sobre las 49 cepas en placas petri de agar Mueller Hinton con diferentes concentraciones de miel, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 y 2%. La prueba arrojó que aproximadamente el 12% de las cepas resultaron ser resistentes frente a la miel, mientras que el 88% restante mostró sensibilidad a diferentes concentraciones de miel.
Ahora, sólo el 7% de las cepas que resultaron ser sensibles a la miel, se encuentran bajo la dilución de 10% (V/V) de concentración final de miel. El restante 93% de las cepas sensibles, se encuentran en soluciones con concentraciones superiores al 10% (V/V).
El 40% de las cepas sensibles,
resultaron inhibidas en su crecimiento a una concentración de 14% (V/V), por lo tanto la concentración inhibitoria mínima para el mayor número de cepas resultó ser a esta concentración final de miel. En la figura 4 se puede observar que a que las cepas 38 y 39 fueron completamente inhibidas a una concentración del 20% de miel, por su parte las cepas 37 y 40 resultaron ser resistentes a esta
39
concentración. La otra fotografía muestra un inóculo de la cepa 37 que confirma crecimiento bacteriano.
A
B
B Figura 4. Ejemplo de cepas sensibles y cepas resistentes a una concentración de 20% de miel. Cepas 38 y 39 sensibles a la solución, cepas 37 y 40 resistentes (A). Vista a lupa de un inóculo de la cepa 37 (B).
7.4.
Análisis comparativo de actividad antibacteriana entre la solución de propóleos y mezcla propóleos-miel
Se eligieron las cepas SCN N° 3, 13 Y 22, las cuales tuvieron halos nítidos y de mayor tamaño, tanto para la solución de propóleos como para la mezcla propóleos-miel. Posteriormente se hizo un análisis comparativo de la capacidad antibacteriana mediante la medición de halos de inhibición. Se analizaron
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comparativamente un inóculo de 20µL de propóleos versus dos inóculos, de 20 y 40µL respectivamente de mezcla propóleos-miel, como se muestra en la figura 5. Los resultados mostraron que la solución de propóleos presentó mayor capacidad antibacteriana que la mezcla propóleos-miel (Anexo 6).
Se observó que para cada una de las soluciones el inóculo de 20µL de propóleos fue más potente que todos los inóculos de 20µL de mezcla observándose un halo de inhibición de 11,8mm en la cepa N°3, de 12,3mm en la cepa N°13 y un diámetro de halo de inhibición de 18,6mm en la cepa 22, mientras que el inóculo de 20µL de mezcla presentó halo de inhibición sólo en la cepa N°22 y fue de 14,0mm. En el inóculo de 40µL se obtuvieron diámetros de halo de inhibición de 11,0mm, 11,7mm y 18,5mm para las cepas 3, 13 y 22 respectivamente.
41
Figura 5. Halos de inhibición de propóleos y mezcla propóleos-miel sobre la cepa SCN N°22. (A) Halo de inhibición en inóculo de 20µL de propóleos. (B) Halo de inhibición en inóculo de 20µL de mezcla. (C) Halo de inhibición en inóculo de 40µL de mezcla.
42
8. DISCUSIÓN
Aunque la identificación, el conocimiento y la determinación del papel de los microorganismos como responsables de las enfermedades infecciosas son hechos recientes, el interés por conocer las causas de la infección y el modo de combatirla comenzaron, sin embargo mucho antes; son tan viejos como el hombre. (GarcíaRodríguez y col., 1997). Los antibióticos son considerados habitualmente como uno de los descubrimientos más importantes de la medicina. En la actualidad es muy improbable que alguien pueda vivir su vida sin recibir algún tipo de agente antimicrobiano. (Belloso, 2009).
El presente estudio se llevó a cabo para analizar la capacidad antibacteriana de propóleos y miel sobre 49 cepas de Staphylococcus coagulasa negativo, bacterias Gram positivas que provocan mastitis en bovinos. Delgado y col. (2006), describe que el propóleos sería más efectivo contra bacterias Gram positivas que contra bacterias Gram negativas.
Probando mediante ensayos in vitro un extracto etanólico de propóleos al 7% p/v, sobre 49 cepas nativas de SCN provenientes de vacas contagiadas con estas bacterias, se comprobó que efectivamente el propóleos es útil inhibiendo in vitro el crecimiento de microorganismos productores de mastitis bovina, por lo tanto se confirma que el propóleos utilizado posee actividad antimicrobiana, debido que al ensayar tres alícuotas de solución de propóleos, de 5, 10 y 25µL
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respectivamente, todas mostraron ser efectivas sobre la totalidad de las cepas en estudio, obteniéndose halos de inhibición que variaron entre 8,7 y 13,8mm, 10,2 y 17,2mm y de 13,8 hasta 21,5mm, para los inóculos de 5, 10 y 25µL respectivamente.
Al analizar los halos de inhibición se puede observar que tienen diferentes magnitudes sobre las diferentes cepas, pero la actividad antimicrobiana está presente sobre todas las cepas en estudio. Los resultados de actividad antibacteriana
determinados
en
este
estudio
concuerdan
con
aquellos
encontrados por Delgado y col., (2006), quien observó una marcada acción del propóleos contra bacterias Gram positivas, principalmente sobre Staphylococcus aureus y Staphylococcus agalactiae obteniendo halos de inhibición de 19 y 21mm de diámetro respectivamente, para alícuotas de 100µL. Woisky y col, (1994), y García y col, (2010), también obtuvieron resultados similares, apoyando la hipótesis de que el propóleos es activo principalmente contra bacterias Gram positivas. Los antibacterianos pueden ser capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos por sí mismos, pero al encontrarse combinados, pueden tener diferentes reacciones, pueden actuar en sinergia, lo que significa que la acción del conjunto de antibióticos es mayor incluso que la suma de cada uno utilizado individualmente. Si actúan en adición, significa que la acción combinada es igual a la suma de las acciones independientes. También se puede dar antagonismos, donde la acción combinada es menor que la del producto más eficaz utilizado solo.
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Del mismo modo la interacción puede ser indiferente y la acción combinada no es más potente que la del producto más eficaz cuando se emplea solo (Florez y col., 1997). Es por esto que también se ensayó, sobre las cepas SCN, una mezcla propóleos-miel que arrojó resultados interesantes. Lo más lógico era pensar que mezclando éstas dos soluciones antibacterianas se potenciarían, sin embargo, sólo el 6% de las cepas presentaron sensibilidad con la alícuota de 5µL, el 29% la tuvo en alícuotas de 10µL y el 86% presentó sensibilidad a la mezcla propóleosmiel con la alícuota de 25µL. Esto se contrapone a los resultados obtenidos con cada producto por separado; el ensayo con propóleos indicó que las tres alícuotas inoculadas en la placa resultaron ser 100% efectivas, o sea la totalidad de las cepas resultó ser sensible a propóleos en sus tres alícuotas, 5, 10 y 25µL, respectivamente. Tomando en cuenta estos resultados sugieren que mezclando la solución de propóleos con la solución de miel queda descartada una potenciación entre ambas soluciones para inhibir la cepa bacteriana utilizada en este caso, sino mas bien, hay un cierto grado de antagonismo lo que indicaría que en una de ellas, ya sea la miel o el propóleos, existe algún componente que produce antagonismo o inhibición sobre la acción bacteriana.
La miel ha sido cada vez más utilizada en el tratamiento de heridas infectadas, donde los productos farmacéuticos convencionales han fallado, sobre todo ahora que están disponibles en el mercado miel estéril y apósitos
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impregnados con miel estéril (French y col., 2005); por lo tanto es razonable considerar la aplicación profiláctica de miel.
Existen muy pocos estudios que muestran sensibilidad in vitro de miel sobre cepas de SCN, es por ello que éste trabajo se planteó entre sus objetivos el determinar la capacidad antibacteriana in vitro de miel, mediante concentración inhibitoria mínima, sobre diferentes cepas de SCN productoras de mastitis en bovinos.
Para los ensayos se utilizó una miel natural de ulmo proveniente de colmenares ubicados en la localidad de Puyehue de la ciudad de Osorno, sobre 49 cepas SCN, demostrando una efectividad marcada sobre la mayoría de las cepas en estudio. El 88% de las cepas resultaron ser sensibles a la miel a diluciones iguales o mayores de 10% de concentración final de miel, lo que, en cierta medida, difiere con lo propuesto por French y col, 2005, quien probó 18 cepas SCN resultando el 100% de las cepas sensibles a la solución de miel pero a concentraciones de 2,7-5%. Lo que queda claro es la marcada capacidad antibacteriana que posee la miel sobre cepas bacterianas, en este caso, SCN. Por lo tanto se puede deducir que la miel tiene un gran potencial para ser usada como un agente antibacteriano en la profilaxis y el control de enfermedades causadas por SCN causantes de mastitis en bovinos.
46
Las diferencias señaladas en el párrafo anterior pueden deberse a algunos factores como por ejemplo la composición química de la miel, debido a un distinto origen botánico de la miel utilizada, lo que llevó a concentraciones inhibitorias mínimas diferentes en los estudios comparados, lo cual no pone en duda su capacidad antibacteriana global. Esto se corrobora claramente en un trabajo realizado por Voidarou y col, 2011, que utilizaron mieles de diferentes procedencias para ser probadas sobre diferentes cepas bacterianas. Además, señala que las diferencias entre regiones en la resistencia de cepas bacterianas son muy frecuentes.
Por lo tanto, la investigación de la actividad antibacteriana de la miel procedente de diferentes lugares geográficos debe continuar y ser profundizada para poder identificar cuáles son realmente los agentes antibacterianos y también aclarar los mecanismos de cura sobre las infecciones.
47
9. CONCLUSIONES
Según los resultados obtenidos en este estudio, y su correspondiente discusión se puede concluir que:
Se confirmó in vitro que la solución de propóleos utilizado resultó ser efectivo sobre la totalidad de las cepas nativas de SCN, por lo que se acepta la hipótesis de las propiedades antibacterianas de éste.
Se acepta la hipótesis que la miel es efectiva sobre cepas SCN productoras de mastitis en bovinos, inhibiendo su crecimiento.
Para la mezcla propóleos-miel se confirmó que no presenta actividad sobre todas las cepas SCN, lo cual sugiere que al mezclar las soluciones estas presentan un cierto grado de antagonismo.
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10. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
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55
11. ANEXOS
Anexo 1. Preparación de medios de cultivo.
Agar Base Sangre: Para 100 mL de agua destilada, pesar 4g de base para agar sangre y agregar sobre el agua. Cerrar y agitar hasta disolver. Luego autoclavar por 60 minutos. Dejar enfriar hasta que alcance aproximadamente 50°C y finalmente agregar la sangre de cordero estéril que corresponde al 5% de la solución.
Agar Mueller Hinton: Para 100mL de agua destilada, pesar 3,8g de ase para agar Mueller Hinton, y agregar sobre el agua. Cerrar y agitar hasta disolver. Autoclavar por 60 min aproximadamente. Dejar enfriar por 20 minutos.
56
Anexo 2. Preparación de los pocillos en placas de agar Mueller Hinton.
Verter sobre las placas 15mL de agar Mueller Hinton aprox., dejar enfriar por algunos minutos hasta solidificar, posteriormente fijar sobre el agar tres tips amarillos en distancias equidistantes, luego se rellenan las placas con 10mL de agar. Una vez enfriadas y solidificadas las placas, se procede a sacar los tips para dejar el pocillos listo para recibir el inóculo.
Figura 6. Fijación de tips sobre agar, para luego proceder al rellenado de placas.
57
Anexo 3. Tamaño de halos de inhibición producidos por la solución de propóleos para cada una de las cepas de Staphylococcus coagulasa negativo. La tabla muestra estudio completo (1), luego la repetición (2) y finalmente el promedio de las dos pruebas.
N° CEPA
PROPÓLEOS 1
PROPÓLEOS 2
Diámetro del halo de inhibición (mm) 5uL 10uL 25uL
Diámetro del halo de inhibición (mm) 5uL 10uL 25uL
RESULTADOS PROMEDIO Diámetro del halo de inhibición (mm) 5uL 10uL 25uL
SCN 1
11,2
12,3
15,4
11,68
13,67
16,08
11,4
13
15,7
SCN 2
10,5
13,1
15,3
10,98
13,4
17,25
10,8
13,2
16,3
SCN 3
12
15,4
17,6
11,1
13,15
15,84
11,5
14,3
16,7
SCN 4
10,8
12,8
17,5
10,97
12,72
15,71
10,9
12,7
16,6
SCN 5
11,3
13,3
19,8
13,19
14,8
17,87
12,3
14,1
18,9
SCN 6
12,3
12,9
15,8
11,81
13,69
16,79
12,1
13,3
16,3
SCN 7
10,3
13,3
16,6
10,2
12,71
14,55
10,2
13
15,6
SCN 8
10,7
14,1
18,6
12,22
14,9
17,55
11,5
14,5
18,1
SCN 9
9,2
12,2
17,4
15,16
15,83
17,61
12,2
14
17,5
SCN 50
10,9
12,9
15,8
10,95
13,25
18,51
10,9
13,1
17,2
SCN 11
11,8
12,4
18,1
10,67
12,38
16,38
11,2
12,4
17,3
SCN 13
12,2
14,1
17,9
10,15
10,61
15,64
11,2
12,4
16,8
SCN 14
12,1
15,1
20,1
14,57
16,89
22,18
13,4
16
21,1
SCN 15
11,2
13,1
18,2
9,86
12,17
16,52
10,5
12,6
17,3
SCN 16
10,9
11,6
16,7
10,73
12,2
16,86
10,8
11,9
16,8
SCN 18
10,9
11,5
16,1
10,58
13,31
17,12
10,8
12,4
16,6
SCN 19
10
11
14,8
9,44
9,91
14,21
9,7
10,5
14,5
SCN 20
9,7
10,5
16,2
10,46
11,45
15,4
10,1
11
15,8
SCN 22
13,6
17,5
22,6
13,94
16,94
20,47
13,8
17,2
21,5
SCN 23
9,2
11,3
16,4
10,03
11,93
17,21
9,6
11,6
16,8
SCN 24
9,4
12,1
15,4
11,9
14,28
16,61
10,6
13,2
16
SCN 25
8,2
11
15
11,23
12,31
15,48
9,7
11,6
15,2
58
Continuación Anexo 3. SCN 26
8,1
10,7
15,1
10,23
11,47
15,8
9,2
11,1
15,4
SCN 27
8,3
10,4
15,1
10,22
12,87
17,63
9,3
11,6
16,4
SCN 31
8,3
9,9
13,4
10,25
12,25
15,35
9,3
11,1
14,4
SCN 35
9,6
11,4
14,8
10,05
11,93
15,13
9,8
11,7
15
SCN 37
10,2
12,1
14,9
12,01
13,16
16,89
11,1
12,6
15,9
SCN 38
9,5
12
15,8
9,71
10,44
14,6
9,6
11,2
15,2
SCN 39
9,8
12
16,2
9,82
11,15
14,7
9,8
11,6
15,5
SCN 40
10
10,8
15,5
9,55
10,68
14,5
9,8
10,7
15
SCN 41
9,9
12,4
17,9
11,49
14,34
17,27
10,7
13,4
17,6
SCN 45
10,4
11,9
16,3
9,21
10,66
14,5
9,8
11,3
15,4
SCN 46
10,4
12,2
14,7
10,39
12,3
14,15
10,4
12,3
14,4
SCN 47
9,2
12,6
15,6
9,94
11,01
14,08
9,6
11,8
14,8
SCN 48
9,8
10,6
14,9
10,26
11,11
14,33
10
10,9
14,6
SCN 49
10,3
11,5
15,1
9
11,44
14,34
9,6
11,5
14,7
SCN 10
9,5
11,3
14,6
9,19
11,22
15,54
9,4
11,3
15,1
SCN 51
9,2
11,5
17,2
8,4
8,8
13,93
8,8
10,2
15,6
SCN 53
11,1
11,6
16,1
9,58
10,57
14,64
10,3
11,1
15,4
SCN 54
12,7
14,8
17,3
10,48
11,56
14,51
11,6
13,2
15,9
SCN 55
12,3
15,9
17,8
8,75
10,84
14,66
10,5
13,4
16,2
SCN 56
14,1
17,2
18,3
11,95
13,95
16,74
13
15,6
17,5
SCN 57
9,6
14,7
19,5
9,7
10,94
15,76
9,6
12,8
17,6
SCN 58
14,9
15,5
18,5
9,68
10,43
14,59
12,3
13
16,5
SCN 59
11,6
13,1
18,2
8,89
9,85
13,39
10,3
11,5
15,8
SCN 60
10,9
13,2
17,9
9,52
10,6
13,4
10,2
11,9
15,7
SCN 63
10
13,2
17,4
7,41
8,98
12,68
8,7
11,1
15,1
SCN 65
11
14
16,2
10,09
11,04
14,15
10,5
12,5
15,2
SCN 66
9
11,2
14,3
9,86
10,63
13,3
9,4
10,9
13,8
Staph. Aureus ATCC 25923
14,2
15,7
19
15,18
16,04
25,58
14,7
15,9
22,3
59
Anexo 4. Tamaño de halos de inhibición producidos por la mezcla propóleos-miel para cada una de las cepas de Staphylococcus coagulasa negativo. La tabla muestra estudio completo (1), luego la repetición (2) y finalmente el promedio de las dos pruebas.
Diámetro del halo de inhibición (mm) 5uL 10uL 25uL
Diámetro del halo de inhibición (mm) 5uL 10uL 25uL
RESULTADOS PROMEDIO Diámetro del halo de inhibición (mm) 5uL 10uL 25uL
SCN 1
-------
-------
12,5
-------
9,5
11,0
-------
-------
11,8
SCN 2
-------
-------
10,8
-------
-------
9,5
-------
-------
10,2
SCN 3
-------
-------
11,2
-------
-------
10,6
-------
-------
10,9
SCN 4
-------
-------
10,2
-------
-------
11,7
-------
-------
10,9
SCN 5
-------
10,0
15,8
-------
-------
11,9
-------
-------
13,9
SCN 6
-------
-------
11,2
-------
--------
10,1
-------
-------
10,6
SCN 7
-------
-------
9,1
-------
--------
-------
-------
-------
-------
SCN 8
-------
9,9
13,3
-----
--------
10,7
-------
-------
12,0
SCN 9
-------
8,8
13,6
-----
-------
10,1
-------
-------
11,9
SCN 50
-------
-------
11,4
-------
--------
9,9
-------
-------
10,6
SCN 11
-------
8,5
12,9
-------
--------
11,1
-------
-------
12,0
SCN 13
-------
8,2
10,3
-------
--------
11,2
-------
-------
10,8
SCN 14
-------
-------
10,3
-------
--------
10,6
-------
-------
10,5
SCN 15
-------
-------
12,5
-------
--------
10,0
-------
-------
11,2
SCN 16
-------
-------
11,1
-------
--------
-------
-------
-------
-------
SCN 18
-------
9,0
11,6
-------
------
11,6
-------
-------
11,6
SCN 19
-------
-------
9,8
-------
-------
-------
-------
-------
-------
SCN 20
-------
9,0
11,1
-------
--------
13,3
-------
-------
12,2
SCN 22
8,2
8,2
9,4
-------
--------
14,4
-------
-------
11,9
SCN 23
------
-------
--------
-------
8,5
10,0
-------
-------
-------
SCN 24
-------
-------
11,7
-------
-------
11,2
-------
-------
11,4
SCN 25
-------
-------
--------
-------
--------
-------
-------
-------
-------
SCN 26
------
-------
10,1
-------
--------
11,3
-------
-------
10,7
SCN 27
-------
-------
12,4
------
--------
11,6
-------
-------
12,0
SCN 31
-------
-------
11,4
------
------
9,2
-------
-------
10,3
SCN 35
-------
-------
10,7
------
------
12,2
-------
-------
11,4
SCN 37
-------
-------
10,9
------
9,1
13,3
-------
-------
12,1
Propóleos-Miel (1) N° CEPA
Propóleos-Miel ( 2 )
60
Continuación Anexo 4 SCN 38
-------
-------
10,8
------
------
10,4
-------
-------
10,6
SCN 39
-------
9,3
10,6
------
------
12,5
-------
-------
11,6
SCN 40
-------
9,2
10,9
------
------
9,6
-------
-------
10,2
SCN 41
-------
10,4
12,4
8,8
9,6
11,3
-------
10,0
11,9
SCN 45
9,2
9,8
13,9
-------
8,6
11,1
-------
9,2
12,5
SCN 46
8,9
9,5
11,7
-------
9,2
10,1
-------
9,3
10,9
SCN 47
-------
10,5
12,8
-------
--------
10,7
-------
-------
11,7
SCN 48
-------
10,9
13,7
-------
8,2
11,9
-------
9,6
12,8
SCN 49
9,6
13,5
14,2
-------
9,1
13,7
-------
11,3
13,9
SCN 10
9,7
11,0
12,4
-------
9,1
11,1
-------
10,0
11,7
SCN 51
8,1
10,0
12,3
-------
9,4
12,0
-------
9,7
12,2
SCN 53
8,9
10,4
13,0
-------
9,2
10,0
-------
9,8
11,5
SCN 54
10,5
13,3
14,2
7,7
9,1
11,3
9,1
11,2
12,8
SCN 55
8,4
11,3
13,0
8,5
9,2
11,7
8,5
10,2
12,4
SCN 56
11,7
12,0
14,3
8,2
10,4
16,7
9,9
11,2
15,5
SCN 57
-------
-------
--------
-------
--------
10,4
-------
-------
-------
SCN 58
-------
-------
9,4
-------
--------
12,2
-------
-------
10,8
SCN 59
-------
-------
10,5
-------
--------
9,9
-------
-------
10,2
SCN 60
-------
-------
11,6
-------
--------
11,3
-------
-------
11,4
SCN 63
-------
-------
10,6
-------
--------
10,3
-------
-------
10,4
SCN 65
-------
9,0
11,7
-------
8,5
10,8
-------
8,7
11,2
SCN 66
-------
-------
--------
-------
--------
9,0
-------
-------
-------
Staph. Aureus ATCC 25923
8,5
10,2
15,0
-------
--------
13,0
-------
-------
14,0
61
Anexo 5. Resultados obtenidos una vez ensayada la solución de miel a las diferentes diluciones la zona marcada muestra concentración inhibitoria mínima. Donde (-) es no crecimiento bacteriano; (+) crecimiento bacteriano. En rojo se muestran las cepas que presentaron resistencia a la miel. N°CEPA
20% 18% 16% 14% 12% 10% 8% 6% 4% 2%
SCN 1
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 2
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 3
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 4
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 5
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 6
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
SCN 7
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 8
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 9
-
-
-
-
+
+
+
+
+
SCN 50
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
SCN 11
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
SCN 13
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
SCN 14
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
SCN 15
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
SCN 16
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 18
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
SCN 19
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
SCN 20
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 22
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
SCN 23
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 24
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
SCN 25
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 26
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 27
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 31
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 35
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 37
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 38
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
SCN 39
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
SCN 40
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 41
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
62
Continuación Anexo 5 SCN 45
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 46
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 47
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 48
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 49
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
SCN 10
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
SCN 51
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 53
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 54
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 55
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 56
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
SCN 57
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
SCN 58
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 59
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 60
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
SCN 63
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
SCN 65
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
SCN 66
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
Staph. Aureus ATCC 25923
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
63
Anexo 6. Análisis comparativo entre solución de propóleos y mezcla propóleosmiel. Se ensayó 20µL de solución de propóleos v/s 20 y 40µL de mezcla propóleos-miel y se calculó el diámetro del halo de inhibición. Se realizaron dos ensayos por cada cepa y para cada inóculo calculando sus respectivos promedios de halo.
N°CEPA SCN 3
1 Diámetro del halo de inhibición (mm)
2 Diámetro del halo de inhibición (mm)
PROPÓLEOS
PROPÓLEOS
PROPÓLEOS-MIEL
PROPÓLEOS-MIEL
RESULTADOS PROMEDIO Diámetro del halo de inhibición (mm) PROPÓLEOS
PROPÓLEOS-MIEL
20µL
20µL
40µL
20µL
20µL
40µL
20µL
20µL
40µL
12.1
-------
11.2
11.5
8.7
10.8
11.8
-------
11.0
12.1
8.6
11.7
12.4
-------
11.6
12.2
-------
11.7
17.8
13.0
18.0
19.3
14.0
18.9
18.5
13.5
18.5
SCN 13 SCN 22