UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

EVALUACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE LA FIBRA DE ALPACA MEDIANTE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS)

TESIS DE MAGÍSTER

ALI WILLIAM CANAZA CAYO VALDIVIA – CHILE 2009

EVALUACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE LA FIBRA DE ALPACA MEDIANTE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS)

Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magíster en Ciencias Mención Producción Animal

Por

ALI WILLIAM CANAZA CAYO VALDIVIA – CHILE 2009

Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Agrarias INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE MAGISTER La Comisión Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de Graduados de la Facultad de Ciencias Agrarias que la Tesis de Magíster presentada por el candidato ALI WILLIAM CANAZA CAYO Ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el día 13 de Julio de 2009 como requisito para optar al grado de Magíster en Ciencias Mención Producción Animal y, para que así conste para todos los efectos firman:

Profesor Patrocinante Daniel Alomar Carrió Ing. Agr., M. Sc. Comisión Evaluadora Luis Latrille Lanas Ing. Agr., M. Sc., Ph. D.

Ximena Valderrama Linares Ing. Agr., M. Sc., Ph. D.

DECLARACIÓN Yo, Ali William Canaza Cayo, declaro que soy el autor del presente trabajo, que lo he realizado en su integridad y no lo he publicado para obtener otros Grados o Títulos.

ÍNDICE DE MATERIAS Capítulo

Página RESUMEN

1

ABSTRACT

3

1

INTRODUCCIÓN GENERAL

5

2

REVISION DE BIBLIOGRAFIA

9

2.1

Situación actual de los camélidos sudamericanos

10

2.2

Características de la fibra de alpaca

11

2.3

Métodos de análisis del Diámetro de Fibras

15

2.3.1

Método del Microscopio de Proyección

16

2.3.2

Método AirFlow

17

2.3.3

Método del Laserscan

18

2.3.4

Método del OFDA (Optical Fibre Diameter Analyser)

18

2.4

Técnica de Espectroscopia de Reflectancia en el Infrarrojo Cercano - NIRS

19

2.4.1

Fundamentos de la técnica

21

2.4.1.1

Regiones espectrales

21

2.4.1.2

Espectros del infrarrojo cercano

22

2.4.1.3

Absorción de las bandas en el infrarrojo cercano

23

2.4.2

Calibración

25

2.4.3

Técnicas de calibración

27

2.4.3.1

Regresión Lineal Múltiple

28

2.4.3.2

Regresión de Componentes Principales

29

2.4.3.3

Regresión de Mínimos Cuadrados Parciales

29

2.4.3.4

Cuadrados de Mínimos Parciales Modificados

30

2.4.4

Análisis Discriminante

30

2.4.5

Pretratamiento de los datos

31

2.4.6

Evaluación de la capacidad predictiva del modelo

32

2.4.7

Detección de valores discrepantes (outliers)

34

2.5

Técnica NIRS aplicada a la evaluación de lanas

34

3

CLASIFICACIÓN DE LA FIBRA DE ALPACA

38

(Lama pacos) DE DIFERENTES LOCALIDADES, SEXO Y COLOR MEDIANTE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS) Y ANÁLISIS MULTIVARIADO ABSTRACT

39

RESUMEN

40

3.1

INTRODUCCIÓN

41

3.2

MATERIALES Y METODOS

44

3.2.1

Muestras de fibra

44

3.2.2

Análisis de espectros en la regiones VIS y NIR

45

3.2.3

Análisis de Componentes Principales (PCA)

46

3.2.4

Análisis discriminante

47

3.3

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

48

3.3.1

Análisis de espectros VIS-NIR de las muestras

48

3.3.2

Análisis de Componentes Principales (PCA)

52

3.3.3

Análisis discriminante

56

3.4

CONCLUSIÓN

59

3.5

REFERENCIAS

60

EVALUACIÓN DE PARÁMETROS DEL

66

4

DIÁMETRO DE FIBRA EN ALPACAS (Lama pacos) MEDIANTE EL USO DE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS) ABSTRACT

67

RESUMEN

68

4.1

INTRODUCCIÓN

70

4.2

MATERIALES Y METODOS

72

4.2.1

Muestras

72

4.2.2

Lectura de espectros

73

4.2.3

Análisis de referencia de las muestras de fibra

74

4.2.4

Calibración y Análisis Estadístico

75

4.3

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

76

4.3.1

Descripción de las muestras

76

4.3.2

Espectros NIRS de las muestras

78

4.3.3

Predicción NIR de los parámetros de la fibra de alpaca

80

4.4

CONCLUSIONES

85

4.5

REFERENCIAS

86

5

DISCUSIÓN GENERAL

92

6

CONCLUSIONES GENERALES

96

7

REFERENCIAS GENERALES

98

ANEXOS

109

INDICE DE TABLAS Tabla

Página

1

División y Características de la región infrarroja

22

2

Bandas de absorción en el infrarrojo cercano de

23

compuestos orgánicos 3

Numero de muestras recolectadas por localidad, sexo y

45

color de fibra 4

Resultados de la clasificación de las ecuaciones

57

discriminantes NIRS para localidad, sexo y color de fibra 5

Indicadores estadísticos de las mediciones de referencia

77

en fibra de alpaca 6

Coeficientes de correlación pearson entre parámetros de

79

fibra medidos en muestras de fibra de alpaca 7

Tratamientos matemáticos y estadísticos de la mejor calibración obtenida para los parámetros de la fibra de alpaca utilizando el espectro completo (VIS-NIR) o solo la región NIR.

82

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1

Página Espectros NIR promedio de las muestras de fibra por

50

localidad (a), sexo (b), edad y color de fibra (c) 2

Espectro NIR como segunda derivada de las muestras de

52

fibra de alpaca 3

Diagrama de los primeros componentes principales de

54

espectros VIS-NIR de las muestras de fibra de alpaca agrupados de acuerdo a localidad (Huancavelica () y Puno (*) 4

Diagrama de los primeros componentes principales de

54

espectros VIS-NIR de las muestras de fibra de alpaca agrupados de acuerdo al color de fibra de alpaca (negro (U), LF ({), blanco () y cafe (*) 5

Diagrama de los primeros componentes principales de

55

espectros VIS-NIR de las muestras de fibra de alpaca agrupados de acuerdo a sexo de las alpacas (Hembra () y Macho (*) 6

Autovectores de los tres componentes principales (PC1, PC2 y PC3) en la región VIS-NIR del espectro de las

55

muestras de fibra de alpaca 7

Localización del lugar de muestreo de la zona costal

73

media “midside” en alpacas 8

Espectro infrarrojo promedio y desviación estándar de

80

las muestras de fibra de alpaca 9

Valores de referencia y predichas por NIRS (μm) del diámetro promedio de fibra y finura al hilado obtenidos en la región VIS (a) y NIR y región NIR (b).

84

ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1

Página Selección de las cuatro mejores ecuaciones para cada

110

parámetro y sus estadísticos de calibración y validación en la región VIS y NIR 2

Selección de las cuatro mejores ecuaciones para cada parámetro y sus estadísticos de calibración y validación en la región NIR

112

1

RESUMEN En la presente investigación se evaluó la espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) en combinación con un análisis multivariado, para clasificar muestras de fibra de alpaca por región de procedencia, sexo y color (análisis cualitativo); y para predecir parámetros del diámetro de fibra y características textiles en muestras de fibra de alpacas (análisis cuantitativo), a partir de sus espectros VIS (visible) y NIR (infrarrojo cercano). Se utilizó un instrumento monocromador FOSS NIRSystems6500 en modo reflectancia para medir las absorbancias de 291 muestras de fibra de alpaca en las regiones VIS y NIR (400-2500 nm). En el análisis cualitativo se utilizaron Análisis de Componentes Principales (PCA) y análisis discriminante por regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) para clasificar la fibra de alpaca de acuerdo a la localidad de origen, sexo y color de la fibra, y una prueba de validación cruzada como el método de validación de los modelos de clasificación desarrollados. En el análisis cuantitativo se utilizó la regresión de mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS) para desarrollar modelos de calibración que permitieran predecir el Diámetro Promedio de Fibra (DPF) (μm), Desviación Estándar del Diámetro Promedio de Fibra (DEDPF) (μm), Coeficiente de Variación del Diámetro Promedio de Fibra (CVDPF) (%), Curvatura de Ondulación (CO) (º/mm), Desviación Estándar de Curvatura de Ondulación (DECO) (º/mm), Factor de Confort (FC) (%), Spining Fineness (SF) (μm) y Longitud de Mecha (LM) (mm). Se realizó tratamientos matemáticos de los espectros y corrección de dispersión de luz como la variación normal estándar

2

y Detrend (SNV & D). Las mejores ecuaciones se seleccionaron considerando el coeficiente de determinación (1-VR), el error estándar en validación cruzada (SECV) y el Valor Residual Predictivo (RPD). Los modelos PLS-DA clasificaron correctamente las muestras de fibra en 100% y 100% de Huancavelica y Puno; 98% y 85% de hembras y machos de Huancavelica, 76,7% y 68% de hembras y machos de Puno; 100%, 94%, 91,4% y 100% de fibras de color negro, café, LF y blanco respectivamente. Los mejores modelos de calibración para la predicción DPF y SF fueron encontrados utilizando la región NIR (1100 A 2500 nm), con 1-VR = 0,90 y 0,87; SECV= 1,01 y 1,08 μm, y RPD = 3,13 y 2,73 respectivamente. Sin embargo, los modelos para DEDPF, CVDPF, CO, DECO, FC, y LM tuvieron una menor calidad predictiva, con 1-VR < 0,65; SECV= < 14,2 μm, y RPD = < 1,5. Se concluye que la técnica NIRS en combinación con un análisis multivariado constituye un método rápido para clasificar las fibras de alpaca por su lugar de origen y color, y para predecir en forma confiable el diámetro promedio de fibra y con una aproximación aceptable la finura al hilado.

3

ABSTRACT In the present research the near infrared reflectance spectroscopy (NIRS) combined with a multivariate analysis were explored to classify alpaca fibre samples according to origin (Huancavelica and Puno), sex (Male and Female) and colour (Black, Coffee, LF (Light Fawn) and White) (qualitative analysis) and to predict the fibre diameter and textile characteristics of alpaca fibre samples (quantitative analysis), from their VIS (visible) and NIR (near infrared) spectral data. Midside alpaca fibre samples (n = 291) were analysed using a monochromator instrument (FOSS NIRSystems6500) in reflectance in the VIS and NIR regions (400 to 2500 nm). Principal Component Analysis (PCA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) and cross-validation test were performed in qualitative analysis to classify alpaca fibre samples according to origin, sex and colour of the fibre; and cross-validation test to validate the models developed. Modified Partial least squares (MPLS) regression was used in quantitative analysis to develop a number of calibration models in order to predict the mean fibre diameter (MFD) (μm), standard deviation of fibre diameter (SDMFD) (μm), coefficient of variation of fibre diameter (CVMFD) (%), curvature degree (CD) (º/mm), standard deviation of curvature degree (SDCD) (º/mm), comfort factor (CF) (%), spining fineness (SF) (μm) and staple length (SL) (mm). Also, Mathematical treatments of the spectra and light scatter correction as standard normal variation (SNV) and Detrend (D) were performed in model development. The best equations were selected through the coefficient

4

of determination (1-VR), the standard error in cross-validation (SECV) and the Predictive Residual Value (RPD). PLS-DA models classified correctly 100% samples according to origin Huancavelica and Puno, 98% and 85% of samples belonging to Huancavelica according to sex (females and male), and 76,7% and 68% of samples belonging to Puno according to sex. PLS-DA also classified correctly 100%, 94%, 91.4% and 100% of samples according to fibre colour black colour, coffee, LF and white, respectively. The best calibration model was found when using the NIR region (1100 to 2500 nm) for the prediction of MFD and SF, with 1-VR = 0.90 and 0.87; SECV= 1.01 and 1.08 μm, and RPD = 3.13 and 2.73 respectively. However, the models for SDMFD, CVMFD, CD, SDCD, CF and SL, had lower predictive quality with 1-VR < 0.65; SECV= < 14.2 μm, and RPD = < 1.5. It is concluded that the NIRS technique combined with multivariate analysis is a rapid method to classify alpaca fibre according to origin and colour, and to reliably predict the fibre diameter and Spinning Fineness in alpaca fibre samples.

5

CAPITULO 1 INTRODUCCIÓN GENERAL

6

En América del Sur se estima que existen más de 7,5 millones de cabezas de camélidos sudamericanos cuyo hábitat son la Puna y los altos Andes, y su crianza es de alta importancia económica, principalmente para la población de las zonas alto andinas del Perú y Bolivia. La alpaca es uno de los camélidos sudamericanos de mayor importancia en la producción de fibra. Su capacidad de adaptación a las grandes alturas, ha permitido utilizar extensas áreas de pastos naturales, de la zona alto andina, donde no es posible la explotación de otras especies, por las condiciones adversas asociadas con este ecosistema. La fibra de la alpaca es una de las más apreciadas por la industria textil, y compite con el cashemere y el mohair, y tiene más aceptación mundial debido a su buena calidad textil. Dentro de la producción mundial de fibras finas de origen animal, la de alpaca representa cerca del 10%. La fibra de llama alcanza apenas el 1% de la producción mundial. La producción de fibra de vicuña es aún menor. Las alpacas presentan una gama de colores de fibra que van del blanco al negro y para su clasificación se han utilizado diferentes tipos de cartas colorimétricas, similares a las empleadas para otras fibras naturales. A pesar de que se admite que existen más de 16 colores diferentes, en algunos casos la fibra solamente se clasifica en 5 tipos: blanco, LF (Light Fawn), castaño, oscuro y mezclado. La clasificación de fibras coloreadas es más exigente que la clasificación de la fibra blanca. Sin embargo, esta metodología de clasificación requiere tiempo y personal entrenado por lo que es importante explorar otras herramientas analíticas que permitan clasificar la fibra de manera rápida y precisa.

7

Entre de las características del vellón de la alpaca, el promedio del diámetro de fibra constituye el principal criterio para determinar el precio, el rendimiento del procesado, y el uso final en la mayoría de las lanas de origen animal. De ahí que se ha invertido mucho esfuerzo en desarrollar métodos de medición del diámetro de fibra que sean rápidos, precisos y eficientes. Entre los métodos oficiales más utilizados para medir el diámetro de fibra y sus parámetros se tiene: el microscopio de proyección, Airflow, Laserscan y OFDA (Optical Fibre Diameter Analyser), cuyas especificaciones están dadas por la IWTO (International Wool Textile Organization). Sin embargo, estos métodos utilizados con mayor frecuencia tienen la desventaja de ser costosos y en algunos casos lentos y destructivos, por lo cual es interesante considerar otros métodos que minimicen estos inconvenientes. Una de las posibles técnicas alternativas de análisis es la espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS), que presenta la característica de ser una técnica no destructiva, rápida, múltiple, que puede ser de gran precisión y exactitud si los procedimientos de generación de las ecuaciones de predicción son los adecuados. Además es una técnica analítica de bajo impacto ambiental, ya que no requiere de sustancias químicas para sus determinaciones. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en el análisis cuantitativo y cualitativo de materiales biológicos y no biológicos en distintos campos de la ciencia y tecnología. La literatura reporta que esta técnica ha sido utilizada en la industria textil, principalmente para realizar mediciones de suarda, humedad, contaminación de

8

lana y diámetro de fibra, principalmente en ovinos. Su uso en el análisis cualitativo se ha centrado en la identificación de alimentos, clasificación de variedades de trigo por color, carnes por tipo de músculos, identificación del sexo y edad en animales, etc. Sin embargo, existe poca información aplicada a fibras de alpacas. Las hipótesis del presente estudio son: i) La espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS), en combinación con un análisis multivariado de datos, es un método efectivo para clasificar la fibra de alpaca por su origen geográfico, sexo y color y ii) La espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) es un método efectivo para predecir variables asociadas a la calidad de fibra en muestras de lana de alpacas. Por lo tanto, los objetivos son: - Evaluar el uso de la técnica NIRS en combinación con un análisis multivariado de datos, para la clasificación de fibras de alpaca según localidad, sexo y color. - Evaluar el potencial de aplicación de la técnica NIRS para predecir variables de importancia económica como el diámetro promedio de fibra (DPF), la desviación estándar del diámetro de fibra (DEDPF), el coeficiente de variación del promedio de diámetro de fibra (CVDPF), la curvatura de ondulación (CO), la desviación estándar de curvatura de ondulación (DECO), el factor de confort (FC), la finura al hilado (FH) y la longitud de mecha (LM), en muestras de fibra de alpacas.

9

CAPITULO 2 REVISION DE LITERATURA

10

2.1

SITUACIÓN ACTUAL DE LOS CAMÉLIDOS SUDAMERICANOS En América del Sur se estima que existen más de 7,5 millones de cabezas

de camélidos sudamericanos, los cuales son agrupados en cuatros especies, dos de ellas silvestres: la vicuña (Vicugna vicugna) y el guanaco (Lama guanicoe); y dos domésticos: la llama (Lama glama) y la alpaca (Lama pacos) (Brenes et al., 2001)1. El hábitat de las alpacas y los otros camélidos sudamericanos está constituido principalmente por las formaciones ecológicas de Puna y Altos Andes que se distribuyen desde el norte del Perú hasta el norte de Argentina, incluyendo las respectivas áreas altoandinas de Bolivia y Chile; teniendo como características generales de ser más húmedas en dirección al norte donde se continúa hacia el Páramo (Ecuador), y más secas hacia el sur. Hasta hace unos 20 años, las alpacas fueron consideradas como específicamente adaptadas a su medio ambiente nativo. Sin embargo, las introducciones exitosas de esta especie a Australia, Canadá, Inglaterra, Francia, Nueva Zelanda y los EE.UU. han demostrado que éstas son más versátiles que lo reconocido anteriormente (Wuliji et al., 2000; Lupton et al., 2006). En el Perú se estima que existen aproximadamente 4 millones de camélidos sudamericanos, de los cuales, la alpaca (Lama pacos) es la especie de mayor existencia numérica con un 72% del total nacional. La mayoría se encuentra en los departamentos de Puno (58%), Cusco (11,9%) y 1

Las referencias del capitulo 2 estan listadas al final de la tesis, paginas 99 al 108.

11

Huancavelica (11,4%) (FAO, 2005) y en ellos constituyen la especie ganadera más importante desde el punto de vista económico en las zonas alto andinas. La alpaca es el productor de fibra más importante de las especies de camélidos sudamericanos, y se estima que más de 1,5 millones de habitantes en la sierra del Perú viven exclusivamente de la crianza de alpacas (FAO, 2008). La crianza de alpacas y llamas en el Perú se desarrolla en la región andina de la sierra, particularmente en el sur y centro, a altitudes que van de los 3.800 hasta más de 5.000 metros sobre el nivel del mar. Entre los 3.800 a 4.000 m de altitud, la crianza de alpacas y llamas por lo general se combina con la de otras especies animales y algunos cultivos, pero encima de los 4.000 m la actividad predominante es la crianza de camélidos, en particular alpacas. Alrededor del 90 % de las alpacas y la totalidad de las llamas está en manos de pequeños productores (FAO, 2005). 2.2 CARACTERÍSTICAS DE LA FIBRA DE ALPACA La alpaca es la especie más importante de los camélidos sudamericanos en cuanto se refiere a la producción de fibra, y existen dos razas, la Huacaya y la Suri,

teniendo la primera rizos y un vellón voluminoso, mientras que Suri

presenta un vellón más compacto suave y liso (Wuliji et al., 2000). Las alpacas son apreciadas por su fibra, debido a su finura, suavidad peso ligero, características de higroscopicidad, resistencia, elasticidad, y colores naturales. Es mas térmica que la lana de ovino, tiene menos posibilidad de producir alergias y contiene menos lanolina (Mueller, 2008).

12

La comercialización de la fibra de alpaca representa una actividad económica importante para los habitantes de la región alto andina y una alternativa de desarrollo industrial, mediante la exportación de fibra procesada o de textiles (De los Ríos, 2006). La industria textil refiere a la fibra de alpaca como una fibra especial y las prendas que se confeccionan con ella, están clasificadas como artículos de lujo (Wang et al., 2003). El diámetro de fibra de la alpaca “baby” (clase de fibra de acuerdo a su finura) oscila alrededor de 22 micras, mientras que el vellón de la alpaca adulta promedia las 26 micras. Respecto del color, se han reconocido 26 tipos de colores de fibra de alpaca; sin embargo, la mayoría de las alpacas (86% en el Perú) son de color blanco, siendo el resto de otros colores, que oscilan del crema al negro. Una alpaca adulta produce en promedio 1,5 a 2,8 kg de fibra por año (Mueller, 2008). Actualmente, se utilizan prendas muy ligeras que están en contacto directo con la piel. Por lo tanto, es importante considerar la sensación de picazón de la fibra del animal con el cual se confecciona la prenda. En la lana de oveja y en la fibra de alpaca, esta característica está asociada con la distribución o porcentaje de fibras, con diámetro mayor a 30 μm (o alrededor de 32 μm). La calidad de los hilados está fuertemente correlacionada con la suavidad y el menor grado de picazón en la fibra de alpaca (Factor de Confort), los cuales a su vez están asociados con el diámetro de fibra y la proporción de fibras < 30 μm (Swinburn et al., 1995). De ahí la importancia del diámetro de fibra en el mercado textil. Sin embargo, solamente el 15% de los mayores criadores de alpaca reciben el

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diferencial del precio por un menor diámetro promedio de fibra. Esta situación ha llevado a que los pequeños criadores de alpaca en el Perú, al no sentirse estimulados a buscar una fibra más fina, han llegado a producir una fibra de mayor diámetro (Velarde Flores, 1988), lo que impacta negativamente el valor de la fibra de los camélidos sudamericanos domésticos en el mercado textil. La calidad de la fibra también es determinada por la uniformidad del diámetro de fibra. Generalmente se acepta una variación del 5% en el diámetro de fibra, lo que implica un aumento o una disminución de 1 μm en el diámetro (Butler y Dolling, 1995). Otras características de la fibra aunque de menor importancia que pueden afectar su valor son entre otras, el rendimiento al lavado o desgrasado, la contaminación con materia vegetal, la presencia de fibras meduladas y la resistencia a la compresión. En Perú, Sumar (1991) reportó un diámetro promedio de fibra de 23,8 μm para alpacas Suri y 24,02 μm para alpacas Huacaya. Sin embargo, estos resultados no fueron ajustados por efectos de edad, sexo, color y localidad. Huanca et al. (2007) reportaron diferencias significativas en el diámetro de fibra entre sexos en alpacas Huacaya del distrito de Cojata, Puno, siendo los valores de 22,47 ± 2,56 μm en machos y 22,83 ± 2,63 μm en hembras; mientras que en el distrito de Santa Rosa, Puno, no hubo diferencia significativa entre sexos (22,74 ± 1,58 μm en machos vs 22,82 ± 1,54 μm en hembras).

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Por otra parte, Montes et al. (2008) en Alpacas Huacaya de Huancavelica, reportan diferencias significativas del diámetro promedio de fibra entre sexos con 23,19 ± 0,24 μm en hembras, y 22,05 ± 0,32 μm en machos. Los mismos autores mencionan que la edad tuvo un efecto significativo sobre el diámetro de fibra, y que éste decrecía gradualmente con la edad. Aunque las diferencias entre animales de 1,5 años y 1,5-3 años no fueron significativas. En otras latitudes no se reportaron efectos del sexo en alpacas. En Nueva Zelanda, los diámetros de fibra promedio, usando distintos métodos de medición, fueron de 27,2 a 31,4 μm en hembras y 28,8 a 32,4 μm en machos. Sin embargo, encontraron efecto significativo del año de nacimiento sobre el diámetro de fibra, con un incremento promedio de 0,8 μm por año. Asimismo, no reportaron diferencias entre colores de vellón de alpacas tanto en alpacas adultas como en crías (Wuliji et al., 2000). En alpacas de Australia, McGregor y Butler (2004) no reportaron efecto del sexo sobre el diámetro promedio de fibra (28,4 μm en machos y 28,8 μm en hembras). En cambio sí detectaron un efecto significativo de la edad sobre el diámetro de fibra, que aumentó conforme aumentaba la edad del animal. Asimismo, los vellones clasificados como colores oscuros fueron 1,0 μm más gruesos que los colores claros (29,2 μm en colores oscuros y 28,2 μm en colores claros).

15

Las alpacas presentan una gama de colores de fibra que van del blanco al negro pasando por los colores intermedios (FAO, 2005; Frank et al., 2006). En la clasificación de la lana de alpacas se han utilizado diferentes tipos de cartas, similares a las empleadas para fibras naturales (Calle Escobar, 1982). En otros estudios, se han utilizado cartas colorimétricas estándar (por ejemplo las cartas Munsel para clasificar el color de suelos) (Ruiz de Castilla y Mamani, 1990; Renieri et al., 1991). A pesar de que se admite que existen más de 16 colores diferentes, en algunos casos la fibra solamente se clasifica en 5 tipos: blanco, LF (Light Fawn), castaño, oscuro y mezclado (Bustinza, 2001). 2.3 MÉTODOS DE ANÁLISIS DEL DIÁMETRO DE FIBRAS Como se menciono anteriormente, el diámetro de fibra constituye la medida objetiva de mayor importancia que define el destino industrial de la fibra. De ahí que se ha invertido mucho esfuerzo en el desarrollo de métodos de medición. En un principio se empleaban los microscopios de proyección (lanámetros), pero debido a su mayor laboriosidad en la medición se buscaron otros métodos más precisos y rápidos. El Air Flow fue un avance importante en este sentido. Sin embargo, a pesar de su rapidez y precisión, este no informaba la frecuencia de los distintos diámetros presentes en la muestra. En los últimos años, se ha extendido el uso de nuevos instrumentos de medición, el Laserscan y el OFDA. Estos instrumentos además de ser rápidos y precisos, proporcionan una información adicional sobre la frecuencia de los diámetros y su variabilidad. Se han desarrollado especificaciones para estos cuatro métodos, los cuales se presentan a continuación.

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2.3.1 Método del Microscopio de Proyección El Microscopio de proyección es el principal instrumento aceptado universalmente para la medición directa del diámetro promedio de fibra de la lana. Las fibras son distribuidas sobre un portaobjetos de vidrio y colocadas bajo el microscopio, luego la imagen ampliada de las fibras se proyecta sobre una pantalla. El operador mide el diámetro de las imágenes de fibras proyectadas con una regla graduada, asegurando que éstas queden bien en la pantalla. Debido a la imagen ampliada de las fibras, se puede conocer con gran precisión el diámetro de fibra (Sommerville, 2000). Según Sommerville (2000) este procedimiento se ha mantenido durante muchos años y se sigue utilizado en la actualidad, sin embargo, es muy laborioso y costoso. De ahí que no es adecuado para mediciones de rutina de grandes lotes de muestras de lana. Sin embargo, se utiliza como método de referencia, ya que los demás equipos de medición son calibrados utilizando muestras de lana estándar, donde el diámetro y los valores de distribución son determinados utilizando el microscopio de proyección. En el método del microscopio de proyección, las muestras de lana son mezcladas, lavadas, secadas, acondicionadas y luego se toman pequeñas muestras representativas, a partir de fragmentos cortos denominados “snippets” que pueden cortarse con un micrótomo. Los snippets, de un promedio de longitud de 0,4 a 0,8 mm son extendidos sobre un portaobjetos con un montaje fluido (aceite). El portaobjetos se coloca en el microscopio de proyección, y se mide el

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diámetro de 400 a 1000 imágenes proyectadas y seleccionadas aleatoriamente de los snippets bajo un aumento de 500x. En la práctica es sabido que el método es significativamente dependiente del operador, debido a las dificultades en identificar consistente y exactamente los límites de la imagen (Baxter, 1994). 2.3.2 Método AirFlow El método Airflow se basa en la medición del descenso de la presión del flujo de aire a través de una masa estándar de fibras (Grishanov et al., 2006). En este método, las muestras de lana son previamente mezcladas, lavadas, secadas y luego acondicionadas en una atmosfera estándar. Luego, éstas son colocadas en una cámara donde se fuerza el paso de una corriente de aire a través de ellas (masa de fibras). El valor del flujo de aire en lana sucia se determina midiendo la tasa de flujo a una presión estándar. Este método mide el área superficial de fibra por unidad de masa. De ahí que sea un método indirecto y debe ser calibrado utilizando lanas o fibras de diámetro conocido (Baxter, 1994). El método Airflow no proporciona mediciones de desviación estándar ni coeficiente de variación del diámetro de fibra, limitándose únicamente al promedio del diámetro de fibra (Sommerville, 2000; Grishanov et al., 2006). Es uno de los métodos antiguos que fue empleado comercialmente por muchos años. El Airflow es afectado por grandes variaciones en el coeficiente de variabilidad. Si el coeficiente de variabilidad es muy grande, entonces el método proporciona un resultado sesgado. En cambio si este valor es muy pequeño, el resultado será muy fino (Sommerville, 2000).

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2.3.3 Método del Laserscan Este es un método automático basado en la medición óptica de snippets suspendidas en una mezcla de agua-isopropanol de 2 mm de largo (Baetens, 1998; AWTA, 2005). Cuando la suspensión resultante fluye a través de la cámara donde es tomada la medición, los snippets individuales son identificados y luego medidos sus diámetros. De esta forma, pueden medirse un gran número de fibras en un período de tiempo corto. Este método produce un histograma de la distribución de diámetro de fibra e indica el diámetro de fibra promedio y su desviación estándar (Grishanov et al., 2006). Aunque el método Laserscan proporciona estimaciones más directas de la finura de la fibra que el método del Airflow, el instrumento requiere ser calibrado utilizando muestras estándar de la lana. El Laserscan es un medio relativamente nuevo de medición del diámetro de fibra, su velocidad de operación y potencia se presta a un volumen muy alto aplicaciones de prueba (Sommerville, 2000). 2.3.4 Método del OFDA (Optical Fibre Diameter Analyser) El OFDA es un instrumento que se basa en la tecnología de digitalización de imágenes y el análisis óptico de las mismas, que permite medir las características de las fibras de lana y otras fibras animales a lo largo de las mechas sucias en tiempo real y si uno lo requiere en el propio galpón de esquila.

19

Esencialmente, el OFDA 2000 es un microscopio automático que aumenta y captura imágenes de la fibra individual y adjunta esta imagen a una cámara de vídeo (Van Schie et al., 1990; Baxter et al., 1992). Las fibras se cortan en snippets de 2 mm de longitud y son extendidas sobre un portaobjetos de vidrio, luego son identificadas y medidas individualmente. El método al igual que el Laserscan produce también un histograma de la distribución del diámetro de fibra, indicando el diámetro de fibra promedio, desviación estándar y coeficiente de variación. Adicionalmente, el equipo proporciona mediciones de largo de mecha, finura al hilado, curvatura media y factor de confort. Los resultados son fiables y reproducibles, debido al gran número de mediciones realizadas (Grishanov et al., 2006). 2.4 TÉCNICA DE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS) La región del infrarrojo cercano, conocida generalmente como NIR (del ingles Near-Infrared), fue descubierta por Sir William Herschel en 1800. Sin embargo, solo casi un siglo mas tarde fue aplicada como técnica analítica cuando Abney y Festing registraron a finales del siglo XIX, el espectro de líquidos orgánicos en la región espectral comprendida entre 700 y 1200 nm (Osborne et al., 1993). Posteriormente, con el desarrollo de equipos ópticos más precisos las aplicaciones se ampliaron. En una primera etapa, las aplicaciones cualitativas se centraron principalmente en la región espectral del infrarrojo medio, debido a

20

que en esta región es posible la observación de bandas de absorción de grupos orgánicos específicos como N-H, C-H, O-H, y C-C (Burns y Ciurczak, 2001). A partir de los años setenta se inició una nueva fase de estudios espectroscópicos, en especial en el análisis cuantitativo a raíz del desarrollo de nuevos espectrofotómetros (Transformada de Fourier), la informática, la computación y la introducción de herramientas matemáticas más sofisticadas. Con estas innovaciones tecnológicas, los estudios cuantitativos se extendieron a las regiones espectrales del infrarrojo cercano y medio. Estos avances repercutieron en el crecimiento de la producción y productividad industrial, reducción de gastos y residuos industriales (Burns y Ciurczak, 2001; Stuart, 2004). Los primeros trabajos que despertaron interés por el estudio de la espectroscopia en el infrarrojo cercano como herramienta de análisis industrial fueron desarrollados en la década de los setenta, por el grupo de investigadores del profesor Karl Norris, que iniciaron sus trabajos en la búsqueda de nuevos métodos para la determinación de la humedad en productos agrícolas (Batten, 1998). La espectroscopia infrarroja es, sin duda, una de las más importantes técnicas analíticas disponibles para los científicos actuales. Una de las grandes ventajas de la espectroscopia infrarroja es que prácticamente se puede estudiar cualquier tipo de muestras y en sus diferentes estados. Se pueden analizar líquidos, soluciones, pastas, polvos, películas, fibras, gases y superficies con una adecuada elección de la técnica de muestreo. Como resultado de la mejora en la

21

instrumentación, se han desarrollado una variedad de técnicas sensibles a fin de evaluar muestras que anteriormente eran intratables (Stuart, 2004). 2.4.1 Fundamentos de la técnica La espectroscopia NIR utiliza el rango espectral de 780 a 2500 nm y proporciona una información estructural compleja asociada al comportamiento vibracional de combinaciones de enlaces químicos. El registro de la región NIR del espectro electromagnético involucra la respuesta de los enlaces moleculares O-H, C-H, C-O, y N-H. Estos enlaces son sometidos a cambios de energía vibracional al irradiarse por las frecuencias NIR. Existen dos patrones de vibraciones en estos enlaces: las vibraciones de estiramiento y las vibraciones de flexión. La absorción de energía de una molécula orgánica en la región NIR ocurre cuando las moléculas vibran o se traducen en un espectro de absorción dentro del espectrofotómetro NIR (Cen y He, 2007). El espectro de absorción se obtiene por el paso de la radiación infrarroja a través de una muestra y determina qué fracción de la radiación incidente es absorbida a una energía en particular. La energía en la cual aparece algún pico en un espectro de absorción corresponde a la frecuencia de una vibración de una parte de la molécula de la muestra (Stuart, 2004). 2.4.1.1 Regiones espectrales Aunque el espectro infrarrojo se extiende desde 700 a 106 nm de longitud de onda, desde un punto de vista funcional se divide en tres zonas: IR lejano,

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donde se producen las absorciones debidas a cambios rotacionales, el IR medio, donde tienen lugar las vibraciones fundamentales y el IR cercano (Near infrared, NIR), donde se producen absorciones debidas a sobretonos y combinaciones de las bandas fundamentales (Tabla 1). Tabla 1. División y características de la región infrarroja Región

Transición característica

Infrarrojo Cercano (NIR) Sobretonos y combinaciones Infrarrojo Medio (IR) Vibraciones fundamentales Infrarrojo Lejano Rotaciones Fuente: (Osborne et al., 1993).

Longitud de Onda (nm) 700 – 2,500 2,500 – 5 x 104 5 x 104 - 106

2.4.1.2 Espectros del infrarrojo cercano Los espectros del infrarrojo cercano son, en su mayor parte, el resultado de bandas debidas a sobretonos “overtones” de grupos fundamentales que contienen enlaces C-H, O-H y N-H; las moléculas orgánicas pueden ser investigadas mediante el uso de este enfoque. La espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) puede ser una opción atractiva para ciertos sistemas orgánicos, debido a la facilidad en la toma de muestras. La tabla 2 resume las bandas comúnmente observadas para moléculas orgánicas en la región del infrarrojo cercano (Stuart, 2004).

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Tabla 2. Bandas de absorción en el infrarrojo cercano de compuestos orgánicos Longitud de Descripción onda (nm) 2200–2450 Elongación de bandas de combinación de grupos C–H 2000–2200 Elongación de bandas de combinación de grupos N–H y O–H 1650–1800 Elongaciones del primer sobretono de grupos C–H 1400–1500 Elongaciones del primer sobretono de grupos N–H y O–H 1300–1420 Elongación de bandas de combinación de grupos C–H 1100–1225 Elongaciones del segundo sobretono de grupos C–H 950–1100 Elongaciones del segundo sobretono de grupos N–H y O-H 850–950 Elongaciones del tercer sobretono de grupos C–H 775–850 Elongaciones del tercer sobretono de grupos N–H Fuente: Stuart, 2004

2.4.1.3. Absorción de las bandas en el infrarrojo cercano Las absorciones observadas en la región del infrarrojo cercano son sobretonos o combinaciones de bandas fundamentales de elongaciones “stretching” del tipo C-H, ó O-H, que ocurren en la región del infrarrojo medio. Las bandas resultantes en el infrarrojo cercano son generalmente débiles en intensidad y a menudo sobrepuestas, haciéndoles menos útiles frente a la región del infrarrojo medio para el análisis cualitativo. Sin embargo, existen diferencias importantes entre las posiciones del infrarrojo cercano de los diferentes grupos funcionales. Estas diferencias a menudo pueden explotarse en el análisis cualitativo (Stuart, 2004). Las bandas más frecuentes en la región NIR se deben a enlaces que contienen átomos ligeros como C-H, N-H, O-H, S-H, debido a su mayor anarmonicidad. Sin embargo, las bandas de los grupos C=O, C-C, C-F ó C-Cl, en general son muy débiles o no aparecen en esta región. Las vibraciones

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fundamentales de estos grupos tienen bajas frecuencias en la región NIR y por tanto, los primeros sobretonos también aparecen en esa región (Guerrero, et al., 2007). La absorción de radiación sigue la ley de Lambert-Beer, que establece que la absorbancia a cualquier longitud de onda es proporcional al número o concentración de las moléculas absorbentes presentes en el camino recorrido por la radiación (Osborne, et.al., 1993), por lo que pueden utilizarse las medidas de transmisión para realizar medidas cuantitativas. Si bien esta ley es válida para la transmisión, también puede ser aplicada a la reflectancia difusa (Shenk et al., 1993). La reflexión de radiación para una muestra opaca puede ser de dos tipos: especular y difusa. La reflectancia especular (o regular) no aporta información sobre la composición, por lo que solo contribuye al ruido. La reflectancia difusa tiene lugar en todas direcciones como consecuencia de los procesos de absorción y dispersión y predomina cuando los materiales de la superficie reflectante son débilmente absorbentes a la longitud de onda incidente y cuando la penetración de la radiación es grande en relación a la longitud de onda. Este tipo de reflexión es la base de las medidas que se realizan en espectroscopia por reflectancia (Alomar y Fuchslocher, 1998). En materiales de naturaleza química heterogénea, el espectro obtenido en la región del infrarrojo cercano es la combinación de bandas de absorciones parciales sobrepuestas o muy cercanas, que suelen confundirse en una línea

25

suavizada, en que se encuentran picos, valles y curvaturas en forma de hombro (Alomar y Fuchslocher,1998). 2.4.2 Calibración La calibración se define como el conjunto de actividades que establecen, bajo condiciones especificas, una relación entre las medidas instrumentales y los valores para una propiedad de interés correspondiente. Un modelo de calibración es una función matemática que relaciona dos grupos de variables, una dependiente (Y) y otra independiente (X): La función está dada por: Y= f(X) = Xb

[1]

Para cada muestra se selecciona un espectro (o varios espectros), que es organizado en forma de una matriz Xij que corresponde al valor de la absorbancia de la muestra ‘i’ en la longitud de onda ‘j’. Por ejemplo, para el dato espectral X (que puede ser absorbancia, transmitancia, segunda derivada de la absorbancia, etc.) tenemos: X =[ x11 x12 x13 ...x1 j ]

[2]

Para dos muestras tenemos: ⎡ x11 X =⎢ ⎣ x21

x12

x13

x22

x23

... x1 j ⎤ ... x2 j ⎥⎦

[3]

26

Lo cual implica un análisis de regresión que tiene como objetivo hallar una relación entre la matriz X que contiene los espectros de las muestras en estudio del conjunto de calibración y el vector y que almacena los respectivos datos de referencia. El resultado es una ecuación semejante a la siguiente: y = Xβ + e

[4]

Donde β es el vector de regresión y e es el vector que representa los errores del modelo.

Es

importante

aclarar

que

X contiene variables altamente

correlacionadas, como son los datos de espectroscopia. El procedimiento usual para la calibración implica la selección de muestras representativas, la obtención de espectros, análisis de referencia, pretratamiento de los datos, modelación estadística, validación del modelo, aplicación del modelo al análisis de muestras desconocidas, análisis de rutina y monitorización y por ultimo transferencia de modelos (Givens et al., 1997; Macho y Larrechi, 2002). El set de muestras seleccionadas para desarrollar una calibración deben representar un rango amplio de composiciones o calidades, tener una distribución uniforme y contarse con datos precisos de su composición analítica (Murray, 1988). Además, es importante considerar el número de muestras que será necesario incluir para obtener resultados satisfactorios. No existe un número mínimo definido, sino que éste dependerá de la entidad a predecir y de la naturaleza del producto a evaluar. Si se trata de analizar entidades químicas

27

simples como es el nivel de nitrógeno en granos de trigo, puede bastar con 30 a 40 muestras; en cambio, si se pretende evaluar el contenido de proteína en productos más heterogéneos se requieren más de 100 muestras (Shenk y Westerhaus, 1993). El pretratamiento de datos tiene por objeto la eliminación de comportamientos no lineales debido a las interferencias ópticas causadas por la dispersión de luz y reflectancia especular residual. 2.4.3 Técnicas de Calibración Las técnicas de calibración tienen como finalidad establecer la relación matemática entre las matrices descritas en la ecuación [3] y [4], y optimizarla para obtener una mejor descripción de la variable de interés, y debe ser capaz de predecir los valores de la propiedad calibrada a través de cualquier muestra del mismo compuesto o similar. Existen varias técnicas disponibles para los tratamientos de los datos espectrales, siendo imposible definir una regla general para cualquier calibración que involucre datos de espectrofotometría NIR. Entre las técnicas más conocidas se destacan la Regresión Lineal Múltiple (Multiple Linear Regression, MLR), Análisis de Regresión de Componentes Principales (Principal Component Regression, PCR), Minimos cuadrados Clasicos (Classic Least Squares, CLS), Mínimos Cuadrados Parciales (Partial Least Squares, PLS), Mínimos Cuadrados Parciales Modificados

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(Modified Partial Least Squares, MPLS), y Redes Neurales Artificiales (Artificial Neural Networks, ANN) (Roggo et al., 2007) 2.4.3.1 Regresión Lineal Múltiple La regresión lineal múltiple tiene como forma básica: k

y j = b0 + ∑ bi xi + eij

[5]

i =1

Donde y j es la variable a medirse; los términos X1, X2,..., Xk son las k variables independientes, cada combinación de uno o más valores espectrales; los bl, b2,..., bk son los k coeficientes de regresión y b0 es el intercepto. En la calibración, se utiliza un conjunto de valores de X y valores conocidos de Y para obtener los valores b, mientras que en la validación y medición de rutina son utilizados un conjunto de valores de X y los valores obtenidos b para predecir los valores Y desconocidos (Givens et al., 1997). En los análisis de regresión lineal múltiple se seleccionan intensidades de los espectros en algunas longitudes de onda, sin embargo, esta técnica tiene dificultades con la elección de las longitudes de onda y la colinealidad de los datos. Estos problemas son evitados por medio de métodos de compresión de datos, que son más complejos en el sentido que los valores X requieren cálculos muy largos. Estos métodos expresan un espectro como la suma de los espectros elementales (llamados cargados o variables latentes), cada uno multiplicado por un “score”. Los scores (algunos o todos) son por lo tanto usados como valores de X (Givens et al., 1997).

29

2.4.3.2 Regresión de Componentes Principales La regresión por Componentes Principales (PCR) se divide en dos etapas. Primero, los datos espectrales son tratados con un Análisis de Componentes Principales, luego se realiza un análisis de regresión lineal múltiple (MLR) sobre los scores como variables predictivas. La ecuación de predicción puede escribirse como: Ymuestreo = Tmuestreob

[6]

Donde T son las nuevas coordenadas dimensionales, Ymuestreo, los valores de referencia y b es el vector de coeficientes. Este método tiene varias ventajas, entre ellas, se reduce el numero variables y la colinealidad de los datos espectrales. Sin embargo, esto no garantiza que los componentes principales calculados sean correlacionados con las propiedades estudiadas (Roggo et al., 2007). 2.4.3.3 Regresión de Mínimos Cuadrados Parciales En el método PLS las regresiones son calculadas con algoritmos de mínimos cuadrados. El propósito del PLS es establecer un vinculo lineal entre dos matrices, los datos espectrales X y los valores de referencia Y. Esta técnica modela las matrices X e Y de tal forma que permita encontrar otras variables en la matriz X que describa mejor a la matriz Y. Se puede explicar mediante la representación de los espectros en el espacio de las longitudes de onda que permitan mostrar direcciones que son combinaciones lineales de longitudes de onda llamadas factores que describen mejor la propiedad estudiada. El método

30

PLS tiene las ventajas del PCR, gracias a la selección de la variable latente de acuerdo a la matriz de covarianza entre los datos y los parámetros investigados (Roggo, et al, 2007, Osborne et al., 1993; Shenk y Westerhaus, 1994) 2.4.3.4 Cuadrados de Mínimos Parciales Modificados Este método de regresión corresponde a una modificación del PLS, que es frecuentemente

usado

en

calibraciones

de

forrajes

e

involucra

una

estandarización de las variables en la regresión después del cálculo de cada factor. Si bien, ésta no es la mejor técnica de calibración para usar en todas las situaciones, a menudo es más estable y segura que el PLS (Shenk y Westerhaus, 1994). 2.4.4 Análisis Discriminante El Análisis Discriminante Lineal (del ingles Linear Discriminant Análisis, LDA), es un método paramétrico que discrimina características de una determinada población. El LDA, al igual que el PCA (del Ingles Principal Component Análisis) es un método de reducción. Así, mientras que el PCA selecciona un eje que retiene la máxima variación en una dimensión menor de datos, El LDA selecciona las direcciones que permitan una máxima separación entre las diferentes clases (Osborne et al., 1993).

31

2.4.5 Pretratamiento de los datos Esto permite, en general, reducir interferencias por factores como el tamaño de partícula de la muestra, destacar rasgos del espectro y facilitar el análisis estadístico de regresión (Shenk y Westerhaus, 1994; Alomar y Fuchslocher, 1998) además de eliminar la falta de linearidad en datos espectrales, debida a la dispersión de luz (Givens et al., 1997). Entre los más utilizados están el centrado de la media, la normalización, Corrección Multiplicativa de Señal (del ingles Multiplicative Scatter Correction, MSC) y la Variación Normal Estándar (del ingles Standard Normal Variate Method, SNV). La Variación Normal Estándar realiza un ajuste aditivo y multiplicativo. Para cada espectro de la muestra el desvío ajustado es simplemente la media de todos los valores sobre las variables, y el ajuste multiplicativo es el desvío estándar de los valores de todas las variables. La SNV se utiliza para controlar los efectos de diferentes tamaños de partícula y el contenido de agua entre muestras; asimismo, remueve la colinealidad entre longitudes de onda químicamente no correlacionadas. La SNV mejora la precisión de predicción mas no simplifica el modelo ni reduce las interferencias sistemáticas (Naes et al, 2002). Las sobreposiciones en los espectros de diferentes analitos pueden tratarse mediante derivadas, por ejemplo mediante la sustracción o diferencia entre el valor de log (1/R) obtenido a una particular longitud de onda y el valor obtenido a una segunda longitud de onda (William y Cordeiro, 1985).

32

2.4.6 Evaluación de la capacidad predictiva del modelo Los criterios para seleccionar el mejor modelo en una evaluación NIRS se basan en procedimientos estadísticos, a fin de obtener estimaciones exactas de los valores predichos y controlar todos los aspectos del proceso de calibración y validación (Shenk y Westerhaus, 1994; Alomar y Fuchlocher, 1998). Entre los principales estadísticos están: El Error Estándar de Calibración (SEC) cuya formula es: SEC =

∑ ( y − x)

2

nc − t − 1

[7]

Donde y es el valor de referencia del laboratorio, x es el valor predicho por NIRS, nc es el número de muestras del grupo de calibración y t es el número de términos de la ecuación de regresión. Además del error estándar de calibración otro criterio estadístico, es el coeficiente de determinación R2. Se emplea tanto en el proceso de calibración como en el proceso de validación cruzada (1-VR) y su formula es: R2 = 1 −

SEC 2 SD 2

[8]

Donde: SD (Standard Error), es la desviación estándar de los valores de referencia y SEC es el error estándar de calibración (Standard Error of Calibration). La etapa de validación externa es un proceso de validación de muestras externas, donde se determina junto con el coeficiente de determinación (R2), el

33

error estándar de predicción (SEP), descrito por Alomar y Fuchlocher (1998) en la siguiente ecuación: SEP =

∑ ( y − x)

2

nv − 1

[9]

Donde y es el valor de referencia del laboratorio, x es el valor predicho por NIRS, nv es el número de muestras del grupo de validación. Aunque no existen normas que determinen la mejor ecuación, la mayoría de los investigadores indican que los valores del error estándar de la calibración (SEC) y validación cruzada (SECV) o RMSECV deben ser de magnitud similar entre sí y semejantes al error estándar de laboratorio (SEL) ó de los datos de referencia. En general, las ecuaciones que posean un error estándar de validación cruzada (SECV) o de predicción (SEP) de una magnitud 1 a 1.5 veces el error estándar de laboratorio, tienen una precisión excelente. Ecuaciones con valores de SECV o SEP de una magnitud de 2 a 3 veces el error estándar de laboratorio, tienen una buena precisión (Delgado, 2003). Otro criterio que se reporta en la literatura es el cociente entre la desviación estándar (SD) y el RMSECV denominado como valor predictivo residual (del ingles residual predictive deviation, RPD), utilizado para probar la exactitud de los modelos de calibración. Un valor de RPD grande (superior a 3) se considera como adecuado para propósitos analíticos en muchas aplicaciones NIR para productos agrícolas (Williams, 2001). Alternativamente se puede considerar la relación inversa entre el SECV y la desviación estándar (SECV/SD)

34

que para calibraciones robustas debe ser menor a 0.33 (Cozzolino y Murray, 2002). 2.4.7 Detección de valores discrepantes (outliers) Una de las ventajas de los métodos multivariantes sobre los métodos tradicionales univariantes, es la capacidad que tienen de detectar la observación u observaciones inconsistentes con el resto de los datos (Egan y Morgan 1998). La detección de outliers en esta etapa es importante porque la inclusión de estas muestras discrepantes en el modelo reduce su capacidad predictiva. La anomalía puede ser causada tanto por la información espectroscópica (anómalos H) como por la química (anómalos T). La detección, interpretación y posible eliminación de estas muestras anómalas es una etapa crítica en el desarrollo de una ecuación de calibración, debido a la gran influencia que provoca su presencia en los resultados del modelo (García Olmo, 2002, citado por Delgado, 2003). 2.5 TÉCNICA NIRS APLICADA A LA EVALUACIÓN DE LANAS La tecnología de la espectroscopia NIR se ha convertido en la técnica analítica más atractiva para medir parámetros de calidad de los alimentos, y productos agrícolas, con las siguientes ventajas: reducción de precios en los instrumentos, determinación simultánea de varios parámetros de calidad, la

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capacidad de reemplazar técnicas de referencia costosas y tediosas, y un análisis mínimo de datos (McCaig, 2002; McClure, 2003). Esta técnica se ha utilizado en la industria textil, para realizar mediciones de suarda en la lana, humedad, contaminación de lana (Slack-Smith et al., 1979; Church y O`Neill, 1999; Hammersley et al., 1995). Hay varios reportes en la literatura sobre el uso de esta técnica para el análisis de la lana, muchas de ellas se han enfocado sobre mediciones de grasa residual, contenido de humedad y mediciones del color (Hammersley, et al., 1995; Hammersley y Townsend, 2001). En otras investigaciones, Sabbagh y Larsen (1978) citados por Hammersley y Townsend, (2001), evaluaron el rendimiento de lana, reportando un error estándar de calibración (SEC) de 2,8% para rendimiento de lana limpia expresado como contenido de fibra seca. Scott y Roberts (1978) utilizando la técnica NIRS estimaron el peso del vellón limpio (PVL), y encontraron correlaciones de 0,99, 0,99 y 0,96 entre el PVL determinado por el método tradicional (lavado manual) y el PVL mediante el NIR para tres rebaños de ovejas. Posteriormente, Scott et al. (1982) citados por Hammersley y Townsend, (2001)

reportaron correlaciones de 0,90 para

promedio de diámetro de fibra en vellones limpios, entre los resultados NIR y el método estándar de Airflow. Keogh y Roberts (1985) realizaron un estudio de calibración NIRS para predecir el rendimiento de vellón y el diámetro de fibra en ovinos, a 6 longitudes

36

de onda predefinidas. Reportaron valores de error estándar de calibración de 3,24% para rendimiento de lana limpia, y un error estándar de calibración de 1,01 μm para diámetro de fibra. Coleman, et al. (1999) utilizaron espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano ajustado con una sonda de fibra óptica para predecir el contenido de Mohair limpio, diámetro de fibra, materia vegetal y fibras meduladas en cabras angora. Ellos reportaron en uno de sus experimentos valores de Error Estándar de Calibración (SEC) de 2,84, 4,78 y 2,15 para contenido de de mohair, diámetro de fibra y porcentaje de fibras meduladas respectivamente. Vera (2004) en un estudio sobre predicción de rendimiento de fibra fina y diámetro de fibra promedio de fibras cashmere, mediante espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano reportó valores de error estándar de calibración (SEC), coeficientes de determinación de validación cruzada (R2) y la relación entre el error estándar de validación cruzada y la desviación estándar (SECV/SD) de 0,73, 0,72 y 0,53 μm respectivamente para diámetro de fibra promedio y de 6,15, 0,88 y 0,34% para rendimiento respectivamente; y concluye que los resultados de la técnica NIRS no sería un método recomendable para la determinación de finura (diámetro de fibras de cashmere). Cabe destacar que Vera (2004) trabajó con muestras de fibra no descerdadas de caprinos cashmere y cruzas.

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Cozzolino et al. (2005) utilizaron espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIR) y en el infrarrojo visible (VIS) para predecir el diámetro de fibra en lanas limpias y sucias de ovinos Merinos y el método de referencia fue el Microscopio de Proyección. Reportaron coeficientes de determinación en calibración (R2) mayores a 0,90 y 0,50 para lana limpia y sucia respectivamente. Mientras que los valores predictivos residuales (RPD) fueron mayores a 3 y 0,60 para lanas limpias y sucias respectivamente. Estos valores indican que el diámetro de fibra en muestras lanas sucias fue débilmente predicho con la técnica NIR. Gishen y Cozzolino (2007) realizaron un estudio de factibilidad sobre el uso potencial de la espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIR) y en el infrarrojo visible (VIS) para evaluar las características de la fibra de alpacas de vellones sucios, y como método de referencia usaron el OFDA. Reportaron que el mejor modelo de calibración para predecir el Diámetro de Fibra Promedio (DPF) fue aquel que utilizó la región NIR (1100 a 2500 nm), con un coeficiente de determinación en validación cruzada (R2) de 0,88 y con una raíz cuadrada del error medio de validación cruzada RMSECV (Root Mean Square Error of Cross Validation) de 2,62 μm. Sin embargo, el valor predictivo residual (RPD) fue de 2 lo que significa una débil predicción del diámetro promedio de fibra con la técnica de espectroscopia.

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CAPITULO 3 CLASIFICACIÓN DE LA FIBRA DE ALPACA (Lama pacos) DE DIFERENTES LOCALIDADES, SEXO Y COLOR MEDIANTE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS) Y ANÁLISIS MULTIVARIADO

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CLASIFICACIÓN DE LA FIBRA DE ALPACA (Lama pacos) DE DIFERENTES LOCALIDADES, SEXO Y COLOR MEDIANTE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS) Y ANÁLISIS MULTIVARIADO2 CLASSIFICATION OF ALPACA (Lama pacos) FIBER FROM DIFFERENT LOCALITIES, SEX AND COLOUR BY MEANS OF NEAR INFRARED REFLECTANCE SPECTROSCOPY COMBINED WITH MULTIVARIATE ANALYSIS ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the potential use of near infrared reflectance (NIR) spectroscopy combined with multivariate analysis to classify alpaca fiber samples according to origin (Huancavelica and Puno), sex (Male and Female) and colour (Black, Brown, LF (Light Fawn) and White). (n=291)

were

scanned

using

a

monochromator

instrument

Samples (FOSS

NIRSystems6500) in reflectance (400-2500 nm). Principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) were used to classify wool samples according to origin, sex and colour of the fiber. PLS-DA classified correctly the 100% of samples according to origin Huancavelica and Puno, 98% and 85% of samples belonging to Huancavelica according to sex (females and male), and 76,7% and 68% of samples belonging to Puno according to sex. 2

PLS-DA also classified correctly 100%, 94%, 91,4% and 100% of

El formato del articulo es de la revista Agricultura Técnica.

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samples according to fibre colour black colour, Brown, LF and white, respectively. These results show that NIR spectroscopy in combination with multivariate data analysis can be used as a rapid method to classify alpaca wool samples by origin and colour. Keys words: Discriminant partial least squares, Principal component analysis, spectroscopy, NIRS, Alpaca, Wool. RESUMEN El presente estudio se realizó para evaluar el uso potencial de la técnica de espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) en combinación con un análisis multivariado de datos, para la clasificación de fibra de alpaca según localidad (Huancavelica y Puno), sexo (Machos y Hembras) y color de fibra (Negro, Café, Light Fawn (LF) y Blanco). Se utilizó un instrumento monocromador FOSS NIRSystems6500 en modo reflectancia para medir las absorbancias de 291 muestras de fibra de alpaca en las regiones VIS (visible) y NIR (infrarrojo cercano) (400-2500 nm). Para clasificar la fibra de alpaca de acuerdo a la localidad de origen, sexo y color de la fibra, se utilizaron Análisis de Componentes Principales (PCA) y análisis discriminante por regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA). Se utilizó una prueba de validación cruzada como el método de validación de los modelos de clasificación desarrollados. Los modelos PLS-DA clasificaron correctamente las muestras de fibra en 100% y 100% de Huancavelica y Puno, 98% y 85% de hembras y machos de Huancavelica, 76,7% y 68% de hembras y machos de Puno, 100%,

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94%, 91,4% y 100% de fibras de color negro, café, LF y blanco respectivamente. Estos resultados demuestran que la técnica NIRS en combinación con un análisis discriminante constituye un método rápido de clasificación de fibras de alpaca por su lugar de origen y color. Palabras claves: Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales, Análisis de componentes principales, Espectroscopia, NIRS, Alpaca, Lana. 3.1

INTRODUCCIÓN En el Perú se estima que existen aproximadamente 4 millones de

camélidos sudamericanos, de los cuales, la alpaca (Lama pacos) es la especie de mayor existencia numérica con un 72% del total nacional. La mayoría se encuentra en los departamentos de Puno (58%), Cusco (11,9%) y Huancavelica (11,4%) (FAO, 2005); y en ellos constituyen la especie ganadera más importante desde el punto de vista económico y social, ya que involucran a una población humana de 2,9 millones de habitantes que representa aproximadamente el 11% de la población nacional, y a unos 100000 productores (Brenes et al., 2001). Su hábitat está constituido principalmente por las formaciones ecológicas de Puna y Altos Andes que se distribuyen desde el norte del Perú hasta el norte de Argentina. La alpaca es uno de los camélidos de mayor importancia en la producción de fibra. Su capacidad de adaptación a las grandes alturas, ha permitido utilizar extensas áreas de pastos naturales, de la zona alto andina, donde no es posible la

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explotación de otras especies, por las condiciones adversas asociadas con este ecosistema (Brenes et al., 2001; Quispe et al., 2008). La fibra de la alpaca es una de las más apreciadas por la industria textil, y compite con el cashmere y el mohair, y tiene más aceptación mundial debido a su calidad y a que es la que más se produce. Las alpacas presentan una gama de colores de fibra que van del blanco al negro pasando por los colores intermedios (FAO, 2005; Frank et al., 2006). En la clasificación de la fibra de alpaca se han utilizado diferentes tipos de cartas, similares a las empleadas para fibras naturales. En otros estudios, se han utilizado cartas colorimétricas estándar, por ejemplo, las cartas Munsel para clasificar el color de suelos (Ruiz de Castilla y Mamani, 1990; Oria et al., 2009). A pesar de que se admite que existen más de 16 colores diferentes, en algunos casos la fibra solamente se clasifica en 5 tipos: blanco, café claro o “light fawn” (LF), castaño, oscuro y mezclado. La clasificación de fibras coloreadas es más exigente que la clasificación de la fibra blanca (Schmid, 2006). Sin embargo, esta metodología de clasificación requiere tiempo y personal entrenado por lo que es importante explorar otras herramientas analíticas que permitan clasificar la fibra de manera rápida y precisa. La espectroscopia de reflectancia en las regiones visible (VIS) e infrarrojo cercano (NIR) constituye una de las mejores técnicas debido a su rapidez, a su bajo costo y a que es no destructiva, ya que involucra muestras que no requieren preparación alguna. Es una técnica que puede medir la composición química de sustancias biológicas en base a los espectros de absorción NIR de enlaces de tipo C-H, O-H y N-H. Dichos enlaces generalmente poseen altas frecuencias vibracionales y resultan en sobretonos y combinaciones de las vibraciones

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fundamentales activas en la región del infrarrojo medio (Osborne et al., 1998). Además, de la información química, el espectro NIR contiene información física que puede ser utilizada para determinar propiedades físicas de las muestras como el color, el peso, forma y dimensiones. Por otro lado, la espectroscopia NIR en combinación con métodos multivariados de reconocimiento de patrones son utilizados frecuentemente para discriminar entre muestras pertenecientes a distintos grupos sobre la base de las propiedades espectrales tal como fue descrito por Casale et al. (2006). Entre los mas utilizados tenemos el análisis de componentes principales, redes neuronales artificiales y análisis discriminante por regresión por mínimos cuadrados parciales (DA-PLS) (Cozzolino et al., 2005). La literatura reporta que la técnica NIRS se ha utilizado en la industria textil, principalmente para realizar mediciones de suarda en lana, humedad, contaminación de lana, (Church y O’Neill, 1999; Hammersley et al., 1995), diámetro promedio de fibra en ovinos y alpacas (Cozzolino et al., 2005; Gishen y Cozzolino, 2007). La técnica NIRS también fue utilizada en el análisis cualitativo como una herramienta discriminante en la identificación y autenticación de alimentos (Downey, 1996), clasificación de núcleos de trigo de acuerdo al color (Delwiche y Massie, 1996; Dowell, 1998), discriminación de variedades de trigo (Miralbes, 2008) identificación de carnes (McElhinney et al., 1999; Alomar et al., 2003), clasificación de vinos de diferentes países (Liu et al., 2008), mediciones de color en lana (Hammersley y Towsend, 2001), caracterizar fibras y mezclas textiles (Espinoza et al., 2006), discriminar la fibra del cashmere de lana fina (Wu

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et al., 2008); y determinación de sexo y especies en venados rojos (Tolleson et al., 2005). Sin embargo, existe poca información aplicada a fibras de alpaca. La hipótesis del presente estudio fue que la espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS), en combinación con un análisis multivariado de datos, es un método efectivo para clasificar la fibra de alpaca por su origen geográfico, sexo y color. Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación fue evaluar el uso potencial de la técnica de espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) en combinación con un análisis multivariado de datos, para la clasificación de fibras de alpaca según localidad de origen, sexo y color de fibra. 3.2

MATERIALES Y MÉTODOS

3.2.1 Muestras de fibra Las muestras (n=291, ca. 10 g cada una) fueron colectadas de la zona del costillar medio de alpacas en dos localidades de Perú: 101 muestras fueron obtenidas de alpacas de color blanco, de ambos sexos, de 2 a 3 años de edad del Centro de Investigación y Desarrollo de Camélidos Sudamericanos Lachocc de la Universidad Nacional de Huancavelica, Huancavelica, y 190 muestras de alpacas tuis de un año de edad, de colores blanco, negro, café y LF de ambos sexos procedente de la Estación Experimental Quimsachata INIA, Illpa, Puno (tabla 3). El Centro Lachocc está ubicado a 3860 m.s.n.m., 12° 47’ 06” latitud sur, 74° 58’ 17” longitud oeste; y la Estación Quimsachata se ubica a 4025 m.s.n.m., 15º 41’

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39’’ latitud sur, 70º 36’ 24’’ longitud oeste, con temperaturas que varían entre -5 °C y 18 °C y una precipitación pluvial que alcanza los 700 mm/año. Las muestras fueron identificadas mediante una tarjeta, guardadas en una bolsa de polietileno y llevadas al Laboratorio de Nutrición Animal del Instituto de Producción Animal de la Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile, donde se realizó el estudio. Tabla 3. Numero de muestras recolectadas por localidad, sexo y color de fibra. Grupo Localidad Huancavelica Puno Sexo Machos Hembras Color de fibra Negro Café LF (Light Fawn) Blanco

N 101 190 117 174 50 50 35 156

3.2.2 Lectura de espectros en la regiones VIS y NIR Los espectros de las muestras de fibra fueron colectados sobre las regiones visible (VIS) e infrarrojo cercano (NIR) (400 a 2498 nm) en una celda circular de 35 mm de diámetro y 10 mm de profundidad, ubicada en un módulo de rotación, utilizando un instrumento monocromador FOSS NIRSystems6500® (FOSS NIRSystems, Silver Spring, MD, USA), en modo de reflectancia. Los espectros de las regiones VIS y NIR se recolectaron a intervalos de 2 nm, produciendo un total de 1050 puntos. Los datos de reflectancia (R) fueron amplificados,

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digitalizados y almacenados en forma de log (1/R) ó unidades de microabsorbancia. Los espectros de reflectancia fueron colectados por dos pares de detectores de sulfuro de plomo. Las lecturas de reflectancia fueron referenciadas a las correspondientes lecturas de un disco de cerámica interno proporcionado por el fabricante del instrumento. A cada muestra se le tomaron tres espectros completos. Cada espectro correspondió al promedio de 32 sucesivas lecturas. Una vez tomados estos espectros, se promediaron a fin de reducir posibles fuentes de error, almacenándose para cada muestra este espectro promedio, el que se utilizó para el análisis multivariado. Se utilizó una computadora personal para la operación del espectrómetro, almacenamiento y manejo de los datos ópticos. Tanto las lecturas de espectros como las calibraciones fueron desarrollados con el programa WinISI II, Versión 1.02 A, de Infrasoft International (ISI, 1999). 3.2.3 Análisis de Componentes Principales (PCA) Los datos espectrales fueron exportados del programa WinISI en formato NSAS al programa SAS (versión 9.1.3, SAS Institute; Cary, NC). Previo a la calibración, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para estudiar patrones en los espectros VIS y NIR sin corregir de las muestras de fibra, debidos a diferencias cualitativas entre localidad, sexo y color de fibra. Con esta técnica multivariada se derivó los primeros componentes principales (PCs) de los datos espectrales para evaluar el posible agrupamiento de muestras y para

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remover outliers (Martens y Martens, 2001; Naes et al., 2002). Los datos fueron analizados utilizando el Procedimiento de Componentes Principales (PROC PRINCOMP) del programa estadísticos SAS (Statistical Analysis System), versión 9.1.3, (SAS Institute; Cary, NC). 3.2.4 Análisis discriminante El análisis discriminante se realizó mediante la técnica de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) (programa WinISI II). Se ingresaron archivos de datos espectrales por separado, uno para cada localidad para su discriminación. En este método, se arma una matriz de calibración con todas las muestras mediante la generación de “variables dummy”, asignándose un valor de uno si el espectro pertenece a un grupo particular (de acuerdo al nombre del archivo) o un valor de dos si no pertenece a tal grupo (Martens y Martens, 2001; Naes et al., 2002). La calibración es por lo tanto desarrollada mediante la regresión de los datos de longitud de onda sobre los “valores de referencia” (1 o 2) de las variables Dummy. En este estudio, se requirió un valor de la variable dummy predicha superior a 1,5 para una "correcta" determinación de la localidad, sexo o color de fibra. El error estándar de las ecuaciones discriminantes desarrolladas por este método representa la precisión asociada con la predicción de las variables dummy. La prueba de validación cruzada fue utilizada para probar la exactitud de la calibración en cada paso, al ser añadido un nuevo factor PLS a la ecuación, hasta que se obtuviera un valor mínimo del error estándar de validación cruzada.

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El mismo procedimiento fue empleado para modelar la función discriminante para el factor sexo (macho y hembra) y color de fibra (café, blanco, negro y LF), con dos y cuatro archivos independientes en la calibración, respectivamente. En cada ecuación discriminante desarrollada, se aplicaron 5 grupos de validación cruzada con un máximo de 15 términos para la ecuación, aplicando distintos pre-tratamientos matemáticos (diferentes órdenes e intervalos de sustracción de segmentos suavizados) y correcciones de dispersión de luz (SNV + Detrend) a los espectros. Con una prueba de validación cruzada completa, subgrupos de muestras son removidos uno a la vez del set de calibración y utilizados como grupo de predicción con una ecuación elaborada con el resto de los grupos. Este procedimiento se repite en forma cíclica, hasta que todas las muestras han sido utilizadas en calibración y en predicción. En cada paso se calcula un indicador de certidumbre (R2) y uno de incertidumbre (error estándar), los que al final se promedian, obteniéndose estos indicadores para la validación cruzada. 3.3

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.3.1 Análisis de espectros VIS-NIR de las muestras En la figura 1 se muestran las absorbancias promedio de radiación infrarroja, expresadas como log (1/R) para las muestras de fibra procedentes de las dos localidades, de ambos sexos y de cuatro diferentes colores. Las bandas de absorción fueron similares a las reportadas para lana de ovino (Cozzolino et al.,

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2005) y de alpaca (Gishen y Cozzolino, 2007). En la región NIR se pueden observar múltiples bandas de absorción a 1500, 1740, 1940 y 2180 nm, las cuales corresponden a primeros y segundos sobretonos de estiramiento N-H, S-H, O-H y C-H respectivamente. Las bandas de absorción alrededor de 1500 nm, son causadas por los enlaces N-H y éstas corresponden a compuestos úricos y amidas, mientras que los enlaces O-H están relacionados con la humedad presente en las muestras de lana (Osborne et al., 1998; Cozzolino et al., 2005; Gishen y Cozzolino, 2007). Las bandas de absorción correspondientes a 2180 nm se originan cuando sustancias como ácidos grasos y otros lípidos son escaneadas y reflejan los enlaces C-H y las bandas de combinación (Coleman et al., 1999). La mayor absorción de compuestos aminados y azufrados era de esperarse, debido a que la lana contiene mas de 170 proteínas en cuya estructura química destacan los grupos amino (NH2) y grupos carboxilo (COOH) (Rippon, 1992). Aparte de las bandas descritas anteriormente, existen otras por debajo de los 1050 nm, con diferencias atribuidas a grasas (962 nm), agua (934 nm), proteína (908 nm) y almidón (864 nm). Dentro del rango visible (400-700 nm), se observa una banda de absorción entre localidades, sexos y colores. En esta región, los pigmentos de eumelalina y feomelanina presentes en lanas que van de color negro a marrón y de amarillo a marrón rojizo respectivamente (Cecchi et al., 2006; Ozeki et al., 1996), tienen una fuerte absorción, siendo los negro-marrón de mayor intensidad que los amarillo-marrón rojizo (Honeyman, 2002).

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Longitud de onda (nm)

Figura 1. Espectros NIR promedio de las muestras de fibra por localidad (a), sexo (b), y color de fibra (c).

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La comparación de los promedios de los espectros de las muestras de fibra procedentes de dos localidades (figura 1a), dos sexos (figura 1b) y cuatro colores (figura 1c) revela claras diferencias en la forma del espectro. Estas diferencias se deben principalmente a la magnitud de la absorbancia total, de los picos de absorción y la pendiente total del espectro. Sin embargo, los principales picos de absorción descritos arriba pueden verse consistentes en los espectros de cada variable (localidad, sexo y color). En la región NIR la separación de los espectros de las muestras de fibra entre sexos y colores fueron mínimas, pero mayores entre localidades. Sin embargo, en la región visible la desviación entre ellos fue más acentuada. Estas claras diferencias alientan las expectativas de las ventajas potenciales de la espectroscopia VIS-NIR para la efectiva discriminación entre fibras de diferentes localidades, sexo o colores. Para reducir los efectos de los factores que causan cambios en la línea base (tamaño de partícula, contenido de agua, etc.) y permitir la resolución de solapamiento de picos de absorción, los espectros fueron corregidos por una corrección de dispersión SNV+Detrend, acompañado de un tratamiento matemático de 2-8-8-1 a los datos espectrales. Esto significa que se realizó una primera y luego una segunda sustracción sobre los datos de absorbancia a intervalos de 8 puntos de datos (16 nm) a lo largo de todo el espectro, después de suavizar los segmentos cada 8 puntos en los datos. Esta modificación se presenta en la figura 2, que cubre el rango VIS-NIR (400-2498 nm). Con ello, los cambios en la línea base fueron eliminados casi en su totalidad, además, algunos solapamientos de picos fueron resueltos de manera que las diferencias en

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absorción se limitan a algunas longitudes de onda significativas, lo que podrían ser útil para facilitar el desarrollo de calibraciones.

Longitud de onda (nm)

Figura 2. Espectros NIR como segunda derivada de las muestras de fibra de alpaca 3.3.2 Análisis de Componentes Principales (PCA) Se analizaron los espectros sin corregir de las muestras de fibra de alpaca mediante un análisis multivariado de componentes principales (PCA) con el fin de examinar diferencias cualitativas entre localidades, sexo y color. Las figuras 3, 4 y 5 muestran los resultados del diagrama de coordenadas (score plots) de los primeros dos componentes principales, los cuales en conjunto explican el 94% (59 y 35%, respectivamente) de la variación total en los espectros VIS-NIR de las muestras de fibra de alpaca. En la figura 3 se observa un agrupamiento definido

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entre las localidades de Huancavelica y Puno. Las muestras de Huancavelica tienden a concentrarse a bajos valores del primer componente principal, en tanto que se distribuyen más ampliamente en el segundo. Las de Puno presentan una distribución más amplia a lo largo de ambos ejes (PC1 y PC2). Asimismo, la discriminación entre las muestras de fibra de alpaca asociados al color (figura 4) fue evidente por la observación de los espectros. Similares resultados fueron observados por Gishen y Cozzolino (2007). Sin embargo, esta separación no fue evidente en la variable sexo, observándose sobreposiciones entre machos y hembras (figura 5). Para investigar la base de la discriminación de los espectros de las muestras de fibra respecto a localidad y color, se analizaron los autovectores de los primeros tres componentes principales (figura 6). El PC1 explicó el 59% de la varianza total, y su autovector presentó el mayor valor alrededor de 1143 nm asociados con los segundos sobretonos de estiramiento de los grupos C-H, presentes en las materias vegetales de la fibra; y 1700 nm asociados con los primeros sobretonos de estiramiento de grupos C-H presentes en lípidos y ácidos grasos. El PC2 tomó en cuenta el 35% de la variación total, y el valor más alto del autovector fue encontrado alrededor de 1908 nm, asociado con primeros sobretonos de estiramiento de grupos O-H, los cuales están relacionados con la humedad presente en las muestras de lana. El valor del autovector más alto en el PC3 (4% de la variación total) se observó en la región visible alrededor de 450 nm, y de 1940 nm en la región NIR asociados con el segundo sobretono de los grupos O-H.

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Componente Principal 2

Figura 3. Diagrama de los primeros componentes principales de espectros VISNIR de las muestras de fibra de alpaca agrupados de acuerdo a localidad (Huancavelica ( ) y Puno (*)).

Componente Principal 2

Figura 4. Diagrama de los primeros componentes principales de espectros VISNIR de las muestras de fibra de alpaca agrupados de acuerdo al color de fibra de alpaca (negro (U), LF ({), blanco ( ) y café (*)).

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Componente Principal 2

Figura 5. Diagrama de los primeros componentes principales de espectros VISNIR de las muestras de fibra de alpaca agrupados de acuerdo a sexo de las alpacas (Hembra ( ) y Macho (*)).

Longitud de Onda (nm)

Figura 6. Autovectores de los tres componentes principales (PC1, PC2 y PC3) en la región VIS-NIR del espectro de las muestras de fibra de alpaca.

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3.3.3 Análisis discriminante Se desarrollaron diferentes calibraciones aplicando diferentes tratamientos matemáticos a los datos espectrales sin corregir para obtener ecuaciones discriminantes, con el fin de reconocer muestras pertenecientes a un determinado lugar, sexo y color de fibra (tabla 4). Los resultados de las mejores ecuaciones para la identificación del lugar de procedencia muestran que el 100% de las muestras pueden ser correctamente asignadas a la localidad a la que pertenecen. Estas ecuaciones fueron realizadas con el mismo modelo para ambas localidades (Huancavelica y Puno), que incluyeron 5 términos PLS, programas de corrección por dispersión SNV+Detrend, y un tratamiento matemático de segunda derivada, sobre un intervalo de 8 puntos y segmentos suavizados de 8 puntos de datos (28-8). Los modelos desarrollados para la identificación de sexos dentro de Huancavelica fueron capaces de identificar casi la totalidad de las muestras pertenecientes a alpacas hembras (80 de 81) y en menor medida los machos (17 de 20). Sin embargo, las ecuaciones discriminantes para clasificar el sexo de las alpacas en Puno fueron algo menores en comparación a las de Huancavelica, con un 67,7 y 68 % de muestras correctamente clasificadas para hembras y machos respectivamente. Asimismo, se obtuvieron modelos discriminantes apropiados para diferenciar los colores de fibra de las alpacas. Respecto del color, la mejor ecuación logró clasificar correctamente las fibras de color blanco y negro, con un 100% de exactitud. Incluyó 12 términos PLS, con corrección SNV+Detrend y un tratamiento matemático de primera derivada, sobre un intervalo de 8 puntos y segmentos suavizados cada 4 puntos

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(1-8-4). La ecuación de calibración seleccionada para los colores LF y Café tuvo un 91,4 (32 de 35) y 94 % (47 de 50) de exactitud respectivamente para clasificar las muestras correctamente, y se obtuvo con un tratamiento matemático 1-4-4-1. Las tres únicas muestras clasificadas incorrectamente en ambos colores, fueron asignadas como café o LF y viceversa. Diferentes modelos fueron seleccionados para los colores de fibra y sexo. Los resultados obtenidos en este estudio muestran que el espectro VIS y NIR de las muestras de fibra de alpaca contienen información química que permite su clasificación de acuerdo al lugar de procedencia y color de fibra. Tabla 4. Resultados de la clasificación de las ecuaciones discriminantes NIRS para localidad, sexo y color de fibra. Tratamientoa Nº de Matemático factores PLS 2-8-8-1 2-8-8-1 0-0-4-1 0-0-1-1 2-4-4-1 0-0-8-1

a

1-8-4-1 1-4-4-1 1-4-4-1 1-8-4-1 Todas las

Perteneciente a

Característica Localidad 5 Huancavelica 5 Puno Sexo (Huancavelica) 14 Hembras 8 Machos Sexo (Puno) 9 Hembras 11 Machos Color de fibra 12 Negro 10 Café 10 LF 12 Blanco ecuaciones fueron desarrolladas utilizando la

Clasificado Correctamente nc

nb

%

101 190

101 190

100,0 100,0

81 20

80 17

98,8 85,0

93 97

63 66

67,7 68,0

50 50 100,0 50 47 94,0 35 32 91,4 156 156 100,0 corrección de dispersión SNV+D;

b

Numero de observaciones antes del análisis discriminante; c Numero de observaciones después del análisis discriminante.

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Los resultados del análisis discriminante ilustran diferencias claras en la composición química de la lana entre localidades y colores de fibra. Diferencias en metabolismo o selección de dietas a diferentes edades podrían resultar en diferencias químicas de los productos finales de los animales de granja (carne, leche, huevo, lana, etc.). Es pertinente destacar que las claras diferencias observadas entre localidades podrían atribuirse a la edad del animal, debido a que las muestras procedentes de Huancavelica fueron de animales de entre 2 a 3 años de edad en comparación a los animales de Puno cuyas edad fueron de 1 año. Podría existir por tanto, un factor de confusión en este aspecto. Los espectros VIS-NIR discriminaron los colores de la fibra con buena precisión (exactitudes mayores al 90%), debido probablemente a la presencia de distintas proporciones de pigmentos de eumelanina y feomelanina (Honeyman, 2002; Cecchi et al., 2006; Ozeki et al., 1996). Respecto del sexo, las alpacas de Puno no fueron discriminadas eficientemente (67% en hembras y 68% en machos). Estos resultados implicarían que los componentes químicos presentes en la lana de ambos sexos son relativamente similares. Asumiendo esta relación, entonces las características de la fibra (por ejemplo diámetro de fibra) serían relativamente similares en ambos sexos. Al respecto, en varias investigaciones no se reportaron efectos significativos del sexo sobre las características de la fibra de alpacas (Wuliji et al., 2000; McGregor y Butler, 2004; Lupton et al., 2006). Sin embargo, Montes et al. (2005) y Quispe et al. (2009), reportaron que las alpacas machos de Huancavelica tuvieron fibras más finas que las hembras, lo que podría atribuirse a que éstas representan a reproductores mejorados traídos de Puno y Cusco, así como al efecto de la selección más exigente que se hace a los machos,

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aunque en forma subjetiva. Esta mayor presión de selección sobre los machos de Huancavelica, podría explicar el mejor resultado de clasificación por sexo en las muestras provenientes de esta localidad, aunque específicamente el mejor resultado fue para las hembras (80 bien clasificadas de un total de 81). En este estudio se trabajó con fibra de alpaca, sin embargo en estudios posteriores se podría considerar la posibilidad de clasificar fibras animales no solamente por localidades o colores de fibra, sino también por especies (llama, vicuña guanaco) y por edades. 3.4

CONCLUSIÓN Los resultados permiten concluir que la técnica NIRS, en combinación con

un análisis de tipo discriminante constituye un método rápido y efectivo de clasificación de fibras de alpaca, por su lugar de origen y color, y no requiere de un personal entrenado en evaluación de fibras. La técnica NIRS identificó claramente las diferencias en las muestras de fibra de alpaca debidas a localidad y color de fibra, de acuerdo a sus componentes orgánicos. Sin embargo, la separación de los espectros de las muestras de fibra entre sexos fue mínima, particularmente en el caso de una de las localidades estudiadas. Estos resultados muestran que los espectros VIS y NIR de las muestras de fibra de alpaca contienen información química que permite su clasificación de acuerdo al lugar de procedencia y color de fibra. En algunos casos, cuando algunos factores como la edad y el color de la fibra son similares entre vellones de alpaca, las ecuaciones discriminantes podrían actuar como una evaluación preliminar antes de aplicar

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ecuaciones de calibración cuantitativas. Asimismo, el alto potencial de la técnica NIRS en la evaluación y caracterización de fibras de alpacas con rapidez, seguridad y mínimo costo, facilitarían el monitoreo y la toma de decisiones en la evaluación y clasificación de fibras animales en la industrial textil. 3.5

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CAPITULO 4 EVALUACIÓN DE LAS CARACTERISTICAS DE FIBRA DE ALPACA (Lama pacos) MEDIANTE EL USO DE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS)

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EVALUACIÓN DE LAS CARACTERISTICAS DE FIBRA DE ALPACA (Lama pacos) MEDIANTE EL USO DE ESPECTROSCOPIA DE REFLECTANCIA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS) 3 EVALUATION OF ALPACA (Lama pacos) FIBRE CHARACTERISTICS BY MEAN OF NEAR INFRARED REFLECTANCE SPECTROSCOPY (NIRS) ABSTRACT The potential of near-infrared spectroscopy (NIRS) combined with multivariate analysis was carried to predict the fibre characteristics of economic importance of alpaca fibre. Mid-side samples (n = 291) were taken from Alpacas Huacaya (male and female) from different ages and colours and subsequently for fibre characteristics such as mean fibre diameter (MFD), standard deviation of fibre diameter (SDMFD), coefficient of variation of fibre diameter (CVMFD), curvature degree (CD), standard deviation of curvature degree (SDCD), comfort factor (CF), spining fineness (SF) and staple length (SL) using OFDA 2000 methodology. Samples were scanned in small cuvettes using a NIRSystem 6500 monochromator instrument by reflectance in VIS (visible) and NIR (near infrared) regions (400 to 2500 nm). Modified Partial least squares (MPLS) regression was used to develop a number of calibration models between the spectral and reference data. Mathematical pre-treatment of the spectra and light scatter correction as standard normal variation and Detrend (SNV & D) of the 3

El formato del articulo es de la revista Agricultura Técnica.

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spectra were used in model development. The best equations were selected through the coefficient of determination (1-VR), standard error in crossvalidation (SECV) and the Predictive Residual Value (RPD). The best calibration model was found when using the NIR region (1100 to 2500 nm) for the prediction of MFD and SF, with 1-VR = 0.90 and 0.87; SECV= 1.01 and 1.08 μm, and RPD = 3.13 and 2.73 respectively. However, the models for SDMFD, CVMFD, CD, SDCD, CF and SL, had lower predictive quality with 1-VR < 0.65; SECV= < 14.2 μm, and RPD = < 1.5. These results show the NIR is a promising technique for predicting the mean fibre diameter and spining fineness in alpaca wool samples. Keys words: Visible, Near infrared, Modified partial least squares, Spectroscopy, NIRS, Alpaca, Wool. RESUMEN El presente estudio se realizó para evaluar el uso potencial de la técnica de espectroscopía de reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) en combinación con un análisis multivariado de datos, para predecir variables de importancia económica en muestras de fibra de alpacas. Se utilizaron muestras (n = 291) de fibra de la región corporal del costillar medio de alpacas Huacaya de ambos sexos, distintas edades y colores; en las que posteriormente mediante la metodología OFDA 2000 se analizaron el diámetro promedio de fibra (DPF), desviación estándar del diámetro promedio de fibra (DEDPF), coeficiente de variación del diámetro promedio de fibra (CVDPF), curvatura de ondulación

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(CO), desviación estándar de curvatura de ondulación (DECO), factor de confort (FC), finura al hilado (FH) y longitud de mecha (LM). Las muestras fueron escaneadas en una cuveta pequeña usando el instrumento monocromador FOSS NIRSystems6500 en modo reflectancia en las regiones VIS (visible) y NIR (infrarrojo cercano) (400-2500 nm). Se utilizó la regresión de mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS) para desarrollar los modelos de calibración entre la información espectral y los datos de referencia. En el desarrollo de los modelos, se aplicaron tratamientos matemáticos de los espectros y corrección de dispersión de luz como la variación normal estándar y Detrend (SNV & D). Las mejores

ecuaciones

se

seleccionaron

considerando

el

coeficiente

de

determinación (1-VR), el error estándar en validación cruzada (SECV) y el Valor Residual Predictivo (RPD). Los mejores modelos de calibración para la predicción DPF y FH fueron encontrados utilizando la región NIR (1100 A 2500 nm), con 1-VR = 0,90 y 0,87; SECV= 1,01 y 1,08 μm, y RPD = 3,13 y 2,73 respectivamente. Sin embargo, los modelos para DEDPF, CVDPF, CO, DECO, FC, y LM tuvieron una menor calidad predictiva, con 1-VR < 0,65; SECV= < 14,2 y RPD = < 1,5. Estos resultados muestran que la técnica NIRS es una herramienta analítica promisoria para la predicción del diámetro promedio de fibra y la finura al hilado en muestras de fibra de alpaca. Palabras claves: Visible, Infrarrojo cercano, Mínimos cuadrados parciales modificados, Espectroscopia, NIRS, Alpaca, Fibra.

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4.1

INTRODUCCION La alpaca es uno de los camélidos de mayor importancia en la producción

de fibra. Su capacidad de adaptación a las grandes alturas, ha permitido utilizar extensas áreas de pastos naturales de la zona alto andina, donde no es posible la explotación de otras especies, por las condiciones adversas asociadas con este ecosistema (Brenes et al., 2001; Quispe et al., 2008). La fibra de alpaca es una de las más apreciadas por la industria textil, compite con el cashemere y el mohair, y tiene más aceptación mundial debido a su buena calidad textil. En relación a las características del vellón, el diámetro de fibra constituye el principal criterio para determinar el precio, el rendimiento del procesado, y el uso final en la mayoría de las lanas de origen animal (lana de oveja (Stobart et al., 1986), mohair (Hunter, 1993) y fibra de alpaca (Frank et al., 2006)), de ahí que se ha invertido mucho esfuerzo en desarrollar métodos de medición del diámetro de fibra más rápidos, precisos y eficientes (Brenes et al., 2001). Entre los métodos oficiales más utilizados para medir variables de interés económico en muestras de fibras de alpacas están: el microscopio de proyección, laserscan, Airflow y OFDA (Optical Fibre Diameter Analyser), cuyas especificaciones están dadas por la IWTO (International Wool Textile Organization) (Sommerville, 2000). Sin embargo, a pesar que estos métodos son utilizados con mayor frecuencia, tienen la desventaja de ser costosos y en algunos casos lentos y destructivos, por lo cual es interesante considerar otros métodos alternativos que permitan minimizar estos inconvenientes. Una de las posibles técnicas alternativas de análisis es la espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo

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cercano (NIRS), que presenta la característica de ser no destructiva, rápida, múltiple, de bajo costo, y de gran precisión y exactitud si los procedimientos de generación de las ecuaciones de predicción son los adecuados; y de bajo impacto ambiental, ya que no requiere de sustancias químicas para sus determinaciones. Es una técnica que puede medir la composición química de sustancias biológicas en base a la absorción de los espectros NIR por medio de enlaces de C-H, O-H y N-H. Dichos enlaces generalmente poseen altas frecuencias vibracionales y resultan en sobretonos y combinaciones de las vibraciones fundamentales activas en la región del infrarrojo medio (Murray y Williams, 1987; Osborne et al., 1993). Esta técnica se ha utilizado en la industria textil, principalmente para realizar mediciones de suarda, de humedad y contaminación en lana, (Slack-Smith et al., 1979; Church y O’Neill, 1999; Hammersley et al., 1995) y diámetro promedio de fibra en lanas sucias y limpias de ovinos (Cozzolino et al., 2005). Sin embargo, existe poca información aplicada a la predicción del diámetro de fibra en alpacas. Como ejemplo, Gishen y Cozzolino (2007) utilizaron la técnica NIRS para predecir el diámetro de fibra y otras características de la fibra de alpacas, reportando ecuaciones de calibración de baja calidad predictiva (RPD = 2 y R2 = 0,88). La hipótesis del presente estudio fue que la técnica NIRS, es un método efectivo para predecir variables de interés económico en muestras de fibras de alpacas. Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación fue evaluar el potencial de aplicación de la técnica NIRS para la predicción de variables de importancia económica como el diámetro promedio de fibra (DPF), la desviación

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estándar del diámetro de fibra (DEDPF), el coeficiente de variación del promedio de diámetro de fibra (CVDPF), la curvatura de ondulación (CO), la desviación estándar de curvatura de ondulación (DECO), el factor de confort (FC), la finura al hilado (FH) y la longitud de mecha (LM), en muestras de fibra de alpacas. 4.2

MATERIALES Y METODOS

4.2.1 Muestras Se utilizaron muestras (n = 291) de fibra de alpaca (Lama pacos L.), de aproximadamente 10 g de la región costal media (midside), que presenta mayor uniformidad respecto al diámetro de fibra (Aylan-Parker y McGregor, 2002) (figura 7). Las alpacas fueron de la raza Huacaya, de ambos sexos, de distintas edades (1, 2, y 3 años) y colores (blanco, negro, café claro (Light Fawn, LF) y café), procedentes de dos regiones productoras de alpacas del Perú (Puno y Huancavelica). Las muestras de Puno fueron proporcionadas por la Estación Experimental Quimsachata INIA, Illpa, Puno, ubicada a 4025 m.s.n.m., 15º 41’ 39’’ latitud sur, 70º 36’ 24’’ longitud oeste, con temperaturas que varían entre -5 °C y 18 °C, y las muestras de Huancavelica, por el Centro de Investigación y Desarrollo de Camélidos Sudamericanos Lachocc de la Universidad Nacional de Huancavelica, ubicado a 3860 m.s.n.m., 12° 47’ 06” latitud sur, 74° 58’ 17” longitud oeste.

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4.2.2 Lectura de espectros Los espectros de las muestras de fibra fueron colectados sobre las regiones visible (VIS) e infrarrojo cercano (NIR) (400 a 2498 nm) en una celda circular de 35 mm de diámetro y 10 mm de profundidad, utilizando un monocromador FOSS NIRSystems6500 (FOSS NIRSystems, Silver Spring, MD, USA), en modo reflectancia, a intervalos de 2 nm, produciendo un total de 1050 puntos.

Figura 7. Localización del lugar de muestreo de la zona costal media “midside” en alpacas (Aylan-Parker y McGregor, 2002). Los datos de reflectancia (R) fueron colectados mediante detectores de sulfuro de plomo (NIR) y silicio (VIS), digitalizados, transformados a unidades de microabsorbancia y almacenados en forma de log (1/R). Las lecturas de reflectancia fueron referenciadas a las correspondientes lecturas de un disco de cerámica interno proporcionado por el fabricante del instrumento. Cada muestra se dividió en tres submuestras y a cada una se tomó el espectro, que resultó de

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promediar 32 lecturas sucesivas, junto a 32 lecturas de la cerámica de referencia. Los espectros de cada submuestra fueron promediados, para obtener el espectro final para cada muestra, el que se utilizó posteriormente para el desarrollo de las calibraciones. Se utilizó una computadora personal para la operación del espectrómetro, almacenamiento y manejo de los datos ópticos. 4.2.3 Análisis de referencia de las muestras de fibra Los análisis de referencia de las características de la fibra de alpaca se realizaron en el Laboratorio de Fibras Textiles del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) Bariloche, Argentina, mediante la técnica del OFDA2000. Las características de la fibra de alpaca medidas fueron diámetro promedio de fibra (DPF) (μm), desviación estándar del diámetro promedio de fibra (DEDPF) (μm), coeficiente de variación del diámetro promedio de fibra (CVDPF) (%), curvatura de ondulación (CO) (º/mm), desviación estándar de curvatura de ondulación (DECO) (º/mm), factor de confort (FC) (%), finura al hilado (FH) (μm) y longitud de mecha (LM) (mm). Con la metodología OFDA2000, las muestras de fibra con ayuda de un minicore fueron cortadas en pequeños trocitos (snippets) de aproximadamente 2 mm de largo de la parte central de la mecha. Luego, los trocitos se colocaron sobre una lamina de vidrio de 70x70 mm. Posteriormente esta lámina fue introducida en el instrumento OFDA2000 conectado a un computador para su lectura.

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4.2.4 Calibración y Análisis Estadístico Para la determinación de las ecuaciones de calibración, los espectros fueron sometidos a distintos tratamientos matemáticos descritos por 4 cifras (e.g. 2, 8, 8, 1), donde el primer número indica el orden de la derivada o de sustracción de los datos espectrales (dos es la segunda derivada de log 1/R), el segundo número es el intervalo de sustracción (gap) en puntos de datos sobre el cual se realiza la derivada; el tercer dígito es el número de puntos de datos utilizados en el primer suavizado y el cuarto número se refiere al número de puntos de datos sobre el cual se aplica un segundo suavizado (se recomienda dejarlo en 1) (Shenk y Westerhaus, 1993; Osborne et al., 1993). Además se probaron correcciones para dispersión de luz a través de SNV y Detrend. Como técnica de regresión se utilizó el método de mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS) (Shenk y Westerhaus, 1993), en combinación con la técnica de validación cruzada a fin de obtener el número óptimo de términos en los modelos de calibración y los estadísticos: coeficiente de determinación en calibración (R2), error estándar de calibración (SEC), error estándar en validación cruzada (SECV) y coeficiente de determinación en validación cruzada (1-VR) (Shenk y Westerhaus, 1993). El criterio para seleccionar el mejor modelo fue elegir aquel modelo que tenga menores valores de SEC y SECV y altos valores de R2 y 1-VR. Asimismo, se utilizó el valor residual predictivo (residual predictive deviation, RPD) definido como el cociente de la desviación estándar y el SECV. Valores de RPD mayores a tres son considerados adecuados para propósitos

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analíticos en muchas aplicaciones NIR para productos agrícolas (William, 2001; Fearn, 2002). Las calibraciones fueron desarrollados con el programa WinISI II, Versión 1.02 A, de Infrasoft International (ISI, 1999). Los análisis de correlaciones entre parámetros de la fibra fueron analizados mediante el Procedimiento de Correlación (PROC CORR) del programa estadísticos SAS (Statistical Analysis System), versión 9.1.3, (SAS Institute; Cary, NC). Tanto la colección de espectros como el desarrollo de las calibraciones se llevaron a cabo en el Instituto de Producción Animal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Chile. 4.3

RESULTADOS Y DISCUSION

4.3.1 Descripción de las muestras En la tabla 5 se muestran las estadísticas descriptivas de los parámetros de la fibra de alpaca analizadas por el método del OFDA 2000. Se observan un amplio rango en todos los parámetros evaluados, que son característicos en las fibras de alpaca. La amplia variación del DPF (rango = 17,8 μm) fue superior a lo reportado por Huanca et al. (2007) quienes encontraron rangos de 9,78 y 14,7 μm en dos localidades de Puno (Cojata y Santa Rosa). Asimismo, Montes et al. (2008) reportan variaciones del DPF entre 17 a 31 μm en alpacas de Huancavelica. Sin embargo, en otras latitudes se reportaron rangos de 23,3 a 34,2 μm en alpacas Huacaya, superiores a los reportados en el presente trabajo (Lupton et al., 2006;

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Gishen y Cozzolino, 2007). Esta diferencia en variabilidad del DPF estaría atribuida al componente genético que difiere entre animales y a efectos no genéticos, como son la edad y el medio ambiente donde se crían. La amplia variación en la composición del conjunto de muestras de calibración, junto a técnicas de análisis de referencia precisas, son importantes para obtener ecuaciones de predicción óptimas (Murray, 1986). Tabla 5. Indicadores estadísticos de las mediciones de referencia en fibra de alpaca Parámetro Promedio Mediana Desv, Est, Mínimo Máximo DPF (μm) 21,87 21,10 3,29 16,40 34,20 DEDPF (μm) 5,12 5,00 0,81 3,50 7,40 CVDPF (%) 23,55 23,50 2,91 17,20 38,20 CO (º/mm) 33,32 33,30 6,04 18,60 59,20 DECO (º/mm) 27,41 27,00 4,79 15,80 52,30 FC (%) 91,78 95,10 10,17 31,80 99,20 FH (μm) 21,77 21,20 3,11 16,30 33,30 LM (mm) 75,81 70,00 20,40 35,00 155,00

CV 15,03 15,76 12,35 18,11 17,49 11,08 14,27 26,90

DPF = diámetro promedio de fibra, DEDPF = desviación estándar del diámetro promedio de fibra, CVDPF = coeficiente de variación del diámetro promedio de fibra, CO = curvatura de ondulación, DECO = desviación estándar de curvatura de ondulación, FC = factor de confort, FH = finura al hilado, LM = largo de mecha, CV = coeficiente de variación.

En la tabla 6 se presenta la matriz de correlaciones Pearson (p < 0,05) para los parámetros de la fibra de alpaca. Es interesante observar que el diámetro de fibra se presenta inversamente correlacionado con el grado de curvatura (r = 0,48) y con el factor de confort (r = -0,90). Gishen y Cozzolino, (2007) reportan similares tendencias entre estas variables. La relación negativa entre la finura y el grado de curvatura podría explicarse por la frecuencia de rizos presentes en la

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fibra. Así, un mayor engrosamiento de la fibra está generalmente asociado con una menor frecuencia de rizos, la que, a su vez, es directamente proporcional a la curvatura (i.e. a mayor frecuencia, mayor curvatura) de la fibra (Lupton et al., 2006). La segunda relación negativa está relacionada con el porcentaje de fibras con diámetro mayor a 30 μm, que son las que ocasionan la sensación de picazón en la prenda confeccionada con fibras animales. Un aumento en el porcentaje de estas fibras reduce el factor de confort, definido como el porcentaje de fibras ≤ 30 µm. La calidad de los hilados está fuertemente correlacionada con la suavidad y el menor grado de picazón en la fibra de alpaca, las que a su vez están asociadas con el diámetro de fibra y la proporción de fibras < 30 μm (Swinburn et al., 1995). Por otro lado, se observaron correlaciones positivas y altas entre DPF y FH (r = 0,98), y entre FC y FH (r = 0,89). Esto era de esperarse ya que estas variables presentan una estrecha relación debido a que están expresadas como función del diámetro de fibra. 4.3.2 Espectros NIRS de las muestras En la figura 8 se presenta el promedio y desviación estándar de los espectros en la región VIS y NIR (400 – 2500 nm) de las muestras de fibra de alpaca. De manera general, las bandas de absorción fueron similares a los reportados para lana de ovino (Cozzolino et al., 2005) y de alpaca (Gishen y Cozzolino, 2007). El espectro promedio mostró absorciones de bandas en la región NIR a los 1500 y 1740 nm correspondientes a primeros sobretonos de grupos N-H y S-H respectivamente.

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Tabla 6. Coeficientes de correlación Pearson entre parámetros de fibra medidos en muestras de fibra de alpaca. DEDPF CVDF CO DECO FC FH LM

DPF DEDPF 0,65 -0,32 0,50 -0,48 -0,37 -0,61 -0,38 -0,90 -0,62 0,98 0,78 0,51 0,26

CVDF

0,09 0,23 0,21 -0,15 -0,26

CO

0,89 0,43 -0,48 -0,24

DECO

0,51 -0,59 -0,39

FC

-0,89 -0,45

FH

0,48

DPF = diámetro promedio de fibra, DEDPF = desviación estándar del diámetro promedio de fibra, CVDPF = coeficiente de variación del diámetro promedio de fibra, CO = curvatura de ondulación, DECO = desviación estándar de curvatura de ondulación, FC = factor de confort, FH = finura al Hilado, LM = largo de mecha. Las correlaciones (p < 0,01) están en negritas.

Se observaron también absorciones de bandas alrededor de los 1940 nm asociadas a segundos sobretonos de grupos O-H presentes en la humedad de las muestras de lana (Osborne et al., 1993; Cozzolino et al., 2005; Gishen y Cozzolino, 2007). Asimismo, se observaron bandas de absorción en 2170 y 2280 nm asociadas con bandas de combinación de las deformaciones C-H presentes en aminoácidos (Murray, 1986; Osborne et al., 1993; Cozzolino et al., 2005; Gishen y Cozzolino, 2007); y las absorciones a 2055 nm de bandas de combinación de grupos N-H presentes en compuestos proteicos de la lana. La mayor absorción de compuestos aminados y azufrados era de esperarse debido a que la lana contiene más de 170 proteínas en cuya estructura química predominan los grupos amino (NH2) y carboxilo (COOH) (Rippon, 1992).

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La desviación estándar del espectro mostró una mayor expresión en el rango visible, explicadas por la marcada variabilidad en el color de las fibras. En esta región, los pigmentos de eumelanina y feomelanina podrían tener una fuerte absorción (Honeyman, 2002). En el rango NIR, se observa variación importante en los 1620, 1930 y 2055 nm correspondientes al primer sobretono de grupos CH, bandas de combinación de deformaciones C-H y bandas de combinación de enlaces N-H presentes en proteínas, respectivamente (Osborne et al., 1993).

Desviación Standard

Promedio

Longitud de onda (nm)

Figura 8. Espectro infrarrojo promedio y desviación estándar de las muestras de fibra de alpaca. 4.3.3 Predicción NIR de los parámetros de la fibra de alpaca En la tabla 7 se presenta los resultados obtenidos para las mejores calibraciones obtenidas para los distintos parámetros de la fibra de alpaca utilizando la región VIS-NIR y NIR, respectivamente. A través de la validación

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cruzada se obtuvo el índice de certidumbre 1-VR (coeficiente de determinación en validación cruzada) y de incertidumbre SECV (error estándar de validación cruzada) como indicadores del mérito relativo de las mejores ecuaciones generadas. Las mejores ecuaciones fueron seleccionadas mediante la relación entre la desviación estándar del set de calibración y el SECV, denominada RPD (Valor Residual Preditivo). Cada ecuación se describe en términos de los estadísticos arriba mencionados, junto al tratamiento matemático de los datos espectrales. En general, de los distintos métodos de corrección de dispersión y de los múltiples tratamientos matemáticos probados, se obtuvo mejores resultados de calibración cuando no se aplicó corrección de dispersión de los espectros. Según Kennedy et al. (1996), una ecuación se considera aceptable si el cociente entre la desviación estándar de los valores de referencia y el error estándar de predicción, es mayor a tres. A pesar que en el presente trabajo no se realizó la validación externa, se asumió el mismo criterio para seleccionar el mejor modelo en el proceso de validación cruzada (Cozzolino y Murray, 2002). De acuerdo a esta relación, los modelos de calibración utilizando las regiones VIS-NIR y NIR para predecir DEDPF, CVDPF, CO, DECO FC y LM resultaron ser muy pobres en su calidad predictiva, por presentar valores de 1-VR < 0,65 y RPD < 1,5. Lo anterior, se confirma al observar la menor correlación entre los valores de referencia y los espectros de los parámetros señalados anteriormente (R2>0,67). Similares resultados para estos parámetros fueron reportados en otros estudios (Gishen y Cozzolino, 2007).

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Tabla 7. Tratamientos matemáticos y estadísticos de la mejor calibración obtenida para los parámetros de la fibra de alpaca utilizando el espectro completo (VISNIR) o solo la región NIR. Parámetro TM R2 Región VIS y NIR (400 a 2500 nm) DPF (μm) 0-0-10-1 0,90 DEDPF (μm) 2-8-7-1 0,60 CVDPF (%) 1-5-1-1 0,40 CO (º/mm) 0-0-8-1 0,55 DECO (º/mm) 1-4-4-1 0,56 FC (%) 0-0-7-1 0,66 FH (μm) 0-0-1-1 0,88 LM (mm) 0-0-2-1 0,40 Región NIR (1100 a 2500 nm) DPF (μm) 0-0-9-1 0,91 DEDPF (μm) 2-6-6-1 0,62 CVDPF (μm) 1-9-9-1 0,37 CO (μm) 0-0-8-1 0,59 DECO (μm) 1-4-4-1 0,56 FC (μm) 0-0-3-1 0,67 FH (μm) 0-0-10-1 0,89 LM (μm) 0-0-6-1 0,44

SEC

1-VR

SECV

RPD

0,98 0,49 2,14 3,59 2,87 2,66 1,03 13,83

0,88 0,54 0,25 0,50 0,51 0,62 0,86 0,37

1,06 0,52 2,40 3,79 3,01 3,25 1,11 14,19

2,91 1,48 1,15 1,42 1,43 1,41 2,66 1,26

0,95 0,47 2,22 3,44 2,84 2,67 0,99 13,35

0,90 0,53 0,27 0,55 0,53 0,64 0,87 0,40

1,01 0,52 2,37 3,64 2,95 3,45 1,08 13,85

3,13 1,46 1,17 1,48 1,46 1,36 2,73 1,28

TM: tratamiento matemático, R2: coeficiente de determinación de calibración, SEC: error estándar de calibración, 1-VR: coeficiente de determinación de validación cruzada, SECV: error estándar de validación cruzada y RPD: Valor Residual de Predicción (de sus siglas en ingles Residual Predictive Deviation).

Los modelos de predicción del DPF y FH resultaron tener una calidad predictiva moderada en razón a sus valores de 1-VR = 0,86-0,88 y RPD 90 %) las muestras de fibra de alpaca por lugar de procedencia y color. Sin embargo, el sexo fue débilmente discriminado (> 67 %). En otras investigaciones, el sexo fue eficientemente discriminado al utilizar NIRS, a partir de muestras de heces fecales en vacunos (Tolleson et al., 2000), ovinos (Godfrey et al., 2001) y ciervos blancos (Tolleson et al., 2005). Si bien nuestros resultados no son comparables con los estudios anteriores, se sabe que los espectros NIR son el resultado de la composición química presente en la muestra (heces, lana, carne, huevo, etc.) objeto de estudio. De ahí que las características químicas de las muestras de fibra de alpaca podrían ser similares en ambos sexos en la presente investigación.

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Por otra parte, la eficiente discriminación de las localidades se podría atribuir a diferencias de edad, ya que diferencias en metabolismo o selección de dietas a distintas edades podrían resultar en diferencias químicas de los productos finales de los animales de granja. Estas diferencias químicas fueron también evidentes respecto de los colores de la fibra, ya que permitieron su discriminación con precisión (exactitudes mayores al 90%). Estos resultados pueden atribuirse a diferencias en pigmentos de eumelanina y feomelanina presentes en las fibras de colores de mamíferos, los mismos que mostraron una fuerte absorción en la región VIS del espectro. Los resultados del segundo estudio mostraron un alto coeficiente de correlación (r > 0.94) entre los datos de referencia y la información espectral para el diámetro de fibra y la finura al hilado (Spining Fineness), sumado a los altos valores en los índices estadísticos de fiabilidad ( 1-VR, R2 y RPD). Este resultado nos permite afirmar que con las ecuaciones de calibración NIRS se puede lograr la predicción del diámetro de fibra de alpacas con aceptable exactitud y precisión. Lo anterior se puede confirmar empleando otros criterios de selección de modelos, como el valor del RER (Range Error Ratio), definido como el cociente entre el rango de los datos de referencia y los valores del SECV, considerándose una buena calibración cuando valores RER son mayores a 13 (Williams y Sobering, 1996; Fearn, 2002). Un segundo criterio es el Coeficiente de Variación (CV), definido como el cociente entre el SECV y el promedio de los datos de referencia en términos porcentuales ((SECV/ X )*100), estimándose que valores CV menores al 5% representan ecuaciones aceptable; un tercer criterio es el

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cociente entre el SECV y el Rango de los datos de referencia en términos porcentuales ((SECV/R)*100). Según los tres criterios, los modelos de calibración NIRS para predecir el diámetro promedio de fibra y la finura al hilado obtuvieron altos valores de RER (> 13), bajos valores CV (< 5%) y bajos valores del cociente ((SECV/R)*100) (< 6.5%) considerando la región NIR del espectro (ver Anexos 1 y 2). Las ecuaciones de calibración para las demás propiedades físicas de la fibra (DEDPF, CVDPF, CO, DECO FC y LM) mostraron un bajo nivel predictivo (1-VR < 0.65, RPD < 1.5 y r