UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

CAMBIOS PROTEOGENÓMICOS DEL RECEPTOR PURINÉRGICO P2X6 INDUCIDOS POR EL CAMBIO DEALIMENTACIÓN DURANTE LA ONTOGENIA DEL INTESTINO DE RATA TESIS QUE COMO PARTE DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN NUTRICIÓN HUMANA PRESENTA: I.Q en A. KARLA MARGARITA PADILLA OLVERA DIRIGIDA POR: Dra. MARÍA GUADALUPE GARCÍA ALCOCER

QUERÉTERO CAMPUS JURIQUILLA DICIEMBRE DE 2013 MÉXICO 0

1

RESUMEN

La familia de receptores purinérgicos P2X está formada por siete miembros (P2X17), los cuales participan en las funciones del intestino debido a que al unirse a ATP extracelular intervienen en la permeabilidad rápida y selectiva a pequeños cationes monovalentes y Ca2+. Un miembro de dicha familia es el receptor P2X6 el cual está involucrado en la regulación fisiológica de las neuronas entéricas, y su funcionalidad puede cambiar por su estado de glicosilación. Anteriormente se ha demostrado el cambio de expresión y distribución de receptores durante el desarrollo y por efecto de la dieta, sin embargo se desconoce si estas diferencias pudieran ocurrir con el receptor P2X6 durante el desarrollo del intestino de rata. En este trabajo se estudiaron los cambios en los niveles de expresión génica y proteica, así como el estado de glicosilación del receptor P2X6 durante el desarrollo de intestino de rata en los períodos perinatal (embrionario y recién nacido) y de transición lactancia-destete. Las metodologías utilizadas fueron qRTPCR y Western Blot, para lo cual se usaron ratas Sprague Dawley macho, que fueron separadas en seis grupos: E18, P0, P7, P17, P32 y adulto, a las que se les estudiaron las secciones proximal y distal del intestino delgado de rata. En este trabajo se encontró que el gen que codifica para el receptor purinérgico P2X6 se encuentra expresado durante toda la ontogenia del intestino delgado de rata de rata y que tiene cambios en su activación dependientes de la edad y sección, obteniéndose mayor actividad en las edades de P7 y P32, así como en las secciones proximales. A pesar de ello, la proteína P2X6 se expresó en mayor cantidad en la edad de E18 y en menor cantidad en las edades de P7 y P32, además se detectaron bandas correspondientes a diferentes estados de glicosilación, así como diferente distribución del receptor purinérgico P2X6 dependientes de la edad y de la sección estudiada.

Palabras clave: ontogenia, purinoreceptor, P2X6, glicosilación

i

SUMMARY

P2X receptors are ligand-gated ion channels that mediate rapid and selective permeability to small monovalent cations and Ca2+ in response to binding of extracellular ATP. The P2X family is formed by seven members (P2X 1-7) that are important in gut function. One of them (P2X6) is involved in the physiological regulation of enteric neurons. Previous research has reported expression of P2X6 in the rat enteric nervous system and glycosylation- dependent regulation of receptor function. There are many examples of changes in the expression and distribution of the receptors during development and due to effects of diet. However it is not known whether differences can also occur in P2X6 during rat gut development. In this work we studied the changes in the levels of gene expression and also in protein level and glycosylation state of the purinoreceptor P2X6 using qRT-PCR and western blot in the small intestine of perinatal (embryonic and newborn) rats and those in suckling-weaning transition period. We used Sprague Dawley rats, separated in six groups: E18, P0, P7, P17, P32 and adult, we studied in the proximal and distal section of the gut. We found that the gene coding for the P2X6 purinergic receptor is expressed throughout the ontogeny of rat small intestine and changes in its expression in an age-dependent and sectiondependent manner. The gene coding for the P2X6 purinergic receptor has greater expression at age P7 and P32, as well as in the proximal sections. In contrast, the P2X6 protein is expressed at higher levels in age E18 and lower at ages P7 and P32, in addition the bands that were detected corresponding to different glycosylation states and also different P2X6 purinergic receptor distribution on then dependent on the age and the studied section.

Key words: rat gut development, purinergic receptor, P2X6, glycosylation

ii

íNDICE GENERAL

Página RESUMEN

i

SUMMARY

ii

íNDICE GENERAL

iii

íNDICE DE FIGURAS

v

íNDICE CUADROS

vi

íNDICE DE GRÁFICAS

vii

I.

INTRODUCCIÓN

2

II.

REVISION DE LITERATURA

4

2.1. Tubo digestivo

4

2.2. Sistema nervioso entérico

7

2.3. Efecto de la nutrición en el desarrollo del intestino delgado y el SNE

9

2.4. Receptores

13

2.5. Receptores Purinérgicos

16

2.6. Receptores P2X

17

2.7. Receptores P2X6

21

2.8. Cambios postraduccionales Figura 9

25 28

III.

JUSTIFICACIÓN

31

IV.

HIPÓTESIS

32

V.

OBJETIVOS

33

V.1 Objetivo general

33

V.2 Objetivos específicos

33

VI.

METODOLOGÍA

34

6.1 Obtención de muestras (intestino delgado de rata) 6.1.1 Sacrificio y extracción de tejido 6.1.2 Preparación de la muestra

34 34 34

6.2 Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) 6.2.1 Extracción de ARN total 6.2.2 Síntesis de cDNA 6.2.3 PCR en tiempo real 6.2.4 Cuantificación relativa

35 35 35 36 37

iii

6.3 Western blot 6.3.1 Extracción de proteína y cuantificación de proteínas 6.3.2 Tratamiento de desglicosilación de proteínas 6.3.3 Electroforesis, electrotransferencia y revelado

38 38 39 40

6.4

41

Análisis estadístico y diseño experimental

VII. RESULTADOS

43

7.1. Cuantificación de la expresión génica de P2X6

43

7.2. Estudio de la expresión y estado de glicosilación del receptor P2X6

47

7.3. Distribución del receptor purinérgico P2X6

51

VIII. DISCUSIÓN

56

IX.

CONCLUSIÓN

63

X.

LITERATURA CITADA

65

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura

Nombre

Página

1 2 3 4 5 6 7

Estructura del intestino delgado Localización del SNE en el intestino delgado Desarrollo del intestino delgado y del SNE Receptor ionotrópico Clasificación de receptores purinérgicos Topología de la proteína receptora P2X Destino de los polipéptidos recién traducidos en la célula eucarionte Modificaciones postraduccionales de las proteínas Tipos de glicosilaciones Proceso de glicosilación Curva de calibración para PCR Principio de la reacción del kit N-glycosidase F Western blotting combina varias técnicas para detectar una proteína especifica Diseño Experimental Diseño de experimento para el análisis de la expresión del gen que codifica para el receptor P2X6 Expresión de la proteína -actina en durante la ontogenia del intestino delgado de rata. Digestión de glicoproteínas control con la enzima N-glicosidasa F. Análisis Western blot de las diferencias entre regiones del intestino delgado en la expresión del receptor P2X6 durante la ontogenia Controles para inmunoflorescencia del receptor de la mucosa del intestino delgado de rata Imágenes confocales de la distribución del receptor P2X6 durante el desarrollo del intestino delgado de rata Cambios proteogenómicos del receptor purinérgico P2X6 durante el desarrollo de la sección proximal del intestino delgado de rata Cambios proteogenómicos del receptor purinérgico P2X6 durante el desarrollo de la sección distal del intestino delgado de rata

5 8 10 15 17 18 26

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

19 20 21 22

v

27 28 29 38 40 41 42 42 47 48 49

51 53 54 55

ÍNDICE CUADROS

Cuadro

Nombre

Página

1 2 3

Primers usados para la PCR Condiciones de PCR. Modelo general lineal para la expresión del receptor P2X6

37 37 45

vi

íNDICE DE GRÁFICAS

Gráfica

Nombre

Página

1

Cuantificación relativa de la expresión del receptor P2X6 durante la ontogenia de intestino delgado de rata en las secciones proximal y distal Prueba de Normalidad para los residuos de la expresión del gen P2X6 Efectos principales en la expresión del receptor purinérgico P2X6

43

2 3

vii

44 46

I.

INTRODUCCIÓN

Los receptores purinérgicos son macromoléculas que responden a ATP extracelular, se encuentran localizados en el sistema nervioso entérico (también conocido como el segundo cerebro), el cual controla la secreción y motilidad gastrointestinal, además de estar involucrado en la sensación visceral. Actualmente se han realizado trabajos que involucran a la fisiopatología de la señalización purinérgica entérica en enfermedades como, síndrome del intestino irritable, constipación, diarrea, diabetes, reflujo gastroesofágico, la enfermedad de Chagas. El sistema nervioso entérico presenta una marcada plasticidad, ya que pueden ocurrir cambios en la expresión de sus cotransmisores (Adenosina y ATP) y sus receptores (receptores purinérgicos) durante el desarrollo y el envejecimiento, en los nervios que quedan después de un traumatismo o cirugía, en condiciones de enfermedad y por efecto de la dieta. El ATP es un cotransmisor, en los nervios responsables de

la inhibición de

la fase de peristalsis, participando en la

transmisión en los ganglios mientéricos y submucosos que involucran el control vascular del tracto gastrointestinal, así como

el control de la secreción de la

mucosa. Como podemos ver la función de los receptores purinérgicos

es

importante para las funciones del intestino. Los receptores purinérgicos P2 (cuyo ligando es ATP), se encuentran distribuidos en el cerebro y la médula espinal del sistema nervioso central de la rata, así como en el plexo mientérico del intestino delgado (sistema nervioso entérico) por esta última razón los receptores P2X, han sido propuestos como blancos potenciales para el tratamiento de enfermedades intestinales. Los receptores P2X se subdividen en 7 subtipos P2X1-P2X7, los cuales han sido identificados en una gran variedad de tejidos y se encuentran 2

diferencialmente distribuidos durante la ontogenia, incrementando así el interés de dichos receptores en los procesos fisiopatológicos. El subtipo P2X6 está involucrado en la regulación fisiológica de las neuronas entéricas de ese sistema nervioso, además se ha visto que actúa como modulador de la permeabilidad de calcio en el SNC, formando heterómeros con las subunidades P2X2 y P2X4. En trabajos de investigación se ha reportado la expresión de P2X6 en el sistema nervioso entérico de rata y los cambios en su funcionalidad por el estado de glicosilación, sin embargo no se han hecho estudios sobre su expresión durante la ontogenia de intestino delgado de rata, ni de sus posibles cambios en la expresión génica y proteica por efecto de la ontogenia y/o de la alimentación (periodo perinatal y de transición lactancia-destete), estos estudios son importantes porque se ha reportado que la dieta puede modular el desarrollo del intestino delgado, así como del sistema nervioso entérico.

3

II.

REVISION DE LITERATURA

2.1. Tubo digestivo El tubo digestivo se extiende desde la boca hasta el ano en mamíferos, el cual incluye la cavidad oral (boca), la faringe (garganta), el esófago, el estómago y el intestino delgado. El intestino delgado, es un

tubo largo que conecta el

estómago con el intestino grueso y ocupa la porcion central del abdomen, en el humano esta formado por tres segmentos con varias diferencias estructurales y funcionales: duodeno, yeyuno e íleon (Castro y Pérez, 2006; Fox, 2008 ). En la rata se encuentra dividido en las secciones proximal y distal (Yu y col., 2010). En el interior del tubo digestivo, ocurre la fragmentación de las moléculas del alimento y/o fármaco en sus subunidades más pequeñas, esto por medio de reacciones de hidrólisis. Los monómeros así formados, se llevan a través de la pared del intestino delgado a la sangre y la linfa en el proceso de absorción (Fox, 2008). El intestino delgado completa la digestión de los alimentos, absorbe los nutrientes y secreta hormonas (Junqueira y Carneiro, 1996). En el intestino delgado se producen dos tipos principales de contracciones: peristaltismo y segmentación. Siendo la principal, la conocida como peristaltismo, que ayuda a mover el quimo (líquido espeso formado de jugos del estómago y de alimentos parcialmente digeridos) hacia adelante, estas contracciones están moduladas por los nervios autónomos. Cuando la acetilcolina estimula a sus receptores muscarínicos en las células musculares lisas, aumenta la producción de potenciales de acción y promueve las contracciones y la motilidad del intestino. Por el contrario, los neurotransmisores inhibidores hiperpolarizan la membrana muscular lisa y de ese modo disminuye la actividad del intestino (Fox, 2008). La estructura histológica general del intestino delgado (Figura 1) está conformada por: la mucosa y submucosa, presentan dos tipos de plegamientos que aumentan la superficie de absorción, por un lado se encuentran las válvulas 4

de Kerking y por otro las vellosidades. Entre cada dos vellosidades se localizan las criptas de Liberkühn (Castro y Pérez, 2006).

Figura 1. Estructura del intestino delgado. Se observan las capas que componen el intestino delgado, así como una ampliación de las vellosidades de la mucosa y sus células (Adaptado de Raffa, 2008).

La mucosa del intestino delgado está plegada en vellosidades, que se proyectan hacia el interior de la luz. Además las células que revisten estas vellosidades tienen pliegues en su membrana plasmática que se denominan microvellosidades. En la membrana celular de las células que revisten las vellosidades se encuentran incrustadas enzimas digestivas, lo que

mejorar el

proceso de digestión. Estas enzimas al borde en cepillo, permanecen sujetas a la membrana celular con sus

lugares activos expuestos al quimo (Fox, 2008).

Lasubmucosa presenta estructuras glandulares productoras de moco alcalino denominadas glándulas de Brunner. Los otros componentes son la capa muscular y la serosa (Castro y Pérez, 2006). Como unidades anatómicas y funcionales del intestino delgado se encuentran las células epiteliales de la mucosa (Ross, 1997). 5

Las células maduras se encuentran en las vellosidades y en las criptas de Lieberkün, las cuales son glándulas tubulares simples, que se extienden a lo largo de todo el espesor de la mucosa y se abren a la luz intestinal en la base de las microvellosidades. Las células que lo conforman son: los enterocitos (células de absorción intestinal), las caliciformes, de Paneth, enteroendocrinas y las células M (Junqueira y Carneiro, 1996; Chesire y Long, 2003).

Los enterocitos son células especializadas en el transporte de sustancias desde la luz del intestino hacia al aparato circulatorio. Los mecanismos de transporte de estas células se localizan en la membrana plasmática lateral, una de las principales enzimas transportadoras es la enzima ATPasa NA+K+, estos mecanismos también aumentan las concentraciones de sustancias en el espacio intercelular, dichas sustancias difunden según el gradiente de concentración, por el espacio intercelular, hasta atravesar la lámina basal epitelial, e ingresar en los capilares que se encuentran por debajo del epitelio. Las sustancias que son demasiado voluminosas para penetrar al vaso sanguíneo, ingresan al quilífero linfático (Ross, 1997). Las células caliciformes se encuentran situadas entre los enterocitos, son más numerosas en las vellosidades y en los dos tercios superiores de las criptas; su número aumenta en sentido descendente en el intestino delgado (Chesire y Long, 2003). Las células caliciformes secretan moco que lubrica y protege la superficie del epitelio intestinal (Junqueira y Carneiro, 1996). Las células de Paneth se encuentran en el fondo de las criptas de Liberkün (Castro y Pérez, 2006). Estas células son fagocíticas y contienen gránulos de lisozima, una enzima que digiere las paredes de bacterias como E. coli, S. aureus, entre otras (Chesire y Long, 2003; Male, 2007). Esta enzima regula la flora intestinal gracias a su acción bacteriolítica (Junqueira y Carneiro, 1996).

Lascélulas enteroendócrinas

se localizan en las criptas del intestino

delgado, segregan hormonas y neurotransmisores como somatostatina, 56

hidroxitriptamina (5-HT; serotonina), secretina, gastrina, motilina y péptido intestinal vasoactivo (Chesire y Long, 2003).

Las células M (células de los micropliegues), son enterocitos modificados que cubren los nódulos linfáticos. Se caracterizan por la presencia

en sus

regiones basolaterales de numerosas invaginaciones de la membrana, que forman depresiones donde se localizan linfocitos. Las células M son importantes para las funciones del sistema inmunitario intestinal, porque presentan perforaciones que facilitan el tránsito de los linfocitos entre las células M y la lámina propia (Junqueira y Carneiro, 1996; Ross, 1997). También existen células indiferenciadas (células madre), que se localizan en las criptas de Liberkühn y dan lugar a los enterocitos, las células caliciformes y a las enteroendócrinas (Chesire y Long, 2003). Un importante sistema de regulación gastrointestinal es el sistema nervioso entérico, que ayuda a integrar las actividades motoras del sistema digestivo, el cual puede funcionar de manera independiente (Gal y Meritxell, 2007). Sin embargo, en todos los procesos digestivos (la motilidad, el transporte iónico asociado a la secreción, la absorción y el flujo sanguíneo), están en parte controlados por las conexiones que se establecen entre el sistema digestivo y el sistema nervioso (Raffa, 2008).

2.2. Sistema nervioso entérico El sistema nervioso entérico (SNE) está formado por neuronas que se localizan en los plexos intramurales de la pared intestinal. Se calcula que hay más neuronas en este sistema que en la médula espinal (Rang, 2008). La organización del sistema nervioso consiste en: el sistema nervioso central (SNC), el cual está formado por el cerebro y la médula espinal, y el sistema nervioso periférico (SNP) constituido por nervios eferentes, nervios aferentes y el sistema nervioso autónomo (Rang, 2008). El sistema nervioso autónomo (SNA) está formado por los ganglios raquídeos y los nervios que salen y llegan de la médula, así como el 7

sistema nervioso motor. El SNA se encarga de la regulación del corazón, los vasos sanguíneos, las glándulas, las vísceras y el músculo liso vascular. El SNA se subdivide a su vez en una porción simpática y otra parasimpática, las cuales se distinguen por su distribución anatómica y el tipo de neurotransmisores. En muchos casos los sistemas simpático y parasimpático se comportan como antagonistas fisiológicos; es decir cuando un sistema estimula un órgano, el otro lo inhibe (Brailowsky, 2002). El tracto gastrointestinal está inervado por el sistema nervioso autónomo y cuenta también con el SNE. Las fibras simpáticas y parasimpáticas llevan al tracto gastrointestinal señales procedentes del sistema nervioso central y constituyen la inervación extrínseca del sistema gastrointestinal.

Figura 2. Localización del SNE en el intestino delgado. En ambas figuras se muestran las capas (plexo miénterico y submucoso) donde se localiza la inervación intrínseca del intestino delgado (Adaptado de Raffa, 2008). Las neuronas entéricas forman circuitos locales en el propio sistema, constituyendo así

la inervación intrínseca, la cual controla la contracción

muscular, la secreción, la absorción intestinal y el flujo sanguíneo de las paredes del esófago, el estómago, el intestino y la vesícula biliar (Gal y Meritxell, 2007). Estas neuronas son los componentes principales del sistema nervioso entérico y se localizan en el interior de la pared del tracto digestivo, en los plexos mientérico 8

y submucoso (Figura 2). El plexo mientérico (de Auerbach) controla principalmente la motilidad. El plexo submucoso (de Meissner) regula el flujo sanguíneo gastrointestinal y la función de las células epiteliales a través del control del contenido de la luz intestinal (Raffa, 2008). Ambos plexos están interconectados y sus células ganglionares reciben fibras parasimpáticas preganglionares del vago, que son principalmente colinérgicas y en su mayor parte excitadoras, aunque algunas son inhibidoras. Las fibras simpáticas que llegan son de predominio posganglionar, además de inervar directamente los vasos sanguíneos, el músculo liso y algunas células glandulares, pueden enviar terminaciones nerviosas a los plexos, donde inhiben la secreción de acetilcolina (Rang, 2008). Por todo lo anteriormente mencionado el SNE es un regulador clave de las funciones gastrointestinales y ha sido demostrado que puede ser modulado por factores nutricionales (Pacha, 2000).

2.3. Efecto de la nutrición en el desarrollo del intestino delgado y el SNE El desarrollo del intestino de rata se empieza a formar la región proximal por la migración de las célulasdel epiblasto alrededor de los 7.5 dpc (días poscoito), esta migración continúa para que a los 8 dpc de lugar al intestino grueso (Nagy y col., 2003). El epitelio del intestino delgado es formado a partir del endodermo (Figura 3-C). El origen el músculo liso de la pared del intestino proviene del mesodermo esplácnico; la mayoría del intestino está compuesto por el endodermo y mesodermo esplácnico, en un arreglo parecido a un tubo. El epitelio en la región más anterior del intestino (hacia la boca) y la región más posterior (hacia el ano) es derivado del ectodermo, el resto de linaje epitelial del intestino es formado por el endodermo. El evento inicial incluye dos invaginaciones, empezando con una en el extremo anterior del embrión formando el portal intestinal anterior (PIA), el cual es cerrado por otra segunda invaginación formando el portal intestinal caudal (PIC), estas darán lugar a tres regiones distintas: intestino anterior (IA), medio (IM) y grueso (IG), ver Figura 3-A; el intestino anterior al comenzar la diferenciación 9

celular dará lugar al estómago, el intestino medio dará lugar al intestino delgado (Sanderson y Walker, 1999).

B

Ectodermo

C

IA

PI A

Mesodermo

Endodermo

IM

IG

PIC

D

Figura 3.Desarrollo del intestino delgado y del SNE.A) muestra un embrión de pollo de E2.5, el cual muestra la formación de PIA-PIC donde se formaran 3 regiones: intestino anterior (IA) medio (IM) y grueso (IG). C) muestran las capas germinales que le darán lugar al intestino delgado. B) vista lateral del cerebelo de un embrión de pollo de E2.9, el cual fue marcado con anticuerpos para células de la cresta neural, se muestra la migración de estas células a partir de la vesícula ótica (ot) para colonizar el intestino (flecha) por lo que ENS probablemente deriva de la cresta neural vagal. C) IHQ para marcar células de la cresta neural, de un intestino delgado de ratón de E12.5 encontrando células inmunoreactivas en la parte de afuera de la mesénquima, que futuramente será el plexo mientérico (Adaptado de Newgreen y Young, 2002).

El intestino delgado es la primera entrada de varios factores ambientales, como una gran cantidad de nutrientes, drogas y xenobióticos. Existen importantes cambios en las funciones del intestino delgado, estos ocurren especialmente en la transición de los periodos perinatales lactancia-destete. Por otro lado durante la etapa de desarrollo perinatal, el intestino delgado se somete a una maduración 10

inicial morfológica y funcional, la cual es acompañada de una abrupta inducción de varios genes relacionados a los nutrientes recibidos y al metabolismo (Henning, 1981; Thomson y Keelan, 1986). Por ejemplo el ácido retinoico (AR) participa en el desarrollo, manteniendo y diferenciando varias células epiteliales en el intestino delgado (Plateroti, 1993). Bhat en 1998 encontró, en su estudio sobre el efecto de la deficiencia de la vitamina A en la expresión del gen de retinal deshidorgenasa (RALDH) durante el desarrollo del estómago e intestino delgado de rata, que la expresión diferencial de RALDH durante el desarrollo del intestino y que el estado de vitamina A regula la expresión del gen RALDH en estos tejidos que se estudiaron con las técnicas de Northern blot y Western blot. Más recientemente Ogura y col. en el 2005, reportaron los cambios en la expresión de genes regulados por el ácido retinoico durante el desarrollo del intestino delgado de rata, usando tanto Northern blot como RT-PCR en tiempo real y encontraron que los niveles de ARNm de los receptores diana del AR (RALDH1) y (RALDH2) fueron mayores en E19 y declinaron después del nacimiento, los niveles de (RXR) y (RAR) resultaron ser mayores con respecto al periodo de transición de lactación-destete, estos resultados sugieren la posible producción perinatal de AR regulando varios genes en el desarrollo de intestino delgado. Otra evidencia de la regulación de la nutrición durante el desarrollo de intestino de rata lo reportaron Suzuki y col. en el 2011, quienes usaron técnicas como la inmunohistoquímica (IHQ), RT-PCR en tiempo real, Western blot e Inmunoprecipitación de cromatina y reportaron que la dieta induce una regulación epigenética in vivo del transportador de fructosa Glut5, ya que hay una baja expresión del transportador Glut5 después del nacimiento y no incrementa con la edad, al menos que haya fructosa. En contraste, la expresión de GTPasa disminuye con la edad e incrementa con la fructosa. El intestino tiene una baja tolerancia a la nutrición enteral, pero al mismo tiempo depende de esta para su crecimiento y maduración, por ejemplo esta 11

reportado que desde la primera ingesta de leche materna se induce un rápido crecimiento y maduración del intestino de lechones (Zhang y col., 1997), esto se ve más claramente en el estudio realizado por Oste y colaboradores en el 2005, quienes estudiaron el efecto de la dieta enteral contra la parenteral en lechones pre-término, aplicando técnicas IHQ y reportaron que el crecimiento del intestino es inducido por la ingesta oral de leche después de un corto período de alimentación parental. Además Bjornvad y colaboradores en el 2008 añadieron que los lechones pretérmino sometidos a la dieta de calostro, a los pocos días de la dieta parental después de su nacimiento, mejora la maduración del intestino y la resistencia a la necrosis enterocolítica. La barrera del epitelio intestinal (BEI) juega un papel importante

para

mantener la homeostasis del intestino y el desarrollo del sistema inmunológico de los recién nacidos (Freier, 1989). Las funciones de la BEI son influenciadas por varios estímulos fisiológicos, tales como los nutrientes moduladores del SNE, el cual es un regulador clave de las funciones gastrointestinales (Pacha, 2000; Keita y Sderholm, 2010). Esto ha sido confirmado con una investigación elaborada por De Quelen y colaboradores en el 2011 quienes mediante técnicas de IHQ y RTPCR en tiempo real, propusieron que la suplementeación de la leche materna con ácidos

grasos

poliinsaturado

n-3

modificó

la

permeabilidad

intestinal,

probablemente a través de cambios neuroplásticos en el SNE de los lechones recién nacidos, mostrando así la plasticidad del SNE. Anteriormente, en el 2008, ya se había reportado esta plasticidad, cuando Van Harver y colaboradores (2008) estudiaron el efecto de la dieta en las células gliales entéricas en lechones pretérmino utilizando técnicas de IHQ, sus resultados mostraron que el SNE es altamente plástico, durante los primeros días después del nacimiento prematuro y que se adaptaba de una manera dependiente de la edad y de la dieta.

Como se ha mencionado anteriormente el SNE participa en cada función intestinal, incluyendo la

motilidad y su desarrollo está asociado con cambios

dependientes del tiempo en la expresión de neuromediadores importantes dentro de las neuronas entéricas, que se produce durante el período pre-y post-natal 12

(Newgreen y Young, 2002), además su plasticidad le confiere una suceptibilidad a ser modulado por la dieta (Van Harver y col., 2008; De Quelen y col., 2011) y esto es debido, en parte, a que el desarrollo del sistema nervioso entérico no está completado al nacimiento, esto se ha visto en ratas (Matini y col., 1997) y ratones (McKeown y col., 2001), aun cuando los mamíferos nacen con un tracto intestinal más maduro que otras especies (Sangild, 2006). Otro ejemplo más concreto del efecto de la dieta en la regulación del SNE es el estudio realizado por Misawa y col. en el 2010 donde investigaron el efecto de la privación de la proteína y la realimentación en la expresión del receptor purinérgico (P2X2) en las neuronas entéricas, esto lo evaluaron en las crías de las ratas embarazadas que recibieron dicha dieta mediante técnicas de IHQ, ellos reportaron que el estado de desnutrición afecta la expresión del receptor P2X 2 en el plexo submucoso y neuronal, sin embargo estos cambios son reversibles después de la realimentación.

2.4. Receptores Los receptores son estructuras macromoleculares que se encuentran en las membranas celulares, en el citoplasma y en el núcleo. Tienen dos funciones esenciales: reconocer al ligando y propagar el mensaje. La unión del ligando al receptor depende de la especificidad y la afinidad. La especificidad de un receptor, se refiere a la capacidad de fijar un ligando con preferencia a otro. La afinidad se refiere a la fuerza de unión entre el receptor y el ligando, mediada por la constante de equilibrio Keq (Taleisnik, 2006). El papel de los

receptores neuronales, ya que son

proteínas que

reconocen las moléculas de los distintos neurotransmisores; como una cerradura que se puede abrir con la llave correspondiente, aunque actualmente se conoce que distintos neurotransmisores modulan la función de un solo receptor. Los receptores son los responsables de que una sinapsis sea inhibitoria o excitadora y en el caso de los metabotrópicos son los que hacen que una misma sustancia 13

provoque múltiples y diferentes efectos en la sinapsis. En muchos casos existe más de un receptor para una determinada sustancia, bien porque hay diferentes sistemas de reconocimiento o porque existen diferentes sistemas de respuesta. Los receptores están constituidos por proteínas, lo que implica la necesidad de una secuencia ordenada de aminoácidos con una configuración tridimensional precisa. En ellos se distinguen los siguientes elementos: 1) El sitio donde se recibe y reconoce la señal, 2) El mecanismo de transducción que sirve para traducir la señal y 3) El sistema efector o mecanismo de inicio de la respuesta celular (Bustamante, 2007). Los receptores desencadenan diferentes tipos de efectos celulares. Algunos de ellos muy rápidos, como lo implicados en la transmisión sináptica y actúan en milisegundos, mientras que otros efectos mediados por receptores, como los producidos por la hormona tiroidea, actúan a lo largo de horas o días (Rang, 2008). Hay dos tipos de receptores neuronales (según su mecanismo de acción) los

metabotrópicos y los ionotrópicos (Koeppen, 2009). Los primeros son

receptores acoplados a proteínas G, actúan por la unión del GTP a dichas proteínas y se desactivan con la hidrolisis de éste. Los receptores asociados con canales iónicos (ionotrópicos), son los responsables de la transmisión rápida de las señales a través de las sinapsis en el sistema nervioso. Transducen directamente una señal química en una señal eléctrica con la forma de un cambio de voltaje a través de la membrana plasmática de la célula diana. Cuando el neurotransmisor se une, este tipo de receptor altera su conformación y abre o cierra un canal para permitir el flujo de un tipo específico de iones (Alberts y col., 2006).

14

C

A

Unión del ligando

Bicapa lípidica

CITOSOL

B

Sitio de unión del ligando

D

Can al Poro

Entrad a

Figura 4. Receptor ionotrópico. A) Ejemplo de receptor nicotínico ACh, con cinco subunidades forman un poro que permite selectivamente el paso de iones cuando se abre por un ligando.B) receptor iónotropico nicotínico abierto por la unión del ligando (Alberts y col, 2008). C) vista desde arriba de un canal iónico cerrado y abierto (Baynes y Dominiczak, 2005). D) modelo del receptor iónotropico P2X4 formado de 3 subunidades, además se muestran sus sitios de glicosilación (Valente y col., 2011).

Los receptores ionotrópicos son complejos proteícos, que tienen un lugar extracelular de unión para el neurotransmisor y forman un canal iónico (poro) a través de la membrana celular. Están constituidos por varias subunidades proteicas, generalmente de tres a cinco (Figura 4-A), cada una de las cuales típicamente tiene una serie de dominios transmembrana que contribuyen a formar la pared del canal iónico (Koeppen, 2009). Los receptores son llamados según el ligando que actúa sobre ellos, en el caso de los receptores purinérgicos son nombrados así ya que son activados por purinas, por ejemplo el ATP (Redolar, 2010).

15

2.5. Receptores Purinérgicos Los nucleósidos, sobre todo la adenosina y los nucleótidos, principalmente ATP y ADP, ejercen una gran variedad de efectos farmacológicos que no se relacionan con su función en el metabolismo energético (Rang, 2008). En 1970 Burnstock y colaboradores propusieron el ATP (adenosina 5´-trifosfato) como un transmisor involucrado en las respuestas mediadas por el nervio del músculo liso del tracto gastrointestinal, vía no adrenérgicas, no colinérgicas. Desde esta evidencia se ha acumulado soporte de la hipótesis que el ATP es un neurotransmisor del sistema nervioso entérico (Burnstock, 2001). Los nucleótidos y nucleosidos de purinas juegan un papel importante en la modulación de las funciones secretoras y motoras del tracto gastrointestinal (Giaroni y col., 2006). Las purinas tienen sus principales funciones en la actividad de células no neuronales como en las neuronas. Esto incluye las funciones de señalización rápida (neurotransmisión sináptica): la secreción exócrina y endócrina, agregación de plaquetas, vasodilatación y transducción nociceptiva; actúan también como cotransmisores y neuromoduladores en muchos tipos de nervios en el sistema nervioso central y periférico. La señalización purinérgica lenta ha sido implicada en la proliferación, migración, diferenciación y muerte celular, desarrollo embriológico, cicatrización de heridas, la aterosclerosis, la isquemia, la renovación celular epitelial y órganos vicerales, la inflamación, la neuroprotección y el cáncer (Burnstock, 2006). En la transmisión purinérgica está implícita la existencia de receptores específicos. En 1978 se propuso una distinción básica de dos tipos de receptores purinérgicos, uno selectivo para adenosina (llamados P1), los cuales son antagonizados con metil-xantinas y otros selectivos para ATP/ADP (llamados P2). En 1985 los receptores P2 fueron subdivididos en los subtipos P2X (ionotrópicos) y P2Y (metabotrópicos) basados en diferencias farmacológicas (Figura 5). Los receptores P2 fueron clonados a principios de los años 90´s. En la actualidad existen 4 subtipos de receptores P1, 8 subtipos de receptores P2Y y 7 subtipos de receptores P2X (Burnstock, 2009), ver figura 5. 16

Figura 5. Clasificación de receptores purinérgicos.Familia de recceptores purinérgicos P1 y P2 dependientes del ligando al que respondan (Baroja-Mazo y col, 2013).

2.6. Receptores P2X Los receptores P2X son canales iónicos trimétricos que se pueden ensamblar en homómeros o heterómeros (North, 2002), estos canales iónicos son activados por el ATP extracelular; el cual además de tener un papel importante como fuente de energía del metabolismo, síntesis de ácidos nucleicos y regulación de enzimas, a nivel extracelular funciona como un neurotransmisor y como un neuromodulador que ha sido estudiado intensivamente (Cheung, 2002; Burnsotck, 1997; Abbracchino y Burnstock, 1998). El ATP activa estos receptores

en muchas

células excitables (neuronas) y células no excitables en el músculo liso (Nakagawa y col., 1990, Edwards y col., 1992; Evan y col., 1992; Dunn y Bakeley, 1988) mediando así una rápida y selectiva permeabilidad a ciertos tipos de cationes como el Na+, K+, Ca2+ (Bean, 1992; North, 1996).

17

Hasta la fecha han sido clonadas en mamíferos siete subunidades del receptor P2X (P2X1-7) (North, 2002). Estas tienen propiedades características con respecto a sus respuestas a agonistas (-meATP), antagonistas (suramin) y la velocidad desensibilizante del receptor. Las subunidades P2X tienen dos regiones transmembranales (Figura 6), un bucle extracelular, el cual contiene 10 residuos de cisteínas conservadas (los cuales son pensados para formar enlaces disulfuro), e N- y C-terminal intracelular (Da Silva y col., 2007; Torres y col., 1998); la segunda región transmembranal ha sido identificada como un determinante crítico en el co-ensamblaje de las subunidades (Torres y col., 1999), de tal manera que son capaces de ensamblarse para formar complejos homoméricos o heteroméricos (Soto y col.,1996; Nicke y col., 1998; Torres y col., 1999) en algunos casos las propiedades funcionales de los heterómeros son distintas de los homómeros (Suzuki-Kerr y col., 2008). El ensamble de los receptores ionotrópicos con sus subunidades toma lugar en el retículo endoplasmático (Deutsch, 2003).

Figura 6. Topología de la proteína receptora P2X. Se muestra las dos regiones N-terminal y C-terminal en el citoplasma y dos segmentos M1 y M2 que atraviesan la membrana plasmática (Burnstock, 2002).

18

Los receptores P2X han sido asociados con la inhibición de la proliferación por nucleótidos de próstata y células de carcinomas de la piel (Coutinho-Silva y col., 2005). Suzuki-kerr y col. (2008) sugieren mediante técnicas de RT-PCR, Western Blot e inmunohistoquímica que la expresión diferencial de los receptores P2X en la retina ocular (en rata), está asociada a los mecanismos de señalización purinérgica, que podrían estar involucrados en el mantenimiento de la homeostasis de la retina. Glass y Burnstock (2001) encontraron todos los receptores P2X distribuidos diferencialmente en el músculo

liso, células

endoteliales y células epiteliales de la tiroides (en ratas adultas), usando los métodos de inmunohistoquimíca y WesternBlot. Dichos autores discuten que el alto nivel de expresión de los receptores P2X en las células endoteliales y epiteliales de la tiroides, pueden estar asociados a la necesidad de regular el tono vascular de la tiroides, un control estricto de la función de barrera endotelial en esta glándula endócrina y al control de la secreción hormonal de la tiroides.

Estudios inmunohistoquímicos han documentado la distribución receptores P2X en el sistema nervioso entérico

del

de los

conejillo de indias

(Vulchanova y col., 1996; Poole, 2002), rata (Xiang, 2004; Yu, 2010) y ratón (Giaroni, 2002; Ruan y Burnstock 2005), por lo cual juegan un importante papel en los procesos fisiológicos tales como transmisión nerviosa, modulador de la movilidad intestinal, sensación del dolor, control del tono vascular e inflamación haciendo de ellos blancos potenciales

para el tratamiento de

enfermedades

inflamatorias intestinales (Galligan y colaboradores 2000; Khakh, 2006). Burnstock, 2008 propone que la acción de agonistas que actúan sobre

los

receptores P2X en las neuronas entéricas intrínsecas, pueden incrementar la propulsión y secreción gastrointestinal y estos podrían ser usados como drogas para el tratamiento contra la constipación, mientras que los antagonistas de P2X ser útiles en el tratamiento contra la diarrea. La expresión de los purinoreceptores P2X durante la ontogenia, se ha estudiado con interés porque presentan cambios durante el desarrollo embrionario y posnatal, estos cambios se deben a la plasticidad del sistema nervioso 19

autónomo, los cuales ocurren por situaciones como el desarrollo, después de un trauma o una cirugía y en condiciones de enfermedad (Burnstock, 2001; Burnstock, 2009). Por ejemplo Ryten y colaboradores en el 2001 documentaron mediantes técnicas inmunohistoquímicas la existencia de

una expresión

transitoria de P2X5 y P2X6 durante el desarrollo de microtúbulos del músculo esquelético de rata y de P2X2 durante el desarrollo de la unión neuromuscular; Cheung y colaboladores en el 2005 valiéndose de técnicas inmunohistoquimicas y RT-PCR reportaron una expresión diferencial de los receptores P2X durante el desarrollo del cerebro de rata del día embrionario (E) 10 al día posnatal (P) 16. La expresión de los genes que codifican para los receptores P2X han sido reportados como posibles reguladores del desarrollo del oído de rata mediante RT-PCR (Brändle, 1999), de la glándula adrenal en rata por inmunohistoquímica (Afework y Burnstock, 2000) así como en el desarrollo de vejiga en humanos por técnicas de RT-PCR en tiempo real (O´relly y col., 2001). También durante la neurogénesis de rata embrionaria se ha estudiado la distribución de los receptores P2X por inmunohistoquímica (Cheung y Burnstock, 2002) e igualmente por inmunohistoquímica se han visto implicados, estos recepotes, durante el desarrollo postnatal del cerebelo de rata (Xiang, 2005). Hay evidencia de cambios funcionales de los purinoreceptores durante la ontogenia del tracto intestinal de ratón. En el estudio elaborado por Giaroni y col. (2006) sobre el desarrollo postnatal de los receptores P2 en el tracto gastrointestinal de ratón, reportaron cambios de funciones de los subtipos P2Y 1, P2X2 en el músculo longitudinal del tracto gastrointestinal del ratón durante el desarrollo postnatal, esto lo realizaron con estudios farmacológicos de curvas de dosis-respuesta usando diferentes antagonistas y agonistas. La localización de los purinoreceptores (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2X1 P2X2 y P2X3) en los segmentos aislados de intestino de ratón se hizo con inmunohistoquímica y los niveles de expresión mediante Western Inmunoblot.

20

2.7. Receptores P2X6 De los siete subtipos de P2X solo el P2X6 es el único incapaz de formar un receptor homomérico funcional (Torres y col., 1999) y cuando se expresa solo es retenido dentro del RE en forma monomérica (Bobanovic y col., 2002) posiblemente para prevenir la formación de homómeros no funcionales

que

salgan a la superficie de la célula y como una alberca intracelular de subunidades listas para incorporarse en los receptores heteroméricos (Ormond y col., 2006). Hay evidencia de análisis bioquímicos y de microscopia de fuerza atómica indican que no forma trímeros estables (Aschrafi y col., 2004; Barrera y col., 2005). A pesar de no poder formar receptores homoméricos, P2X6 fácilmente

forma

heterómeros con P2X2 y P2X4, produciendo receptores con

propiedades diferentes a la de los receptores iniciales (King y col., 2000). Por ejemplo la permeabilidad al calcio de del hetetoméro P2X2/6 es significativamente mayor

que la del homoméro P2X2 (Egan y Khakh, 2004). De hecho se ha

reportado que las subunidades P2X2, P2X4, and P2X6 se coexpresan en muchas áreas del sistema nervioso central (Collo y col., 1996; Le y col., 1998; Kukley y col., 2001); fuera del sistema nervioso central P2X6 es nuevamente coexpresado con P2X4 en células endoteliales vasculares y en las células epiteliales del túbulo renal (Glass y col., 2002; Turner y col., 2003). Chu y col. (2003), investigaron como se veía afectada la expresión de P2X6 en el hipocampo de rata, por una dieta deficiente de Zinc, llevando a cabo técnicas de electroforesis de dos dimensiones y espectroscopia de masas, los resultados arrojaron

que los niveles en la dieta de zinc, afectan el nivel de

expresión de proteína y una dieta de restricción de zinc, induce a un aumento de expresión de P2X6. La investigación realizada por Barrera y colaboradores en el 2007, desarrollaron un método basado en microscopía de fuerza atómica, para determinar la estequiometría y el arreglo de las subunidades de los receptores ionotrópicos con el que pudieron notar la rapidez y preferencia con la que P2X 2 21

forma heterómeros con P2X6 en vez de formar homómeros, incluso aun cuando las subunidades de P2X2 están 4 veces más concentradas que P2X6, produciendo así receptores

con propiedades diferentes de los receptores iníciales. Por

ejemplo, la permeabilidad del calcio del heterómero P2X2/6 es significativamente mayor que la del homómero P2X2. Esta evidencia sugiere que las subunidades P2X6, retenidas en el retículo endoplásmico (ER), actúan como un moduladores empalmándose con ambas subunidades P2X2 y P2X4 en el SNC. Los subtipos de receptores P2X6 y P2X4 se expresan durante el desarrollo neuronal (Cheung y col., 2005) y son los receptores P2X más predominantes en el cerebro de rata; usando células P19 se estudió el empalme de receptores P2X 6, mediante la técnica de RT-PCR en el desarrollo del cerebro en ratón y durante la diferenciación neuronal in vitro, identificando así una variante de empalme del receptor P2X6 de ratón, la cual es presentada durante la diferenciación neuronal in vitro y no en el cerebro adulto de la rata. Es posible que este empalme funcione como un mecanismo de regulación post-transcripcional de expresión génica del receptor P2X6, durante la diferenciación neuronal in vitro y el desarrollo neuronal postnatal (Da Silva y col., 2007). En cuanto al papel que juega el receptor P2X6 durante el desarrollo tenemos el estudio realizado por Slater y colaboradores en el 2000 que mediante técnicas de inmunohistoquímica, métodos de rojo de alizarina S y fragmentación apoptótica estudiaron a los receptores purinérgicos P2X durante la apoptosis en el envejecimiento, encontrando que la expresión de P2X6 y P2X4 aumenta con la edad, lo cual involucra este receptor con la regulación de la apoptosis en la próstata de rata. Más adelante, Xiang y colaboradores en el 2006 mediante RTPCR y doble inmunomarcaje estudiaron la expresión de los receptores P2X en células inmunológicas en hígado de rata durante el desarrollo postnatal y los resultados mostraron que la subunidad P2X6 aumentaba su expresión 15 veces más de P1 a P60. Además Jones y colaboradores en el 2004 en su estudio, sobre la regulación funcional de los receptores P2X6 vía N-glicosilación, discuten sobre el 22

requerimiento de un estudio detallado para la expresión del receptor P2X 6 y su estado de glicosilación en diferentes regiones del cerebro en distintas edades, esto por la diferencia encontrada por Rubio y Soto (2001) en la proteína receptora P2X6 detectada en el cerebro entero de rata de 5 días de nacida (49-kDa) y la detectada en mesencéfalo de rata adulta (70-kDa), argumentando que es posible que la proteína receptora P2X6

detectada de 49-kDa represente una forma

inmadura del receptor y que el incremento de los niveles de glicosilación y por lo tanto de funcionalidad ocurren con la edad. A continuación Korzina y colaboradores en el 2010 descubrieron, mediante métodos imunohistoquímicos en las neuronas del ganglio estrellado (GE) de ratas de diferentes edades (neonatales, 10, 20, 30, 60 y 180 días), la proporción de neuronas

que

expresan

colinoereceptores

M1

y los

purinoreceptores P2X6 y P2X2 no tienen un cambio significativo a comparación del receptor P2X3, el cual tiene un pico a los 20 días. También demostraron que la gran mayoría de neuronas estudiadas en los animales (más del 98%) fueron inmureactivas para M, P2X6 y P2X2 desde el nacimiento. Por último en el 2011 Schwindt y col. Encontraron una expresión elevada de P2X6 y P2X2 en cultivo de neuroesferas de rata libres de mitógenos sugiriendo que P2X2/6 induce la diferenciación neuronal, esto aplicando técnicas inmunohistoquímicas y de RTPCR tiempo real. En cuanto a estudios de la expresión de este receptor en el sistema nervioso entérico está el de Yu y colaboradores en el 2010 estudiaron la expresión de los receptores P2X4 y P2X6

en el tracto intestinal de rata con

inmunohistoquímica de doble marcaje fluorescente y encontraron que P2X6 está distribuido ampliamente en el tracto intestinal de la rata, siendo el plexo mientérico donde se localiza principalmente, expresándose

en las neuronas sensoriales

intrínsecas y que P2X6 probablemente en una combinación heteromérica con los receptores P2X2 pueda estar involucrado en la regulación fisiológica de esas neuronas.

23

Las bases moleculares asociadas al papel fisiológico indican la inhabilidad de la subunidad P2X6 para ensamblarse correctamente cuando se expresa sola y es retenida en el RE. Estudios previos han reportado resultados que se contradicen. Un análisis de P2X6 en una electroforesis de poliacrilamida muestran la formación de largos agregados y ensambles homotetraméricos (Aschrafi y col., 2004); más adelante reportaron que no hubo expresión de la proteína P2X 6 en la membrana plásmatica (Barrera y col., 2005). Los resultados de los investigaciones de Jones y colaboradores indicaron que aproximadamente el 5% de las células humanas embrionarias de riñón (HEK) 293 transfectadas con P2X, producen receptores funcionales. El análisis de Western Blot

y las técnicas de

electrofisiología revelaron que la proteína P2X6 de las células responsivas a ATP estaba más ampliamente glicosilada, con un peso molecular de 70 kDa comparado con 60 kDa de las células no sensibles. Collo y colaboradores en el 1996 también reportaron la producción de receptores P2X6 recombinantes, aunque con diferentes propiedades farmacológicas y cinéticas que las reportadas por Jones y colaboradores en el 2004. Ormond y colaboradores en el 2006, reportaron, que el nivel de la expresión en la membrana plasmática de P2X6 en células normales de riñón de rata (NEK) fue muy bajo y que la proteína era retenida en el

ER en estado

glicosilado, valiéndose para ello de métodos bioquímicos y de imagen confocal, además utilizando Western Blot encontraron que cuando las subunidades P2X6 son coexpresadas con las subunidades P2X2 y P2X4, presentan un ligero incremento en la masa molecular (1-2 kDa). Los datos obtenidos en dicho estudio no fueron consistentes con los obtenidos por Jones y colaboradores en el 2004. Mediante una mutación en el blanco N-terminal de la proteína, mostraron que esta región ejerce un efecto inhibitorio en el ensamble y exportación de P2X 6 del RE, cuando esta región es removida,P2X6 forma ensambles homotriméricos de P2X6, sufre una glicosilación compleja y es llevado a la membrana plasmática, ellos proponen que la región N terminal de la subunidad P2X 6 contribuye a un mecanismo de prevención que impide la exportación a la membrana plasmática y expresión inadecuada de los receptores P2X6 24

no funcionales ensamblados

homoméricamente, es por ello que P2X6 en la forma normal (sin mutación) no sucede este ensamble. Entonces si P2X6 es normalmente no funcional, ¿entonces cuál es su papel fisiológico?, la pregunta surge a partir de lo que se ha reportado de la subunidad P2X6, ya que puede incrementar la permeabilidad al calcio del receptor P2X2 (Egan and Khakh, 2004) y cambiar las propiedades farmacologícas de P2X 2 y P2X4,

posiblemente este designado para operar como una subunidad

moduladora en lugar de un receptor por sí mismo. Esta suposición está sustentada por diversos reportes sobre la coexpresión de P2X6 con P2X2 y P2X4 en el SNC y en el periférico (Collo et al., 1996; Rubio y Soto, 2001; Glass y col., 2002; Turner y col., 2003), así como con la demostración de que P2X6 es regulado bajo condiciones patológicas

como el cáncer y deficiencia de zinc, pero también

durante la ontogenia (Nawa y col., 1999; Chu y col., 2003; Xiang y col., 2006). Con lo antes mencionado se resalta que las propiedades funcionales de P2X6 están vinculadas con sus cambios postraduccionales.

2.8. Cambios postraduccionales Los cambios postraduccionales son modificaciones covalentes que le ocurren a la proteína durante

síntesis ribosomal (modificación co-transduccional) o

después de la síntesis, estas modificaciones afectan en la estructura y funcionalidad de la proteína (Walsh, 2009). La síntesis proteica comienza con los ribosomas libres en el citoplasma, a medida que se sintetiza la cadena polipeptídica. La información contenida en la secuencia de aminoácidos le otorga uno de los dos conjuntos de información adicional: 1) terminar la traducción y ser liberada a un orgánulo o 2) detener la traducción, ir al RE y finalizar la traducción ahí (Figura 7), si el destino es el RE, una vez que el polipeptído sale de los ribosomas libres hacia el RE, es entonces ahí donde se completa la síntesis proteica.

25

Retículo endoplasmático rugoso

Figura 7. Destino de los polipéptidos recién traducidos en la célula eucarionte.Las secuencias señal sobre los polipéptidos recién sintetizados se unen a proteínas receptoras específicas sobre la membrana externa del orgánulo al cual están dirigidos. Una vez que la proteína se ha unido a él, el receptor forma un canal en la membrana y la proteína entra en el orgánulo (Purves, 2009). Si la proteína terminada entra en la luz del RE puede ser transportada a su localización apropiada a través del RE y del sistema de Golgi. Se necesitan señales adicionales para dirigir la proteína, estas señales son de dos clases, algunas secuencias de aminoácidos que permiten la retención de la proteína dentro del RE y otras son azúcares, que se agregan en el sistema de Golgi. Las proteínas resultantes finalizan en la membrana plasmática o en un lisosoma (Purves, 2009). La mayoría de las proteínas terminadas no son idénticas a las cadenas polipeptídicas traducidas a partir de mRNA sobre los ribosomas, esto es porque los polipeptídos se modifican en alguna de las diversas formas después de la traducción, estas modificaciones son esenciales para la función final de la 26

proteína, las modificaciones post-traduccionales más comunes son la proteólisis, fosforilación y glicosilación, ver Figura 7 (Purves, 2009). Muchas proteínas sufren modificaciones químicas en los residuos de sus aminoácidos, implicando la unión de un grupo químico con un grupo –NH2 o – COOH al final de la proteína o a un grupo reactivo de un residuo interno en la cadena lateral, estas modificaciones pueden ser acetilación, fosforilación, hidroxilación, metilación, -carboxilación y glicosilación (Figura 8). Los biólogos celulares han reconocido este set de modificadores covalentes como código de regulación combinatoria, ya que la adición o remoción de estos grupos modificadores causa un comportamiento diferente de la proteína, esto ayuda a la célula a responder rápidamente y con gran versatilidad a las condiciones ambientales (Alberts y col., 2008).

Figura 8. Modificaciones postraduccionales de las proteínas. La mayoría de los polipéptidps son modificados luego de su traducción y así se convierten en proteínas funcionales (Modificado de Purves, 2009). La glicosilación es una adición covalente post-traduccional de moléculas de azúcar a residuos de asparagina, serina o treonina pertenecientes a una molécula proteica. La glicosilación puede añadir un solo azúcar o una cadena de azúcares 27

en un sitio determinado y es usualmente enzimáticamente catalizada (Petsko y Ringe, 2004). Algunas de las funciones de la glicosilación son la ayuda en la pegladura y el ensamblaje, otra función es que ayudan a la ubicación y tráfico de las nuevas proteínas para llegar a su destino final, también el glicomponente puede jugar un papel directo para el reconocimiento del ligando así como de la activación biológica, estabilización y vida media de la proteína (Walash, 2009). Hay dos tipos de glicosilaciones la N-glicosilación y la O-glicosilación (Figura 9), la primera ocurre en los residuos de asparagina y se les une N-acetilglucosamina, mientras que la segunda en los residuos de treonina o serina uniéndoseles la Nacetilgalactosamina (Petsko y Ringe, 2004).

O-enlace

CH3

Figura 9. Tipos de glicosilaciones. Existen la N-glicosilación y la Oglicosilación, cuyas diferencias principales radican en los aminoácidos donde se llevan a cabo y de los azúcares que se enlazan (Petsko y Ringe, 2004).

La N-glicosilación de las protínas empieza en el retículo endoplasmático rugoso (RER), ver Figura 10, durante la síntesis de proteínas (modificación cotranscripcional), a diferencia de la O-glicosilación, el oligosacárido es primero transferido a un enlace de membrana dolicol pirofosfato (DPP) el cual lo transferirá 28

a la cadena polipetídica mientras el resto se sigue sintetizando en el ribosoma, conforme la cadena polipetídica va creciendo dentro del ER monosácaridos van siendo cortados del extremo no reductor del oligosacárido, después de completarse la cadena polipetídica, la glicoproteína inmadura es transportada al aparato de Golgi, donde ocurrirán futuras modificaciones, posiblemente sean añadidos nuevos monosacáridos y otros sean removidos, finalmente cuando la glicoproteína es completada es transportada a su destino final (Petsko y Ringe, 2004).

Figura 10. Proceso de glicosilación. La N-glicosilación.Se ilustra el proceso de de glicosilación. La N-glicosilación comienza durante la síntesis de proteica en el RER y continua durante el transporte de la proteína del RER al aparato de Golgi donde es completada y la proteína deja el aparato de Golgi para ser dirigida a su destino final (Modificado de Petsko y Ringe, 2004; Walsh, 2009).

Es bien conocido que la N-glicosilación afecta las funciones de los canales iónicos, al nivel de ensamblaje de subunidades, el tráfico de la proteína y a la apertura del canal por la unión del ligando (Gehle y Col., 1997; Standley y Baudry 2000; Gong y col., 2002; Watanabe y Col., 2003). También se sabe que los Nglicanos también ejercen un papel bien conocido como blancos para el control la maduración y calidad en la vía secretora temprana (Hebert y Col. 2005). Los N29

glicanos son añadidos co-transcripcionalmente durante la traducción en el lumen del RE (Kowarik y Col., 2002) y mediante el reconocimiento chaperones, calnexina y calreticulina asisten un apropiado plegamiento (Molinari y Helenius 2000; Daniels y Col., 2003). Al igual que la mayoría de las proteínas de membrana, todos los receptores P2X están glicosilados

en su mitad extracelular, la N-glisosilación ha sido

estudiada en varios miembros de la familia P2X: P2X1 (Rettinger y Col., 2000; Roberts y Evans 2006), P2X2 (Torres y Col., 1998), P2X3 (Vacca y Col., 2010), P2X4 (Hu y Col., 2002; Valente y Col., 2011) and P2X6, los aminoácidos donde ocurre esta N-glicosilación son 157, 187 y 202 (Jones et al. 2004), P2X7 (Lenertz y col., 2010), estos estudios han mostrado que la unión de N-glicanos afectaron la función del receptor, su oligomerización, su expresión en la superficie y la función del canal.

30

III.

JUSTIFICACIÓN

Los receptores purinérgicos se encuentran localizados en el SNE, el cual regula el tracto gastrointestinal. Se ha reportado que el subtipo P2X6 está involucrado en la regulación fisiológica de las neuronas entéricas así como cambios en su funcionalidad por el estado de glicosilación, pero no se han hecho estudios sobre su expresión durante la ontogenia de intestino delgado de rata, ni de sus posibles cambios proteogenómicos por efecto de la ontogenia y/o de la alimentación (lactancia vs destete) ya que se ha reportado que la dieta puede modular el desarrollo del intestino delgado, así como del SNE y que estos cambios en etapas tempranas del desarrollo afectan en la adultez.

31

IV.

HIPÓTESIS

El receptor purinérgico P2X6 sufre modificaciones postraduccionales durante la ontogenia del intestino de delgado de rata por efecto del cambio de alimentación al destetar.

32

V.

OBJETIVOS

V.1 Objetivo general Analizar los cambios proteogenómicos del receptor purinérgico P2X6 durante el desarrollo del intestino delgado de rata por efecto del cambio de alimentación (perinatal, lactancia-destete).

V.2 Objetivos específicos

 Cuantificar la expresión génica del gen que codifica para el receptor P2X6 durante la ontogenia y regiones (proximal y distal) del intestino de rata mediante RT-PCR en tiempo real.  Evaluar el estado de glicosilación de la proteína receptora P2X 6 durante la ontogenia y regiones (proximal y distal) del intestino de rata utilizando el método de Western Blot.  Estudiar el efecto del cambio de tipo de alimentación

en los posibles

cambios proteogenómicos del receptor P2X6 en el intestino delgado de rata en los períodos perinatal (embrionario) y posnatales (transición lactanciadestete).

33

VI.

METODOLOGÍA

6.1 Obtención de muestras (intestino delgado de rata) 6.1.1 Sacrificio y extracción de tejido Se usaron ratas Sprague Dawley macho de diferentes edades embrionarias (E) 18, posnatales (P)0, P7, P17, P32 (11 días después destete de las ratas), y Adultas. Las cuales fueron conservadas a una temperatura de 22±2˚C, con ciclos de luz-obscuridad de 12 h y con acceso a agua y alimento ad libitum. Estas se obtuvieron del bioterio del Instituto de Neurobiología, UNAM campus Juriquilla. El día en que nacen las ratas fue considerado como P0. Las ratas E18 y las P0 fueron decapitadas y las demás se anestesiaron con pentobarbital sódico (40 mg/Kg) vía intraperitonial, y posteriormente se llevó a cabo la disección de las mismas para extraer del intestino delgado la porción proximal, que se reconoce por estar justo después del estómago y en el caso de las P0 es de color blanco, y la porción distal que se identifica por estar justo antes del colon, que es de color amarillenta en las P0. Las ratas E18 fueron colocadas en una caja petri con solución fisiológica estéril fría para posteriormente hacer la disección y extracción del intestino con ayuda de un estereoscopio 6.1.2 Preparación de la muestra El tejido extraído se lavó inmediatamente en una solución de PBS 1x estéril, a continuación se pasó a tubos eppendorf previamente enfriados y debidamente etiquetados, inmediatamente se congelaron con nitrógeno líquido, por último se almacenan a -70°C hasta su utilización.

34

6.2 Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) 6.2.1 Extracción de ARN total Se pulverizó el intestino congelado en un mortero con pistilo, previamente horneados y enfriado, utilizando nitrógeno líquido y se alicuotó en medidas de 25 mg aproximadamente cada tuboeppendorf de 1.5 ml. La extracción del ARN total se realizó con un kit comercial de Roche (High Pure RNA Tissue Kit), primero se añadió 400 l

del buffer de lisis a los 25 mg de tejido, se homogeinizaron con

una jeringa de 5 ml, posteriormente se centrifugaron a máxima velocidad por dos minutos a 4°C, una vez centrifugado se recuperó el sobrenadante para añadirle 200 l de etanol absoluto a temperatura ambiente, esta mezcla se adicionó al tubo con filtro del kit y se centrifugó a máxima velocidad por 30 segundos a 4°C. A continuación se descartó el sobrenadante del tubo colector y se le añadió al tubo con filtro 90 l de buffer de trabajo de la DNAsa I y 10 l de DNAasa I, dejándose incubar por 15 minutos a 15-25° C. Al finalizar el tiempo de incubación se le agregaron 500 l del Buffer de lavado I al tubo con filtro y se centrifugó a 8000 g durante 15 segundos a 4°C, transcurrido los 15 segundos, se removió el sobrenadante del tubo colector para ahora añadir

500 l del Buffer de lavado II

y centrifugó nuevamente en las

mismas condiciones que con el Buffer de lavado I, se volvió a hacer otro lavado con el Buffer II ,esta vez 300 l del Buffer de lavado II y se centrifugaron a 13,000 g por 2 minutos. Por último a terminar el segundo lavado se retiró el tubo colector y el tubo con filtro se colocará en un tubo de 1.5 ml nuevo estéril para colectar el ARN total, se colectaron 100 l del Buffer de elución y se centrifugó a 8000 g durante 1 minuto a 4°C. El tubo contiene el ARN y fue inmediatamente guardado a -70°C. 6.2.2 Síntesis de cDNA Del ARN alícuotas para

recolectado en el tubo eppendorf de 1.5 ml se obtuvieron su cuantificación, la 35

cuales

se

realizaron

utilizando en

espectrofotómetro Nano-Drop ND-1000. Con la concentración obtenida del ARN, se colocaron losl necesarios para tener un g de ARN,

ADNc se sintetizó

mediante un kit comercial de Roche (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit) a partir del ARN. Se colocó en un tubo de 0.2 ml para PCR estéril los microlitros de ARN, posteriormente se añadió 1l de oligo-DT y se completó a un volumen final de 13 l con agua grado PCR, se mezclaron y desnaturalizaron calentando a 65°C por 10 minutos. Por otro lado se hizo la mezcla reactivos para la síntesis de ADNc, colocando en un tubo estéril de 0.2 ml: 4 l de buffer de incubación RT, 0.5 l de inhibidor de ARNasas, 2 l mezcla de nucleótidos y 0.5

l de enzima RT

(retrotranscriptasa) por cada reacción. Una vez finalizados los 10 minutos se añadió 7 l de la mezcla de síntesis de ADNc mezclando bien para posteriormente poner a incubar la enzima a 55°C por 30 minutos, después se inactivó la enzima calentando por 5 minutos a 85°C, finalmente se guarda el ADNc recién sintetizado a -20°C. 6.2.3 PCR en tiempo real Para montar la PCR en tiempo real se utilizó el kit comercial de Roche llamado: LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green I, con el cual se prepararó una mezcla de reacción, la cual contenía por cada reacción: 4 l de agua grado PCR, 1.5 l de cloruro de magnesio 25 Mm, 0.5 l de primer foward, 0.5 l de primer reverse y 1 l del vial que contiene la enzima y el Syber Green; los primers (Invritrogen) de cada gen: el gen de interés (P2X6) y el constitutivo (actina) se muestran en la tabla 1, los cuales fueron diseñados en el programa primer 3. Se montaron los capilares que posteriormente fueron cargados con 7 l de la mezcla de reacción y a continuación se adicionó 2l de muestra a cada capilar, en seguida se centrifugaron los capilares por 1 minuto a 2000 g. Se colocaron los capilares en el carrusel para poder cargarlos al termociclador Light Cycler 1.5. Se procedió a ponerlas condiciones del programa de qPCR (Cuadro 2) para el cual se 36

utilizó el

software LightCycler® 4.1,

finalmente se realizó la corrida del

experimento. Cuadro 1 Primers usados para la PCR GEN

PRIMERS

P2X6 -actina

Numero NCBI

Foward

5´-TGACACCAGCTCAAGTCCAG-3´

Reverse

5´-CACCAGCTCCAGATCTCACA-3´

Foward

5´- AGCCATGTACGTAGCCATCC-3´

Reverse

5´-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3´

NM_012721.2

NM_031144.2

Cuadro 2 Condiciones de PCR. PROGRAMA CICLOS Modo de Análisis Desnaturalización 1 Ninguno PCR 40 Cuantificación Curva Melting 1 Curva Melting Enfriamiento 1 Ninguno Programa Temperatura Tiempo Rampa (°C) (°C/s) Desnaturalización 95 10 min 20 PCR 95 5s 20 63 5s 20 72 9s 20 Curva Melting 95 0s 20 65 10 s 20 95 0s 0.2 Enfriamiento 50 30 s 20

Modo Ninguno Ninguno Ninguno Sencillo Ninguno Ninguno Continuo Ninguno

6.2.4 Cuantificación relativa

Se realizó una curva de calibración para cada muestra, para obtener la eficiencia de la curva. Para dicha curva se prepararon una serie de diluciones: 1:2, 1:10, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:1000, para calcular la pendiente y de esta manera obtener la eficiencia, E=10

(–

Pendiente)

, graficando logaritmo de la

concentración de ADN contra CT para poder sacar la ecuación de la recta y así obtener la pendiente, como se ilustra en la Figura 11. Una vez que se obtuvo la curva de calibración con una eficiencia de 1.8 a 2, se metieron las muestras por 37

triplicado para cada edad con tres extracciones diferentes, así mismo se metióactina como gen constitutivo y los controles (mezcla de reacción sin cDNA). Para sacar la cuantificación se siguió el método ΔΔCT (Helming et al., 2009), con las ecuaciones1 y 2.

Figura 11. Curva de calibración para PCR.A) En la gráfica se ilustra cómo se obtienen los CT a partir de las diluciones de la muestra, B) muestra cómo se calcula la eficiencia a través de la pendiente, la cual se obtiene de la ecuación de la recta después la regresión lineal de la gráfica del logaritmo de la concentración contra los CT (Ygonaar, 2006). Ecuación 1. ΔCT A = CT gen target - CT gen HK ΔCT B = CT gen target - CT gen HK Ecuación 2 E ˉ ΔCT A

E ˉ Δ CT B

6.3 Western blot 6.3.1 Extracción de proteína y cuantificación de proteínas A partir de las muestras de intestino, que se obtuvieron manteniéndose a 70°C hasta su uso, se extrajo la proteína agregándose un buffer de lisis (TrisHCl, BIO-RAD) y mezcla de inhibidores de proteasas comercial (tabletas complete 38

mini

de

Roche)

para

evitar

la

desintegración

de

la

proteína

de

interés.Posteriormente para cada grupo de edad se realizó un homogenizado en un homogenizador ultra turrax (IKA, USA) a una velocidad de 22 000 rpm durante 10 segundos. En seguida se dejaron las muestras en agitación constante durante 1 hora en hielo, después de la extracción se centrifugaron las muestras a 3000 rpm durante 15 minutos a 4°C se recuperael sobrenadante en un tubo nuevo y se volvió a centrifugar a 12,000 rpm durante 15 minutos a 4°C, se recuperó este sobrenadante y se cuantificó las proteínas por el método de Bradford. El ensayo de Bradford se realizó preparando diluciones de una proteína estándar, para esto se utilizó la albúmina sérica bovina (BSA) en un rango de 1.2 a 10 g/ml, y posteriormente se prueba 2 cantidades de la proteína de interés (5l y 10 l),finalmente se adicionóel reactivo de bradford y se cuantificó mediante un espectrofotómetro de UV-VIS (Ultrospec 2100 pro) a una longitud de onda de 595 nm, las mediciones se hicieron por triplicado. Posteriormente se graficó la absorbancia contra la concentración de BSA, generando así la curva de calibración para obtener la ecuación de la recta y poder conocer la concentración de la proteína de interés. 6.3.2 Tratamiento de desglicosilación de proteínas

Con el extracto de proteína obtenido, se empleó el kit de desglicosilación Nglycosidase F (Roche, Indianapolis, IN) para remover todos los N-glicanos (Figura 12). Se añadieron 100 g de la glicoproteína de interés en viales etiquetados con “+” y con “-“. Por otro lado se añadieron otros 100 g con una glicoproteína control en viales etiquetados como “ C+” y “C-“ , posteriormente se adicionaron 5 l del buffer desnaturalizante a cada vial y se incubó por 3 min a 95°C, transcurrido este tiempo se centrifugó para bajar la muestra y poder adicionar 10 l del buffer de reacción a cada vial, Finalmente

se colocaron 10 l de N-glicosidasa F

previamente reconstituida a los viales marcados con “+” (incluyendo “C+”), para los viales marcados con “- “ se

les adicionó 10 ml del buffer de reacción, a

continuación de incubaron todos los viales 1h a 37°C. 39

R1= Fucosa 1,3 R2= Oligosacárido

Péptido, Proteína N-glicosidasa F

Figura 12. Principio de la reacción del kit N-glycosidase F. Procedimiento enzimático para remover N-glicanos glicoproteínas unidos N-(Asparagina) a cadenas de carbohidratos (modificado de Roche, 2005).

6.3.3 Electroforesis, electrotransferencia y revelado De las muestras obtenidas en el paso anterior se tomó la misma cantidad de proteína para mezclarlo e incubarlo por 3 min a 95°C con

un buffer

desnaturalizante reductor que contiene 20 mM buffer de fosfatos salino (PBS), 1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) y 1% de 2-mercaptoetanol y se depositaron en un gel de poliacrilamida al 10% para la realizar la electroforesis (Figura 13) en las siguientes condiciones: 150v por 20 min y después a 100v 45 minutos más. Una vez terminada la electroforesis las proteínas contenidas en el gel se electrotransfirieron hacia una membrana de nitrocelulosa a 120mA durante 1hora (Ver figura 13). Esta membrana se lavó 3 veces con PBS durante 10 minutos cada lavado y se bloquó con leche al 3% en buffer de fosfatos salino con tritón X-100 (PBT) durante 2 horas con agitación constante, transcurrido el tiempo se hicieron los lavados con PBS y se incubó con el anticuerpo primario anti-P2X6 hecho en conejo (1:500;Santa Cruz Biotecnology) durante toda la noche a 4°C. Al día siguiente se lavó 3 veces con PBS y se incubó con el anticuerpo secundarioanticonejo(1:1000; Santa Cruz Biotecnology)marcado con peroxidasa de rábano picante durante 2 horas, una vez transcurrido este tiempo se repitieron

40

los lavados con PBS. Enseguida se reveló la membrana por el método de quimioluminiscencia, para lo cual se utilizó el reactivo ECL®(General Electric).

Figura 8. Western blotting combina varias técnicas para detectar una proteína especifica.Paso 1: después de la electroforesis el gel SDS se transfiere a una membrana porosa. Pasó 2: la membrana es cubierta con una solución del anticuerpo específico. Paso 3: la membrana se incuba con el anticuerpo secundario marcado. Paso 4: detección de la proteína mediante la reacción enzimática del anticuerpo secundario con el substrato (modificado de Lodish H,et al., 2000).

6.4 Análisis estadístico y diseño experimental Todos los experimentos se hicieron por triplicado (conforme el diseño experimental (Figura 14). Para la parte de la qRT-PCR se utilizó un diseño factorial (Figura 15), se hizo la prueba de normalidad utilizando el estadístico Kolmogorov-Smirnov al 95% confianza, posteriormente se hizo un ANOVA Modelo Lineal General para la parte de PCR, así como un análisis de efectos principales, finalmente se hizo una prueba pos-hoc de Bonferroni al 95% de confianza utilizando para ello el paquete estadístico de Minitab 16.

41

5 ratas Sprague Dawley macho

Obtenciónde intestino delgado (Proximal y distal)

qRT-PCR

Western blot

Inmunofluorescencia

Figura 9. Diseño Experimental.En la siguiente figura se muestra de manera resumida la metodología que se seguirá, haciendo cada muestra por triplicado.

Figura 15. Diseño de experimento para el análisis de la expresión del gen que codifica para el receptor P2X6.En la Se se observa el diseño factorial de 4 factores: Individuo, réplica, edad y sección, así como los niveles para cada factor.

42

VII.

RESULTADOS

7.1. Cuantificación de la expresión génica de P2X6 La expresión relativa del gen P2X6 que codifica para el receptor purinérgico P2X6se cuantificó con PCR tiempo real y los resultados fueron comparados con la expresión del gen endógeno que codifica para -actina. En la gráfica 1 se muestra la expresión relativa de este gen con respecto al gen endógeno de -actina a diferentes edades (E18, P0, P7, P17, P32 y Adulto) y regiones (proximal y distal) del intestino delgado de rata. En dicha gráfica se observa que el gen P2X6 se encuentra expresado durante toda la ontogenia del intestino delgado de rata, así como cambios de expresión con una tendencia variante dependiente de la edad y región.

Expresion relativa del gen P2X6 ( P2X6/b-actina)

2.0

c

c

c a

b

d

1.5 1.0 0.5 0.0 E18 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

a

E18

P0P

P7P

P17P

c d

b

P0D

P7D

P17D

P32P

a

AP

Seccion proximal b

P32D

AD

Seccion distal

Grafica 1. Cuantificación relativa de la expresión del receptor P2X6 durante la ontogenia de intestino delgado de rata en las secciones proximal y distal. Cada columna representa la media de expresión relativa del gen P2X6 de 5 experimentos, normalizado con el gen constitutivo de -actina. a, b, c, d letras diferentes indican diferencia significativa (P ˃ 0.05).

43

Posteriormente se analizó si los cambios observados en la expresión del receptor P2X6 (Gráfica 1) eran significativos, para ello primero se probó la normalidad de los datos obtenidos de los experimentos medianteel estadístico de Kolmogorov-Smirnov al 95% de confianza, arrojando un valor P de 0.124 con lo cual se concluye que los datos son normales (Gráfica 2). A continuación se hizo un análisis de varianzas de modelo general lineal (ANOVA GLM, por sus siglas en inglés) para ver si los datos obtenidos se ajustaban a este modelo. En el análisis de ANOVA GLM se obtuvo un valor de R2=0.92 (Cuadro 3), por lo cual se dice que los datos se ajustan de una forma aceptable al modelo y este puede ser utilizado para análisis posteriores. Normal 99.9

Media Desv .Est. N KS Valor P

99 95

-1.74976E-15 1.005 108 0.076 0.124

Porcentaje

90 80 70 60 50 40 30 20 10 5 1 0.1

-3

-2

-1

0

1

2

3 Expresión del Gen X6 GLM

Grafica 2. Prueba de Normalidad para los residuos de la expresión del gen P2X6. Se observa el valor P obtenido mediante el estadístico de Kolmogorov-Smirnov al 95% de confianza.

En el cuadro 3 se observa el resultado de la ANOVA GLM, donde se aprecia que solo los factores edad y sección tienen efecto significativo (P>0.05) en la expresión del gen del receptor purinérgico P2X6 (variable de respuesta), por 44

lo que la expresión no está siendo afectada por la diferencia entre individuos utilizados en el experimento, ni por efecto de la réplica.

Cuadro 3. Modelo general lineal para la expresión del receptor P2X6 Fuente

GL

Individuo Réplica Edad Sección Error Total

2 2 5 1 97 107

SC Sec. 0.01637 0.00027 6.4379 0.42075 0.54207 7.41736

SC Ajust. 0.01637 0.00027 6.4379 0.42075 0.54207

CM F P Ajust. 0.00818 1.46 0.236 0.00013 0.02 0.977 1.28758 230.4 0.000* 0.42075 75.29 0.000* 0.00559 R-cuad.(ajustado) = 91.94%

R-cuad. = 92.69%

GL: Grados de libertad; SC Sec: Sumatoria de cuadrados secuenciales; SC Ajust: Sumatoria de cuadrado ajustados; CM: Cuadrados medios ajustados; F: Estadístico F; P: Estadístico P Efecto significativo (P ˃ 0.05). *

El factor sección tuvo un efecto significativo en la expresión del gen que codifica para el receptor P2X6, encontrándose mayor expresión del gen en las regiones proximales que en las distales (Gráfica 3). En el factor edad se observó un efecto de disminución de la expresión del gen que codifica para el receptor P2X6 en PO y adulto, así como un aumento de la expresión del gen en la edad de P7. Los factores de individuo y réplica no mostraron cambios en su pendiente lo cual indica que ambos factores no tienen efecto significativo en la expresión del gen que codifica para el receptor P2X6 (Gráfica 3).

45

Expresión relativa del gen P2X6 ( P2X6/b-actina)

Medias de datos Individuo

2.0

Réplica

1.8 1.6 1.4 1

2

3

1

Edad

2.0

2

3

Sección

1.8 1.6 1.4 E18

P0

P7

P17

P30

Adul

Proximal

Distal

Grafica 3. Efectos principales en la expresión del receptor purinérgico P2X6. Se observa cambios en la pendiente para el factor edad e individuo indicando efecto significativo en la expresión del gen P2X6 para estos factores, no se observó cambio de pendiente para los factores individuo y réplica.

En la gráfica 1, se muestran diferencias significativas de la expresión del gen que codifica para el receptor P2X6 entre las diferentes edades de la ontogenia de intestino delgado de rata (prueba de pos-hoc Bonferroni). Se observó una mayor expresión del gen que codifica para el receptor P2X6 receptor P2X6 en las edades de P7 y P32, así como una menor expresión en las edades de P0 y Adulto. Cabe resaltar que se observa un comportamiento interesante en la edad de P0 ya que primero decae la expresión del gen al nacimiento de la rata comparada con la que tenía en etapa embrionaria para

posteriormente incrementar su expresión 0.5

veces más en la edad de P7. A partir de la edad P7 a la edad de P32 se mantiene un nivel de activación constante de expresión de P2X6. Finalmente en la edad adulta la expresión del receptor P2X6 llega a su mínimo nivel de expresión.

46

7.2. Estudio de la expresión y estado de glicosilación del receptor P2X 6

Con el fin de verificar la expresión del receptor purinérgico P2X6 al nivel de proteína durante el desarrollo del intestino delgado de rata se realizó un análisis de western blot sobre los extractos de proteína obtenidos de la sección proximal y distal del intestino delgado y un tejido control (cerebro de rata). La Figura 16A muestra el western blot para la estandarización de las condiciones experimentales; en el cual se utilizó: 100g del tejido control, así como diferentes concentraciones de extracto de proteína de intestino delgado de rata (20g , 50g y 100g) y el anticuerpo de anti -actina como control de carga. Se detectó la proteína de actina en peso molecular de 40KDa, así como un cambio de expresión congruente con el cambio de carga de proteína.

Figura 10. Expresión de la proteína -actina en durante la ontogenia del intestino delgado de rata.A) Control de carga de proteína detectado con el anticuerpo de anti -actina. B) Niveles de expresión de la proteína actina en 100mg de extracto de proteína total de cerebro de rata (muestra control) y de intestino delgado de rata de diferentes edades (de embrionario, E18, a Adulto). Las letras P y Di denotan la sección del intestino estudiada, las cuales corresponden a la región proximal y distal respectivamente (n=3).

Una vez estandarizadas las condiciones del experimento en el western blot se realizó una corrida con las diferentes edades por triplicado. La Figura 16B muestra los niveles de expresión de la proteína .actina en diferentes edades durante el desarrollo del intestino delgado de rata así como en el control. La expresión de la 47

proteína-actina se detectó con un peso molecular de 40KDa, además se encontró expresada en todas las muestras con una variación menor en su expresión dependiente de la edad.

Figura 117. Digestión de glicoproteínas control con la enzima Nglicosidasa F. Gel de SDS-PAGE con 10l de la reacción enzimática de las glicoproteínas control del kit de desglicosilación N-glicosidasas F (Roche).Para la Figura 16 la glicoproteínas fueron incubadas en presencia (+) o en ausencia (-) de la enzima N-glicosidasa F durante 1h a 37°C. El análisis de la expresión del receptor P2X6 así como de su estado de glicosilación durante el desarrollo del intestino delgado de rata se llevó a cabo utilizando un kit de desglicosilación (Roche), al cual se le probó su adecuado funcionamiento corriendo un gel SDS-PAGE con la reacción de las glicoproteínas control con la enzima N-glicosidasa F del kit. La figura 17 muestra la eficiencia de la enzima N-glicosidasa F. Se observa el desplazamiento de las bandas correspondientes para cada glicoproteína a un peso inferior una vez que se añade la enzima (+). Las glicoproteínas control utilizadas en el experimento fueron las siguientes: transferrina humana tiene un peso de 65KDa y contiene dos glicosilaciones reduciendo su peso a 60KDa, 1-glicoproteína acida humana con un peso de 45KDa la cual contiene 5 glicosilaciones bajando su peso a 22KDa y por último la Ribonucleasa B con un peso de 17KDa, y al quitarse su única glicosilación baja a un peso de 15KDa.

48

El nivel de expresión y de glicosilación del receptor purinérgico P2X 6 se realizó mediante un análisis de western blot

incubando 100g de los extractos de

proteína obtenida del tejido de intestino de rata de las diferentes edades con la N glicosidasa F a 37°C por 1h. La figura 18 muestra el inmunoblotting del producto de la reacción enzimática de la proteína con la N glicosidasa F detectado por el anticuerpo primario anti-P2X6 (Santa Cruz), en dicha figura se observa una expresión

diferencial del receptor purinérgico P2X6 durante el desarrollo del

intestino de rata dependiendo de la edad y de la sección del intestino.

Figura 12. Análisis Western blot de las diferencias entre regiones del intestino delgado en la expresión del receptor P2X6 durante la ontogenia. La figura muestra las bandas detectadas usando el anticuerpo primario anti-P2X6 (Santa Cruz Biotechnology) en 100g de proteína de intestino (región proximal, P, y región distal, Di) incubados en presencia (+) o en ausencia (-) de la enzima N-glicosidasa F durante 1h a 37°C. En la figura se observan los cambios en la expresión de receptor purinérgico P2X6 en las edades: embrionaria 18 (E18) y posnatales a partir del día de nacimiento (P0) a la edad adulta (A). Los experimentos se realizaron por triplicado.

La mayor expresión del receptor purinérgico P2X6 ocurre en la edad embrionaria E18

obteniéndose bandas de 70KDa sin observarse desplazamiento por el

tratamiento enzimático. La edad de P0 en la sección proximal (P0P) muestra una menor expresión del receptor P2X6 que la edad de E18; sin embargo se observó 49

un desplazamiento de la banda de 70KDa a un peso de 52KDa después del tratamiento enzimático. El receptor P2X6 no se encontró expresado en la sección distal de la edad P0, a pesar de ello en la edad de P7, este receptor volvió a expresarse de manera similar a como se encontró en P0. En la edad de P7 se expresó el receptor de igual manera en la sección proximal como en la sección distal, las bandas detectadas en ambas secciones corresponden a un peso de 70KDa y posteriormente al tratamiento enzimático se observó una segunda banda con un peso aproximado de 65KDa.

Para la edad de P17, el receptor P2X6 continúa expresándose en ambas secciones del intestino como lo hizo en la edad de P7; no obstante se encontraron dos bandas independientemente del tratamiento enzimático. La primera banda detectada en la edad de P17 es de 70KDa y la segunda de aproximadamente 60KDa. A continuación, en la edad de P30 la expresión del receptor P2X 6 es dependiente de la sección, ya que se observa una sola banda en la sección proximal mientras que en la sección distal se observan 3 bandas. La sección proximal de la edad P30 muestra una sola banda con un peso de 52KDa, la cual no cambia ni se desplaza por efecto de la digestión enzimática. En cambio en la sección distal de la edad de P30 se observan 3 bandas en presencia y ausencia de la N-glicosidadasa F, la primera banda es de un peso de 70KDa, la segunda es de un peso de 65Kda aproximadamente y la tercera de 52KDa. El receptor P2X6 sigue expresándose hasta la edad adulta observándose una banda correspondiente a los 52KDa, sin presentar la forma de 70KDa a diferencia de las otras edades, además posteriormente del tratamiento enzimático se observó que para ambas secciones (proximal y distal) del intestino delgado desaparece la banda de 65KDa. Durante el desarrollo del intestino delgado de rata, el receptor P2X6

se expresa con diferentes pesos moleculares

encontrándose bandas de 70, 65, 60 y 50 KDa, en donde las primeras edades (E18 a P17) presentan bandas de 70KDa y a partir de la edad P30 se detectaron bandas de 52KDa. El efecto de la digestión con N- glicosidasa F es dependiente de la edad y sección del intestino estudiada. 50

7.3. Distribución del receptor purinérgico P2X6 Para conocer la distribución del receptor P2X6

en el desarrollo del intestino

delgado de rata se procedió a hacer una inmunoflorescencia, para ello se probó la especificidad del anticuerpo secundario utilizado (Alexa 568, Invitrogen) mediante laminillas blanco, las cuales no se incubaron con el anticuerpo primario. La figura 19 muestra los controles para hacer la inmunoflouresencia, en donde se puede apreciar que no hay marca inmunoreactiva en ninguno de los tejidos, por lo cual no hay marca inespecífica del anticuerpo segundario.

Figura 139. Controles para inmunoflorescencia del receptor de la mucosa del intestino delgado de rata. Se observa dos microfotografías (40X) correspondientes a la edad de P0 y a la edad adulta en donde solo se incubó con el anticuerpo secundario Alexa 568. En ambas fotografías no se observa ninguna señal inmunoreactiva, por lo cual no hay marca inespecífica del anticuerpo secundario utilizado (barra 30m). Más adelante, se probaron los diferentes tejidos de mucosa de intestino delgado de rata durante el desarrollo. La figura 20 muestra los cambios de distribución y expresión del receptor purinérgico P2X6. La sección proximal del intestino de rata expresa el receptor purinérgico P2X6 en la edad de P0, P7 y adulta en los vasos entéricos del intestino delgado. En cambio la sección distal del intestino de rata presentó una expresión del receptor P2X6 más débil comparada con la región proximal, se detectó un cambio en su distribución hasta la edad adulta ya que pasó de localizarse en los enterocitos a los vasos entéricos en la edad adulta. El 51

receptor P2X6 solo se expresó débilmente en

la sección distal del intestino

delgado a la edad de P0 y P7; sin expresarse en la edad de P17, posteriormente a la edad de P30 comienza a detectarse marca inmunoreactiva débil y finalmente en la edad adulta el receptor P2X6 presentó una marca inmunoreactiva moderada cambiando su distribución hacia los vasos entéricos.

En la Figura 21 muestra el comportamiento del receptor P2X6 durante la ontogenia del intestino delgado de rata en la sección proximal, en la cual se muestran los cambios en la expresión del gen que codifica para el receptor P2X 6, así como la expresión y localización del receptor P2X6. En la edad de E18 se observa que la expresión del gen P2X6 corresponde con la expresión de la proteína, posteriormente en la de edad de P0 se observó un comportamiento similar entre el gen que codifica para P2X6 que la proteína y ambos con una expresión baja, sin embargo la expresión del receptor P2X6 detectada por inmunofluorescencia para la edad de P0 es alta. Las edades de P7a P30 muestran una alta expresión del gen P2X6

(1.75 veces de activación más que el gen constitutivo) la cual

permanece constante. La expresión de proteína de estas edades es moderada pero constante con diferentes bandas detectadas, por último la distribución solo es detectada por inmunofluoresencia en la edad de P7 en los vasos entéricos. Finalmente en la edad adulta la expresión del gen que codifica para el receptor P2X6

disminuye alrededor de 1.25 veces de expresión, la proteína P2X6 se

expresa solo con bandas de 52KDa y se encuentra localizada en los vasos entéricos.

Los cambios en la expresión del gen que codifica para P2X6 y en la proteína P2X6, así como su localización se encuentran resumidos en la figura 22, en donde muestra que los cambios presentados por este receptor durante el desarrollo del intestino delgado de rata son similares a los observados en la sección proximal; no obstante algunas ocurren algunas diferencias a los de la sección proximal, por ejemplo en la edad de P0 se observó activación del gen más no la expresión de la proteína. Otro cambio interesante es el cambio de distribución del receptor en la edad de P30. 52

Figura 14. Imágenes confocales de la distribución del receptor P2X6 durante el desarrollo del intestino delgado de rata. Se muestra los cambios en la expresión y distribución del receptor purinérgico P2X6 en las distintas etapas del desarrollo del intestino delgado de rata, tanto para la sección proximal como la distal. La sección proximal presenta señal inmunoreactiva del receptor P2X6 en los vasos entéricos (VE) en las edades de P0, P7 y Adulto. La sección dsital presento inmunoreactividad del receptor P2X6 en los enterocitos (CE) para la edad P0 y P7, mientras que para las edades P30 y adulto cambia su distribución a los VE (barra 30m)

53

Figura 15. Cambios proteogenómicos del receptor purinérgico P2X6 durante el desarrollo de la sección proximal del intestino delgado de rata. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

54

Figura 16. Cambios proteogenómicos del receptor purinérgico P2X6 durante el desarrollo de la sección distal del intestino delgado de rata. Todos los experiementos se realizaron por triplicado. 55

VIII.

DISCUSIÓN

En este trabajo se estudió los cambios en la expresión del receptor purinérgico P2X6 durante el desarrollo de intestino de rata tanto para la expresión génica como la proteica. Se encontró, por la técnica de qRT-PCR, que el gen que codifica para el receptor P2X6 esta prendido durante la ontogenia de intestino delgado de rata, desde etapas embrionarias (E18) hasta la etapa adulta, por lo cual podría estar teniendo un papel en la regulación del desarrollo del intestino, esto es consistente con trabajos previos donde proponen a los receptores P2X como reguladores del desarrollo de diversos órganos, tales como: oído de rata (Brändle, 1999), glándula adrenal en rata (Afework y Burnstock, 2000), hígado de rata (Xian y col, 2006) yvejiga en humanos (O´relly y col., 2001) por mencionar algunos.

Es importante mencionar que P2X6 se encuentra altamente activado en la etapa embrionaria, esto puede deberse a una posible implicación de P2X 6 en la diferenciación del SNE, ya que se han reportado mecanismos mediados por los receptores purinérgicos P2X en la diferenciación neuronal, por la relación que tienen estos receptores en la movilización de calcio intracelular (Glaser y col, 2013); lo anterior es consistente con lo reportado por Silva y colaboradores en el 2007 que con técnica de RT-PCR reportaron una mayor expresión del receptor P2X6 en etapas embrionarias que en las etapas adultas durante el desarrollo de cerebro de rata.

Los resultados de este trabajo indicaron que la edad resultó tener un efecto significativo en la activación del gen P2X6, observándose una sobre regulación en las edades de P7 y P32. Es interesante mencionar que Xiang y colaboradores (2005) también observaron en P7 el mismo comportamiento de la subunidad P2X6al estudiar el desarrollo de cerebelo de rata. Con lo anterior se puede decir que la expresión del receptor

P2X6 en el sistema nervioso entérico tiene un 56

comportamiento similar en el sistema nervioso central, por lo que es importante continuar realizando estos estudios para conocer la relación entre los dos sistemas nerviosos. Las subunidades de los receptores purinérgicos P2X6y P2X2también se han reportado que participan en la diferenciación neuronal, así como en la neurogenesis pos-natal (Majumder et al, 2007; Schiwindt et al, 2011), por lo cual en la edad de P7 P2X6 podría estar teniendo una modulación en la terminación de la diferenciación posnatal de las neuronas entéricas.

La expresión del gen que codifica para la subunidad del receptor P2X6 incrementa con la edad de P0; este comportamiento también se ha reportado en otro tejidos como la vejiga humana (O´relly y col., 2001) e hígado de rata (Xiang y col., 2006), a diferencia de estos tejidos, en intestino

la activación de P2X 6

disminuye significativamente en a partir de la edad P32 a la edad adulta. La disminución de P2X6 a partir de P32 podría deberse a que en comparación con la vejiga e hígado, el intestino está en interacción con los nutrientes de la dieta. Tal cambio ocurre después de la transición lactancia-destete (P32) y pudiera contribuir con cambios que tiene lugar en el intestino cuando la composición de los alimentos cambia de leche materna a alimento sólido, esto es consistente con lo observado por Giaroni y colaboradores (2006) para el receptor purinérgico P2Y1. Es necesario realizar otros estudios para poder afirmar que la expresión de este receptor está siendo afectada por el cambio de dieta, sin embargo investigaciones anteriores han comprobado que la dieta puede modular el desarrollo del intestino, al ser este una primera entrada a nutrientes (Pácha y col., 2000; Ogura y col., 2005), así como una modulación epigénetica in vivo por efecto de la dieta (Suzuki y col., 2011; Marques y col., 2011). Además se ha señalado que el tipo de leche y/o suplemento ingerido durante la lactancia de lechones puede regular la permeabilidad del sistema nervioso entérico. Por último se reportó que una dieta deficiente de zinc disminuye significativamente la expresión del receptor purinérgico P2X6 (Chu y col., 2003), así como dietas deficientes de 57

proteínas disminuyen

la expresión de P2X2 (Misawua y col., 2011) siendo un

estado reversible.

Es interesante los cambios encontrados para este receptor durante la ontogenia, ya que dependiendo de la edad podría ser su función fisiológica o si implicación en la regulación del desarrollo. Lasubunidad de P2X6 es la encargada de modular la selectividad al ligando de ATP en los receptores heteroméricos P2X4/6 o de aumentar su permeabilidad al Ca2+ en canales P2X2/6, en ambos casos la respuesta de estos receptores es la entrada de iones monovalentes o divalentes como el Ca2+ , el cual actúa como un segundo mensajero activando proteínas intracelulares de señalización, como lo son las Calmudulinas, las cuales a su vez activan a cinasas dependientes de calmodulinas (llamadas CaMK). Un trabajo reciente encontró que la proteína CaMK II es esencial para la función del sistema nervioso entérico, este podría ser una vía por la cual este receptor purinérgico pueda estar regulando el desarrollo del intestino delgado (Gao et al, 2013).

Conociendo el comportamiento de la activación del gen que codifica para el receptor P2X6, se verificó si existía un comportamiento similar en la expresión de la proteína además de estudiar su estado de glicosilación para lo cual se realizó un western blot. El análisis de western blot arrojó una alta expresión de la proteína P2X6 consistente con la activación del gen para la edad de E18, además la banda detectada fue de un peso de 70KDa la cual correspondería al peso del receptor P2X6 totalmente glicosilado (Jones y col; 2004) sin embargo no se observó desplazamiento alguno por el tratamiento enzimático, esto puede deberse a que el tiempo de incubación no fue el adecuado para este tipo de muestra ya que la eficacia de la enzima se muestra en las glicoproteínas control (Figura 18) o que pudiera estar teniendo otro tipo de glicosilación que no fuera la N-glicosilación mayormente reportada.

La alta activación del gen y expresión de la proteína en la edad de E18 pudiera deberse a la función que podría estar realizando el receptor en la 58

diferenciación neuronal, debido a que Schwindt y colaboradores en el 2011 reportaron la relación de la expresión del heteroreceptor P2X2/6 y la inducción de la diferenciación neuronal en cultivos de neuroesferas de rata libre de mitógenos valiéndose de técnicas de inmunohistoquímica y de PCR en tiempo real. Es interesante la formación de este heteroreceptor (P2X2/6) ya que la forma encontrada, en este estudio, de la subunidad P2X6 fue de 70KDa, la cual corresponde a la forma funcional del receptor, la cual solo es funcional en la formación de heterotrímeros con las subunidades P2X2 y P2X4 más no del homoméro (King y col., 2000), por lo cual nos indicaría que la subunidad P2X6 pudiera estar siendo glicosilado por estar formando receptores heterotriméricos funcionales con la subunidad P2X2 y así participar en la diferenciación neuronal del sistema entérico del intestino delgado de rata en edad pre-natal E18.

A continuación en la edad P0 la expresión de la proteína decae al igual que lo hace la activación del gen, esto para ambas secciones. El decremento de la expresión de la proteína observado en la edad de P0 pudiera corresponder con el decremento de expresión de proteína reportado por Cheung y Burnstock en el 2002 del receptor P2X3 posterior al nacimiento de la rata. El receptor P2X3 tiene papeles de regulación nociceptiva (Burnstock, 2001) por lo que se cree que este decremento posterior al nacimiento pudiera ser para regular el dolor de parto. Este comportamiento es interesante debido a que el subtipo P2X 2 también tiene acción en procesos nociceptivos, además de tener la cualidad de formar heterotrímeros con la subunidad P2X6, lo cual pudiera estar explicando la disminución de la expresión de esta sububidad al nacimiento de la rata (P0).

Las bandas detectadas en la edad de P0 dependen de la región estudiada, debido a que en la sección proximal se observa la expresión de la proteína del receptor P2X6 con bandas de 70KDa y posteriormente al tratamiento enzimático se observa una banda a 70KDa y otra a 52KDa, mientras que en la sección distal no se detectó ninguna banda. Cabe resaltar que las diferencias entre secciones no se encuentran en la activación del gen pero si en la distribución del receptor; por lo cual pudiera estarse activado la expresión del mRNA que codifica para el receptor 59

P2X6 en ambas secciones pero en la sección distal disminuirse la expresión de la proteína comparada con la sección proximal.

Aunque la banda de P2X6 no es detectada en la sección distal del intestino delgado, se puede observar una ligera expresión del receptor por marcaje fluorescente en los enterocitos, esto es debido a que la inmunoflourescencia fue realizada en la cortes de la mucosa del intestino delgado de rata, mientras que el western blot fue realizado en todo el tejido de intestino delgado de rata. Por lo cual si el receptor solo se encuentra expresado débilmente en los enterocitos de la mucosa, al hacer el extracto de proteína total de todo el intestino es posible que no esté teniendo la suficiente sensibilidad para detectar la poca cantidad de proteína P2X6 presente. Las bandas detectadas en la sección proximal corresponden a un peso de 70KDa, sin embargo posteriormente al tratamiento enzimático se observó una segunda banda de 52KDa, la cual corresponde a la subunidad P2X 6 totalmente desglicosilada (Suzuki-Kerr y col, 2008), lo cual podría indicar que cierta cantidad de la proteína detectada a 70KDa fue desglicosilada por la enzima N glicosidasa F (Roche) o en su defecto que alguna de esa proteína se encontraba N-glicosilada y tuviera otro tipo de glicosilación. Las bandas para el receptor P2X 6 en la sección proximal de intestino de rata difieren de la los cambios en los estados de glicosilación reportado por Ormond y colaboradores en 2006, ya que reportan un cambio de 52KDa a 45KDa utilizando el mismo kit, estas diferencias podrían deberse a que Ormond y col estudiaron células embrionarias de riñón humano transfectadas con P2X6 recombinante, mientras que en este estudió de evaluó el comportamiento del receptor endógeno de la rata. Además otros estudios hechos en rata reportan el peso de 70KDa para un estado totalmente glicosilado de la proteína P2X6 (Glass y Burnstock, 2001)

La diferencia en la distribución del receptor P2X6 entre secciones proximal y distal en la edad de P0, es relevante ya que

dicho receptor se encuentra

localizado en los vasos entéricos en la sección proximal, en cambio en la sección 60

distal se encuentran en expresado en los enterocitos. Lo anterior mencionado podría estar hablándonos de una acción fisiológica diferenciada dependiendo la sección del intestino, esta distribución del receptor P2X6 en diferentes tipos de células ocurre también en otros tejidos de rata, tales como la tiroides y la retina (Glass y Burnstock, 2001; Suzuki-Kerr y col,2008).

Posteriormente a la edad de P7 se observó un sobre-regulación en la activación del gen, a pesar de esto la proteína no siguió el mismo comportamiento, si bien es cierto que la proteína del receptor P2X6 se expresó más en la edad de P7 que en la edad de P0 no hubo una sobre expresión de esta, parecida al comportamiento que tuvo del gen que codifica para el receptor P2X6 en P7. Esta vez, la proteína P2X6 se expresó de igual manera en ambas secciones del intestino delgado, encontrándose bandas de 70KDa y después del tratamiento enzimático se detectó una segunda banda de aproximadamente un peso de 65KDa, esta banda es consistente con el monómero glicosilado reportado por Suzuki-Kerr y colaboradores (2008) en células corticales de la retina de rata. Además se encontró un comportamiento similar en la distribución del receptor P2X6 que en la sección proximal disminuye la marca inmunoreactiva flourescente del receptor P2X6, mientras que en la sección distal aumenta, esto pudiera deberse a que las funciones realizadas por este receptor empiezan a ser más importantes en la sección distal.

La expresión del receptor P2X6 en la edad de P17 siguió el mismo comportamiento que en la edad de P7 al igual que la activación del gen, el único cambio es la localización del receptor P2X6 en la mucosa del intestino ya que en ambas secciones (proximal y distal) no se encontró marca inmunoreactiva, esto sugiere que al estar activado el gen y expresada la proteína quizá la localización del receptor P2X6 haya cambiado y en lugar de tener alguna función en la mucosa del intestino, estuviera expresada en el sistema nervioso entérico . Conforme continúa el desarrollo se observa que en la edad de P30 se mantiene sin cambios en la expresión del receptor y activación del gen, sin embargo comienza a 61

aparecer marca inmunoreactiva solo en la sección distal, pero esta vez cambiando de distribución hacia los vasos entéricos.

Cabe mencionar que la edad de P30 corresponde a una semana de la etapa del destete y es interesante que estos cambios se comiencen a dar a esta edad y en esta sección, ya que Giaroni y colaboradores en el 2001 encontraron cambios en la contracción y relajación del colón de rata por efecto del cambio de distribución de los receptores P2Y1 contribuyendo dichos cambios a los cambios en el intestino por la composición del alimento de la leche materna al alimento sólido. En este trabajo se encontró también que las bandas detectadas fueron diferentes entre secciones, ya que en la región proximal solo se encontraron bandas de 52KDa con y sin tratamiento enzimático, las cuales corresponden al receptor desglicosilado y no funcional (Jones y colaboradores, 2004), mientras que para la sección distal se detectaron bandas para el receptor P2X6 con diferentes estados de glicosilación. Por lo tanto estas diferencias en la edad distal pudieran estar relacionadas con el comportamiento de P2Y1 en el colón de rata.

Por último a llegar a una edad adulta ocurre algo relevante, la activación del gen disminuye a niveles de los encontrados en P0; la proteína se expresa con una banda correspondiente a una sola glicosilación; no obstante se encuentra una expresión moderada en la mucosa del intestino, esto pudiera deberse a que durante las edades de P7 a P17 se estuvo

activando el gen sin llegar a

traducirse por completo a proteína, generando un pool del gen que codifica para este receptor para posteriormente empezar a expresarse nuevamente en una etapa adulta; ya que se ha sido reportado la sobre regulación de la proteína P2X6 durante el envejecimiento y ha sido involucrado en el proceso de apoptosis de la próstata de rata (Slater y Murphy, 2000). Por lo anteriormente mencionado esto pudiera estar pasando en el intestino delgado de rata, ambos son músculo liso y pudiera ser que el incremento encontrado en la expresión del receptor P2X6 en la edad adulta sea una fase de preparación para los mecanismos del proceso de envejecimiento. 62

Los cambios encontrados en la activación, expresión y distribución del receptor purinérgico P2X6 hablan de una regulación durante el desarrollo del intestino delgado de rata, así como de posibles diferencias en la función de dicho receptor dependiendo de la edad y sección.

IX.



CONCLUSIÓN

El gen que codifica para el receptor purinérgico P2X6 se encuentra expresado durante toda la ontogenia del intestino delgado de rata.



El gen que codifica para el receptor purinérgico P2X6 se expresa de manera diferencial en las regiones del intestino delgado de rata, activándose más en la región proximal que en la distal.



La edad con mayor expresión del gen que codifica para el receptor purinérgico P2X6 fueron P7 y P32, mientras que la menor expresión se observó en las edades de P0 y adulto.



La proteína P2X6 se expresa durante todo el desarrollo del intestino delgado de rata con excepción en la edad P0 en la sección distal mayor y el mayor nivel expresión del receptor P2X6 ocurre en la edad de E18.



El receptor P2X6 presenta diferentes estados de glicosilación correspondientes a los pesos de: 70KDa, 65KDa, 60KDa y 52KDa, sin embargo en algunas edades no ocurrió desplazamiento de las bandas detectadas por el tratamiento de desglicosilación recibido.

63



El receptor P2X6 presenta una distribución diferencial dependiente de la edad y la sección. El receptor P2X6 se localizó en los vasos entéricos en la sección proximal, en cambio en la sección distal se expresó en los enterocitos.



El receptor P2X6 no se expresó en la mucosa del intestino delgado de rata durante toda la ontogenia.



Se encontró que la edad de la rata estudiada tiene efecto significativo en la expresión del gen que codifica para el receptor purinérgico P2X6, observándose cambios significativos en edades que coinciden con el cambio de alimentación (E18, P0 y adulto).



Durante el desarrollo del intestino delgado de rata ocurren cambios en la expresión del gen que codifica para el receptor P2X6, en la expresión de la proteína P2X6 así como en su distribución, dichos cambios mostraron un comportamiento dependiente de la sección del intestino evaluada y de la edad de la rata, la cual coincide con las edades de cambio de tipo de alimentación; sin embargo se necesitan realizar más estudios para determinar si tales cambios se ven afectados por el cambio de dieta o por duración del período de lactancia entre otros.

64

X.

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