Universidad de Colima Facultad de Ciencias Marinas

RELACIÓN ENTRE ESTRÉS TÉRMICO Y DAÑO OXIDATIVO EN EL CORAL HERMATÍPICO Pocillopora capitata.

Tesis que para obtener el grado de Maestro en Ciencias del Mar Presenta Laura Angélica Flores Ramírez

Asesores Dr. Marco Agustín Liñán Cabello Dra. Lidia Silva Iñiguez Dra. Tania Zenteno Savín

Manzanillo, Col., octubre de 2006

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AGRADECIMIENTOS A la Universidad de Colima por el apoyo económico otorgado para la realización de ésta Maestría Al Dr. Marco Agustín Liñán Cabello por su asesoramiento científico, por su incondicional ayuda y por sus observaciones críticas en la realización del presente trabajo.

A la Dra. Tania Zenteno Savín por sus substanciales sugerencias y recomendaciones y por su estímulo para seguir adelante.

Al Dr. Aramís Olivos Ortiz por todo el apoyo brindado antes, durante y después de la culminación de esta Tesis.

Al Dr. Alfredo Mena Herrera A la Dra. Lidia Silva Iñiguez

Al M. C. Carlos Lezama Cervantes

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DEDICATORIA A mis padres, Gustavo Flores Hernández y Susana Ramírez Cortez A mis hermanos, Gustavo Alonso, Diana Isabel y Omar Andrés A mi sobrino Braulio de Jesús A la Familia López Ramírez A mis compañeros de generación A mis grandes amigos y amigas (por orden alfabético), Astrid, Carlos, Dafne, Dolores, Eladio, Emma, Géraldine, Gonzalo, John, José Luis, Karla, Mariela, Marisol, Nefertiti, Nidia, Rocío, Rubí, Sol y Wendy ...y a todos aquellos que de una u otra manera me alientan a continuar.

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INDICE I. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 1 II. ANTECEDENTES ................................................................................................... 4 II.1. Aspectos ecológicos de los ecosistemas coralinos .................................................... 4 II.2. El blanqueamiento coralino y sus causas ................................................................... 5 II.3. Estrés oxidativo .......................................................................................................... 8 II.4. Situación de las comunidades coralinas en el Pacifico Oriental Tropical .................. 13

III OBJETIVOS .......................................................................................................... 15 III.1. Objetivo general ...................................................................................................... 15 III.2. Objetivos específicos............................................................................................... 15 III.3. Hipótesis ................................................................................................................. 15

IV. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 16 IV.1. Sitio de estudio y colecta de muestras .................................................................... 16 IV.2. Diseño experimental ............................................................................................... 17 IV.3. Determinación del contenido de clorofila a (Cl a) .................................................... 18 IV.4. Pigmentos carotenoides (PC) ................................................................................ 19 IV.5. Densidad de zooxantelas endosimbióticas.............................................................. 20 IV.6. Zooxantelas expulsadas ......................................................................................... 21 IV.7. Determinación de la superficie de área del coral ..................................................... 21 IV.8. Marcadores moleculares de estrés oxidativo.......................................................... 21 IV.8.1. Obtención del extracto crudo en el tejido del coral........................................... 22 IV.8.2. Lipoperoxidación (MDA) .................................................................................. 22 IV.8.3. Superóxido dismutasa (SOD) .......................................................................... 23 IV.9. Análisis estadístico................................................................................................. 23

V. RESULTADOS...................................................................................................... 24 V.1. Pigmentos fotosintéticos .......................................................................................... 24 V.2. Densidad y expulsión de zooxantelas endosimbióticas ............................................ 26 V.3. Pigmentos fotosintéticos por zooxantela .................................................................. 27 V.4 Marcadores de estrés oxidativo .................................................................................. 0 V.4.1 Lipoperoxidación (MDA) .................................................................................... 29 V.4.2 Superóxido dismutasa (SOD) ............................................................................ 31

VI. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 34 VII. CONCLUSIONES ............................................................................................... 42 VIII.- LITERATURA CITADA ..................................................................................... 43

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LISTA DE TABLAS Tabla 1.

Daño celular (M MDA g-1 proteína) para cada grupo a cada temperatura. Los resultados se presentan como media  desviación estándar (n = 3); con letras distintas se indican diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a la prueba de Tukey. ................................................................................................ 30

Tabla 2. Actividad de la SOD (U mg-1 de proteína) para cada grupo a cada temperatura. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 3); con letras distintas se indican diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a la prueba de Tukey.................................................................................................................. 32 Tabla 3. Coeficientes de regresión encontrados entre las posibles combinaciones de parámetros evaluados en este estudio. CC―coral control no expuesto al gradiente de temperatura. Valores en negritas representan datos significativos (P < 0.05)..................................................................................... 33

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LISTA DE FIGURAS Figura 1. Rutas enzimáticas y no enzimáticas como mecanismos de defensa contra las especies reactivas de oxígeno (EROs) y formación del nocivo hidroxilo (HO•). SOD―superóxido dismutasa; GSH―glutatión; GPx―glutatión peroxidasa; CAT―catalasa; GSSG―glutatión disulfido. (Figura modificada de R&D Systems. Cytokine bulletin: Free radicals and oxidative stress, Spring 1996). ...... 9 Figura 2. Representación esquemática del modelo propuesto en corales para la producción de EROs, su difusión desde una localización celular a otra, y algunos de los productos predominantes del peróxido de hidrógeno como resultado del incremento en la temperatura superficial del mar. D1 y D2— proteínas integrales de la membrana tilacoidal; NADH—nicotinamida adenín dinucleótido reducida; NAD—nicotinamida adenín dinucleótido. (Figura tomada de Downs et al., 2002). .......................................................................... 12 Figura 3. Ubicación del sitio de estudio y la zona de colecta dentro de la Bahía de Santiago en Manzanillo, Colima, México. .......................................................... 16 Figura 4. Diagrama de flujo que representa en forma general la metodología realizada en el presente estudio a fin de caracterizar en el coral Pocillopora capitata biomarcadores de daño oxidativo e indicadores de las tasas fotosintéticas. MDA—malondialdehído, un producto de la peroxidación lipídica; SOD—superóxido dismutasa. ............................................................................. 17 Figura 5. Concentraciones promedio de pigmentos fotosintéticos y la tasa (PC/Cl a) en corales expuestos al incremento de temperatura. A) tratamiento N; B) tratamiento P; C) tratamiento C; CC) coral control no expuesto al cambio de temperatura. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 3); con letras distintas se denotan diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a la prueba de Tukey. ........................................................................... 25 Figura 6.

Densidad promedio de zooxantelas endosimbióticas en corales de todos los tratamientos expuestos al incremento de temperatura. CC―coral control no expuesto al cambio de temperatura. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 8); con letras distintas se denotan diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a comparaciones simples/parejas. .................................................................................................. 26

Figura 7. Valores promedio de zooxantelas expulsadas en corales de todos los tratamientos expuestos al incremento de temperatura. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (n = 4). El asterisco indica una diferencia significativa (ANDEVA) a P < 0.05 de acuerdo a comparaciones simples/parejas. .................................................................................................. 27

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Figura 8. Concentraciones promedio de pigmentos fotosintéticos por zooxantela en corales de todos los tratamientos expuestos al incremento de temperatura. CC―coral control no expuesto al cambio de temperatura. A) tratamiento N; B) tratamiento P; C) tratamiento C. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 8); con letras distintas se denotan diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a la prueba de Tukey.................. 28 Figura 9.

Daño celular (MDA) en corales de cada tratamiento expuestos al incremento gradual de temperatura. CC―coral control no expuesto al gradiente de temperatura. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 3). ................................................................................................................ 30

Figura 10. Actividad de la SOD en corales de todos los tratamientos expuestos al incremento gradual de temperatura. CC―coral control no expuesto al gradiente de temperatura. Los datos representan las medias  desviación estándar (n = 3). ................................................................................................. 31

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RELACIÓN ENTRE ESTRÉS TÉRMICO Y DAÑO OXIDATIVO EN EL CORAL HERMATIPICO Pocillopora capitata.

Resumen aprobado por:

Dr. Marco Agustín Liñán Cabello Director de Tesis Con el fin de evaluar la respuesta a la exposición de un aumento gradual de 10 ºC de temperatura (22 a 32 °C sobre 10 h) en fragmentos normales (N), parcialmente blanqueadas (P) y un control (C) del coral Pocillopora capitata, se examinaron marcadores de estrés oxidativo tales como peroxidación lipídica (MDA) y la actividad de superóxido dismutasa (SOD), indicadores de blanqueamiento como clorofila a (Cl a) y pigmentos carotenoides (PC), así como densidad zooxantelar. Los resultados revelaron que todas los tratamientos (N, P y C) contienen niveles más altos de PC respecto a la Cl a. Ambos pigmentos aumentaron al incrementar la temperatura desde los 22 hasta los 28 °C solamente en muestras N y C, mientras que entre los 26 y 28 ºC muestras P mostraron menor daño celular respecto a N y C, así como mayor actividad antioxidante entre los 26 y 30 °C. En los tres tipos de fragmentos coralinos la tasa de expulsión zooxantelar aumentó constantemente a través del rango completo de temperaturas. Colectivamente, estos resultados indican que la temperatura tiene un efecto directo en la relación antagónica entre el daño inducido por temperatura y los mecanismos antioxidantes en esta especie de coral.

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THERMAL STRESS AND OXIDATIVE DAMAGE IN THE HERMATYPIC CORAL, Pocillopora capitata

ABSTRACT To examine the response to exposure to a thermal gradient in coral, we assessed the effect of a gradual 10 ºC temperature increase (22 to 32 ºC over 10 h) on normal (N), partially bleached (P) and control (C) samples collected from different branches of the same coral (Pocillopora capitata). We examined markers of oxidative stress, including lipid peroxidation (MDA) and superoxide dismutase (SOD) activity, indicators of bleaching, including chlorophyll a (Chl a) and carotenoid pigment (PC) levels, as well as zooxanthellae density. Our results revealed that N, P and C coral samples all contained higher levels of PC versus Chl a. The levels of both pigments increased as the temperature increased from 22 to 28 ºC only in N and C samples, whereas P samples showed less cellular damage than N and C samples at temperatures between 26 and 28 °C, and had greater antioxidant activities at temperatures between 26 and 30 ºC. The rate of zooxanthellar expulsion consistently increased with temperature in all three coral types across the entire temperature range. Collectively, these results indicate that temperature has a direct effect on the antagonistic relationship between temperature-induced damage and protective antioxidant mechanisms in this type of coral.

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I. INTRODUCCIÓN Los corales conforman una relación simbiótica con microalgas fotosintéticas (zooxantelas) que viven dentro de sus células endodermales, siendo éstas altamente dependientes de la luz solar para satisfacer las demandas fotosintéticas, a partir de las cuales cubren muchos de los requerimientos energéticos del coral (Papina et al., 2003). Sin embargo, bajo condiciones de altas temperaturas, la estabilidad de esta simbiosis es adversamente afectada, causando el blanqueamiento (Glynn, 1990) en una amplia variedad de especies de coral (Calvin y Muscatine, 1997; Down et al., 2002). Varios estudios in vitro han mostrado que los dinoflagelados simbióticos mantenidos en cultivo son susceptibles al estrés termal (Iglesias-Prieto et al., 1992; Jokiel y Coles, 1990; Warner et al., 1996), mientras que estudios in vivo han señalado que el blanqueamiento inducido termalmente es una fuente principal de daño para muchos arrecifes de coral hermatípicos (Fitt et al., 2001; Lesser, 2004). Los episodios globales de blanqueamiento durante los meses más calientes en verano han incrementando en frecuencia y severidad en las dos épocas pasadas (Glynn, 1993; Brown, 1997a, 1997b), indicando que la importancia de éste problema va en aumento. Estudios mecanísticos han mostrado que la radiación fotosintéticamente activa (PAR: 400-700 nm) y la radiación ultravioleta (UVR: 290-400nm, UVB: 290-320 nm, UVA: 320-400 nm) pueden actuar junto con altas temperaturas para producir el blanqueamiento (Lesser et al., 1990; Fitt y Warner, 1995). Diversos componentes de la ruta fotosintética son susceptibles al daño inducido por temperatura; el fotosistema II (PSII) es particularmente vulnerable, con daños reportados en el complejo productor de oxígeno (Becker et al., 1990; Havaux, 1993), en el centro de reacción del PSII (Heckathorn et al., 1997), y en la conectividad entre el complejo captador de luz y el centro de reacción del PSII (Schreiber y Armond, 1978). En plantas y algas verdes, el disturbio termal puede modificar la vulnerabilidad del aparato fotosintético al daño por PAR, inhibiendo la fotosíntesis (Al-Khatib y Paulsen, 1989). Sin embargo, estos organismos poseen mecanismos protectivos que contrarrestar tal inhibición, los cuales incluyen el incremento en la producción de la

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proteína D1 (Öquist et al., 1992; Anderson et al., 1997), el ciclo de las xantofilas que disipa el exceso de energía de excitación fuera del centro de reacción del PSII (Brown et al., 1999), y la inactivación de centros de reacción intactos (Schnettger et al., 1994). En ausencia de tales mecanismos protectivos, el centro de reacción del PSII puede ser dañado (Ohad et al., 1994), llevando a un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) (Fitt et al., 2001; Lesser, 2004; Tchernov et al., 2004). El daño específico de los efectos provocados por las EROs incluyen la peroxidación lipídica de la membrana celular, pérdida de la función en organelos, mutación, inactivación enzimática, reducción en la eficiencia metabólica, disminución en la fijación de carbono y decremento de la fotosíntesis. Para prevenir este daño, las células y los organismos utilizan estrategias protectivas que involucran a antioxidantes de bajo peso molecular (mecanismos no enzimáticos) tales como caroteno, vitamina C, -tocoferol, flavonoides, hidroxiquinonas y glutatión (Warner, 1994; Meyers, 1995; Goodsell, 1996), mecanismos enzimáticos como la enzima superóxido dismutasa (SOD), ascorbato peroxidasa y glutatión reductasa, o mecanismos

dirigidos

a

reparar

los

daños

causados

por

las

EROs

en

macromoléculas tales como ácidos nucleicos, proteínas y lípidos (Medina, 1996; Liñan-Cabello et al., 2003). En corales, el daño al PSII de la zooxantela simbiótica ha sido asociado al fotoblanqueamiento y a un daño significativo en el cnidario hospedero (Downs et al., 2000). Más específicamente, la zooxantela genera un flujo de radicales superóxido (O2•–) y peróxido de hidrógeno (H2O2) que da como resultado la formación de numerosos radicales hidroxilos (HO•) que se difunden al citoplasma de las células del cnidario (Dykens et al., 1992). Se sabe que concentraciones relativamente bajas citoplasmáticas de H2O2 pueden ser neutralizadas por los diversos mecanismos enzimáticos y no enzimáticos (Halliwell y Gutteridge, 1999), mientras que concentraciones más altas pueden sobrepasar a los mecanismos de defensa antioxidante y conllevar a un daño oxidativo y al blanqueamiento. Sin embargo, los mecanismos precisos, celulares y moleculares, que gobiernan al blanqueamiento inducido por temperatura en cnidarios aún permanecen desconocidos. 2

En este trabajo se caracterizaron biomarcadores de estrés oxidativo e indicadores de las tasas fotosintéticas en coral Pocillopora capitata, siguiendo la exposición

a un incremento de 10 ºC de temperatura transcurridas 10 h. Los

resultados proveen nuevos conocimientos en la respuesta bioquímica de los corales ante estrés térmico.

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II. ANTECEDENTES II.1. Aspectos ecológicos de los ecosistemas coralinos Los arrecifes coralinos son ecosistemas construidos por corales pétreos hermatípicos o formadores de arrecifes, estos se presentan principalmente en el paralelo situado entre el trópico de cáncer y el trópico de capricornio. Sin embargo, la distribución de estas comunidades no es regular, ya que, en esta latitud hay extensas costas marítimas sin arrecifes, mientras que por otro lado aparecen arrecifes fuera de los trópicos. Las isocrinas, es decir, las líneas de valores medios de temperatura invernal iguales, son más adecuadas que la línea rígida de un determinado grado de longitud. La isocrina de 20° C circunscribe bastante bien los arrecifes del planeta, por lo tanto, la temperatura es el factor determinante en la distribución de los arrecifes coralinos a gran escala (Schuhmacher, 1978). Dentro de las condiciones ecológicas generales que determinan la posibilidad de desarrollo en una comunidad arrecifal, además de la temperatura, está la energía lumínica. En virtud de que la luz tiende a extinguirse rápidamente al atravesar una columna de agua, resulta lógica la relación entre la batimetría y este tipo de organismos. A profundidades menores a 10 metros la energía cinética en las aguas es mayor, pero se presentan otros factores que limitan el crecimiento de algunos organismos. La variación de estos factores depende o está en relación a las características fisiográficas, dirección de los vientos e intensidad de los mismos, y al oleaje (Sevilla, 1977). De acuerdo a lo señalado anteriormente, queda claro que la construcción de arrecifes es un proceso orgánico e inorgánico, es decir, biológico y ecológico, en el cual frecuentemente se aprecia que en principio el crecimiento es inducido por condiciones tales como alto potencial cinético, temperaturas adecuadas y altas concentraciones de oxígeno favorecidas por el intenso movimiento del agua. En etapas posteriores el movimiento del agua

acelera el proceso de erosión y

sedimentación, los cuales servirán de sustrato para el crecimiento de algunos miembros de la comunidad (Sevilla, 1977).

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Los arrecifes coralinos están considerados entre los ecosistemas más biodiversos y complejos de los océanos (Connell, 1978), funcionan como zonas de refugio, alimentación, reproducción y crianza para numerosos organismos. Una característica remarcable de los corales hermatípicos es su simbiosis con microalgas fotosintéticas llamadas zooxantelas (Symbiodinium sp.), las cuales viven dentro de sus tejidos a densidades de 0.5 a 5 millones por cm -2 de coral (Trench, 1979; Muscatine, 1990). El alga provee carbohidratos así como diversos ácidos grasos poliinsaturados (Papina et al., 2003) al animal y facilita el depósito de carbonato de calcio en el esqueleto, mientras que el coral ofrece materiales nitrogenados y otros compuestos requeridos para el desarrollo algal. Cuando el coral se ve afectado por algún agente como la temperatura excesivamente baja o alta, o por cambios bruscos de salinidad, por ejemplo, la relación simbiótica se rompe y las algas son expulsadas del tejido, lo cual causa la pérdida del color de las colonias, fenómeno conocido como blanqueamiento. Si la perturbación es a corto plazo, el coral puede soportar la falta de algas y eventualmente recuperará su dotación; sin embargo, si el problema dura mucho tiempo, el coral sufrirá alteraciones fisiológicas y terminará muriendo (Bryant et al., 1997) debido a que la mayor proporción de nutrición para el coral proviene de los productos fotosintéticos del alga.

II.2. El blanqueamiento coralino y sus causas En los últimos diez años, la comunidad internacional se ha preocupado por disminuir la presión humana sobre los arrecifes, y se han llevado a cabo evaluaciones del estado de estos ecosistemas en todo el mundo. En 1992 y 1997 aparecieron los primeros resúmenes de estos trabajos, (Wilkinson, 1992; Eakin et al., 1997) en los cuales se revela que alrededor del 10% de los arrecifes estaban dañados a tal nivel que su recuperación era imposible a corto plazo, y únicamente el 30% de ellos se hallaba en condiciones de tener asegurada su existencia, al menos hasta fines del siglo XXI (Reyes-Bonilla et al., 2002). La situación descrita no era la mejor y sin embargo empeoró, esta vez, por causas aparentemente naturales, ya que entre 1997 y 1998 se presentó uno de los

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eventos más intensos de la oscilación sureña de El Niño en el siglo y dio lugar a que la temperatura oceánica superficial se elevara más de 5° C sobre los niveles normales en los océanos Índico y Pacífico (Glynn, 2001), acontecimiento que causó estrés en los corales arrecifales de ambos océanos, al provocar el fenómeno llamado blanqueamiento (Reyes-Bonilla et al., 2002). Los registros de blanqueamiento de coral se remontan a 1870, pero desde los 1980´s estas incidencias se han vuelto más frecuentes, generalizadas y severas (Glynn, 1993; Brown, 1997a).

En 1979 y 1980, se produjeron varios casos de

blanqueo de coral en los arrecifes que rodean Okinawa, la isla de Pascua, el noroeste de Australia y el mar Caribe. Un incidente más grave se produjo en 1982 y 1983, afectando a arrecifes situados al este de África, Indonesia y la costa oeste de América Central y Sudamérica. Casos de blanqueo todavía más graves y más dañinos tuvieron lugar en el trienio comprendido entre 1986 y 1988, afectando áreas como Taiwan, Hawaii, Fiji, isla Mayotte y toda la extensión de la Gran Barrera de Arrecifes (Glynn, 1993; Goreau y Hayes, 1994; Goreau et al., 2000). El blanqueamiento por estrés térmico en corales hermatípicos se ha convertido en la principal característica de degradación de muchos sistemas arrecifales (Fitt et al., 2001; Lesser, 2004). Muchos expertos consideran que el blanqueamiento

de las comunidades coralinas es la primera evidencia firme del

calentamiento global de los océanos, y se ha señalado que, de continuar

la

tendencia a la elevación de la temperatura, los arrecifes pueden desaparecer del planeta, debido a la ocurrencia de repetidos eventos de blanqueamientos, en tanto que otros no están de acuerdo en tal pronóstico, pero en general existe una gran inquietud por el estado de estos sistemas biológicos y por sus perspectivas de recuperación (Reyes-Bonilla et al., 2002). Según Douglas (2003), blanqueamiento de coral es un nombre incorrecto, debido a que el blanqueamiento no se limita únicamente a los corales, sino que se exhibe en todos los animales que están en simbiosis con algas dinoflageladas del género Symbiodinium, también conocidas como zooxantelas debido su color amarillo-café. Dicha simbiosis está restringida principalmente a los animales bénticos

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del filum cnidarios (anémonas de mar, zoantidos, corales escleractinios y octocorales) de la zona fótica a bajas latitudes, aunque las simbiosis también se presentan en algunas esponjas y almejas. Blanqueamiento de coral es un término genérico utilizado para describir la pérdida o degradación de pigmentos (coloración) del coral, y puede involucrar tanto una pérdida de pigmentos fotosintéticos en el alga como un decremento en el número de éstas en el tejido del coral hospedero (Fitt et al., 2001), así, el esqueleto blanco se torna visible a través del tejido transparente del coral, dando al organismo una apariencia blanquecina (Jokiel, 2004). Las especies de Symbiodinium poseen clorofila a y c, así como varios carotenoides, particularmente la peridinina la cual le confiere el color café (Douglas, 2003) y comprende entre el 60 y 70% de los pigmentos totales encontrados en las zooxantelas (Borneman, 2001). El blanqueamiento coralino es considerado como una reacción a las condiciones medioambientales anormales, en respuesta a la variación de un amplio rango de parámetros físicos y químicos (Jones, 1997). Estos pueden actuar solos o en combinación e incluyen: el incremento de la temperatura superficial del mar (Jokiel y Coles, 1990), bajas temperaturas (Steen y Muscatine, 1987; Gates et al., 1992), incremento en la irradiancia (Lesser et al., 1990), decremento en la irradiancia (Franzisket, 1970), alteración de la calidad espectral en el rango visible (Kinzie et al., 1984), alteración en la calidad espectral de la radiación ultravioleta (Gleason y Wellinton, 1993), bajas salinidades (Goreau, 1964, Coles y Jokiel, 1978), sedimentación (Meehan y Ostrander, 1997; Philipp y Fabricius, 2003), enfermedades infecciosas (Kushamaro et al., 1997,1998; Ben-Haim y Rosenberg, 2002), exposición a mareas bajas (Vaughan, 1914; Yonge y Nicholls, 1931), contaminación por hidrocarburos (Guzman et al., 1991) y exposición a materiales tóxicos (Jones, 1997; Jones y Steven, 1997). Sin embargo, a pesar de las considerables investigaciones en este tópico, no existe una explicación simple y coherente acerca de las causas o mecanismos del blanqueamiento (Douglas, 2003). Un problema clave para entender el blanqueamiento, es que la magnitud a la cual los factores externos, físicos y/o químicos activan el blanqueamiento, determina los síntomas de éste (Douglas, 2003). La información disponible sobre las causas o

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mecanismos del blanqueamiento se encuentra fragmentada, ésta incluye: daño y reducción en la proteína D1 dentro del centro de reacción del PSII en células de Symbiodinium (Warner et al., 1999) y ruptura del ciclo de Calvin (Jones et al., 1998). Cada uno ha sido sugerido que contribuye al mecanismo del blanqueamiento en respuesta a la temperatura y radiación elevadas; a la inhibición de la fotosíntesis en respuesta a toxinas producidas por el patógeno Vibrio shiloi (Banin et al., 2001); a cambios en los patrones celulares de la fosforilación de proteínas que conllevan al desprendimiento de la célula animal (Sawyer y Muscatine, 2001); y a células necróticas y programadas para morir por rutas intermediarias de lisis. Douglas (2003) refiere que varios de estos fenómenos no son necesariamente mutuamente exclusivos, sino que pueden ocurrir secuencialmente

o en paralelo, y variar en

importancia dependiendo de los activadores del blanqueamiento. Un componente importante poco estudiado han sido los mecanismos celulares y/o moleculares del blanqueamiento. Brown (1997a y 1997b) y Downs et al. (2000) mencionan que diversos factores medioambientales asociados a eventos masivos de blanqueamiento pueden análogamente inducir al incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs), a una respuesta antioxidante y a un significativo daño oxidativo en el coral simbiótico. Los factores externos, mencionados anteriormente pueden desestabilizar la cadena fotosintética del transporte de electrones e incrementar las tasas de producción de las EROs. Las defensas antioxidantes del coral pueden compensar y aminorar la capacidad destructiva de estas EROs, sin embargo, por arriba de este umbral, las EROs causarían un daño oxidativo (Downs et al., 2002).

II.3. Estrés oxidativo El oxígeno es esencial para la vida en la tierra. En su estado normal, el oxígeno es relativamente poco reactivo, sin embargo, a lo largo del metabolismo normal, y como consecuencia de perturbaciones ambientales y contaminantes (radiaciones, sequías, estrés térmico, herbicidas, etc.), el oxígeno da origen a diversos intermediarios letales o altamente tóxicos. Estos intermediarios, que son las

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especies biológicas de oxígeno citotóxicas más importantes, reciben el nombre genérico de especies reactivas de oxígeno (EROs) y radicales libres (Strain et al., 1991). Los radicales libres y otras especies derivadas del oxígeno son constantemente generados in vivo, tanto por “accidentes químicos” como para propósitos metabólicos específicos (Medina, 1996). El término EROs incluye al radical superóxido (O2•–), al peróxido de hidrógeno (H2O2), al radical hidroxilo (HO•), al óxidonitrógeno (NO•) y al peroxinitrito (ONOO-) (Warner, 1994). Uno de los radicales más reactivos es el radical hidroxilo (HO •), estos reaccionan con casi todas las moléculas en las células vivas; por ello, cuando es formado in vivo, daña cualquier cosa que se encuentre cerca (ya que en la célula no puede migrar distancias significativas). El nocivo HO• puede formarse si el O2•– y/o el H2O2 se ponen en contacto con iones fierro o cobre (Fig. 1) (Medina, 1996).

._

O2

GSH

SO D

GSSG

GPx

H 2O 2

Lactoferrina

CAT

X

Fe2+

H 2O + O 2

Fe3+

.

OH

X

-caroteno

Peroxidación lipídica

-tocoferol

Ruptura del ADN

Flavonoides

Degradación proteica

Figura 1. Rutas enzimáticas y no enzimáticas como mecanismos de defensa contra las especies reactivas de oxígeno (EROs) y formación del nocivo hidroxilo (HO•). SOD―superóxido dismutasa; GSH―glutatión; GPx―glutatión peroxidasa; CAT―catalasa; GSSG―glutatión disulfido. (Figura modificada de R&D Systems. Cytokine bulletin: Free radicals and oxidative stress, Spring 1996).

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Algunas de las consecuencias del daño oxidativo incluyen a la peroxidación lipídica de membranas celulares, pérdida de función en organelos, mutación, inactivación enzimática, reducción en la eficiencia metabólica, y en las plantas, una reducida fijación del carbono que conlleva a una capacidad fotosintética deteriorada. De permitir que este daño continúe y/o permanezca sin reparación, la integridad y función celular podrían comprometerse rápidamente. La eliminación rápida y efectiva de estas especies de oxígeno es esencial para la sobrevivencia y correcta función de los organismos. Para prevenir este daño, las células y los organismos utilizan tres estrategias de defensa: en una se utilizan antioxidantes de bajo peso molecular (mecanismo no enzimático), mientras que las otras dos utilizan varias enzimas (mecanismo enzimáticos), o se reparan los daños macromoleculares causados por EROs en ácidos nucleicos, proteínas y lípidos (Medina, 1996). Dos tipos de defensa han evolucionado a la par con los organismos como mecanismos de autoprotección. Los mecanismos no enzimáticos

incluyen al

-caroteno, ácido ascórbico, -tocoferol, flavonoides, hidroxiquinonas y glutatión (Fig. 1) (Meyers, 1995; Warner, 1995; Goodsell, 1996), dichos compuestos pueden neutralizar directamente a las EROs. Por otro lado, las defensas enzimáticas incluyen enzimas que son capaces de remover, neutralizar o depurar a los radicales libres e intermediarios de oxígeno. Ejemplos de defensas enzimáticas son la ascorbato peroxidasa, y la glutatión reductasa (GR), que eliminan el peróxido de hidrógeno en cloroplastos y mitocondrias; la catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx), que remueven el peróxido de hidrógeno de las células; y la superóxido dismutasa (SOD), que depura los radicales superóxido (Fig. 1) (Medina, 1996). Se ha propuesto que las enzimas SOD son la barrera más importante para la eliminación de los radicales O2•–, éste radical

es el primero en formarse y es

responsable de la formación de otros radicales libres más peligrosos. La CAT y la SOD son las enzimas más eficientes que al combinarse pueden convertir los radicales O2•– y H2O2 en agua y oxígeno molecular (Scandalios, 1993). El estrés oxidativo se produce, por lo tanto, al romperse el equilibrio entre la producción de las EROs y los mecanismos de defensa antioxidante, lo que conlleva a una variedad de

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cambios fisiológicos y bioquímicos que provocan el deterioro y la muerte celular (Fig. 1). Como se expuso anteriormente, el blanqueamiento coralino puede ser inducido por diversos factores externos; sin embargo, el componente importante poco estudiado es el de los mecanismos celulares y moleculares, ya que pocos son los modelos que incorporan estos mecanismos. Un modelo propuesto concerniente al posible mecanismo de blanqueamiento está basado en la respuesta antioxidante de los componentes involucrados en la relación simbiótica (Downs et al., 2000). Estresores como altas o bajas temperaturas, osmolaridad, altas tasas de luz, y radiación ultravioleta, pueden desestabilizar la cadena fotosintética en el transporte de electrones lo que se traduce en un incremento en la producción de EROs (Richter et al. 1990; Halliwell y Gutteridge, 1999). La producción de EROs se lleva a cabo en los cloroplastos por distintos mecanismos asociados con el fotosistema I y con la transferencia de electrones en el fotosistema II, lo más notable es la reacción de Mehler y la generación de H2O2 (Mehler, 1951; Badger, 1985). Se ha propuesto que la generación de H2O2 en las algas se puede difundir al citoplasma del coral (Fig. 2) (Downs et al., 2002). Una vez dentro del citoplasma, el H2O2 puede ser neutralizado por rutas antioxidantes enzimáticas y no enzimáticas, como la SOD y CAT o ser convertidos a EROs más nocivas, es decir, a radicales HO• (Halliwell y Gutteridge, 1999). A bajas concentraciones de EROs, las defensas antioxidantes del coral pueden compensar y aminorar la capacidad destructiva de estas especies, altas concentraciones de EROs causarán un daño oxidativo. Los corales pueden erradicar la fuente dominante de producción de EROs expulsando a sus algas simbióticas, así, la Teoría Oxidativa del Blanqueamiento Coralino propone que el blanqueamiento es una defensa final contra el estrés oxidativo (Downs et al., 2002). El daño oxidativo puede ser evaluado utilizando marcadores de estrés, para lo cual se aplican métodos

directos e indirectos. Entre los métodos directos se

encuentra la medición de la concentración de agentes antioxidantes, lo que resulta difícil en muchos casos, por tener éstos un tiempo de vida media muy corto. El uso de la espectrometría de la resonancia de rotación de electrones (espín) es la única 11

técnica analítica que mide directamente las EROs, pero resulta muy costosa y compleja para su aplicación, lo que hace imprescindible medirlos indirectamente (Pérez-Gastell y Pérez-de Alejo, 2000).

Figura 2. Representación esquemática del modelo propuesto en corales para la producción de EROs, su difusión desde una localización celular a otra, y algunos de los productos predominantes del peróxido de hidrógeno como resultado del incremento en la temperatura superficial del mar. D1 y D2—proteínas integrales de la membrana tilacoidal; NADH—nicotinamida adenín dinucleótido reducida; NAD—nicotinamida adenín dinucleótido. (Figura tomada de Downs et al., 2002).

Se han desarrollado métodos para medir algunas de las EROs, pero indirectamente, mediante los productos terminales de su acción oxidante sobre proteínas, ADN y lípidos. Los resultados de diferentes estudios muestran que los niveles de antioxidantes pueden aumentar o disminuir en diversas patologías, así, la medición de sus niveles puede ser utilizada como marcadores de enfermedades o para el seguimiento de los tratamientos utilizados. Entre los métodos indirectos más usados están las mediciones de antioxidantes enzimáticos como CAT y SOD y la determinación de los niveles no enzimáticos como vitaminas A y C (Pérez-Gastell y

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Pérez-de Alejo, 2000). Otro método indirecto utilizado es la medición del estado antioxidante total; éste método refleja el equilibrio dinámico entre el sistema antioxidante y la producción de EROs y es utilizado como instrumento para estimar el riesgo de daño oxidativo (Takayama y Egashira, 1998).

II.4. Situación de las comunidades coralinas en el Pacifico Oriental Tropical Respecto al Pacífico Oriental, dentro del cual se encuentra el área de interés de este estudio, las condiciones no son óptimas. Esta región recibe tormentas tropicales y ciclones de manera continua, los meteoros causan daños importantes en la sección arrecifal localizada cerca de la superficie, pero sus efectos son menores en aguas profundas y además, también tienen consecuencias provechosas porque la agitación del agua favorece la fragmentación de las colonias de coral, que pueden depositarse en áreas libres del fondo y favorecen la extensión de la superficie arrecifal cuando reinician su crecimiento (Reyes-Bonilla et al., 2002). Desde el punto de vista de los efectos causados por las actividades humanas, el principal problema que sufren los arrecifes de coral del Pacífico Oriental es el exceso de sedimento que llega a sus aguas, material que resulta de la deforestación y de las malas prácticas agrícolas y también acarrea pesticidas y nutrientes, produciendo eutroficación en la zona costera (Reyes-Bonilla et al., 2002). Según Schuhmacher (1978) los arrecifes coralinos del Pacífico Oriental tienen poca importancia, dadas sus reducidas dimensiones, y la mayoría de los arrecifes son exclusivamente costeros. El hecho de que se formen arrecifes es posible gracias a la desviación de las frías corrientes marinas (corrientes de California y Humboldt). No obstante, según la dirección del viento puede producirse de forma súbita e irregular una ascensión del agua profunda y fría, con lo cual el agua superficial puede descender repentinamente de 25 °C a 15 °C. Es éste un fenómeno esencial que impide la formación de grandes arrecifes. De manera general, se coincidía en afirmar que en la costa mexicana había pocas especies (menos de 15) y que no existían verdaderos arrecifes (Anónimo,

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1988, citado en Reyes-Bonilla y López-Pérez, 1998). Sin embargo, estudios más recientes y detallados muestran que se había subestimado de manera importante el número de formaciones coralinas, la riqueza de especies y la complejidad de esos sistemas biológicos (Brusca y Thomson, 1975; Reyes-Bonilla, 1993, en ReyesBonilla y López-Pérez, 1998). En el caso particular de los sistemas coralinos del estado de Colima, estas comunidades han presentado diversos eventos de blanqueamiento, los cuales no han sido estudiados en forma sistematizada, destacando únicamente un estudio realizado por Liñán-Cabello et al. (en prensa), en el arrecife la Boquita (Manzanillo, Col., Méx.), quienes reportan para el verano del 2004 niveles de blanqueamiento del 12% en las poblaciones de P. capitata, fenómeno asociado principalmente a la influencia térmica de la laguna Juluapan y al estrés lumínico propio de la escasa profundidad.

Sin embargo, estos singulares ecosistemas, al igual que otros

identificados sobre las costas del Pacifico, son puntos de interés para diversas especies de naturaleza endémica, además de ser un importante recurso económico, cultural y nutricional para la comunidad local. Sin embargo, su explotación no sustentable y la destrucción continua del litoral entre otras causas amenazan con acabar con la futura disponibilidad de dicho recurso. Por ello es necesario realizar estudios que consideren aspectos estructurales,

funcionales, y celulares de tan

importantes ecosistemas que permitan hacer un uso racional y adecuado del mismo.

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III OBJETIVOS III.1. Objetivo general Caracterizar diversas relaciones entre marcadores de daño oxidativo e indicadores de las tasas fotosintéticas respecto al estrés termal del coral hermatípico Pocillopora capitata.

III.2. Objetivos específicos  Determinar in vitro cambios asociados al estrés termal en las concentraciones de clorofila a y pigmentos carotenoides en el coral hermatípico P. capitata.  Evaluar in vitro el efecto del estrés termal sobre la densidad de zooxantelas endosimbióticas presentes en el tejido del coral P. capitata.  Valorar in vitro el nivel de daño oxidativo en respuesta al estrés termal en el coral hermatípico P. capitata.

III.3. Hipótesis Poblaciones del coral hermatípico Pocillopora capitata colectadas del mismo sitio y con distintos umbrales de decoloración pigmental, presentan diferentes respuestas al incremento de la temperatura. Corales pálidos o con blanqueamiento parcial, previamente expuestos a variaciones cercanas entre 22 - 28 °C, exhiben signos de ajuste metabólico hasta a este rango, sin embargo, un régimen termal de mayor temperatura a corto tiempo, disminuye la capacidad de estas poblaciones para ajustarse a tales cambios, de la misma forma que lo hacen las poblaciones con pigmentación normal, las cuales exhiben un mayor aprovisionamiento bioquímico que les permiten tolerar cambios termales de corto plazo.

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IV. MATERIALES Y MÉTODOS IV.1. Sitio de estudio y colecta de muestras Las muestras de coral Pocillopora capitata fueron obtenidas de un arrecife ubicado dentro de la bahía de Santiago (La Boquita) en Manzanillo, Col., Méx., donde los parches de coral cubren un área de 3,876.2 m 2 a profundidades de 0.5 a 3.5 m. A su vez, cerca del extremo noroeste de éste arrecife se localiza una estructura artificial de intercomunicación con la laguna de Juluapan (Fig. 1). Se colectaron muestras en varios sitios a profundidades menores de 1 m. En cada sitio, se obtuvieron muestras del coral dominante con apariencia normal (N) y aquellas que mostraban blanqueamiento parcial a lo largo de sus ramas (P). Las muestras control (C y CC) correspondieron a corales de parches no influenciados por los cambios termales de la laguna, localizados a 350 m al sureste del área de intercomunicación, colectados a la misma profundidad y sin daño aparente con respecto al blanqueamiento. Todos los fragmentos de coral recolectados fueron transportados al laboratorio en contenedores plásticos de 10 L en agua de mar a temperatura ambiente.

Laguna Juluapan

Bahía de Santiago

Sitio de estudio

Océano Pacífico

Figura 3. Ubicación del sitio de estudio y la zona de colecta dentro de la Bahía de Santiago en Manzanillo, Colima, México.

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IV.2. Diseño experimental Las muestras de coral correspondientes a N, P y C fueron mantenidas por duplicado en unidades de cultivo que contenían 1 litro de agua de mar previamente filtrada y esterilizada, con aereación constante, luz artificial (210 µmol m-2 s-1) y una temperatura base de 22 ºC (conforme a la temperatura del agua de mar en los sitios de muestreo durante la colecta). Las unidades de cultivo fueron puestas en un acuario de vidrio (60 X 38 X 40 cm) lleno hasta a la mitad de su capacidad con agua; la temperatura fue externamente controlada por dos calentadores sumergibles de 3000 Watts, y homogeneizada por medio de una bomba sumergible (Aquatic Ecosystem, 24 W). El gradiente de temperatura fue establecido por el incremento continuo de la temperatura base a una tasa de 1.0 °C h-1 por 10 h. Dos fragmentos de cada muestra de coral o tratamiento con su respectiva réplica fueron colectados cada dos h, a las temperaturas de 22, 24, 26, 28, 30 y 32 ºC. Paralelamente se corrió un experimento control (CC) que consistió de muestras de coral mantenidas a 22 ºC por 10 h, con fragmentos tomados al inicio y al final del período experimental. Cada uno de los fragmentos muestreados fueron envueltos en papel aluminio y preservados a -70 ºC hasta los análisis posteriores. Colecta fragmentos de coral en zona de estudio (Bahía de Santiago)

Realización bioensayo (10 h)

Obtención muestras de coral para Análisis de laboratorio

Pigmentos fotosintéticos

Densidad zooxantelar

Niveles de MDA Actividad de la SOD

Figura 4. Diagrama de flujo que representa en forma general la metodología realizada en el presente estudio a fin de caracterizar en el coral Pocillopora capitata biomarcadores de daño oxidativo e indicadores de las tasas fotosintéticas. MDA—malondialdehído, un producto de la peroxidación lipídica; SOD—superóxido dismutasa.

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IV.3. Determinación del contenido de clorofila a (Cl a) El tejido del coral fue removido del esqueleto utilizando aire comprimido, en una modificación del método WaterPikTM (Johannes y Wiebe, 1970). El tejido resultante fue homogeneizado con un macerador por 30 segundos en agua de mar filtrada y aforado a un volumen de 100 ml. De éste homogeneizado se tomaron alícuotas para los análisis de Cl a, PC y densidad de zooxantelas endosimbióticas. Para la determinación del contenido de Cl a, 10 ml del homogeneizado fueron mezclados con 0.1 g de MgCO3 y centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos (n = 3 duplicados). El sobrenadante fue descartado y el pelet algal resuspendido con 10 ml de acetona al 100% grado reactivo, cubiertas con papel aluminio e incubadas para la extracción del pigmento a 2 ºC por 24 h. Las muestras fueron entonces centrifugadas una vez más a 3000 rpm por 10 minutos, y las absorbancias del sobrenadante determinadas a 630, 647 y 664 nm, utilizando un espectrofotómetro Genesys 5 (Spectronic Instruments, Rochester, New York, USA). Las concentraciones de Cl a (g cm-2) para cada tratamiento fueron calculadas utilizando las ecuaciones de Parsons et al. (1984) y corrigiendo después el volumen del homogenizado y el área de superficie de los fragmentos de coral. [Cl-A] = (11.85A664) – (1.54A647) – (0.08A630) Donde: [Cl-A] = concentración de clorofila a, en g ml-1 11.85, 1.54 y 0.08 = constantes A664 = coeficiente de extinción a 664 nm A647 = coeficiente de extinción a 647 nm A630 = coeficiente de extinción a 630 nm El valor de [Cl-A] se sustituyó en la siguiente fórmula: Cl a = ([Cl-A] * vol)/ A Donde: Cl a = concentración del pigmento en g cm-2 vol = volumen total obtenido del blastato u homogeneizado

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A = área ocupada por tejido vivo en el esqueleto del coral (cm 2) Aunado a éste cálculo, también se determinó la concentración de Cl a por zooxantela utilizando la siguiente fórmula: Cl a_Z = [Cl-A]/(cont /0.0001) Donde: Cl a_Z = concentración del pigmento por zooxantela en g zoox-1 [Cl-A] = concentración de clorofila-a, en g ml-1 cont = conteo de zooxantelas para cada alícuota en el hematocitómetro

IV.4. Pigmentos carotenoides (PC) Los pigmentos carotenoides fueron determinados bajo condiciones de penumbra, de acuerdo a la técnica propuesta por Sommer et al. (1992). Así, 10 ml del homogeneizado fueron centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos (n = 3 duplicados). El sobrenadante fue descartado y el pelet algal resuspendido con 10 ml de cloroformo al 100% grado reactivo, cubierto con papel aluminio e incubado para la extracción de los pigmentos a 2 ºC por 24 h. Cada muestra fue nuevamente centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos, y la absorbancia del sobrenadante se determinó a 440 nm usando un espectrofotómetro Genesys 5. Las concentraciones de PC (g cm-2) se obtuvieron utilizando el respectivo coeficiente de extinción molar del pigmento peridinina, que representa entre el 60 y 70% de los pigmentos totales encontrados en la zooxantela del coral (Borneman 2001), y corrigiendo después el volumen del homogeneizado y el área de superficie de los fragmentos de coral.

X Donde

( ABS * ml *1000) K *100

X = concentración de PC en g ml-1 ABS = valor de absorbancia obtenido en la lectura de la muestra a 440 nm ml = mililitros de solvente utilizados para la extracción K = coeficiente de extinción molar (1332 para la peridinina) 1000 y 100 = constantes

19

El valor de X se sustituyó en la siguiente fórmula: PC = (X * vol)/ A Donde: PC = concentración de pigmentos en g cm-2 vol = volumen total obtenido del blastato u homogeneizado A = área ocupada por tejido vivo en el esqueleto del coral (cm 2)

Para determinar la concentración de PC por zooxantela se utilizó la siguiente fórmula: PC_Z = (X)/(cont /0.0001) Donde: PC_Z = concentración de PC por zooxantela en g zoox-1 (X) = concentración de PC en g ml-1 cont = conteo de zooxantelas para cada alícuota en el hematocitómetro

IV.5. Densidad de zooxantelas endosimbióticas Para evaluar el posible cambio en la densidad zooxantelar a consecuencia del gradiente térmico, 10 ml del homogeneizado fueron preservados con 1 ml de formol al 4% y los dinoflagelados simbióticos fueron contados con un hematocitómetro o cámara Neubauer (n = 8 duplicados). Después

de hacer las correcciones del

volumen y de estimar la superficie de área del coral, la densidad de los dinoflagelados simbióticos fue expresada por unidad de área.

Donde:

 cont * vol    0.0001   DZ  A

DZ = densidad zooxantelar por unidad de área (céls cm-2) cont = conteo de zooxantelas para cada alícuota en el hematocitómetro vol = volumen total obtenido del blastato u homogeneizado, en mililitros 0.0001 = volumen conocido del hematocitómetro en mililitros A = área ocupada por el tejido vivo en el esqueleto en cm 2

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IV.6. Zooxantelas expulsadas Para calcular los cambios en la expulsión zooxantelar en respuesta al incremento de temperatura, 10 ml del agua circundante fueron tomados de cada unidad experimental a intervalos de dos horas a las temperaturas 22, 24, 26, 28, 30 y 32 °C. Las alícuotas fueron fijadas con formol al 4% grado reactivo y las zooxantelas contadas utilizando una cámara Neubauer; los resultados son expresados como células ml-1 (n = 4 duplicados por tratamiento). Céls l-1 = N° céls / S * P * F Donde: Céls l-1 = células por microlitro N° céls = número de células contadas S = superficie recontada en mm2 P = profundidad de la cámara Neubauer en mm F = factor de dilución

IV.7. Determinación de la superficie de área del coral La superficie de área del coral, ocupado por el tejido vivo, fue calculada midiendo el diámetro y la altura máxima de cada fragmento de coral con un vernier y considerando su forma como la de un cilindro, según la siguiente fórmula: A = 2r2+2rh Donde: A= área del coral en cm-2 r = radio de la rama de coral h = altura de la rama de coral

IV.8. Marcadores moleculares de estrés oxidativo Para este estudio en particular se utilizaron métodos indirectos como marcadores de daño oxidativo y actividad enzimática en las muestras de coral. Antes de realizar dichos ensayos moleculares se debe llevar a cabo la obtención del

21

extracto crudo en el tejido del coral y a partir de éste realizar las determinaciones correspondientes.

IV.8.1. Obtención del extracto crudo en el tejido del coral El método aplicado para la obtención del extracto crudo fue una adaptación de lo descrito anteriormente por Downs et al. 2002 y Richier et al. 2003. A los fragmentos coralinos previamente congelados se les removió el tejido utilizando el método descrito anteriormente del aire comprimido. El tejido resultante se disolvió en nueve volúmenes de un buffer de extracción (buffer de fosfatos 20mM, pH 7.4, EDTA 1 mM y Tritón X-100 al 0.1%), el extracto crudo fue sonicado (6X10 seg) y centrifugado a 6000 rpm por cinco minutos, almacenando el sobrenadante a -80 °C en una ultracongeladora (ScientemTM, mod. 85-3.1). A partir de este extracto crudo se determinaron los niveles de proteínas por medio del Kit Protein Assay ESL (Cat. No. 1767283 ROCHE), según lo descrito anteriormente por Matsushita et al., (1993); los niveles de malondialdehído (MDA) y la actividad de la SOD en las muestras de cada tratamiento.

IV.8.2. Lipoperoxidación (MDA) Los niveles de malondialdehído (MDA), un producto de la lipoperoxidación, fueron evaluados por la reacción del ácido tiobarbitúrico (TBA) a 535 nm (Buege y Aust, 1978). Muestras de 1 ml (n = 3 duplicados) fueron mezcladas con 2 ml de una solución que contenía 15% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA), 0.375% (p/v) de ácido tiobarbitúrico (TBA) y ácido clorhídrico (HCl) al 0.25 N, e incubadas a 90 ºC por 20 minutos a baño maría. Posteriormente las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente, y se centrifugaron por 20 minutos a 3000 rpm. Después de la centrifugación, el sobrenadante fue medido espectrofotométricamente a 535 nm contra un blanco compuesto de 2 ml de la mezcla TBA/TCA/HCl y 1 ml del buffer de extracción. Los resultados se expresan en M de MDA por gramo de proteína, según la siguiente fórmula:

22

C=A/P Donde: C = Concentración de MDA (Mol l-1) A = Absorbancia de la muestra  = coeficiente de extinción de 1.56 X 105 Mol l-1 cm-1 (Rossell, 1989) P = Grosor de la fotocelda

IV.8.3. Superóxido dismutasa (SOD) La SOD se determinó utilizando un kit disponible comercialmente (SOD-525TM, assay) de Oxis International (Foster city, CA, USA), el cual es un ensayo espectrofotométrico que se basa en el principio de Nebot et al. (1993) sobre la autooxidación activada de un catecol tetracíclico. La actividad de la SOD se expresa en unidades de SOD por miligramo de proteína (U mg-1proteína).

IV.9. Análisis estadístico Los resultados son presentados como las medias  DS. Los datos fueron evaluados por medio de pruebas de normalidad, homocedasticidad e independencia al 95% de confianza. Cuando fue necesario se realizaron transformaciones logarítmicas o arcseno a los datos, convirtiéndolos nuevamente para su presentación. Las diferencias entre los valores medios fueron examinadas por análisis de varianza de una vía (ANDEVA), seguido, cuando era pertinente, por una prueba de comparación múltiple (Tukey). En limitados casos se utilizó estadística no paramétrica (Kruskall-Wallis), y comparaciones simples/parejas fueron empleadas para evaluar las diferencias entre los tratamientos (Sheskin, 1996). Las diferencias fueron reportadas como estadísticamente significativas cuando P < 0.05 (Zar, 1999). Para el procesamiento de los datos se utilizó el software Statistic ver. 6 (Tulsa, Oklahoma, USA).

23

V. RESULTADOS V.1. Pigmentos fotosintéticos Los resultados revelan que las concentraciones de pigmentos fotosintéticos en el coral cambiaron con el incremento de la temperatura, con patrones que difieren en N ó C cuando se comparan con P. En los tratamientos N y C los niveles de pigmentos fotosintéticos fueron significativamente más altos a 28 ºC (N = 8.96±0.36 g cm-2 Cl a y 60.81±6.84 g cm-2 PC; C = 17.4±4.17 g cm-2 Cl a y 116.9±4.04 g cm-2 PC, p = 0.001; Fig. 5A y 5C). En el tratamiento P, los niveles de pigmentos llegaron a su máximo a

26 ºC

(8.64±0.44 g cm-2 Cl a y 46±4.99 g cm-2 PC, p = 0.001), mostrando relativamente bajos niveles de pigmentos a 28 ºC (P = 0.93±0.16 g cm-2 Cl a y 6.14±0.76 g cm-2 PC, p = 0.001; Fig. 5B), indicando que P no presentó la misma capacidad de respuesta fotosintética a los 28 ºC con respecto a lo observado en los tratamientos N y C. En el tratamiento C, dos picos máximos fueron observados en los niveles de PC, uno a 24 ºC (81.7±3.27 g cm-2, p = 0.001) y el otro a 28 ºC (116.9±4.04 g cm-2 p = 0.001; Fig. 5C), mientras que un solo pico fue observado a 28 ºC para la Cl a (17.4±4.17 g cm-2, p = 0.001). Aunado a la determinación de pigmentos fotosintéticos, se cálculo la tasa PC/Cl a en cada tratamiento para ser utilizado como un indicador sensitivo de daño fotooxidativo, en donde tasas altas significan una disminución de Cl a y tasas bajas un menor contenido de PC. Como se muestra en la figura 5A, 5B y 5C, la tasa PC/Cl a para muestras N tendió a incrementar con el aumento de la temperatura desde los 26 hasta los 30 ºC, y disminuyó en 24 y 32 ºC. Para el tratamiento P, la tasa permaneció relativamente alta a 24, 28 y 30 ºC, con la disminución de ésta a 26 y 32 ºC. Mientas que el tratamiento C presentó solo un máximo a 28 ºC, mostrando en general tasas bajas. Sin embargo, las tendencias presentadas en cada uno de estos tratamientos no reflejaron diferencias estadísticas (p > 0.05).

24

Cl a PC Radio

pigmentos fotosintéticos (  g cm -2)

140 120

10

Radio (PC/Cl a )

A

8

100 80

6

c

60

a

a

4

40 20

d b

a b

0 22

c

a

d

2

a

d

0 24

26

28

30

32

CC

Temperatura ( °C )

Cl a PC Radio

140 120

10 Radio (PC/Cl a )

Pigmentos fotosintéticos (  g cm -2)

B

8

100 6

80 c

60 40 20

4

b a a

b c

b

d

0 22

24

a

d

b

26

2

a

0

28

30

32

CC

Temperatura (°C )

C

Pigmentos fotosintéticos (  g cm -2)

d

120

10 8

100

b

80

6

a a

60

c

4

c

40 20

a

b

c

b

a

Radio (PC/Cl a )

Cl a PC Radio

140

2

a

0

0 22

24

26

28

30

32

CC

Temperatura (°C)

Figura 5. Concentraciones promedio de pigmentos fotosintéticos y la tasa (PC/Cl a) en corales expuestos al incremento de temperatura. A) tratamiento N; B) tratamiento P; C) tratamiento C; CC) coral control no expuesto al cambio de temperatura. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 3); con letras distintas se denotan diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a la prueba de Tukey.

25

V.2. Densidad y expulsión de zooxantelas endosimbióticas La densidad zooxantelar registrada respecto al incremento de temperatura y a partir de los 28 ºC (los valores anteriores se excluyeron debido a que mostraron inconsistencias), es presentada en la figura 6. La densidad simbiótica fue significativamente más baja en todos los tratamientos expuestos a 32 °C (N = 0.3±0.05X106 céls cm-2; P = 0.4±0.07 X106 céls cm-2; C = 1.9±0.13 X106 céls cm-2, p = 0.0001). Al analizar las pendientes de los tratamientos, fue posible reconocer que C presentó una respuesta relativamente menor al gradiente termal, mientras que el tratamiento P fue sustancialmente el más afectado (Fig. 6). Por su parte el tratamiento CC, no expuesto al aumento de temperatura, presentó una densidad promedio de 0.4±0.07X106 céls cm-2 (p > 0.05).

Densidad zooxantelar ( x10 6 céls cm -2 )

5

N a

P

b

C

4 a

CC

3 c

2 1

a

b b

0 28

30

c c

32

Temperatura (°C)

Figura 6.

Densidad promedio de zooxantelas endosimbióticas en corales de todos los tratamientos expuestos al incremento de temperatura. CC―coral control no expuesto al cambio de temperatura. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 8); con letras distintas se denotan diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a comparaciones simples/parejas.

La liberación o expulsión de zooxantelas incrementó exponencialmente con el aumento de la temperatura. Las muestras de P presentaron el mayor nivel de expulsión zooxantelar después de los 28 ºC, alcanzando valores significativos a 32 ºC (92.5±15.2X103 céls ml-1, p = 0.0005), mientras que los tratamientos N y C incrementaron la tasa de liberación después de los 30 ºC, exhibiendo valores 26

máximos de expulsión a 32

ºC (N = 7.2±1.2X103 céls ml-1, p = 0.0028; y

C = 20±2.7X103 céls ml-1, p = 0.0005). Las muestras de CC (datos no presentados debido a su menor escala respecto a los demás) no exhibieron cambios significativos en relación a las zooxantelas liberadas (0.63±0X103 céls ml-1, p > 0.05), sin embargo, su tendencia general concuerda con lo observado en los tratamientos N, P y C (Fig. 7).

Zooxantelas expulsadas (x10 3 céls ml -1)

120

N

100

P

80

C

*

60 40 20

*

0 22

24

26

28

30

* * 32

Temperatura (°C)

Figura 7. Valores promedio de zooxantelas expulsadas en corales de todos los tratamientos expuestos al incremento de temperatura. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (n = 4). El asterisco indica una diferencia significativa (ANDEVA) a P < 0.05 de acuerdo a comparaciones simples/parejas.

V.3. Pigmentos fotosintéticos por zooxantela Las concentraciones promedio de Cl a y de PC por zooxantela endosimbiótica (Cl a_Z y PC_Z respectivamente) se muestran a partir de los 28 ºC en la figura 8A, 8B y 8C (los valores anteriores se excluyeron debido a que mostraron inconsistencias). En los tratamientos N y P (Fig. 8A y 8B) los pigmentos fotosintéticos tienden a incrementar con el aumento de temperatura hasta alcanzar máximos significativos a 32 ºC (N = 19.8±3.2 g cél-1X10-6 Cl a_Z, p = 0.0001 y 93.4±15 g cél-1X10-6 PC_Z, p = 0.0001; P = 9.7±1.8 g cél-1X10-6 Cl a_Z, p = 0.0001 y 56±10 g cél-1X10-6 PC_Z, p = 0.0002).

27

A

PC_Z c

-6

x10 )

120 90

-1

( g cél

Pigmentos fotosintéticos

Cl a_Z

60 b a

30

b

a

a

0 28

30

32

CC

Temperatura (°C) Cl a_Z PC_Z 120 -6

(  g cél x10 )

90 c

-1

Pigmentos fotosintéticos

B

60

b a

30

a

b

c

0 28

30

32

CC

Temperatura (°C)

C

PC_Z

120 90

-1

-6

(  g cél x10 )

Pigmentos fotosintéticos

Cl a_Z

60 a

30 a

c

b a

b

0 28

30

32

CC

Temperatura (°C)

Figura 8. Concentraciones promedio de pigmentos fotosintéticos por zooxantela en corales de todos los tratamientos expuestos al incremento de temperatura. CC―coral control no expuesto al cambio de temperatura. A) tratamiento N; B) tratamiento P; C) tratamiento C. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 8); con letras distintas se denotan diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a la prueba de Tukey.

d

d

b 28

El comportamiento del tratamiento C fue relativamente diferente, exhibiendo en general bajas concentraciones de pigmentos fotosintéticos, concretamente a 30 ºC (3.3±0.15 g cél-1X10-6 Cl a_Z, p = 0.0006 y 15.8±0.70g cél-1X10-6 PC_Z; p = 0.0001; Fig. 8C). Particularmente, las concentraciones promedio de CC (5.3±0.76g cél-1X 10-6 Cl a_Z, p = 0.011 y 44±6.6g cél-1X10-6 PC_Z, p = 0.044) superan a las exhibidas por el tratamiento C durante el gradiente termal (28 - 32 ºC), recordando que CC no fue expuesto al aumento de temperatura.

V.4 Marcadores de estrés oxidativo V.4.1 Lipoperoxidación (MDA) Las concentraciones de MDA para cada temperatura dentro del gradiente térmico se presentan en la figura 9 y en la tabla 1. No se observaron diferencias significativas (P < 0.05) en las concentraciones de MDA entre los grupos de tratamientos; sin embargo, concentraciones relativamente altas de este indicador fueron observadas a los 22 ºC en los tres grupos (N, P y d C).

d

El tratamiento N mostró dos picos de mayor daño, el primero a 24 ºC (2.7 M g-1 proteína, p = 0.001) y el segundo a 28 ºC (2.2 M g-1 proteína, p = 0.001); sin embargo, al final del gradiente térmico disminuyó el contenido de MDA en este tratamiento. Las concentraciones de MDA en el tratamiento P fueron las más altas a 22 ºC (2.4 M g-1 proteína, p = 0.001) y 32 ºC (2.5 M g-1 proteína, p = 0.001) y relativamente bajas a las otras temperaturas de prueba. El tratamiento C, por su parte, reflejó un comportamiento similar al tratamiento N, con picos máximos a 22 ºC y 28 ºC (2.2 M g-1 proteína, p = 0.001) y 28 ºC (2.2 M g-1 proteína, p = 0.001) así como el decremento de MDA al final del experimento. Así, mientras que los tratamientos N y C exhibieron el mayor daño celular desde los 22 hasta los 28 ºC, P presentó un comportamiento contrario, con las

29

menores concentraciones de MDA a las mismas temperaturas, a excepción de los 22 ºC. Finalmente después de 30 ºC se invierte la tendencia señalada anteriormente, en donde P terminó con mayor contenido de MDA y, por ende, N y C exhibieron un menor daño celular (Fig. 9). Por otro lado, la figura 9 muestra también que el tratamiento no expuesto al gradiente térmico (CC) registró una concentración relativamente baja de MDA (1.9 M g-1 proteína, p = 0.0007). N P Malondialdehído (  M MDA g -1 proteína )

4

C CC

2

0 22

24

26

28

30

32

Temperatura (°C)

Figura 9. Daño celular (MDA) en corales de cada tratamiento expuestos al incremento gradual de temperatura. CC―coral control no expuesto al gradiente de temperatura. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 3).

Tabla 1. Daño celular (M MDA g-1 proteína) para cada grupo a cada temperatura. Los resultados se presentan como media  desviación estándar (n = 3); con letras distintas se indican diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a la prueba de Tukey.

Temperatura (ºC) 22 24 26 28 30 32

N

P

C

2.1  .11a 2.7  .27b 1.4  .01c 2.2  .04a 1.1  .06c 1.5  0.18c

2.4  .07a 1.7  .08b 0.9  .01c 1.0  .05c 1.9  .09b 2.5  .04a

2.2  .09a 1.6 .21b 1.7  .04b 2.2  .04a 1.5  .01b 1.9  .03ab

30

V.4.2 Superóxido dismutasa (SOD) La actividad de la SOD en corales de los distintos tratamientos se muestra en la figura 10 y tabla 2. Al igual que en los valores de MDA, tampoco se observaron diferencias significativas entre los grupos de tratamientos (P < 0.05); sin embargo, las muestras del tratamiento N presentaron las máximas concentraciones de SOD desde los 26 hasta los 30 ºC. La mayor actividad de esta enzima fue observada en P, el cual mostró una tendencia a incrementar los niveles de SOD desde los 22 ºC hasta un máximo alcanzado a los 28 ºC (8.3 U mg-1 proteína, p = 0.0004), y al final desciende a un valor mínimo en 32 ºC (4.8 U mg-1 proteína, p = 0.0004). N P C CC

Actividad SOD ( U mg-1 proteína )

10 8 6 4 2 0 22

24

26

28

30

32

Temperatura (°C) Figura 10. Actividad de la SOD en corales de todos los tratamientos expuestos al incremento gradual de temperatura. CC―coral control no expuesto al gradiente de temperatura. Los datos representan las medias  desviación estándar (n = 3).

El tratamiento C únicamente exhibió dos puntos de mayor actividad, el primero a 26 ºC (6.2 U mg-1 proteína, p = 0.0004) y el segundo a 32 ºC (6.1 U mg -1 proteína, p = 0.0004). En relación a lo anterior, nuevamente las muestras de P presentaron la mayor actividad de la SOD en la etapa intermedia y hacia el final del experimento (26-30 ºC) respecto a los otros grupos; sin embargo, a la temperatura de 32 ºC también se

31

invierte esta tendencia, en donde N y C terminaron con una mayor actividad enzimática comparadas con P. Para el tratamiento CC, no expuesto al gradiente térmico, se registró una concentración promedio relativamente alta de SOD (6.7 U mg-1 proteína, p = 0.08) (Fig. 10, Tabla 2).

Tabla 2. Actividad de la SOD (U mg-1 de proteína) para cada grupo a cada temperatura. Los datos se presentan como media  desviación estándar (n = 3); con letras distintas se indican diferencias significativas (ANDEVA) entre los respectivos tratamientos a distintas temperaturas a P < 0.05, de acuerdo a la prueba de Tukey.

Temperatura (ºC) 22 24 26 28 30 32

N

P

C

4.1  1.34a 6.3  1.03ab 6.9  1.13ab 6.7  .56ab 7.1  .57ab 6.2  .68ab

3.0  .02a 4.7  .61a 7.2  .0ab 8.3  1.13b 7.2  1.16ab 4.8  .41ab

3.5  .31a 2.9 .77a 6.2  .76ab 5.2  .0ab 5.5  .50ab 6.1  1.75ab

A fin de obtener más elementos que permitieran elucidar la participación de los pigmentos carotenoides como agentes antioxidantes, se realizaron análisis de regresión entre todos los parámetros evaluados en este estudio, En la tabla 4 se muestran los valores de r encontrados para cada combinación en cada tratamiento, dando como resultando que la única regresión significativa (p = 0.01) se encontró entre la relación Cl a y PC en todos los tratamientos. Aunque las demás regresiones no son significativas, se observó que los pigmentos fotosintéticos tienden a relacionarse con los indicadores de estrés oxidativo en todos los tratamientos. Resaltando también los valores de r encontrados para la relación MDA/SOD de los tratamientos N, P y CC.

32

Tabla 3. Coeficientes de regresión encontrados entre las posibles combinaciones de parámetros evaluados en este estudio. CC―coral control no expuesto al gradiente de temperatura. Valores en negritas representan datos significativos (P < 0.05).

Parámetro

N

P

C

CC

Cl a/PC

0.90 0.95

0.90

0.97

MDA/Cl a

0.20 0.33

0.25

0.14

MDA/PC

0.14 0.32

0.03

0.05

SOD/Cl a

0.08 0.08

0.17

0.16

SOD/PC

0.21 0.02

0.32

0.02

MDA/SOD

0.32 0.45

0.05

0.72

33

VI. DISCUSIÓN Debido a la alta transparencia de las aguas tropicales de los océanos, la radiación UV penetra a profundidades que sobrepasan los 20 m (Lesser y Lewis, 1996), estas longitudes de onda provocan efectos perjudiciales sobre la fotosíntesis y el crecimiento de las zooxantelas (Lesser y Shick, 1989) y sobre la sobrevivencia de la epifauna del arrecife de coral (Siebeck, 1988). Para este estudio se examinaron las relaciones entre los PC y la Cl a en los diferentes tratamientos, los resultados revelaron que las concentraciones de carotenoides totales fueron de 5 a 7 veces más altos que los niveles de Cl a. Esta observación difiere de los valores, 0.2 a 0.8, previamente reportados en el coral Aiptasia pallida (Macri y McKagan, 1998). Dicha discrepancia puede ser debida a que los corales utilizados en el presente estudio fueron muestreados de una región que esta expuesta a niveles relativamente altos de radiación solar (Barnes y Chalker, 1990) y cambios continuos de temperatura. Así, estos corales pueden tener una tasa relativamente baja de fotosíntesis con respecto a la concentración de carotenoides, debido al daño fotoquímico causado por los altos niveles de radiación fotosintética disponible (PAR, 400-700 nm) y de radiación ultravioleta (UV, 280-400 nm). A este respecto, Iglesias-Prieto et al. (1992) reportaron que aunque las tasas de saturación de luz de la fotosíntesis disminuyan por arriba de los 30 °C y la fotosíntesis cese completamente a 34-36 °C, la respiración de las células algales indica que éstas no han muerto, sino que perciben y responden a las temperaturas elevadas. De acuerdo a Tan et al. (2000), la clorofila puede ser sintetizada y fotooxidada bajo niveles normales de radiación solar. Sin embargo, bajo condiciones de alta irradiancia, la tasa de degradación de la clorofila excede la tasa de síntesis, llevando al decremento de las concentraciones de clorofila, así, tasas bajas con respecto a los carotenoides, conllevan al aumento de los procesos fotooxidativos (Hendry y Price, 1993). Lo encontrado en este trabajo fue similar a reportes anteriores (Ambarsari et al., 1997) respecto a que la producción de diatoxantina y los niveles totales de xantofilas incrementaron, con respecto a los niveles totales de clorofila, en el alga simbiótica del coral Goniastrea aspera después de la exposición a altos niveles de irradiación durante un evento de blanqueamiento. Cuando Mobley y Gleason (2003)

34

caracterizaron la función protectiva de las xantofilas (diatoxantina) en la zooxantela de la anémona Aiptasia pallida, demostraron que los efectos protectivos contra la fotooxidación y la fotoinhibición, inducida por radiación UV, persisten por más de 20 días después de que la actividad de las xantofilas desaparece. Lo anterior sugiere la importancia de los carotenoides como mecanismo de atenuación contra el estrés causado por alta irradiancia. Las zooxantelas también contienen otras xantofilas como la peridina, neoperidina, diadinoxantina y diatoxantina, los cuales ayudan a disipar el exceso de energía de excitación y protegen al simbionte de la radiación solar (Brown et al., 1999; Brown et al., 2000). Las concentraciones de todos estos pigmentos en el alga simbiótica del coral son el resultado de un mecanismo de fotoaclimatación a largo plazo a cierto rango de intensidades de luz (Lewis, 1995; Jokiel et al., 1997; Dunlap y Shick, 1998), mientras que las respuestas a corto plazo en las fluctuaciones de luz y temperatura son mediadas por las xantofilas (Ambarsari et al., 1997; Brown et al., 1999). Los argumentos anteriores fueron establecidos al observar, a corto tiempo, relaciones inversas entre muestras con menores concentraciones de carotenoides como fuente de xantofilas con respecto a los indicadores de estrés inducido por el aumento de temperatura (Fig. 5, 9 y 10). Los incrementos en las concentraciones de Cl a y PC en los tratamientos N, P y C mostraron valores máximos a temperaturas diferentes (26 - 28 ºC), siendo ésto análogo a reportes previos donde muestras de Goniastrea aspera, obtenidas de áreas expuestas a diferentes niveles de temperatura e irradiancia, mostraron diferencias en tolerancia, con las mayores capacidades adaptativas en poblaciones que exhibían blanqueamiento solar (Brown et al., 2002). Lo encontrado, en conjunto con reportes previos, parece sugerir que poblaciones

regularmente expuestas a

estrés termal tienden a tener tolerancias más altas y mayores habilidades para ajustar su maquinaria fotosintética. En el presente estudio, los fragmentos de coral estuvieron bajo un nivel mínimo de luz durante el transporte al laboratorio, siendo posteriormente expuestas a un incremento de temperatura con luz constante durante todo el gradiente térmico (46 W m-2). Así, se observó un incremento en las concentraciones de pigmentos fotosintéticos con la inducción de la temperatura, siendo este efecto más 35

pronunciado en las muestras del tratamiento C, por su parte, el tratamiento N presentó la menor variación en las tasas PC/Cl a, lo cual podría indicar un nivel relativamente bajo de daño fotooxidativo (Hendry y Price, 1993; Gonçalves et al., 2001). Estas observaciones sugieren colectivamente que los tratamientos C y N fueron más termotolerantes que el tratamiento P. Los incrementos en las concentraciones de PC y Cl a de los tratamientos N y C a temperaturas próximas a los 28 ºC, podrían estar asociados a que este rango, fisiológicamente representa un límite en el mantenimiento y bienestar de diversas especies de coral (Borneman 2001). Al respecto Iglesias-Prieto et al., (1992) reportan que el incremento observado en las concentraciones fotosintéticas entre los 20 y 30 °C puede ser explicado por el aumento de la actividad enzimática dentro del ciclo reductivo de la pentosa (ciclo de Calvin), y que los valores de Q10 para la fotosíntesis son similares entre algas y plantas bajo el mismo rango de temperaturas (Iglesias-Prieto, 1992). Esto a su vez podría explicar porque el tratamiento CC mostró valores bajos en las concentraciones de pigmentos fotosintéticos, debido posiblemente a que la maquinaria fotosintética de la zooxantela no fue activada con el incremento de la temperatura, ya que éste tratamiento permaneció a una temperatura constante (22 ºC) durante todo el período del experimento. Se ha sugerido que el estrés oxidativo puede ser un factor que determine el blanqueamiento coralino, los cambios a nivel celular y bioquímico son usualmente la primera respuesta detectable ante una perturbación medioambiental y pueden ser observados antes de que los signos físicos del blanqueamiento sean evidentes (Bierkens, 2000). Este fenómeno está caracterizado por la eliminación total o parcial de las zooxantelas. Para examinar el comportamiento de la relación cnidariozooxantela durante un gradiente experimental de temperatura, se monitoreó la densidad simbiótica en los corales expuestos al gradiente térmico. Los resultados revelaron que los corales N y C fueron menos susceptibles al estrés térmico que el tratamiento P, en términos de densidad y expulsión zooxantelar (Fig. 6 y 7). De acuerdo a Jokiel y Coles (1990), una rápida y catastrófica pérdida de zooxantelas puede ser inducida por distintos factores externos e internos, incluyendo la elevación de temperatura; así, cambios en la densidad simbiótica afectan el estado fisiológico

36

de la colonia del coral, donde la baja densidad de zooxantelas puede traducirse en una reducida capacidad fotosintética (Clayton y Lasker, 1984), y la reducción en esta capacidad, la pérdida de dinoflagelados, y los cambios en la concentración de pigmentos fotosintéticos, asociados con la degradación de la Cl a, pueden ser parcialmente debidos a la presencia de formas activas de oxígeno (O ) (Saxby et al., 2

2003). Lo anterior se confirmó al observar, particularmente en el tratamiento P, los niveles más bajos de pigmentos fotosintéticos después de 30 ºC, lo cual puede ser debido a la menor densidad simbiótica exhibida dentro del mismo rango de temperatura. Los mecanismos involucrados en la disminución de la densidad zooxantelar no están del todo entendidos y las discusiones en torno a esta incógnita fisiológica se han centrado en dos mecanismos principales; la exocitosis de la zooxantela en las células gastrodermales o el deterioro de las células gastrodermales con sus zooxantelas (Gates et al., 1992). Sin embargo, es probable que el mecanismo de degradación dependa de la intensidad y duración del estrés, así como de la especie de hospedero. Por otro lado, la pérdida de zooxantelas puede ocurrir sin un decremento en las concentraciones de pigmentos fotosintéticos por zooxantela (Fitt y Warner, 1995; Jones, 1997, Saxby et al. 2003). Lo encontrado en el presente estudio respecto al contenido de Cl a_Z y PC_Z, contrasta con trabajos que han reportado dicho decremento en corales blanqueados (Hoegh-Guldberg y Smith1989; Jokiel y Coles 1990; Kleppel et al., 1989; Porter et al., 1989; Fang et al., 1995). Así, la pérdida de pigmentos puede ser consecuentemente un efecto transitorio o secundario que resulte de la exposición, a largo plazo, a temperaturas y luz elevadas (HoeghGuldberg y Smith, 1989; Jones, 1997). Aunado a lo anterior, según Saxby et al. (2003), existen cuatro posibles causas que pueden incrementar tanto el contenido total de clorofila como el contenido de clorofila por dinoflagelado: 1) efectos que confunden a los productos de degradación de la clorofila; 2) un mecanismo de pérdida de simbiontes; 3) el estatus nutricional del dinoflagelado; y 4) el efecto sobre las reacciones enzimáticas. De este

37

modo, tanto el tiempo de exposición al efecto de la temperatura así como los mecanismos mencionados anteriormente podrían ser la posible causa que explique el incremento de los pigmentos fotosintéticos por zooxantelas endosimbióticas. En los tres tratamientos (N, P y C), la concentración de pigmentos fotosintéticos tendió a disminuir a temperaturas por arriba de los 30 °C. Similarmente, algas expuestas a las mismas temperaturas muestran un decline en su capacidad fotosintética en asociación con altos niveles de daño lipídico en la membrana tilacoidal (Iglesias-Prieto et al., 1992), conduciendo a disturbios en el flujo de electrones durante la fase oscura de la fotosíntesis que ocasionan la producción de EROs y a un eventual daño en el PSII (Jones, 1997; Hoegh-Guldberg y Jones, 1999;). En corales, las EROs pueden ser igualmente generadas a través de reacciones enzimáticas en el tejido del coral (Dykens y Shick, 1982, 1984; Dykens, 1984; Dykens et al., 1992), o pueden originarse de reacciones fotosintéticas u otras reacciones oxidativas dentro de las algas y ser liberadas al tejido del coral (Lesser y Shick, 1989; Lesser et al., 1990). El aumento de la temperatura y la liberación de EROs pueden provocar cambios en las membranas de los tilacoides y alterar el equilibrio fotoquímico (Asada y Takahashi, 1987; Ludlow, 1987). Las EROs pueden reaccionar con los lípidos de las membranas, provocando daños en las mismas e induciendo la peroxidación de lípidos; así, los incrementos en los niveles de peroxidación lipídica se pueden utilizar como un marcador de daño en la membrana celular inducido por EROs. Además, los niveles de las EROs, de los antioxidantes y las peroxidasas pueden ser medidos para evaluar el estrés oxidativo dentro de un organismo (Griffin, 2005). Recientemente, Tchernovt et al. (2004) han sugerido que la composición lipídica de la membrana tilacoidal de las zooxantelas determina su susceptibilidad al blanqueamiento. Los niveles de MDA (como un indicador de peroxidación lipídica), en los diferentes tratamientos de coral (N, P y C) expuestos al gradiente experimental de temperatura, mostraron valores máximos al inicio del gradiente (22 °C), mientras que N y C exhibieron un segundo pico a 28 °C; lo primero podría ser el reflejo de una mayor actividad fotosintética a la temperatura inicial mientras que lo último podría corresponder a una mayor abundancia de EROs derivados del daño al PSII 38

(Tabla 1, Fig. 5A, 5B, 5C), (Mathis y Kleo, 1973; Havaux, 1993; Heckathorn et al., 1997). En temperaturas mayores a 30 °C, los valores de P fueron más altos que los mostrados por N y C, indicando quizá la acumulación progresiva de hidroxiperóxidos debido a la carencia de pigmentos carotenoides observada (Fig. 5B). Así, es posible que valores altos de MDA en las muestras P, expuestas a temperaturas mayores a 30 °C, reflejen no solamente el daño lipídico de las zooxantelas, sino también la subsecuente difusión de EROs hacia las células del cnidario. Estudios previos han demostrado que los carotenoides pueden proteger al fotosistema en cuatro formas diferentes: 1) reaccionando con los productos de la lipoperoxidación y terminando con la cadena de reacciones peroxidativas (Burton y Ingold, 1984); 2) eliminando al oxígeno singlete y disipando la energía como calor (Mathis y Kleo, 1973); 3) reaccionando con moléculas excitadas o tripletes de clorofila para prevenir la formación del oxígeno singlete; o 4) por la disipación del exceso de energía de excitación a través del ciclo de las xantofilas (Brown et al., 2002). Con base a estos reportes, se considera que estos compuestos, además de mantener el balance fotosintético de las zooxantelas, representan una herramienta molecular contra el blanqueamiento, regulando la propagación de los prooxidantes de las zooxantelas hacia el coral. Para explorar la función de la SOD como componente esencial de la defensa biológica contra la toxicidad del oxígeno, se examinó su nivel de actividad en los diferentes corales expuestos al gradiente experimental de temperatura y se encontró que la actividad incrementó con el aumento de la temperatura, alcanzando la máximo actividad en 30-32 °C para corales N y C, presentando los niveles más altos el tratamiento P a 28 °C. Lo anterior coincide con estudios preliminares que muestran que el estrés termal incrementa la actividad de la SOD (Lesser, 2004), y un segundo estudio reporta que niveles altos de SOD fueron observados en muestras del coral Stylophora pistillata expuestas a 33 °C por seis horas (Yakovleva et al., 2004). En el presente estudio, el pico observado en la actividad de esta enzima en el tratamiento P a 28 °C, podría estar relacionado al hecho de que la expulsión de zooxantelas fue más pronunciada en estas mismas condiciones (Tabla 2, Fig. 7). La combinación de estas observaciones, sugiere que en dichas muestras, las pocas algas que 39

estuvieron disponibles incrementaron la producción de la SOD cuando el gradiente de temperatura aumentó hasta los 28 °C, sin embargo, por arriba de los 30 °C la concentración de la SOD disminuye en virtud de una menor abundancia de algas. Los niveles generalmente bajos

en la actividad de la SOD para los

tratamientos N y C probablemente reflejen también

su mayor contenido de

carotenoides (Tabla 2, Fig. 5A, 5C), lo cual puede estar asociado a un mayor potencial antioxidante y una mayor protección contra el blanqueamiento. Estudios anteriores han mostrado que diversas especies de coral, e incluso individuos de una misma especie, tienen diferentes umbrales de temperatura para la inducción al blanqueamiento (Hueerkamp et al., 2001; Glynn et al., 2001). Por ejemplo, Platygyra ryukyuensis es menos sensible al estrés oxidativo que Stylophora pistillata (Yakovleva et al., 2004; Bhagooli y Hidaka, 2004), así, altas temperaturas reducen el umbral de fotoinhibición

de manera diferente en estos mismos corales, con

diferentes susceptibilidades al blanqueamiento bajo estrés termal (Bhagooli y Hidaka, 2004). Estas variaciones podrían estar relacionadas con diferencias en los mecanismos celulares antioxidantes los cuales también pueden formar las bases para la aclimatación. Beckman y Ames (1998) hipotetizan que exposiciones crónicas o repetidas a estrés oxidativo pueden disminuir la salud global de corales individuales y/o sus descendientes; sin embargo, se encontró que las muestras P, previamente expuestas a factores de estrés medioambiental, exhibieron altos niveles de SOD como producto del incremento en la actividad antioxidante en la porción de sus zooxantelas, sugiriendo que estas muestras fueron más sensibles al gradiente termal por debajo de los 28 °C, pero menos tolerantes a temperaturas más altas. La discusión de los resultados anteriores parece sugerir que poblaciones coralinas, expuestas regularmente a niveles bajos de un estresor (en este caso temperatura), desarrollan estrategias que involucran mecanismos celulares y/o moleculares los cuales aumentan su capacidad de respuesta a fin de mantener la relación simbiótica. Además, es posible considerar que a pesar de los enormes patrones de crecimiento polimórfico referido para el género Pocillopora, lo cual le permite sobrevivir a diversos entornos críticos (Borneman, 2001), los indicadores moleculares sugieren que las poblaciones coralinas de La Boquita se encuentran 40

regularmente expuestas a un estado de estrés térmico local, como consecuencia directa de la inadecuada ubicación de la intercomunicación artificial con la laguna Juluapan, lo cual puede causar daños irreversibles sobre su productividad, adaptabilidad y capacidad de regeneración. Por todo lo anterior, es necesario implementar planes de manejo y control en los arrecifes coralinos de las costas del Pacífico Mexicano.

41

VII. CONCLUSIONES  Concentraciones máximas y mínimas de pigmentos fotosintéticos se expresaron dentro del rango de los 24 a 28 °C en todos los tratamientos, posiblemente debido al ajuste de la maquinaria fotosintética dentro las zooxantelas.  La pérdida de zooxantelas endosimbióticas ocurrió

sin un decremento en las

concentraciones de pigmentos fotosintéticos, siendo el tiempo de exposición al cambio de la temperatura una probable causa de este comportamiento.  La cinética de expulsión zooxantelar aumentó exponencialmente al incrementar la temperatura tanto en corales Normales, Parcialmente blanqueados o Pálidos y el Control; sin embargo, los corales Pálidos fueron más susceptibles al efecto de la temperatura.  Se determinaron comportamientos antagónicos en la relación MDA/SOD de los distintos tratamientos entre los 24 a 28 °C, coincidiendo con las concentraciones máximas y mínimas de pigmentos fotosintéticos, lo cual puede ser explicado por el aumento de la actividad enzimática a dichas temperaturas.  En este estudio, los corales Pálidos resultaron ser más sensibles y menos tolerantes al estrés térmico respecto a los demás tratamientos, exhibiendo una mayor reducción fotosintética y baja densidad simbiótica, esto probablemente debido a una mayor liberación de formas activas de oxígeno.  La condición general, antecedentes de exposición a estrés, así como los mecanismos celulares / moleculares del coral parecen influir en su capacidad de respuesta ante

estrés térmico, dando como resultado variaciones respecto al

daño oxidativo entre individuos de la misma especie.

42

VIII.- LITERATURA CITADA Al-Khatib, K., y Paulsen, G. M. (1989). Enhancement of thermal injury to photosynthesis in wheat plants and thylakoids by high light intensity. Plant Physiology, 90, 1041–1048. Ambarsari, I., Brown, B. E., Barlow, R. G., Britton, G., y Cummings, D. (1997). Fluctuations in algal chlorophyll and carotenoid pigments during solar bleaching in the coral Goniastrea aspera at Phuket, Thailand. Marine Ecology Progress Series, 159, 303-307. Anderson, J. M., Park, Y.-I., y Chow, W. S. (1997). Photoinactivation and photoprotection of photosystem II in nature. Plant Physiology, 100, 214-233. Anónimo, (1988). Coral reefs of the world. Atlantic and Eastern Pacific. (Vol. 1). Cambridge: IUCN Publications. Asada, K., y Takahashi, M. (1987). Production and scavenging of active oxygen in photosynthesis. En D. J. Kyle, C. B. Osmond, y C. J. Arntzen (Eds), Photoinhibition (pp. 228-287). Amsterdam: Elsevier. Badger, M. R. (1985). Photosynthetic oxygen exchange. Annual Review of Plant Physiology, 36, 27-53. Banin, E., Khare, S. K., Naider, F., y Rosenberg, E. (2001). Proline-rich peptide from the coral pathogen Vibrio shiloi that inhibits photosynthesis of zooxanthellae. Applied and Environment Microbiology, 67,1536-1541. Barnes, D. J., y Chalker, B. E. (1990). Calcification and photosynthesis in reefbuilding corals and algae. En Z. Dubinsky (Ed.), Coral reefs (pp.109-131). Amsterdam: Elsevier.

43

Becker, G. B., Norman, J., y Moholt-Siebert, M. (1990). En M. Baltscheffsky (Ed.), Current Research in Photosynthesis (pp. 705-708). Vol. IV. The Netherlands: Kluwer, Dordrecht Beckman, K. B., y Ames, B. N. (1998). The free radical theory of aging matures. Physiology Review, 78, 547-581. Ben-Haim, Y., y Rosenberg, E. (2002). A novel Vibrio sp. pathogen of the coral Pocillopora damicornis. Marine Biology, 141, 47-55. Bhagooli, R., y Hidaka, M. (2004). Photoinhibition, bleaching, susceptibility and mortality in two scleractinian corals, Platygyra ryukyuensis and Stylophora pistillata, in response to thermal and light stresses. Comparative Biochemistry and Physiology A: Physiology, 137, 547-555. Bierkens, J. (2000). Applications and pitfalls of stress-proteins in biomonitoring. Toxicology, 153, 61-72. Borneman, E. H. (2001). Aquariums corals. Husbandry and natural history. Charlotte, V T: Microcosm Ltd. Brown, B. E., Downs, C. A., Dunne, R. P., y Gibb, S. W. (2002). Exploring the basis of thermotolerance in the reef coral Goniastrea aspera. Marine Ecology Progress Series, 242, 119–129. Brown, B. E., Dunne, R. P., Warner, M. E., Ambarsari, I., Fitt, W .K., Gibb, S. W., y Cummings, D. G. (2000). Damage and recovery of Photosystem II during a manipulative field experiment on solar bleaching in the coral Goniastrea aspera. Marine Ecology Progress Series, 195, 117-124.

44

Brown, B. E. (1997a). Adaptations of reef corals to physical environmental stress. Advance of Marine Biology , 31, 221-299. Brown, B. E. (1997b). Coral bleaching: causes and consequences. Coral Reef, 16 (Suppl), S129-S138. Brown, B. E., Ambarsari, I., Warner, M. E., Fitt, W. K., Dunne, R. P., Gibb, S.W., y Cummings, D. G. (1999). Diurnal changes in photochemical efficiency and xanthophylls concentrations in shallow water reef corals: evidence for photoinhibition and photoprotection. Coral Reefs, 18, 99-105. Brusca, R. C. y Thomson, D. A. (1975). Pulmo reef: the only “coral reef" in the Gulf of California. Ciencias Marinas, 2(2), 37-53. Bryant, D., Burke, L., McManus, J., y Spalding, M. (1997). Reefs at Risk: A mapbased indicator of potential threats to the world´s coral reefs. Washington: World Resource Institute. Buege, J. A., y Aust, S. D. (1978). Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology , 51, 302-310. Burton, G. W., y Ingold, K. U. (1984). Beta-carotene: an unusual type of lipid antioxidant. Science, 224(4649), 569–573. Calvin, M., y Muscatine, L. (1997). Oxidative stress in the symbiotic sea anemone Aiptasia pulchella (Carlgren, 1943): Contribution of the animal to superoxide ion production at elevated temperature. Biological Bulletin, 192, 444-456. Clayton, W. S., y Lasker, H. R. (1984). Host feeding regime and zooxanthellae photosynthesis in the anemone, Aiptasia pallida (Verrill). Biological Bulletin, Marine Biological Laboratory, Woods Hole 167, 590-600. 45

Coles, S. L., y Jokiel, P. L. (1978). Synergistic effects of temperature on photosynthesis and respiration in hermatypic corals. Marine Biology, 43, 209216. Connell, J. H. (1978). Diversity in tropical rainforest and coral reefs. Science, 199, 1302-1310. Douglas, A. E. (2003). Coral bleaching-how and why?. A review. Marine Pollutution Bulletin, 46, 385-392. Downs, C. A., Fauth, J. E., Halas, J. C., Dustan, P., Bemiss, J., y Woodley, C. M. (2002). Oxidative stress and seasonal coral bleaching. Free Radical Biology and Medicine, 33, 533-543. Downs, C. A., Mueller, E., Phillips, S., Fauth, J., y Woodley, C. M. (2000). A molecular biomarker system for assessing the health of coral (Montastrea faveolata) during heat stress. Marine Biotechnology, 2, 533-544. Dunlap, W. C., y Shick, J. M. (1998). Ultraviolet radiation-absorbing mycosporine-like amino acids in coral reef organisms: A biochemical and environmental perspective. Journal of Phycology, 34, 418-430. Dykens, J. A. (1984). Enzymic defenses against oxygen toxicity in marine cnidarians containing endosymbiotic algae. Marine Biology Letters, 5, 291-301. Dykens, J. A., Shick, J. M., Benoit, C., Buettner, G. R., y Winston, G. W. (1992). Oxygen radical production in the sea anemone Anthopleura elegantissima and its symbiotic algae. Journal of Experimental Biology, 168, 219-241.

46

Dykens, J. A., y Shick, J. M. (1984). Photobiology of the symbiotic sea anemone, Anthopleura elegantissima: defenses against photodynamic effects, and seasonal photoacclimitization. Biological Bulletin, 167, 693-697. Dykens, J. A., y Shick, J. M. (1982). Oxygen production by endosymbiotic algae controls superoxide dismutase activity in their animal host. Nature, 297, 579580. Eakin, C. M., McManus, J. W., Spalding, M. D., y Jamieson, S. C. (1997). Coral reef around the World: Where are we and where do we from here?. Proceeding of the 8th International Coral Reef Symposium (1, 277-282). Panama. Fang, L. S., Liao, C. W., y Liu, M. C. (1995). Pigment composition in differentcoloured scleractinian corals before and during the bleaching process. Zoological Studies, 34, 10-17. Fitt, W. K., Brown, B. E., y Warner, M. E. (2001). Coral bleaching: interpretation of thermal tolerance limits and thermal thresholds in tropical corals. Coral Reefs, 20, 51–65. Fitt, W. K., y Warner, M. E. (1995). Bleaching patterns of four species of Caribbean reef corals. Biological Bulletin, 189, 298-307. Franzisket, L. (1970). The atrophy of hermatypic reef corals maintained in darkness and their subsequent regeneration in light. International Reviews of Hydrobiology, 55, 1-12. Gates, R. D., Baghdasarian, G., y Muscatine, L. (1992). Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin, 182, 324-332.

47

Gleason, D. F., y Wellinton, G. M. (1993). Ultraviolet radiation and coral bleaching. Nature, 365, 836-838. Glynn, P. W. (1990). Coral mortality and disturbance to coral reefs in the tropical eastern Pacific. En P. W. Glynn (Ed.), Global ecological consequences of the 1982-1983 El Niño-Southern Oscillation (pp. 55-126). Amsterdam: Elsevier. Glynn, P. W. (1993). Coral Bleaching: Ecological perspectives. Coral Reefs, 12, 1-17. Glynn, P. W. (2001). A collection of studies on the effects of the 1997-98 El NiñoSouthern Oscillation Event on corals and corals reef in the Eastern Pacific. Bulletin of Marine Science, 69, 1-288. Glynn, P. W., Mate, J. L., Baker, A C., y Calderon, M. O. (2001). Coral bleaching and mortality in Panama and Ecuador during the 1997-1998 El Niño-Southern Oscillation event: spatial/temporal patterns and comparisons with the 1982-83 event. Bulletin of Marine Science, 69, 79-109. Gonçalves, J. F., Marenco, R. A., y Vieira, G. (2001). Concentration of photosynthetic pigments and chlorophyll fluorescence of mahogany and tonka bean under two light environments Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 13(2), 149-157. Goodsell, D. S. (1996). Our molecular nature: the body´s motors, machines and messages. New York: Springer-Verlag. Goreau, T. J. (1964). Mass expulsion of zooxanthellae from Jamaican reef communities after Hurricane Flora. Science, 145, 383-386. Goreau, T. J., y Hayes, R. L. (1994). Coral bleaching and ocean hotspots. Ambio, 23(3), 176–180.

48

Goreau, T. J., McClanahan, T., Hayes, R., y Strong, A. E. (2000). Conservation of coral reefs after the 1998 global bleaching event. Conservation Biology, 14(1), 5–15. Griffin, S. P. (2005). Comparison of molecular biomarkers within and across scleractinian coral species exposed to elevated temperatures (Doctoral Dissertation, University of Puerto Rico). Guzman, H. M., Jackson, J. B. C., y Weil, E. (1991). Short-term ecological consequences of a major oil spill on Panamanian subtidal reef corals. Coral Reefs, 10, 1-12. Halliwell, B., y Gutteridge, J. M. (1999). Free radicals in biology and medicine. New York: Oxford University Press, Inc. Havaux, M. (1993). Characterization of thermal damage to the photosynthetic electron transport system in potato leaves. Plant Science, 94, 19-33. Heckathorn, S. A., Coleman, J. S., y Hallberg, R. L. (1997). Recovery of net CO2 assimilation after heat stress is correlated with recovery of oxygen-evolvingcomplex proteins in Zea mays L. Photosynthetica, 34, 13-20. Hendry, G. A. F., y Price, A. H. (1993). Stress indicators: chlorophylls and carotenoids. En G. A. F. Hendry y J. P. Grime (Eds), Methods in comparative plant ecology (pp. 148-152). London: Chapman & Hall.

49

Hernández-Saavedra, N. Y. (1997). Caracterización de la enzima superóxido dismutasa tipo cobre-zinc de la levadura marina Debaryomyces hansenii, y clonación de la secuencia que la codifica a partir de ADNc. Tesis doctoral no publicada. Centro de Investigaciones Biológicas del Noreste, S. C., Biotecnología, México. Hoegh-Guldberg, O., y Jones, R. (1999). Photoinhibition and photoprotection in symbiotic dinoflagellates from reef-building corals. Marine Ecology Progress Series, 183, 73–86. Hoegh-Guldberg, O., y Smith, G. J. (1989). The effect of sudden changes in temperature, light and salinity on the population density and export of zooxanthellae from the reef corals Stylophora pistillata Esper and Seriatopora hystrix Dana. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 129, 279303. Hueerkamp, C., Glynn, P. W., D`Croz, L., y Colley, S. B. (2001). Bleaching and recovery of five eastern pacific corals in an El Niño-related temperature experiment. Bulletin of Marine Science, 69, 215-236. Iglesias-Prieto, R., Matta, J. L., Robins, W. A., Trench, R. K. (1992). Photosynthetic response to elevated temperature in the symbiotic dinoflagellate Symbiodinum microadriaticum in culture. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America, 89, 10302-10305. Johannes, R. E., y Wiebe, W. J. (1970). Method for determination of coral tissue biomass and composition. Limnology and Oceanography, 15, 822-824.

50

Jokiel, P. L., y Coles, S. L. (1990). Response of Hawaiian and other Indo-Pacific reef corals to elevated temperature. Coral Reefs, 8, 155-162. Jokiel, P. L. (2004). Temperature stress and coral bleaching. En E. Rosenberg, y Y. Loya (Eds), Coral health and disease (488 pp). USA: Springer. Jokiel, P. L., Lesser, M. P., y Ondrusek, M. E. (1997). UV-absorbing compounds in the coral Pocillopora damicornis: interactive effects of UV radiation, photosynthetically

active

radiation

and

water

flow.

Limnology

and

Oceanography, 42(6), 1468-1473. Jones, R. J. (1997). Zooxanthellae loss as a bioassay for assessing stress in corals. Marine Ecology Progress Series, 149, 163-171. Jones, R. J., Hoegh-Guldberg, O., Larkum, A. W. D., y Schreiber, U. (1998). Temperature-induced bleaching of corals begins with impairment of the CO 2 fixation mechanism in zooxanthellae. Plant Cell and Environment, 21, 12191230. Jones, R. J., y Steven, A. L. (1997). Effects of cyanide on corals in relation to cyanide fishing on reefs. Marine and Freshwater Research, 48, 517-522. Kinzie, R. A. III, Jokiel, P. L., y York, R. H. Jr. (1984). Effects of light of altered spectral composition on coral zooxanthellae associations and on zooxanthellae in vitro. Marine Biology, 78, 239-248. Kleppel, G. S., Dodge, R. E., y Reese, C. J. (1989). Changes in pigmentation associated with the bleaching of stony corals. Limnology and Oceanography, 34, 1331-1335.

51

Kushamaro, A., Rosenberg, E., Fine, M., Haim, Y., y Loya, Y. (1998). Effect of temperature on bleaching of the coral Oculina patagonica by Vibrio AK-1. Marine Ecology Progress Series, 171, 131-137. Kushmaro, A., Rosenberg, E., Fine, M. y Loya, Y. (1997). Bleaching of the coral Oculina patagonica by Vibrio AK-1. Marine Ecology Progress Series, 147, 159165. Lesser, M. P. (2004). Experimental biology of coral reef systems. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 300, 217–252. Lesser, M. P., Stochaj, W. R., Tapley, W. R., y Shick, J. M. (1990). Bleaching in coral reef anthozoans: effects of irradiance, ultraviolet radiation, and temperature on the activities of protective enzymes against active oxygen. Coral Reefs, 8, 225232. Lesser, M. P., y Shick, J. M. (1989). Photoadaptation and defences against oxygen toxicity in zooxanthellae from natural populations of symbiotic cnidarians. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 134, 129-141. Lesser, M. P., y Lewis, S. (1996). Action spectrum for the effects of UV radiation on photosynthesis in the hermatypic coral Pocillopora damicornis. Marine Ecology Progress Series, 134,171-177. Lewis, S. (1995). Response of a Pacific stony coral to short-term exposure of ultraviolet and visible light. En D. Gulko y P.L. Jokiel (Eds),Ultraviolet Radiation and Coral Reefs. (Tech. Report No. 41).

52

Liñán-Cabello, M. A., Zacarías-Salinas, J. S, Hernández-Rovelo, O., Flores-Ramírez, L. y

Lezama-Cervantes, C.

(en prensa). Correlation of chlorophyll a and

carotenoid concentrations with coral bleaching from locations in the Pacific coast of Mexico. Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. Liñán-Cabello, M. A., Paniagua-Michel, J., y Zenteno-Savín, T. (2003). Carotenoids and retinal levels in captive and wild shrimp, Litopenaeus vannamei. Aquaculture Nutrition, 9, 383-389. Ludlow, M. M. (1987). Light stress at high temperature. En D. J. Kyle, C. B. Osmond, y C. J. Arntzen (Eds), Photoinhibition (pp. 89-110). Amsterdam: Elsevier. Macri, E., y McKagan, S. (1998). Temperature and uv effects on pigments in the zooxanthellae of Aiptasia pallida. The advisement of Suzanne Strom Presented at

Sigma Xi

May 1998. Western Washington University,

Bellingham, WA. Mathis, P., y Kleo, J. (1973). The triplet state of carotene and of analog polyenes of different length. Photochemistry and Photobiology, 18, 343-346. Matsushita, M., Irino, T., Komoda, T., y Sakagishi, Y. (1993). Determination of proteins by a reverse biuret method combined with the copper-bathocuproine chelate reaction. Clinica Chimica Acta, 216, 103-11. Medina, J. J. (1996). The clock of ages. Great Britain: Cambridge University Press. Meehan, W. J., y Ostrander, G. K. (1997). Coral bleaching: a potential biomarker of environmental stress. Journal of Toxicology and Environment Health, 50, 529552.

53

Mehler, A. H. (1951). Studies on the reaction of illuminated chloroplast I. Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents. Archives of Biochemistry and Biophysics, 33, 65-67. Meyers, R. A. (1995). Molecular biology and biotechnology. New York: VCH Publisher Inc. Mobley, K. B., y Gleason, F. (2003). The effect of light and heterotrophy on carotenoid concentrations in the Caribbean anemone Aiptasia pallida (Verril). Marine Biology, 143, 629-637. Muscatine, L. (1990). The role of symbiotic algae in carbon and energy flux in reef corals. En Z. Dubinsky (Ed.), Ecosystems of the World 25: Coral Reefs (pp. 89107). Amsterdam: Elsevier. Nebot, C., Moutet, M., Huet, P., Xu, J. Z., Yadan, J. C., y Chaudiére, J. (1993). Spectrophotometric assay of superoxide dismutase activity based on the activitated autoxidation of a tetracyclic catechol. Analytical Biochemistry, 214, 442-451. Ohad, I., Keren, N., Zer, H., Gong, H., Mor, T. S., Gal, A., Tal, S., y Domovich, Y. (1994). Light-induced degradation of the photosystem II reaction centre D1 protein in vivo: an integrative approach. In: Photoinhibition of photosynthesis: from molecular mechanisms to the field (pp. 161-177). Bios Scientific Publishers. Öquist, G., Anderson, J. M., McCaffery, S. y Chow, W. S. (1992). Mechanistic differences in photoinhibition of sun and shade plants. Planta, 188, 422-431.

54

Papina, M., Meziane, T., y van Woesik, R. (2003). Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology B: Biochemistry and Molecular Biology, 135, 533537. Parsons, T. R., Maita, Y., y Lalli, C. M. (1984). A manual of chemical and biological methods for sea water analysis. Oxford: Pergamon. Pérez-Gastell, P. L., y Pérez-de Alejo, J. L. (2000). Métodos para medir el daño oxidativo. Revista Cubana de Medicina Militar, 29, 192-198. Philipp, E., y Fabricius, K. (2003). Photophysiological stress in scleractinian corals in response to short-term sedimentation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 287,57-78. Porter, J. W., Fitt, W. K., Spero, H. J., y Rogers, C. S. (1989). Bleaching in reef corals: Physiological and stable isotopic responses. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America, 86, 9342–9346. Reyes-Bonilla, H. (1993). Biogeografía y ecología de los corales hermatípicos del Pacífico de México. En S. I. Salazar-Vallejo y N. E. González (Eds), iodiversidad Marina y Costera de México (pp. 202-227). Chetumal: CONABIO/CIQRO. Reyes-Bonilla, H., López-Pérez, R. A., y Medina-Rosas, P. (2002). El estado actual de los arrecifes coralinos en el mundo. Ciencia y Desarrollo, 166,12-21. Reyes-Bonilla, H., y López-Pérez, R. A. (1998). Biogeografía de los corales pétreos (Scleractinia) del Pacífico de México. Ciencias Marinas, 24(2), 211-224.

55

Richier, S., Merle, P-L., Furla, P., Pigozzi, D., Sola, F., y Allemand, D. (2003). Characterization of superoxide dismutases in anoxia- and hyperoxia-tolerant symbiotic cnidarians. Biochimica et Biophysica Acta, 1621, 84-91. Richter, M., Ruhle, W., y Wild, A. (1990). Studies on the mechanism of photosystem II photoinhibition. The involvement of toxic oxygen species. Photosynthesis Research, 24, 237-244. Rossell, J. B. (1989). Measurement of rancidity. En J. C. Allen y R. C. Hamilton (Eds), Rancidity in Foods (pp 23-65). London: Elsevier Science. Sawyer, S. J., y Muscatine, L. (2001). Celullar mechanism underlying temperatureinduced bleaching in the tropical sea anemone Aiptasia pulchella. Journal of Experimental Biology, 204, 3443-3456. Saxby, T., Dennison, W. C., y Hoegh-Guldberg, O. (2003). Photosynthetic responses of the coral Montipora digitata to cold temperature stress. Marine Ecology Progress Series, 248, 85-97. Scandalios, J. G. (1993). Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology,101,7-12. Schnettger, B., Critchley, C., Santore, U J., Graf, M., y Krause, G. H. (1994). Relationship between photoinhibition of photosynthesis, D1 protein turnover and chloroplast structure: effects of protein synthesis inhibitors. Plant Cell and Environment, 17, 55-64. Schreiber, U., y Armond, P. A. (1978). Heat-induced changes of chlorophyll fluorescence in isolated chloroplasts and related heat-damage at the pigment level. Biochimica et Biophysica Acta, 502(1),138–151.

56

Schuhmacher, H. (1978). Arrecifes Coralinos: Su extensión, mundo animal y ecología. España: Omega. Sevilla, M. L. (1977). Introducción a la ecología marina. México: Instituto Politécnico Nacional. Sheskin, D. J. (1996). Handbook of parametric and nonparametric statistical procedures. Boca Raton, USA: CRC Press. Siebeck, O. (1988). Experimental investigation of UV tolerance in hermatypic corals (Scleractinia). Marine Ecology Progress Series, 43, 95-103. Sommer, T. R., D´Souza, F. M. L., y Morrissy, N. M. (1992). Pigmentation of adult rainbow trout Oncorhnchus mykiss, using the green alga Hematococcus pluvialis. Aquaculture, 106, 63-74. Steen, G. R., y Muscatine, L. (1987). Low temperature evokes rapid exocytosis of symbiotic algae by sea anemone. Biological Bulletin, 172, 246-263. Strain, J. J., Hannigan, B. M., y McKenna, P.G. (1991). The pathophysiology of oxidant damage .Journal of Biomedical Science, 2, 19-24. Takayama, F., y Egashira, T. (1998). Assay for oxidative stress injury bu detection of luminol-enhanced chemiluminescence. Nippon Yakurigsako Zasshi, 111, 177-86. Tan, Y., Jiang, J. H., Wu, H. L., Cui, H., y Yu, R. Q. (2000). Resolution of kinetic system of simultaneous degradation of chlorophyll a and b by PARAFAC. Analytica Chimica Acta, 412, 195-202.

57

Tchernov, D., Gorbunov, M. Y., de Vargas, C., Yadav, S. N., Milligan, A. J., Haggblom, M., y Falkowski, P. G. (2004). Membrana lipids of symbiotic algae are diagnostic of sensitivity to termal bleaching in corals. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America, 101, 1353113535. Trench, R. K. (1979). The cell biology of plant–animal symbiosis. Annual Reviews of Plant Physiology, 30, 485–531. Vaughan, T. W. (1914). Reef corals of the Bahamas and of southern Florida. Carnegie Inst Wash Year Book, 13, 222-226. Warner, H. R. (1994). Superoxide dismutase, aging, and degenerative disease. Free Radical Biology and Medicine, 17, 249-258. Warner, M. E., Fitt, W. K., y Schmidt, G. W. (1996). The effects of elevated temperature on the photosynthetic efficiency of zooxanthellae in hospite from four different species of reef corals: a noval approach. Plant Cell and Environment, 19,291-299. Warner, M. E., Schmidt, G. W., y Fitt, W. K. (1999). Damage to photosystem II in symbiotic dinoflagellates: a determinant of coral bleaching. Proceedings of National Academy of Science of the United States of America, 98, 8007-8012. Wilkinson, C. R. (1992). Coral reefs of the world are facing widespread devastation: can we preventthis through sustainable management practices? Proceedings of the 7th International Coral Reef Symposium (1,11-21). Yakovleva, I., Bhagooli, R., Takemura, A., y Hidaka, M. (2004). Differential susceptibility to oxidative stress of two scleractinian corals: antioxidant

58

functioning of mycosporine-glycine. Comparative Biochemistry and Physiology B: Biochemistry and Molecular Biology, 139,721-730. Yonge, C. M., y Nicholls, A. G. (1931). Studies on the physiology of corals. V. The effect of starvation in light and in darkness on the relationship between corals and zooxanthellae. Sience Report Great Barrier Reef Expedition, 1, 178-210. Zar, J. H. (1999). Biostatistical analysis. Englewood Cliffs, N J: Prentice-Hall.

59