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UNI V
AD S ID ER
UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA
ANÁLISIS DE GENOTIPOS Y DE LOS TIEMPOS DE DUPLICACIÓN DE CEPAS DE Staphylococcus aureus RESISTENTE A METICILINA AISLADAS DE INFECCIONES NOSOCOMIALES Y ADQUIRIDAS EN LA COMUNIDAD Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Médicas
Presenta M. en C. Gerardo Martínez Aguilar
Asesores D. en C. Xóchitl A. R. Trujillo Trujillo Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Colima D. en C. Celia M. Alpuche Aranda Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Secretaría de Salud D. en C. Miguel Huerta Viera Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Colima
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Colima, Col. Marzo del 2010
AGRADECIMIENTOS Y DEDICATORIAS
Al CONACyT por la beca otorgada para la realización del Doctorado: No. de registro 82192.
Este proyecto fue realizado con recursos otorgados por
Fondos Sectoriales/Conacyt
al
proyecto “EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE S. aureus RESISTENTE A METICILINA ADQUIRIDO EN HOSPITALES Y EN LA COMUNIDAD” con el número de registro SALUD-2003-C01-091, The Fogarty International Center of the National Institutes of Health Grant D43 TW01036 y del Fondo de Fomento a la Investigación FOFOI 2005/1/I/046.
A todas las enfermeras, médicos, y químicos de los hospitales participantes ya que con su apoyo y compromiso fue posible el desarrollo de este proyecto.
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INDICE
Resumen
1
Abstract
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Glosario
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Antecedentes
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Planteamiento del problema
12
Pregunta de Investigación
13
Hipotesis general
13
Objetivo general
13
Objetivos específicos
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Material y Métodos
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Tipo de Estudio
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Periodo de Estudio
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Clasificación de las infecciones de acuerdo a su origen
15
Tamaño de la muestra
15
Colaboración con otras Instituciones
15
Hospitales participantes
16
Variables del Estudio
16
Definición operacional de las variables
16
Identificación inicial de S. aureus y de la resistencia a meticilina
17
Conservación y envío de las cepas de S. aureus.
17
Susceptibilidad a antimicrobianos
17
Extracción de DNA
18
Electroforesis de campos pulsados
18
Tipificación de SSCmec por PCR con iniciadores múltiples
18
Detección de genes que codifican para Panton-valentine-leucocidin
19
4 Tipificación de secuencias de locus múltiples
20
Asignación, interpretación y comparación de las secuencias de locus múltiples
21
Tiempos de duplicación de cepas nosocomilaes y comunitarias de S aureus
21
Análisis estadístico
22
Aspectos éticos
23
Recursos financieros
23
Instituciones y personal participante
24
Resultados
25
Discusión
33
Conclusiones
37
Perspectivas
38
Bibliografía
39
Anexo 1
45
Anexo 2
48
Anexo 3
49
Tablas y Figuras
Tabla 1
19
Tabla 2
20
Tabla 3
25
Tabla 4
26
Tabla 5
31
Tabla 6
31
Tabla 7
32
Figura 1
22
Figura 2
28
Figura 3
30
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RESUMEN
Antecedentes. Se ha postulado que las cepas comunitarias de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) tienen tiempos de duplicación menores que las nosocomiales. Objetivo. Comparar los tiempos de duplicación de cepas comunitarias de SARM-AC y de cepas nosocomiales de SARM-AH de acuerdo a sus genotipos. Metodología. Estudio transversal comparativo efectuado con cepas nosocomiales y comunitarias de SARM aisladas de algunos hospitales mexicanos durante los años 2005 y 2006. Se realizó la caracterización molecular de las cepas mediante: electroforesis de campos pulsados, tipificación del tipo de casete cromosómico de resistencia a meticilina (SCCmec) por reacción en cadena de la polimerasa con iniciadores múltiples y tipificación de secuencias de locus múltiples. Se compararon los tiempos de duplicación de cepas susceptibles y resistentes a meticilina, de acuerdo al tipo de SCCmec y de sus secuencias tipo. Resultados. se analizaron un total de 426 cepas de S. aureus, 351 (82.4%) de origen nosocomial y 75 (17.6%) de origen comunitario. Se encontraron 83 cepas resistentes a meticilina de origen nosocomial y 3 de origen comunitario. No se encontraron diferencias significativas en los tiempos de duplicación de acuerdo a la susceptibilidad o resistencia a meticilina y al el tipo de SCCmec (p = 0.187) ni de acuerdo a sus secuencias tipo (p = 0.765). Se documentaron las clonas circulando en los hospitales participantes así como la presencia de SARM-AC. La secuenciación de genes caseros mostró la presencia de una clona no descrita previamente. Conclusiones. Los tiempos de duplicación de cepas nosocomiales y comunitarias no están determinados por el tipo de SCCmec o los tipos clonales. Se documentó la presencia de SARM-AC en México y la existencia de una clona nosocomial no reportada previamente.
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ABSTRACT
Background. It has been hypothesized that community acquired methicilin-resistant S. aureus (MRSA) have generation times shorter than nosocomial strains Objective. To compare generation times in CA-MRSA and in HA-MRSA strains according to its genotype. Methods. A cross sectional comparative study was performed with hospital and community acquired strains isolated from Mexican hospitals during 2005 and 2006. Molecular characterization was performed by pulsed field gel electrophoresis. Multiplex PCR typing for SCCmec types and
multilocus sequence typing for clonal types. Generation times were
compared among resistant and susceptible S. aureus strains and according to their SSCmec type and sequence type. Results. Four hundred and twenty six S. aureus strains were analyzed; 351 (82.4%) from Mexican hospitals and 75 (17.5%) community acquired. Eighty six were methicillin-resistant, 83 nosocomial and 3 community acquired. We did not found significant differences in the generation times of the strains according to their susceptibility or resistance to methicillin, SCCmec type (p = 0.187) and sequence type (p = 0.765). The nosocomial clones circulating in hospital were documented and also the presence of CA-MRSA. Housekeeping genes sequencing showed a clone not reported previously. Conclusions. Generation times of nosocomial and community acquired strains were not determined by the SCCmec type or clonal type. We documented the emergence of CA-MRSA in Mexico and the presence of a nosocomial clone not previously reported.
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GLOSARIO
Staphylococcus aureus susceptible a meticilina (SASM). S. aureus susceptible a todos los antibióticos β lactámicos Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM). S. aureus resistente a todos los antibióticos β lactámicos Staphylococcus aureu resistente a meticilina de adquisición comunitaria (SARM-AC). S. aureus resistente a todos los antibióticos β lactámicos aislado de pacientes sin historia de hospitalización en el año previo Staphylococcus aureu resistente a meticilina de adquisición hospitalaria (SARM-AH). S. aureus resistente a todos los antibióticos β lactámicos aislado de pacientes con al menos 48 horas de hospitalización. Casete cromosómico de resistencia a meticilina (SCCmec) Elemento genético móvil de 21 a 67 kb que se inserta en el genoma de SASM, contiene el gen mecA y sus reguladores. Gen mecA. Gen que confiere resistencia a todos los antibióticos β lactámicos ya que codifica para la producción de proteína alterada denominada “proteína fijadora de penicilina” (PBP2A). Arginine Catabolic Mobile Elment (ACME). Elemento genético móvil
presente en el
SCCmec que interviene en el metabolismo de la arginina (ACME por las siglas en inglés de Arginine Catabolic Mobile Elment) y que puede desempeñar algún papel en la virulencia de SARM-AC. Gen Panton-Valentine-Leucocidin (PVL). Gen que codifica para una leucocidina que tiene la capacidad d e lisar leucocitos. Inicialmente se le atribuyo un papel patógeno en las cepas de SARM-AC, sin embargo, este papel aun no esta claro y se le considera más como un marcador genético de estas cepas. Cepas de referencia ATCC. Cepas de “The American Type Culture Collection” de las cuales se conocen todas sus características fenotípicas y que se utilizan como controles de calidad para la identificación y pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos.
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Kirby-Bauer. Método cualitativo para realizar pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos mediante método de difusión de disco Electroforesis de Campos Pulsados (ECP). Separación de fragmentos del DNA bacteriano genómico mediante su digestión en bloques de parafina y electroforesis con campos electromagnéticos emitidos en
diversas condiciones de voltaje y tiempo a temperatura
constante. Secuenciación de locus múltiples (MLST). Secuenciación de siete genes caseros altamente conservados en S. aureus. Las secuencias de los alelos de estos genes permiten su clasificación dentro de clonas circulando a nivel mundial e incluidas en una base de datos internacional. Clinical Laboratory Standars Institute (CLSI). Normas actualizadas para la realización de pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos. Tiempos de duplicación. Tiempo en minutos en el que las cepas se duplican al reproducirse por conjugación y que se determina mediante curvas de crecimiento en medios de cultivo adecuados.
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ANTECEDENTES
Las bacterias han existido por más de 3 billones de años y son ejemplo de las formas más antiguas de vida en la tierra. El gran potencial de evolución de estos microorganismos se evidencia en la presencia de innumerables especies que difieren en muchas de sus propiedades tales como: capacidad metabólica, composición de la superficie celular, nichos ecológicos y afinidad por ciertos hospederos. 1 Desde la perspectiva Darwiniana cada organismo viviente es el resultado de las fuerzas que controlan la evolución y que incluyen: plasticidad del genoma, expresión de fenotipos y la presión selectiva ejercida por el medio ambiente.
2
La capacidad
de adaptarse y cambiar como respuesta a estas fuerzas constituye la base de la evolución genética de toda forma viviente. En células eucariotas la reproducción sexual da lugar a gran variabilidad genética. En organismos procariotas, sin la posibilidad de intercambiar material genético de esta forma, factores tales como frecuencia de mutaciones puntuales, altos niveles de recombinación, silenciamiento de genes y la trasferencia de material genético entre diferentes especies y géneros determinan su evolución. Este último proceso conocido como trasferencia horizontal de genes constituye la piedra angular de la evolución bacteriana y conduce a cambios dramáticos en la composición de los genomas microbianos en periodos relativamente cortos de tiempo. 3
El Staphylococcus aureus es una bacteria comensal de la mucosa nasal y de la piel de los seres humanos. Coloniza en algún momento a aproximadamente un 30% de la población, sin embargo es también uno de los patógenos más importantes como causa de infecciones adquiridas en la comunidad o en el ambiente hospitalario, estas pueden ser infecciones superficiales de la piel o infecciones generalizadas y graves tales como neumonías, bacteriemias, endocarditis y/o choque tóxico que ponen en riesgo la vida del paciente. 4, 5
El repertorio genético de este microorganismo es amplio lo que le permite adaptarse rápidamente a cualquier medio ambiente hostil como se evidencia por aislados clínicos de S. aureus que muestran resistencia a virtualmente todos los antibióticos usados en la práctica clínica para su tratamiento. 6,7,8 El ejemplo más notable de este fenómeno en los hospitales es
10 la presencia de S. aureus resistente a la meticilina (SARM), su prevalencia se aproxima al 80% en muchos centros hospitalarios de los Estados Unidos de América (EUA).
6
La
prevalencia real en México es desconocida, algunos reportes señalan que es cercana al 50%, 9 aunque en instituciones de tercer nivel de atención se han notificado hasta un 100% de resistencia a meticilina.10 Con frecuencia las cepas nosocomiales presentan resistencia a múltiples antibióticos además de la meticilina.11
Estas consideraciones epidemiológicas reflejan fielmente como los genes bacterianos pueden ser transmitidos entre diferentes organismos vía conjugación, trasducción y transformación natural. Los primeros dos procesos requieren acarreadores específicos tales como fagos y plásmidos. La mayoría del ácido desoxiribunucleíco (ADN) trasferido por estos mecanismos es parte del material genético localizado fuera del ADN cromosómico de la bacteria, también conocido como material genético flexible. En este material genético también existen transposones, integrones, islotes (< 10 kilobases (kb) e islas genéticas (> 10 kb). 12
Pese a la velocidad con la cual SARM se ha diseminado dentro de los hospitales, estas cepas multiresistentes han sido incapaces de diseminarse a la comunidad ya que se postula que el conservar múltiples genes de resistencia disminuye su capacidad biológica para multiplicarse y competir con la flora comensal normal. Sin embargo, en los últimos años han aparecido y rápidamente se han diseminado en la comunidad cepas activas y altamente virulentas de SARM. El S. aureus resistente a la meticilina de adquisición comunitaria (SARM-AC) es claro ejemplo de este fenómeno y fue reportado por vez primera en Australia en 1993 13 y más tarde en otros países incluyendo el norte del Continente Americano.14-16
A diferencia de las cepas de SARM de adquisición hospitalaria generalmente son multirresistentes,
(SARM-AH) que
las cepas aisladas de pacientes con infección de
adquisición comunitaria sueles ser susceptibles a múltiples antibióticos tales como: aminoglucósidos, clindamicina, tetraciclina, rifampicina, trimetoprim/sulfametoxasol, y con relativa frecuencia son resistentes a eritromicina.
17
Además, los individuos afectados no
tienen los factores de riesgo asociados con SARM-AH y a diferencia de las cepas nosocomiales de SARM que raramente presentan alta virulencia, las cepas de SARM-AC
11 causan infecciones serias y a menudo fatales en pacientes inmunocompetentes.
18,19
Así
mismo, la velocidad con que se propaga esta bien adaptada clase de SARM es preocupante. Por ejemplo, en una comunidad rural de Nativos Americanos las cepas de SARM-AC son ahora más prevalentes que las completamente susceptibles
20
y en algunos lugares, como
Houston, Tx, se ha reportado que hasta el 73% de las infecciones por S. aureus de adquisición comunitaria, en niños, son ocasionadas por cepas resistentes a meticilina.
21
Estos hallazgos
nos plantean la posibilidad de que esta nueva clase de SARM pueda llegar a sustituir a S. aureus susceptible a meticilina (SASM) como la flora normal que coloniza al ser humano.
El estudio de los mecanismos moleculares de resistencia a meticilina en S. aureus, ha mostrado que esta resistencia resulta de la integración sitio-específica de un elemento genético de 21 a 67 kb dentro del genoma de SASM y que ha sido denominado casete cromosómico del estafilococo (SCCmec). El SCCmec es un elemento genético móvil que contiene el gen mecA que codifica para una proteína alterada denominada “proteína fijadora de penicilina” (PBP2A) y sus reguladores. Esta proteína tiene actividad de transpeptidasa y es necesaria para la síntesis del peptidoglicano de la pared celular de S. aureus. A pesar de su nombre, esta proteína muestra disminución en la afinidad por los antibióticos β-lactámicos y permite la síntesis de peptidoglicano en presencia de los mismos. La resistencia a meticilina conferida por el gen mecA resulta en resistencia cruzada a todos los β-lactámicos y, por lo tanto, inhabilita el uso de penicilinas y cefalosporinas como opción de tratamiento. 22 Además de portar al gen mecA, el SSCmec sirve como un sitio para la integración para otros determinantes de resistencia tales como transposones y plásmidos. En cepas de SARM hospitalarias se han identificado cuatro tipos de SCCmec (I, II, III y IV) mientras que, las cepas de SARM-AC poseen el tipo IV SCCmec con algunas variantes y que difiere del de cepas nosocomiales.
8,23
El tamaño de los SCCmec I, II y III varía entre 34 y 67 kb y poseen
genes de resistencia a otros antibióticos, mientras que el tipo IV es más corto 21 a 25 kb y no tiene otros genes de resistencia además del mecA. El tipo de SCCmec está determinado por la clase de mec (A o B) y el tipo de complejo de genes de recombinasas llamado CCC de los tipos 1, 2 y 3 24 por lo tanto, el genotipo de cada clona de MRSA está determinado por el tipo de SSCmec y el tipo de cromosoma que lo recibe, este último determinado mediante la
12 secuenciación de locus múltiples (MLST) de siete genes caseros altamente conservados en S. aureus. 25
Por su estructura molecular y función el SCCmec puede ser considerado como una isla genómica, inicialmente descritas como islas de patogenicidad, y que en años recientes ha sido objeto de gran atención. Inicialmente se encontraron en el genoma de cepas patógenas de E. coli y posteriormente también se encontraron en otras bacterias y fueron asociadas con patogenicidad.
26
La secuenciación de genomas bacterianos completos mostró que estos
elementos están presentes en muchas especies bacterianas y no son exclusivos de mecanismos de patogenicidad y se han denominado islas genómicas.
27
Estas islas son parte del material
genético flexible de las bacterias y tiene un tamaño entre 10 y 100 kb, con frecuencia incluyen secuencias incorporadas por fagos o plásmidos, genes de transferencia y/o integrasas y otros elementos de inserción de secuencias. Estos bloques de material están con frecuencia insertados en genes que codifican para ARNt y pueden ser inestables.
28,29
Además de los
elementos de movilidad estas islas acarrean grupos de genes con funciones diversas. Al igual que otros elemento del ADN extracromosómico la mayoría de estas islas difieren el ADN cromosomal con respecto a su contenido de G+C y a la distribución y utilización de codones. La ventaja evolutiva de las islas genómicas sobre fragmentos pequeños de material genético (islotes) es que un mayor número de genes pueden ser trasferidos e incorporados en bloque dentro de un genoma receptor. Esta transferencia puede condicionar cambios dramáticos en el comportamiento del organismo dando como resultado final un cambio evolutivo mayor que le confiere ventajas importantes. 30,31
El análisis de las secuencias de las islas genómicas mostró que además de acarrear genes que codifican proteínas con propiedades de trasferencia, recombinación, restricción y modificación, la mayoría de los grupos de genes localizados en estos elementos genéticos codifican funciones que son útiles para la sobrevida y transmisión de los microorganismos, por lo tanto, confieren una ventaja selectiva dentro de una población a los organismos que las poseen. Por ejemplo: elementos que codifican el ingreso de sucrosa en Salmonella senftenberg son necesarios para la adaptación metabólica de estas bacterias a sus hospederos. 32 Otras islas genómicas codifican para sistemas de incorporación de hierro las cuales incrementan la
13 capacidad de la bacteria para crecer y diseminarse en el suelo o dentro de un hospedero como en el caso de las enterobacterias y Pseudomonas spp.
33
Las islas genómicas también pueden
acarrear genes que codifican factores que confieren resistencia a antimicrobianos. Por ejemplo, la región mec-A de estafilococo favorece la sobrevida de sus portadores tanto en el suelo donde existen microorganismos productores de antibióticos como en los hospitales con una fuerte presión selectiva de de los mismos. 34 Recientemente se ha descrito que el SCCmec también acarrea un elemento móvil que interviene en el metabolismo de la arginina (ACME por las siglas en inglés de Arginine Catabolic Mobile Elment) y se postula que la selección para resistencia y patogenicidad puede estar interrelacionada. 35 El Incremento de la fortaleza fisiológica o “fitness” de la bacteria determinan cambios evolutivos importantes, en este contexto el “fitness” se considera como un grupo de propiedades que favorecen la sobrevida, diseminación y/o transmisión de un organismo dentro de un nicho ecológico específico. 36 Las leyes Darwinianas son válidas (“sobrevida del más fuerte”) para la evolución de eucariotas y procariotas.
37
Por lo tanto el poseer una isla genómica puede proporcionar una ventaja
selectiva bajo condiciones específicas del medioambiente (estrés, exposición a substancias antibacterianas) debido a que incrementa la transmisión, sobrevida y colonización dentro de un nicho. Por lo tanto desde un punto de vista funcional las islas genómicas que incrementan la fortaleza del microorganismo que la recibe deberán ser denominados islas de fortaleza o “fitness islands”
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ya que le confieren a la bacteria nuevas propiedades que incrementan la
capacidad de adaptación a sus hospederos. A este respecto se ha documentado que la presencia de ACME en el SCCmec además de contribuir a la patogenicidad incrementa el crecimiento y sobrevida de las cepas que lo poseen. 35 Mediante la caracterización molecular (tipificación del SCCmec por reacción en cadena de la polimerasa [PCR] y secuenciación de genes caseros por MLST) de colecciones internacionales de SARM ha sido posible determinar que la resistencia a meticilina emergió en los hospitales en cinco linajes clonales diferentes y que la mayoría de la cepas contemporáneas de SARM que ocasionan infecciones intrahospitalarias son causadas por un número limitado de clonas epidémicas.
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A diferencia del número reducido de clonas de SARM circulando en los
hospitales de diversos continentes, 8 estudios de epidemiología molecular indican que SARMAC tiene linajes clonales muy diversos y sugieren que el tipo IV de SSCmec puede diseminarse fácilmente entre clonas de S. aureus. 40
14
La presión ejercida por el medio ambiente natural o clínico condiciona que las bacterias se seleccionen mediante mutaciones o pérdida de genes de resistencia.
41
La capacidad de una
bacteria para sobrevivir y crecer en condiciones adversas son un reflejo de su fortaleza física, por lo tanto la medición de velocidad de crecimiento en cultivo ofrece un buen modelo para evaluar su capacidad fisiológica y deducir los tiempos de generación o duplicación. El desarrollo de resistencia a los antibióticos, ya sea por la adquisición de elementos de resistencia o por mutaciones, impone un costo biológico a la bacteria que se expresa en una disminución de su velocidad de crecimiento. 42
Es un estudio sobre la fortaleza física y el crecimiento competitivo de cepas nosocomiales de SARM sensibles y resistentes a gentamcina, aisladas de 24 hospitales franceses, se encontró que las cepas de SARM sensibles a gentamicina tuvieron tiempos de generación más cortos que las cepas resistentes. Los experimentos sobre crecimiento competitivo mostraron que las cepas de SARM sensibles a gentamicina sobrepasaron el crecimiento de las cepas resistentes a este antibiótico. Estos resultados ayudaron a explicar de manera racional la emergencia y predominio de cepas SARM sensibles a gentamcina en estos hospitales, así como el reemplazo gradual de las cepas de SARM resistentes a gentamicina. 43
Por otro lado, el estudio de los fenotipos de resistencia de SARM-AC sugiere que, a diferencia de las cepas nosocomiales las cuales son seleccionadas por la exposición a antibióticos βlactámicos potentes, las cepas comunitarias no fueron seleccionadas por la presión selectiva ejercida por los antibióticos, lo que podría explicar su rápida diseminación en la comunidad. Okuma y cols compararon los tiempos de duplicación entre cepas comunitarias (SCCmec IV) y un número pequeño de cepas nosocomiales (SCCmec tipo I, II y III) y encontraron que los tiempos de duplicación fueron menores para las cepas comunitarias, postulando que la alta tasa de crecimiento de SARM-AC puede ser un prerrequisito para competir exitosamente con otras cepas y colonizar las mucosas del ser humano en ausencia de la presión selectiva de los antibióticos. 24 En este sentido, la presencia de resistencia a meticilina en S. aureus no implica un costo biológico a expensas de la sobrevida, puesto que esta resistencia le proporciona a la
15 bacteria una ventaja de sobrevida selectiva solamente si se encuentra en presencia de meticilina. 44
16
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La resistencia bacteriana es un problema grave y creciente con implicaciones importantes para la salud pública. Staphylococcus aureus es un patógeno común en el ser humano que desarrolla rápidamente resistencia a los antibióticos utilizados para su tratamiento como en el caso de la meticilina. El SARM durante mucho tiempo estuvo limitado a las instituciones de salud, por lo que la emergencia de resistencia a meticilina en S. aureus aislado de infecciones adquiridas en la comunidad ha causado gran preocupación entre la comunidad médica, si además se considera la emergencia de resistencia de S. aureus a otros antibióticos como la vancomicina se magnifican las repercusiones de la resistencia a meticilina en el tratamiento empírico con β-lactámicos, utilizado rutinariamente en infecciones de la comunidad en las cuales S. aureus juega un rol importante. Por otra parte, las características moleculares del elemento cromosómico que acarrea el gen de resistencia a meticilina sugieren que este se comporta como una isla de patogenicidad y de fortaleza y además puede ser transferido fácilmente a diferentes cepas de S. aureus y en conjunto son su velocidad de duplicación pueden explicar su rápida diseminación en la comunidad. Por lo tanto, además del estudio genotípico de esta clase de SARM, el estudio de sus características fenotípicas tales como la capacidad de crecimiento podría facilitar la comprensión de los mecanismos involucrados en su rápida diseminación y proporcionar estrategias para su control.
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PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Existen diferencias en los tiempos de duplicación entre las cepas SARM-AC y las cepas de SARM-AH de acuerdo a sus genotipos?
HIPÓTESIS GENERAL
Los tiempos de duplicación entre las cepas de SARM-AC y las cepas de SARM-AH son diferentes de acuerdo a sus genotipos.
OBJETIVO GENERAL
Comparar los tiempos de duplicación de cepas de SARM-AC y de cepas de SARM-AH de acuerdo a sus genotipos.
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OBJETIVOS ESPECÍFICOS
-
Aislar S. aureus resistente a meticilina (SARM) de infecciones comunitarias y nosocomiales, de acuerdo a las recomendaciones de la Academia Americana de Microbiología.
-
Determinar su perfil de susceptibilidad a antimicrobianos de acuerdo a los lineamientos del CLSI (National Committee for Clinical Laboratory Standards)
-
Determinar la huella digital genómica de SARM aislado de infecciones comunitarias y nosocomiales mediante electroforesis de campos pulsados. (ECP)
-
Determinar el genotipo de SARM aislado de infecciones de adquisición nosocomial y comunitaria, mediante la tipificación de secuencias de locus múltiples (MLST) y mediante la tipificación del SCCmec por PCR.
-
Determinar y comparar los tiempos de duplicación de cepas seleccionadas de SARM aislado de infecciones de nosocomiales y comunitarias de acuerdo a sus genotipos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Tipo de Estudio.
Estudio transversal comparativo, para evaluar los tiempos de duplicación de cepas de SARM aisladas de infecciones adquiridas en la comunidad y en hospitales de acuerdo a sus genotipos.
Periodo de Estudio
Se analizaron todos los aislados clínicos de S. aureus de origen nosocomial y comunitario, obtenidos entre Enero 2005 y Junio de 2006 en los siguientes hospitales: Hospital Infantil de México Federico Gómez, México, DF, Hospital Pediátrico de Sinaloa, Culiacán, Sinaloa., Hospital de Pediatría del Centro Médico de Occidente, IMSS Guadalajara, Jal., Hospital
19 General Ignacio Morones Prieto, San Luis Potosí, San Luís Potosí, Hospital General de Durango (SSA) y Hospital General Regional No. 1 del IMSS, Durango, Durango. Todas las cepas aisladas se enviaron al laboratorio de microbiología de la Unidad de Investigación Biomédica del Instituto Mexicano de Seguro Social en la ciudad de Durango donde se confirmaron los patrones de resistencia y realizaron las pruebas para la caracterización molecular de las cepas mediante las siguientes técnicas: electroforesis de campos pulsados, tipificación del SSCmec por reacción en cadena de la polimerasa con iniciadores múltiples (PCR multiplex) y tipificación de secuencias de locus múltiples (MLST)
Clasificación de las infecciones de acuerdo a su origen (nosocomial o comunitario).
La clasificación del origen nosocomial o comunitario de las infecciones se realizó de acuerdo a los criterios de la Norma Oficial Mexicana para el Control y Prevención de Infecciones Nosocomiales.
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Brevemente, se consideraron de origen nosocomial a las infecciones
adquiridas después de 72 horas del ingreso del paciente al hospital y que no se encontraban en periodo de incubación al momento del ingreso. Se consideraron de origen comunitario a las infecciones diagnosticadas en pacientes que no tenían antecedente de contacto con instituciones de salud durante los 12 meses previos al episodio.
Tamaño de la muestra
Se incluyeron todas los aislamientos de S. aureus obtenidos durante el periodo de estudio
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de pacientes en los que se estableció el diagnóstico de infección nosocomial o comunitaria de los hospitales participantes.
Colaboración con otras instituciones
Se estableció colaboración con la Universidad Nacional Autónoma de México a través del Laboratorio de Infectología, Microbiología e Inmunología Clínica de la Unidad de Medicina Experimental de la Facultad de Medicina. Este laboratorio proporcionó asesoría técnica para la estandarización de los tiempos de duplicación. También se estableció colaboración con el
20 Laboratorio de Enfermedades Infecciosas del Texas Children´s Hospital/Baylor College of Medicine en Houston, Texas que proporcionó las cepas de SARM-AC y cepas de referencia internacional y controles positivos para los protocolos de PCR.
Hospitales participantes
Los hospitales participantes se seleccionaron si contaban con especialistas en infectología, comité para la prevención y control de infecciones nosocomiales y laboratorio de microbiología con control de calidad.
Variables de estudio
Variable Independiente. Genotipo de las cepas de S. aureus resistente a meticilina Variable Dependiente. Tiempos de duplicación de las cepas
Definición operacional de las variables
-S. aureus. Bacteria Gram positiva aislada de infecciones nosocomiales y de la comunidad identificada de acuerdo a los pruebas y lineamientos recomendados por la Asociación Americana de Microbiología. 47 -Resistencia a Meticilina. Diámetro del halo de inhibición ≤ de 21 mm que indica la resistencia a este antibiótico y que se determina mediante la difusión en agar de un disco conteniendo 30 µg de cefoxitina y se confirma mediante la detección del gen mecA por PCR.48 -Genotipos de las cepas de S. aureus. Diferencias genéticas entre cepas de S. aureus que se identifican por: tipificación por PCR del tipo de SSCmec, 49 determinación de la huella digital genómica mediante digestión inicial con la enzima Sma I y electroforesis de campos pulsados 50
y secuenciación de alelos de 7 genes caseros (MLST). 25
-Tiempos de Duplicación: Tiempo en minutos en el que las cepas se duplican al reproducirse por conjugación y que se determina mediante curvas de crecimiento en medios de cultivo adecuados. 51, 52
21 Identificación inicial de S. aureus y de resistencia a meticilina
Los laboratorios de microbiología de los hospitales participantes utilizaron manuales de procedimientos estándar, control de calidad y cepas de referencia ATCC para garantizar la correcta identificación de S. aureus y la realización de pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos. En todos los sitios la identificación se realizó de acuerdo a los lineamientos recomendados por la Asociación Americana de Microbiología. 47 La búsqueda de resistencia a meticilina se realizó por difusión en disco utilizando discos conteniendo 30 µg de cefoxitina.48
Conservación y envío de las cepas de S. aureus
Todas las cepas de S. aureus que se aislaron de episodios de infecciones nosocomiales y comunitarias fueron conservadas en cada uno de los laboratorios de microbiología de los hospitales participantes. De cada cultivo se realizó una resiembra y se mantuvo en crecimiento durante toda la noche. Al día siguiente la caja completa se transfirió a tubos eppendorff de 2 mL conteniendo l mL de sangre de caballo y se conservó en congelación a –70° C. Cada mes se enviaron a la Unidad de Investigación Biomédica en la ciudad de Durango, donde se reidentificaron de acuerdo a los lineamientos estándar y se realizó una re-siembra para nuevamente colectarse en sangre de caballo y mantenerse a –70° C hasta la realización de los diferentes procedimientos de biología molecular, pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos y tiempos de duplicación.
Susceptibilidad a antimicrobianos En el laboratorio de la Unidad de Investigación Biomédica se realizó la determinación de susceptibilidad a antibióticos por el método de difusión de disco (Kirby-Bauer) de acuerdo a los lineamientos del CLSI vigentes. teicoplanina,
clindamicina,
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Se incluyeron los siguientes antibióticos: vancomicina,
trimetoprim/sulfametoxazol,
eritromicina,
gentamicina,
rifampicina y penicilina. Los resultados se evaluaron después de un periodo de incubación de 24 h a 35° C de acuerdo a los puntos de corte recomendados.
22 Extracción de DNA Para la extracción del DNA cromosómico de las bacterias se realizó el siguiente procedimiento: se tomaron dos colonias de un cultivo de 18 a 24 horas de edad, se colocaron en caldo soya tripticasa y se crecieron en agitación constante a 35° C durante dos horas. Se realizó un lavado de la bacteria y la extracción se completó con el sistema UltraCleanTM Microbial DNA Kit (MO Bio Laboratories, Inc. Solana Beach, CA). La concentración obtenida con esta técnica es de ~200 ng/µl y se corroboró corriendo una muestra en un gel de agarosa con un marcador de peso molecular. El DNA se conservó en congelación a –20° C.
Electroforesis de Campos Pulsados El crecimiento, la digestión y electroforesis de las cepas obtenidas se realizó de acuerdo al procedimiento recomendado por McDougal 50 y descrito detalladamente en el anexo 1.
Tipificación de SCCmec por PCR con iniciadores múltiples
La tipificación del elemento cromosómico que acarrea el gen de resistencia a meticilina se efectuó mediante PCR de tipo múltiplex que está basada en el uso de iniciadores múltiples para detectar las secuencias de los diferentes tipos de SSCmec. En esta técnica se seleccionan ocho locus (A-H) con base en secuencias previamente descritas, en la tabla 1 se muestran los locus con sus respectivos cebadores, secuencias de oligonucleótidos, tamaño esperado del producto, y tipo de SCCmec. 49 El protocolo para PCR múltiple se realizó con mezclas totales de 50 µl las cuales contenían: 1X de amortiguador de PCR, Master mix (Promega) que contenían 400 µM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfatados, 400 nM de los cebadores CIF2 F2, CIF2 R2, MECI P2, MECI P3, RIF5 F10, RIF5 R13, puB110 RI y pT181 R1; 800nM de los cebadores DCS F2, DCS R2, MECA P4, MECA P7, y IS431 P4; 200 nM de los cebadores KDP F1, KDP R1, RIF4 F3 y RIF4 R9; 3mM de MgCl2 y aproximadamente 200 ng de ADN. Los parámetros para el termociclador fueron los siguientes: pre-desnaturalización a 94°C por 5 min; 30 ciclos a 94°C por 30 s, 55°C por 30 s y 72°C por 30 seg.; post-extensión a 72°C por 7 min, y se mantuvieron a 4°C después del último ciclo. Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2 % con amortiguador 0.5 X de Tris-borate-EDTA con un
23 voltaje de 100 V. Se tiñeron con bromuro de etidio para su visualización en un transiluminador con luz ultravioleta.
Detección de genes que codifican para Panton-Valentine-Leucocidin (PVL)
Aunque inicialmente se le atribuyó a PVL un papel importante en la patogenia de las infecciones secundarias a SARM-AC en la actualidad este rol no es claro, sin embargo todas las cepas que portan el SCCmec tipo IV poseen además el gen de PVL y se le considera como un marcador genético de estas cepas. Su presencia en SARM-AH es poco frecuente. Para su identificación se utilizaron los iniciadores previamente descritos por Lina y cols. 53 El protocolo para la detección de este gen fue el siguiente: amortiguador de PCR buffer 1X, 200 µM de cada uno de los deoxinucleótidos trifosfatados, 50 nM de cada uno de los iniciadores, MgCl2 1.5 mM, 0.25 de Taq polimersa y 5 ng de ADN. Los parámetros del termociclador fueron 94°C, 30 s; 55°C, 30 s; 72°C, 30 s y mantenimiento a 4°C. Tabla 1. Locus, secuencias de oligonucleótidos, tamaño esperado y tipo de SCCmec en la tipificación por PCR de tipo multiplex. Locus A B C D E F G H mecA
Primer CIF2 F2 CIF2 R2 KDP FI KDP RI MECI P2 MECI P3 DCS F2 DCS RI RIF4 F3 RIF4 R9 RIF5 F10 RIF5 R13 IS431 P4 pUB110 RI IS431 P4 pT181 RI MECA P4 MECA P7
Secuencia de oligonucleótidos TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG ATTTACCACAAGGACTACCAGC AATCATCTGCCATTGGTGATGC CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG ATCAAGACTTGCATTCAGGC GCGGTTTCAATTCACTTGTC CATCCTATGATAGCTTGGTC CTAAATCATAGCCATGACCG GTGATTGTTCGAGATATGTGG CGCTTTATCTGTATCTATCGC TTCTTAAGTACACGCTGAATCG GTCACAGTAATTCCATCAATGC CAGGTCTCTTCAGATCTACG GAGCCATAAACACCAATAGCC CAGGTTCTCTTCAGATCTACG GAAGAATGGGGAAAGCTTCAC TCCAGATTACAACTTCACCAGG CCACTTCATATCTTGTAACG
Oliveira DC, de Lencastre H. (2002)
Tamaño esperado (pb) 495
Tipo de SCCmec I
284
II
209
II, III
342
I, II, IV
243
III
414
III
381
IA
303
IIIA
162
Control Interno
24 Tipificación de secuencias de locus múltiples (MLST)
En este procedimiento se determinaron las secuencias de fragmentos internos de siete genes altamente conservados de ∼ 500 pb (house-keeping genes). Este procedimiento ha sido validado para S. aureus y es una herramienta que permite determinar, de acuerdo a secuencias disponibles en el sitio www.mlst.net, si la cepa de S. aureus evaluada pertenece a clonas ya conocidas o si se trata de clonas nuevas. Para cada gen las diferentes secuencias se designan como alelos distintos y cada aislamiento es definido por los alelos de cada uno de los siete locus determinando su
perfil alélico o secuencia tipo (ST). Los genes con sus
correspondientes cebadores y secuencias que se utilizaron para la tipificación de S. aureus, se muestran en la tabla 2. 25
TABLA 2. Genes que se utilizan para la tipificación de S. aureus por MLST iniciadores y sus secuencias. Gene ArcC AroE GlpF Gmk Pta Tpi YqiL
Primer arcC-Up arcC-Dn aroE-Up aroE-Dn glpF-Up glpF-Dn Gmk-Up Gmk-Dn pta-Up Pta-Dn tpi-Up tpi-Dn yqiL-Up yqiL-Dn
Secuencia (5’-3’) TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC AGGTATCTGCTTCAATCAGCG ATCGGAAATCCTATTTCACATTC GGTGTTGTATTAATAACGATATC CTAGGAACTGCAATCTTAATCC TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC ATCGTTTTATCGGGACCATC TCATTAACTACAACGTAATCGTA GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA TTTGCACCTTCTAACAATGTTAC CAGCATACAGGACACCTATTGGC CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC
Enright MC et al (2000) El volumen total de la mezcla para PCR fue de 50 µl y contenía 0.5 µl (0.5 µg) de ADN cromosómico, 0.5 µg de cada primer, 1 U de Taq polimerasa, 5 µl de amortiguador 10X, y 0.2 nM de deoxinucleótidos trifosfatados. El programa del termociclador para la PCR fue: desnaturalización inicial a 95°C por 5 min, 30 ciclos de alineación a 55°C l min, una extensión a 72° l min, desnaturalización a 95°C 1 min y una etapa final de extensión a 72°C por 5 min.
25 Los productos de PCR fueron purificados con el sistema QIAquick PRC purification kit (Quiagen, Foster city CA). Las secuencias se determinaron con los cebadores utilizados en la amplificación inicial. (Seqwrite en Houston, Tx)
Asignación, interpretación y comparación de las secuencias de locus múltiples (MLST).
De acuerdo a las secuencias obtenidas de cada uno de los 7 locus. Los alelos se numeraron consecutivamente. El perfil alélico obtenido se comparó con el perfil de cepas nosocomiales y comunitarias de diversas regiones geográficas disponible en línea (www.mlst.net). Las secuencias se consideraron como alelos distintos cuando se encontró diferencia en al menos un nucelótido.
Tiempos de duplicación de cepas nosocomiales y comunitarias. La capacidad de sobrevivir, multiplicarse, competir con otros microorganismos y, finalmente, colonizar las mucosas, refleja que una bacteria tiene un buen estado fisiológico. Los tiempos de duplicación fueron estimados mediante la inoculación de una colonia de un cultivo de toda la noche en 25 mL de caldo soya tripticasa mantenido en agitación y temperatura constante hasta la obtención de las muestras para cada uno de los tiempos requeridos para el cálculo de los tiempos de duplicación o generación. El número de colonias se estimó mediante la siembra de alicuotas de diluciones seriadas de las muestras obtenidas en tiempos determinados. La fórmula para cálculo de tiempos de generación y el sustento de la misma se muestran en la Figura 1. En este proyecto se determinaron los tiempos promedio de duplicación de las cepas de acuerdo al tipo de SCCmec y a su ST.
26 Debido a que el crecimiento bacteriano ocurre por división binaria, el incremento en una población bacteriana es considera una progresión geométrica G (tiempo de duplicación) = t (tiempo en minutos u horas) / número de generaciones B = número de bacterias al inicio del intervalo de tiempo b = número de bacterias al final del intervalo de tiempo n = número de generaciones (número de veces que la población bacteriana se divide durante el intervalo de tiempo)
Tiempo de generación o duplicación: Intervalo de tiempo requerido por las células o población bacteriana para duplicarse. Ecuación que expresa el crecimiento por división binaria b = B x 2n Se despeja n logb = logB + nlog2 n = logb - logB = 3.3logb/B .301 G = t/n = t/3.3logb/B = 120 _ 3.3 log b/B
Figura 1. Procedimiento y y método usado para el cálculo de los tiempos de duplicación.
MW2 n1 n2 n3 1c
46 0
36 0
27 0
18 0
90
2c 3c
B
AS A
L
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Gerhardt P, (2002)
Kenneth T. (2005)
Análisis Estadístico
Se utilizó estadística descriptiva para la presentación de resultados en tablas y gráficas y estadística paramétrica para contrastar los tiempos de duplicación entre los diferentes tipos clonales. Para la comparación entre dos tipos de clonas se utilizó t- de Student y para la contrastación de los tiempos de duplicación entre más de dos tipos clonales se utilizó análisis de varianza no paramétrico (Kruskal- Wallis). Se utilizó el programa SPPS para Windows versión 10.0 (1999). La similitud entre las cepas de SARM fueron calculadas usando el coeficiente de Dice, se construyó un dendrograma de la relación entre cepas. La fuerza del dendrograma fue estimado por el coeficiente de correlación cofenético (CCCr) usando la prueba no paramétrica de Mantel. Se utilizó el programa NTSYSpc 2.02 (1998).
27
ASPECTOS ÉTICOS
Se considera como un estudio sin riesgo, según el Artículo 17, Incisos I, II y III y Artículo 65 del Reglamento de la Ley General en Salud en Materia de Investigación para la salud. Durante todo el estudio la información es manejada en forma confidencial y no se mencionan nombre ni datos de los pacientes en forma individual en la presentación de resultados en congresos o publicaciones . El estudio se evaluó y fue aprobado por la Comisión Nacional de Investigación Científica del Instituto Mexicano del Seguro Social (número de registro 2004-161-003) y por lo Comités de Ética de cada Hospital Participante (Anexo 2).
RECURSOS FINANCIEROS
Este proyecto se efectuó con fondos del financiamiento de Fondos Sectoriales CONACYT otorgado al proyecto “EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE S. aureus RESISTENTE A METICILINA ADQUIRIDO EN HOSPITALES Y EN LA COMUNIDAD” con el número de registro SALUD-2003-C01-091, de The Fogarty Internacional Center of the National Institutes of Health Grant D43 TW01036 y del Fondo de Fomento a la Investigación FOFOI 2005/1/I/046 (Anexo 3)
28
INSTITUCIONES Y PERSONAL PARTICIPANTE
HOSPITAL GENERAL REGIONAL NO 1 IMSS. DURANGO Unidad de Investigación Médica en Epidemiología Clínica Dr. Gerardo Martínez Aguilar Comité de Infecciones Nosocomiales Enf. Carmen Anaya Arriaga BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE Texas Children’s Hospital/Infectious Diseases Laboratory Kristina Hulten Ph.D. Edward O Mason, Jr., Ph.D. UNIDAD DE MEDICINA EXPERIMENTAL DE LA FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Laboratorio de Infectología Microbiología e Inmunología Clínica Dra. Celia. M. Alpuche Aranda LABORATORIO ESTATAL DE SALUD PÚBLICA DE SINALOA. SS Dr. Eduardo Llausas Magaña HOSPITAL DEL NIÑO DE SINALOA Comité de Infecciones nosocomiales Dr. Ángel León Rito HOSPITAL GENERAL DE DURANGO. SS Laboratorio de Microbiología Dr. Juan Carlos Tinoco F Comité de Infecciones Nosocomiales Enf. María Cruz Pérez Prado
HOSPITAL CENTRAL “IGNACIO MORONES PRIETO” Facultad de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de San Luis Potosí Dr. Daniel Noyola MC Fidel Martínez HOSPITAL INFANTIL DE MEXICO “FEDERICO GOMEZ” DC Norma Velázquez Guadarrama Laboratorio de Bacteriología UNIVERSIDAD DE COLIMA. FACULTAD DE MEDICINA Dr. Oscar Newton Sánchez Dr. Fabián Rojas Larios
29
RESULTADOS
Durante el periodo de estudio se analizaron un total de 426 cepas de S. aureus, 351 (82.4%) de origen nosocomial y 75 (17.6%) comunitarias. La distribución por centro de acuerdo a la susceptibilidad a la meticilina y a su origen nosocomial o comunitario se muestran en la tabla 3, donde se muestra respecto a la resistencia a meticilina que el 23.6% (83/351) de origen nosocomial y 58.6% (44/75) de origen comunitario fueron resistentes a este antibiótico. Es evidente las amplias variaciones en las proporciones de resistencia a meticilina en las cepas nosocomiales desde 1.2% en Durango hasta 83% en San Luís Potosí. Solo se encontraron 3 cepas de SARM de origen comunitario.
Tabla 3. Cepas de S. aureus por susceptibilidad a meticilina y hospitales participantes. CEPAS de Staphylococcus aureus N = 426 (100%) HOSPITALES PARTICIPANTES
Hospital de Pediatría del CMO IMSS
Nosocomiales
Comunitarias
n = 351 (82.4%)
n = 75 (17.6%)
SARM
SASM
SARM
SASM
n=83
n = 268
n = 44
n =31
10
19
0
0
1
6
1
8
1
79
0
20
2
98
0
0
53
66
1
3
(Guadalajara, Jal) Hospital Pediátrico de Sinaloa (Culiacán Sin) Hospital General de Durango (Durango Dgo.) Hospital General de Colima (Colima,Col.) Hospital
Central
“Ignacio
Prieto” San Luis Potosi
Morones
30 Hospital Infantil de México
16
0
1
0
-
-
41
0
“Federico Gómez” Texas Children’s Hospital Houston, TX.
Las cepas aisladas de Guadalajara fueron colectadas durante el año 2005 y las de San Luís Potosí, Colima y México durante el 2006. Las cepas de Durango y Sinaloa fueron recolectadas durante todo el periodo de estudio. Debido a que solo se obtuvieron 3 cepas de SARM de origen comunitario en México se utilizaron 41 cepas donadas por el cepario del laboratorio de enfermedades infecciosas del Texas Children´s Hospital de Houston, TX para determinar y comparar los tiempos de duplicación. En la tabla 4 se muestran los porcentajes de susceptibilidad de cepas nosocomiales y comunitarias a diferentes antimicrobianos. Como era esperado se encontraron mayores porcentajes de resistencia en las cepas de origen nosocomial que en las comunitarias, principalmente en antibióticos pertenecientes a los grupos de macrólidos y quinolonas.
Tabla 4. Susceptibilidad a antibióticos de cepas nosocomiales y comunitarias de S. aureus aisladas en los hospitales participantes. (N = 426) Antibióticos
Cepas Nosocomiales
Cepas de la comunidad
n = 351 (82.4%)
n = 75 (17.6%)
%S
% NS*
%S
% NS
Ciprofloxacina
72
28
91
9
Clindamicina
78
22
96
4
Eritromicina
61
39
83
17
Gentamicina
94
6
99
1
Linezolid
100
0
100
0
Rifampicina
95
5
100
0
Vancomicina
100
0
100
0
T/S
89
11
100
0
31 Quinupristina
98
2
100
0
Cefoxitima
76
24
41
59
S = Sensibles
NS = No sensibles
* = cepas con susceptibilidad intermedia y resistentes.
Por electroforesis de campos pulsados, se documentaron varias clonas circulando en los hospitales participantes. Se construyó un dendrograma de la relación entre las cepas, la similitud entre ellas se calculó por medio del coeficiente de Dice. (Figura 3). La fuerza del dendrograma fue estimado por el coeficiente de correlación cofenético (CCCr) usando la prueba no paramétrica de Mantel. De acuerdo al porcentaje de similitud entre las cepas estudiadas el dendrograma permitió identificar 21 grupos diferentes con clonas predominantes en algunos centros hospitalarios como las clonas de los grupos A, C, F, I. Las clonas del grupo S fueron similares a la clona USA 300. El dendrograma reveló un 94% de similitud entre las clonas F y G y un 93 % entre las clonas A, B y C.
32
A
B
C
D E
F
G H
I
r = 0.927
J
p= 0.0004
K L
M
P
N
O
Q R
S T
U
0.00
0.25
0.50
0.75
425-HIM 931-HIM 488-HIM 428-HIM 10-HIM 882-HIM 375-HIM 234-HIM 32-SLP 46-SLP 56-SLP 57-SLP 10-SLP 42-GDL 81-SLP 10-GDL 54-HIM 635-HIM 60-SLP 60-SLP 76-SLP 63-SLP 47-SLP 6-SLP 24-SLP 42-SLP 41-SLP 714-H 828-HIM 867-HIM 817-HIM 18-SLP 19-SLP 25-SLP 26-SLP 27-SLP 33-SLP 5-SLP 7-SLP 15-SLP 1-SLP 3-SLP 7-SLP 69-SLP 8-SLP 9-SLP 14-SLP 17-SLP 72-SLP 146-HG 28-SLP 58-SLP 61-SLP 44-SLP 78-SLP 31-SLP 59-SLP 48-SLP 121-SLP 23-SLP 67-SLP 66-SLP 68-SLP 50-GDL 37-GDL 21-GDL 22-GDL 5-GDL 52-GDL 188-COL 71-SLP 53-SLP 36-SLP 14-SLP 41-GDL 45-GDL 101-DF 163-HIM-IV 77-SLP 17-SIN USA300 186-COL 39-SLP 150-HIM 1.00
Dice Coefficient
Figura 2. Dendrograma de los porcentajes de similitud entre patrones de macrorrestriccion (Sma I) de DNA de cepas de S. aureus resistente a meticilina aislados en algunos hospitales de México.
33 En todas las cepas de SARM se documentó la presencia del gen mecA, así mismo, por medio de PCR con iniciadores múltiples se determinó el tipo de SCCmec presente en las cepas. En 82 (98.7%) de las 83 cepas de SARM de origen nosocomial se encontró el SCCmec Tipo II y en la restante el tipo IV; en 43 (97.7%) de las 44 cepas de origen comunitario se encontró el tipo IV de SSCmec y en la restante el tipo II. En las figura 2 se muestran cepas control con los diferentes tipos de casete de resistencia y algunas cepas de los sitios participantes.
A 1
3
4
5
6
7
1
S C C m e cIII
1 7 4 9
1 7 4 8
S C C m e cII
S C C m e cII
1 7 4 6
S C C m e cIV
S C C m e cI
MW Kb 500 500 400 400 300 300
2
200 200 3 9 -S L P
1 7 -S L P
1 7 4 7
100 100
Linea1 = MW; Lineas 2 a 5 Controles de SSC I-IV; Lineas 6 y 7 Cepas 17 y 39 de SLP
B
34 1
2
3
4
5
6
7
1
Línea 1= MW; Línea 2 Control de SCC II; Línea 6 control SSC III-A; Líneas 3,4,5 y 7 Cepas de Guadalajara con SCCmec II. Figura 3. Tipificación del casete cromosómico de resistencia por PCR Multiplex en cepas de San Luis Potosí (A) y de Guadalajara (B)
Cuando se compararon los promedios de los tiempos de duplicación de las cepas de S. aureus de acuerdo a la presencia o no de casete cromosómico de resistencia y al tipo presente en las mismas no se encontraron diferencias estadísticamente significativas. (p = 0.187). Así mismo no se encontraron diferencias en los tiempos de duplicación de las cepas de acuerdo a su ST (p = 0.765). Tablas 5 y 6
35 Tabla 5. Tiempos de duplicación en minutos en cepas de S. aureus susceptibles y resistentes a meticilina y de acuerdo al tipo de casete cromosómico de resistencia. Cepas Susceptibles
Cepas Resistentes a Meticilina *p
n = 60
sin casete n = 30
SSCmec II
SSCmec IV
N = 30
n = 30
Mediana
44.4
43.2
52.1
(Rango)
(30.4-87.0)
(26.3—223.7)
(30.5-92.8)
0.187
*Análisis de Kruskal-Wallis Tabla 6. Tiempos de duplicación en minutos en cepas de S. aureus de acuerdo a su secuencia tipo determinada por MLST.
Secuencias Tipo ST5 n=5
ST8 n=4
ST97 n=1
ST1011 n=4
*P
45.6
51.6
47.9
49.3
0.765
(26.3-223.7)
(30.5-92.8)
Mediana (25.4-218)
(Rango)
*Análisis de Kruskal-Wallis Por electroforesis de campos pulsados, se documentaron varias clonas circulando en los hospitales participantes. Se construyó un dendrograma de la relación entre las cepas, la similitud entre ellas se calculó por medio del coeficiente de Dice. (Figura 3). La fuerza del dendrograma fue estimado por el coeficiente de correlación cofenético (CCCr) usando la prueba no paramétrica de Mantel. De acuerdo al porcentaje de similitud entre las cepas
36 estudiadas el dendrograma permitió identificar 21 grupos diferentes con clonas predominantes en algunos centros hospitalarios como las clonas de los grupos A, C, F, I. Las clonas del grupo S fueron similares a la clona USA 300. El dendrograma reveló un 94% de similitud entre las clonas F y G y un 93 % entre las clonas A, B y C.
La secuenciación de los 7 genes caseros de cepas seleccionadas permitió identificar las siguientes secuencias tipo (ST) entre las cepas estudiadas: 5, 8, 97 1011. Las ST 5, 8 y 97 se han reportado previamente en cepas de SARM identificadas en diferentes regiones del mundo. La ST 5 se ha encontrado en las clonas USA 100 y USA 800 en hospitales de los Estados Unidos de Norteamérica. La ST 8 se ha documentado en la clonas USA 300 las cuales poseen SCCmec tipo IV a y son PVL positivas. La secuencia 1011 fue asignada como una nueva ST ya que las cepas que la poseen presentan un polimorfismo en alelo arc. A este alelo se le asignó el número 126 y por lo tanto se añadió a la base de datos de MLST como una nueva cepa. En la tabla 7 se muestra los alelos de los 7 genes caseros y la ST correspondiente.
Tabla 7. Secuencia tipo identificadas en cepas seleccionadas de SARM de los hospitales participantes. Alelos Cepas
ST
14 SIN
Arc
Aro
Glp
Gmk
97
3
3
1
17SIN , 77 SLP,163 HIM,186 COL.
8
3
1
5G, 21G, 22G, 14SLP, 17 SLP,
5
1
1011
126
23SLP, 66SLP, 78SLP,146 HG
Pta
Tpi
Yqi
1
4
4
3
1
1
1
5
3
4
1
4
12
1
10
4
1
4
12
1
10
La ST 1011 no se había reportado previamente en otras regiones por lo que se añadió a la base de datos de MLST como una nueva cepa.
37
DISCUSIÓN
En este estudio no se encontraron diferencias en los tiempos de duplicación de cepas de SARM de acuerdo a: susceptibilidad a meticilina, tipo de SCCmec, ni a sus secuencias tipo. La tipificación molecular de cepas de SARM permitió documentar la emergencia de SARMAC y las clonas circulando en algunos hospitales de México. La secuenciación de genes caseros mostró la presencia de una clona no descrita previamente como causal de infecciones nosocomiales en San Luis Potosí y Durango.
Uno de los factores que se han propuesto para explicar la rápida diseminación de SARM en la comunidad es el que las cepas comunitarias tienen tiempos de duplicación menores a los de cepas de adquisición nosocomial.24 Sin embargo, cuando comparamos los tiempos de duplicación de cepas de S. aureus sensible y resistente a meticilina, de acuerdo al tipo de SCCmec y a sus secuencias tipo no encontramos diferencias significativas entre los mismos, generando la interrogante de: ¿A qué factores se pueden atribuir la divergencia entre nuestros resultados y los reportados por Okuma y cols? 1) A diferencia de las cepas de origen nosocomial que se agrupan en pocos linajes genéticos, las cepas de SARM-AC poseen múltiples linajes
23
por lo que además de los diferentes tipos de SCCmec, diferencias en otras
partes del genoma bacteriano pueden condicionar diferencias en los tiempos de duplicación; 2) Se observan variaciones importantes en los tiempos de duplicación en minutos, por lo tanto si solo se compara una cepa o un número limitado de las mismas tal como se realizó en el estudio de Okuma K, et al.24 las diferencias encontradas pueden ser atribuidas a estas variaciones más que a diferencias reales entre las cepas. En nuestro estudio documentamos estas amplias variaciones al interior de los grupos comparados, por lo tanto postulamos que existen otros factores además de los casetes cromosómicos de resistencia y de las secuencias tipo que determina los tiempos de duplicación de las cepas de S. aureus. El estudio de los genomas completos de cepas representativas de determinadas clonas así como de factores genéticos del hospedero permitirán mejorar el conocimiento sobre los mecanismos que determinan la velocidad de duplicación de las cepas y su diseminación en ciertas comunidades. 3) Recientemente, en modelos de conejo, se ha demostrado que la presencia de
38 ACME (Arginine Catabolic Mobile Elment) incrementa la fortaleza física de la clona USA 300 (clona de SARM-CA diseminada globalmente) y que la eliminación del SCCmec no afecta la fortaleza de la cepa, postulándose que SARM-AC podría haber emergido y persistido en la comunidad debido a que la presencia del SCCmec tipo IV no impone un costo a la fortaleza de la bacteria al menos en modelos in vitro e in vivo y por el contrario la presencia de los tipos I, II y III de SCCmec impone un costo a la fortaleza bacteriana disminuyendo los tiempos de duplicación.54, 55 Sin embargo, al igual que en nuestro trabajo, los estudios que han demostrado una menor tasa de crecimiento de las cepas que poseen SCCmec 1-III no han evaluado el papel del elemento ACME por lo que no es posible definir si la menor tasa de crecimiento se debe a la ausencia de mismo y/o a la presencia de otros elementos presentes en estas islas genómicas.
Con respecto a la caracterización molecular de las cepas, ECP puede detectar modificaciones genómicas que surgen de mutaciones en el sitio de reconocimiento de la enzima usada y de la recombinación, deleción o inserción que afecta el tamaño del fragmento. 56 En nuestro estudio, por ECP, se encontraron varias clonas circulantes, algunas de ellas en hospitales de diferentes ciudades señalando la facilidad para su diseminación o reflejando movimientos de pacientes o personal colonizado entre hospitales. El carácter transversal de este trabajo solo nos permite plantear estas hipótesis, su confirmación requiere de estudios prospectivos en los que se determinen si los pacientes y personal de salud se colonizan por estas cepas y cuales son las dinámicas que se establecen entre ellas y la flora habitual.
En la actualidad las infecciones nosocomiales por SARM son un problema endémico y epidémico para muchos hospitales de todo el mundo aunque su frecuencia varía entre los diferentes países.57 La tipificación molecular de colecciones de cepas de SARM ha permitido determinar que el número de clonas asociadas a infección nosocomial es limitado y que cinco de ellas representan cerca del 70% de los aislamientos recuperados en hospitales.
8
La
prevalencia de SARM en hospitales mexicanos no está determinada aunque existen reportes aislados de algunos centros hospitalarios de tercer nivel de atención. En el Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional del IMSS documentó la presencia de una clona (secuencia tipo ST30-SCCmec IV) predominante durante los años 1997-2000 y que fue
39 remplazada en los años siguientes por la clona New York -Japon (secuencia tipo ST5-SCCmec II).
58
De igual manera en un hospital de tercer nivel de atención de Guadalajara, Jal., se
encontró una clona predominante de SARM entre los años 1999-2003 con características muy similares a la clona New York/Japón descrita inicialmente en New York y Tokio y actualmente ampliamente diseminada en EUA.59 En este estudio documentamos la presencia de una clona predominante, con características semejantes a la clona New York /Japón o USA 100 (ST5-SSCmec II) en cinco de los hospitales participantes (Guadalajara, Durango, Colima, San Luís Potosí y Ciudad de México) Por ECP la clona difiere de la New York /Japón en la posición de las bandas pero cumple con los criterios de Tenover
56
para considerarse como la
misma clona, la secuencia tipo es 5, tiene SCCmec tipo II y es PVL negativo. Así mismo en los hospitales de Guadalajara y San Luís Potosí se identificaron algunas cepas que por ECP difieren de la clona predominante en la posición de bandas. La tipificación por MLST mostró una secuencia tipo ST 1011 no previamente reportada en otros sitios (de acuerdo a la clasificación del sitio oficial de MLST) y que difiere de la ST5 por la presencia de una mutación en una base en el gen Arc y a la que se le asignó la ST 1011. Esta clona tiene el SSCmec tipo II y a diferencia de la New York-Japón que posee el alelo Arc tipo 1 se le asignó el número 126. Aparentemente es una clona derivada de la New York/Japón que se ha adaptado a estos hospitales. Debido al diseño de este estudio no podemos determinar el momento de su aparición, ni sabemos si es una clona con la capacidad de adaptación de las clonas actualmente circulando en hospitales o si era remplazada por estas, por lo que es necesario mantener un sistema de vigilancia epidemiológica y molecular continua
Como era de esperarse la mayoría de las cepas de SARM nosocomiales tuvieron el SCC mecII confirmando su origen nosocomial, sin embargo identificamos dos cepas de S. aureus aisladas de pacientes con infección nosocomial pero que poseían el SCCmec tipo IV. Este hallazgo puede tener dos explicaciones posibles: 1) Señalar la presencia de cepas de SARMAC causando infecciones nosocomiales, fenómeno que se ha descrito en sitios con alta prevalencia de SARM-AC 60 o 2) Tratarse de cepas de origen nosocomial con SCCmec-IV las cuales a diferencia de las de adquisición comunitaria son PVL negativo, poseen la ST 5 y se han clasificado en EUA como USA 800 50 Estas dos cepas fueron PVL negativo, sin embargo
40 no fue posible realizar la secuenciación de los genes caseros para determinar el tipo clonal y tener la certeza total de que se trata de la clona USA 800.
En los últimos años se ha descrito la presencia de SARM-AC en países de diversos continentes.38 En algunas ciudades de los EUA se han reportado una alta frecuencia de infecciones por SARM-AC causando, predominantemente infecciones de piel y tejidos blandos pero también infecciones graves algunas veces fatales.19, 60 El estudio molecular de estas cepas muestra, que a diferencia de las nosocomiales, poseen el SCCmec tipo IV, el gen que codifica para PVL y por MLST son ST8 y que se han denominado USA 300 y USA 400 de acuerdo a la clasificación propuesta por Mc Dougal
50
y que se encuentran ampliamente
diseminadas en los EUA. En este estudio se encontraron 4 cepas idénticas por ECP a la USA 300. Estas se identificaron en los siguientes hospitales: Hospital Pediátrico de Sinaloa, Hospital Infantil de México, y los hospitales generales de Colima y San Luis Potosí. La cepa aislada en el hospital de Sinaloa se obtuvo de un niño con infección de piel y tejidos blandos, esta cepa es PVL positiva y mediante tipificación por MLST se determinó que tiene la ST 8. Estos datos confirman la aparición de SARM-AC y específicamente la clona USA 300 en nuestro país. Aunque solo se trata de casos aislados, el potencial que posee esta clona para diseminarse rápidamente señala la necesidad de establecer sistemas de vigilancia epidemiológica continuos.
La emergencia de SARM-AC en diversos continentes y la alta prevalencia de infecciones en las cuales esta bacteria desempeña un papel importante sugieren que estas cepas posen características especiales que les permiten colonizar y causar infecciones superficiales y graves en niños y adultos. Inicialmente la virulencia de estas cepas se atribuyó a la presencia del gen PVL que codifica para una toxina con capacidad de lisar leucocitos y se asoció con mayor mortalidad y con la presencia de complicaciones graves tales como neumonía necrozante 61 e infecciones musculoesqueléticas. 18 Estudios en modelos animales con cepas de SARM en los que se suprimió el gen PVL mostraron que conservaron su virulencia y se propone un nuevo factor de virulencia de tipo peptídico denominado modulina soluble en fenol (PSM por sus siglas en inglés). 62
41
CONCLUSIONES
1. No se encontraron diferencias en los tiempos de duplicación de cepas de SARM de acuerdo al tipo de SCCmec ni de acuerdo a sus secuencias tipo. Tampoco entre cepas susceptibles y resistentes a meticilina.
2. Los tiempos de duplicación de cepas nosocomiales y comunitarias no están determinados por el tipo de SCCmec o los tipos clonales por lo que consideramos que existen otros factores que determina los tiempos de duplicación de las cepas de S. aureus.
3. El análisis de los genotipos de cepas nosocomiales permitió documentar las clonas circulando en algunos hospitales Mexicanos. La clona predominante es muy semejante a la clona New York-Japón encontrada anteriormente en el Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI y en el Hospital Civil de Guadalajara por lo que es la clona predominante en infecciones nosocomiales en pacientes mexicanos.
4. Documentamos la presencia de una clona causante de infección nosocomial no reportada previamente y que muy probablemente es descendiente de la clona New York-Japón.
5. Documentamos la emergencia de SARM-AC en algunas ciudades y las cepas son similares a la clona USA 300 ampliamente diseminada en EUA.
6. Documentamos mediante la tipificación molecular de cepas de SARM las clonas circulando en algunos hospitales de México así como la presencia de SARM-AC. La secuenciación de genes caseros mostró la presencia de una clona no descrita previamente causado infección nosocomial en San Luis Potosí y Durango.
42
PERSPECTIVAS
En este estudio no se encontraron diferencias -in vitro- en los tiempos de duplicación de cepas de S. aureus resistentes y susceptibles a meticilina ni tampoco en cepas de SARM de acuerdo al tipo de SCCmec o a sus secuencias tipo. Sin embargo el comportamiento de las cepas puede ser diferente en las condiciones habituales de colonización de piel y mucosas por lo que es importante realizar estudios prospectivos, a mediano plazo, en pacientes y personal de salud en los que se determine la interacción con la flora comensal y las dinámicas de colonización y multiplicación de diferentes clonas de SARM.
La secuenciación de genes caseros mostro la presencia de una clona (ST1011) no descrita previamente en la literatura causado infección nosocomial en San Luis Potosí y Durango. El hallazgo de esta clona, aparentemente derivada de la New York-Japón, requiere que la vigilancia epidemiológica establecida para este estudio se implemente de forma continua ya que al igual que la New York-Japón esta clona puede tener características que favorezcan su establecimiento y diseminación en hospitales mexicanos.
El diseño transversal de este estudio nos permitió identificar la aparición de una nueva clona sin embargo no podemos determinar el momento de su aparición por lo que además de los sistemas de vigilancia epidemiológica prospectivos implementados por los comités de prevención y control de infecciones nosocomiales en los hospitales participantes es necesario continuar con el estudio molecular de las cepas de SARM tener la capacidad de identificar la aparición de clonas circulando en otros países y/o la emergencia de nuevas clonas. Esta información será de gran utilidad para implementar las medidas adecuadas para limitar su diseminación.
43
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49
ANEXO 1
PROTOCOLO DE ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSADOS
A.- PREPARACIÓN DE LOS BLOQUES
DÍA 1
1. Se pasa la bacteria a una placa de agar.
DÍA 2 2. Se coloca una colonia en 5 mL de caldo de Soya Tripticasa e incuba a 35o C toda la noche.
DÍA 3
3. Se agita el caldo de soya tripticasa con la colonia. Se toman 400 µl de la bacteria del caldo a los tubos Eppendorf y se centrifuga a velocidad máxima por 1-2 minutos. El botón tiene que ser aproximadamente de este tamaño ●
→ ●
4. Se resuspende el botón en 125 µl de buffer PIV y se mantiene los tubos en hielo durante el procedimiento. 5. Se calienta a 50o C los tubos en baño caliente. Se descongela la lisostafina (1 mg/mL) en hielo. 6. Se derrite la agarosa al 1.6% (0.16 g en 10 mL de agua doble destilada) en el microondas y se equilibra en el baño caliente. 7. Se transfieren los tubos bacterianos a los bloques calientes y se equilibran brevemente menos de 5 min., a 50o C. 8. Se toma un tubo a la vez: se agrega 1 µl lisostafina y 125 µl de agarosa. Se mezcla con la pipeta sin crear burbujas e inmediatamente se transfieren a los moldes de bloques. Se hacen 2-3 bloques por aislado.
50 9. Los bloques de agarosa se dejan solidificar a temperatura ambiente. 10. Se etiquetan los tubos con los números de los aislados y se agregan 2 mL de Buffer EC de lisis a cada tubo (Se agrega 2.5 µl de RNAsa (20mg/mL) y 2.5 µl lisostafina (1mg/mL) por mL de solución de EC lisis antes de usar). 11. Se sacan cuidadosamente los bloques de los moldes a los tubos respectivos e incuban a 37oC toda la noche.
DÍA 4
12. Se decanta la solución EC-lisis de los tubos, previniendo que los bloques se escapen. 13. Se agrega 2 mL de buffer ESP a cada tubo. (Se agrega 2.5 µl de Proteinasa K (20 mg/mL por mL de solución antes de usarse). 14. Se incuba a 50o C toda la noche.
DÍA 5
15. Se decanta la solución y se lavan los bloques de agarosa 5 veces por 30 minutos con TE, agitando lentamente a temperatura ambiente. 16. Se guardan los bloques de agarosa en TE a 4o C no más de 3 meses, bien etiquetados con fecha.
B. ELECTROFORESIS Y TINCIÓN
DÍA 1
1. Se remueve un bloque de agarosa por aislado a un tubo Eppendorf de 2 mL (desde el fondo) y se lavan los bloques en 1 mL de 1x buffer enzima de restricción por 5 minutos. 2. Se decanta el buffer, se agrega 300 µl de 1x NEB 4, se agrega 1.5 µl de enzima Sma I (25-30U) y se incuba a 25o C toda la noche.
DÍA 2
51
3.
Se remueve la solución y colocar los bloques de agarosa en TE. Los bloques de agarosa pueden ser guardados por una semana a 4oC.
4. Se elabora 2 litros frescos de buffer de TBE al 0.35x (70 mL de TBE al 10x y 1930 mL de agua). 5. Se realiza el gel: 1g agarosa certificada para campos pulsados (BioRad Cat # 162-0137) en 100 mL TBE al 0.4x. Se vierte el gel dentro de la canastilla ensamblada cuando ~ 50oC. Se remueve el peine e inserta 1/3 del bloque de agarosa dentro de cada hueco. Se usan los huecos de la orillas de la izquierda y derecha para los marcadores. 6. En el microondas se coloca agarosa al 1% de baja fusión y se enfría (20 mL: 0.2 g y 20 mL de buffer 0.35x TBE o agua destilada). Se cubren los hoyos con agarosa para sellar se usan pipetas pequeñas de plástico desechables. 7. Se vierte 1800-2000 mL de buffer dentro de la cámara de electroforesis y se empieza la circulación. Se remueven las burbujas. 8. Se empieza el sistema de enfriamiento. Esto toma cerca de 2-3 minutos para que el enfriador realmente enfríe. Se inserta el gel dentro de la cámara de electroforesis, los pozos cercanos a la parte de atrás de la cámara (opuesta donde tú la levantas). 9. Se programa la máquina. El último programa usado es siempre el que queda grabado. Staphylococcus spp: Block 1: inicio cambiar el tiempo a 5 seg, final cambiar el tiempo de 15 seg, correr el tiempo 10 horas; Block 2: inicial cambiar el tiempo 15 seg, final cambiar el tiempo a 60 seg, correr el tiempo 13 horas; 6 V/ cm; ángulo de 120o. Generalmente corre mejor entre 100 y 135 V. 10. Se tiñe el gel en TBE a 0.35x con 10 µl de bromuro de etidio (5 mg/mL), se agita a temperatura ambiente. 11. Se lava el gel con agua doble destilada en agitación leve por 45 min a 1 hora. 12. Se coloca en un transiluminador con luz ultravioleta. Se captura la foto (exposición: cámara colocada a 6.7 cm). Las imágenes se conservan en el disco duro de la computadora conectada al sistema. Los patrones de restricción son interpretados de acuerdo a las recomendaciones de Tenover y cols.
52
ANEXO 2.
CARTA DE APROBACIÓN DEL PROYECTO
53
ANEXO 3.
COMPROBANTE DE DESIGNACIÓN DE RECURSOS FINANCIEROS
54
55