UNIVERSIDAD DE GRANADA FACULTAD DE MEDICINA

POTENCIALIDAD QUERATINOCÍTICA DE LAS CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON PARA SU UTILIZACIÓN EN INGENIERÍA TISULAR TESIS DOCTORAL

Carolina Marañés Gálvez 2010

Editor: Editorial de la Universidad de Granada Autor: Carolina Marañés Gálvez D.L.: GR 1478-2010 ISBN: 978-84-693-0725-0

POTENCIALIDAD QUERATINOCÍTICA DE LAS CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON PARA SU UTILIZACIÓN EN INGENIERÍA TISULAR

Memoria que presenta La licenciada en Medicina y Cirugía Carolina Marañés Gálvez para aspirar al título de Doctor

Fdo.: Carolina Marañés Gálvez

VºBº El Director de Tesis

VºBº El Director de Tesis

Fdo.: Dr. Ricardo Fernández Valadés Doctor en Medicina y Cirugía Universidad de Granada

Fdo.: Dr. Miguel Alaminos Mingorance Doctor en Medicina y Cirugía Doctor en Ciencias Biológicas Universidad de Granada

VºBº El Director de la Tesis

Fdo.: Dr. Dª. María del Carmen Sánchez Quevedo Doctora en Ciencias Químicas Universidad de Granada

Departamento de Histología Universidad de Granada 2009

Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en los laboratorios del Grupo de Ingeniería Tisular del Departamento de Histología de la Universidad de Granada y financiada por el Proyecto de Investigación titulado “EVALUACIÓN IN VITRO E IN VIVO DE SUSTITUTOS DE MUCOSA ORAL HUMANA GENERADOS EN EL LABORATORIO MEDIANTE INGENIERÍA TISULAR” – PI FIS08/0615 del Fondo de Investigación Sanitaria del Instituto de Salud Carlos III. Parte de los resultados expuestos en esta memoria han sido galardonados con el Premio a la mejor Comunicación Oral presentada en el 2º Congreso Mundial de la Sociedad Internacional de Ingeniería Tisular y Medicina Regenerativa (TERMIS) celebrado en Seúl (Corea del Sur) del 31 de agosto al 3 de septiembre de 2009.

Para Andrea y Alberto

AGRADECIMIENTOS En primer lugar, y ante todo, quiero agradecer este trabajo a mi marido Alberto. Siempre me ha animado y ha creído en mí, y sin su ayuda, insistencia y apoyo diario, nunca lo hubiera conseguido. Sólo él sabe los sacrificios que hemos hecho por mi carrera. A mis Directores de Tesis, en especial, al Doctor D. Ricardo Fernández Valadés, que desde que comencé la residencia ha estado siempre a nuestro servicio, ayudándonos y orientándonos en la realización de trabajos de investigación, y a quien debo, por supuesto, el haber tenido el enorme placer de conocer al Doctor D. Miguel Alaminos Mingorance, brillante Cirujano e Histólogo, que realiza tan impresionante trabajo de investigación en el campo de la Ingeniería Tisular. También agradecer su colaboración y trabajo constante a la Dra. Doña Carmen Sánchez-Quevedo, por toda su simpatía y dedicación. Al resto del equipo que forma el Departamento de Histología de la Universidad de Granada, sobre todo a Ingrid, siempre dispuesta a atender nuestras dudas, y recados para el Dr. Alaminos. A mis compañeras de residencia, con las que tan buenos ratos he pasado operando a los pequeños animalitos que hemos utilizado en nuestros diversos trabajos, en especial a Esther, compañera y amiga infatigable, siempre dispuesta a prestar su apoyo, con la mejor de las sonrisas, entre bromas,…, sin palabras. Nos hemos reído mucho todo este tiempo. Y, por supuesto, a mi padre, que siempre ha estado orgulloso de mí, y que simplemente, está ahí, para todo lo que hemos necesitado.

ÍNDICE

Potencialidad queratinocítica de las células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en Ingeniería Tisular

ÍNDICE...................................................................................................................... 6 INTRODUCCIÓN...................................................................................................... 10 1. LA PIEL ...................................................................................................................... 12 1.1. ESTRUCTURA Y FUNCIONES ............................................................................ 12 1.2. PATOLOGÍA DE LA PIEL ................................................................................... 16 1.2.1. QUEMADURAS ......................................................................................... 16 1.2.2. NEVUS CONGÉNITOS GIGANTES.............................................................. 18 1.3. TRATAMIENTO: SUSTITUTOS CUTÁNEOS ....................................................... 20 1.3.1. TIPOS DE COBERTURAS............................................................................ 21 1.3.1.A. COBERTURAS SINTÉTICAS: .............................................................. 21 1.3.1.B. COBERTURAS BIOSINTÉTICAS: ........................................................ 22 1.3.1.C. COBERTURAS BIOLÓGICAS: ............................................................ 23 1.3.1.C.a. Autoinjertos: .............................................................................. 24 1.3.1.C.b. Sustitutos biológicos: ................................................................ 24 2. LA MUCOSA ORAL .................................................................................................... 29 2.1. ESTRUCTURA Y FUNCIONES ............................................................................ 29 2.2. PATOLOGÍA DE LA MUCOSA ORAL: FISURA PALATINA .................................. 34 3. EL CORDÓN UMBILICAL............................................................................................ 37 3.1. LA INGENIERÍA TISULAR. CÉLULAS MADRE DEL CORDÓN UMBILICAL ........... 39 3.2. CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON DEL CORDÓN UMBILICAL 47 3.2.1. POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN ............................................................. 50 OBJETIVOS ............................................................................................................. 53 MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................... 55 4. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE PIEL HUMANA ........................................................ 56 5. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE MUCOSA ORAL HUMANA. ..................................... 56

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6. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE GELATINA DE WHARTON ....................................... 57 7. AISLAMIENTO DE LAS CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON DEL CORDÓN UMBILICAL ..................................................................................................... 57 8. DESARROLLO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE FIBROBLASTOS DE LA PIEL .................. 58 9. DESARROLLO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE FIBROBLASTOS DE MUCOSA ORAL ..... 60 10.

SUBCULTIVO DE LAS CÉLULAS PROCEDENTES DE CULTIVOS PRIMARIOS DE PIEL

Y MUCOSA ORAL ........................................................................................................... 61 11.

SUBCULTIVO CELULAR DE LAS CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON

DEL CORDÓN UMBILICAL .............................................................................................. 62 12.

CONGELACIÓN DE CÉLULAS ................................................................................ 63

13.

CONSTRUCCIÓN DE SUSTITUTOS DE PIEL Y MUCOSA ORAL HUMANA

HETEROTÍPICA MEDIANTE INGENIERÍA TISULAR .......................................................... 64 14.

EVALUACIÓN IN VIVO DE LOS SUSTITUTOS HETEROTÍPICOS DE PIEL Y MUCOSA

ORAL HUMANA ............................................................................................................. 66 15.

EVALUACIÓN HISTOLÓGICA DE LOS SUSTITUTOS DE PIEL Y MUCOSA ORAL ..... 69

15.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA .................................................................................... 69 15.2. INMUNOFLUORESCENCIA............................................................................... 69 RESULTADOS .......................................................................................................... 71 16.

CULTIVOS PRIMARIOS DE FIBROBLASTOS DE LA PIEL Y MUCOSA ORAL ............ 72

17.

CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON DEL

CORDÓN UMBILICAL ..................................................................................................... 73 18.

EVALUACIÓN EX VIVO DE LOS SUSTITUTOS HETEROTÍPICOS DE MUCOSA ORAL Y

PIEL 74 19.

EVALUACIÓN CLÍNICA DE LOS SUSTITUTOS DE PIEL HUMANA HETEROTÍPICA Y

DE MUCOSA ORAL HETEROTÍPICA DE ESPESOR COMPLETO ........................................ 76 20.

EVALUACIÓN HISTOLÓGICA IN VIVO DE LOS SUSTITUTOS DE PIEL HUMANA

HETEROTÍPICA Y MUCOSA ORAL HETEROTÍPICA DE ESPESOR COMPLETO. ................. 78

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21.

EVALUACIÓN POR INMUNOFLUORESCENCIA DE LOS SUSTITUTOS DE PIEL

HUMANA HETEROTÍPICA .............................................................................................. 80 21.1. FILAGRINA. ...................................................................................................... 80 21.2. INVOLUCRINA ................................................................................................. 82 21.3. CITOQUERATINAS ........................................................................................... 83 21.3.1. Pancitoqueratina ..................................................................................... 84 21.3.2. Citoqueratinas 1/10. ................................................................................ 85 21.3.3. Citoqueratinas 4/13. ................................................................................ 87 21.3.4. Citoqueratinas 7/8. .................................................................................. 88 22.

EVALUACIÓN POR INMUNOFLUORESCENCIA DE LOS SUSTITUTOS DE MUCOSA

ORAL HETEROTÍPICA ..................................................................................................... 92 22.1. FILAGRINA ....................................................................................................... 92 22.2. INVOLUCRINA ................................................................................................. 93 22.3. CITOQUERATINAS ........................................................................................... 95 22.3.1. Citoqueratinas 1/10. ................................................................................ 95 22.3.2. Citoqueratinas 4/13. ................................................................................ 96 22.3.3. Citoqueratinas 7/8. .................................................................................. 98 DISCUSIÓN ........................................................................................................... 102 CONCLUSIONES .................................................................................................... 113 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 116

INTRODUCCIÓN

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La Ingeniería Tisular se ha erigido como un campo de investigación primordial en el avance de la ciencia médica, para el tratamiento de patologías muy diversas. Se ha investigado mucho, y se continúa investigando, intentando mejorar los tratamientos que somos capaces de ofrecer a los pacientes, en prácticamente todos los campos de la medicina. En pleno auge se encuentra la investigación acerca de las células madre, y en particular, de las presentes en el cordón umbilical, por ciertas características que presentan las mismas, que posteriormente comentaremos. Con nuestra investigación, buscamos ofrecer algo de luz en el tratamiento de determinadas cuestiones que nos afectan diariamente, que en ocasiones son difíciles de solventar, ya que en Cirugía Pediátrica, luchamos con el inconveniente de la escasez de tejidos que presenta el niño. Hemos enfocado la investigación en el tratamiento de determinadas lesiones que pueden afectar a la piel y la mucosa oral, con lo que expondremos primeramente algunos apuntes sobre la anatomía y patología de ambas. Igualmente se resumirá los conocimientos e investigaciones recientes acerca del cordón umbilical, pasando posteriormente a exponer todo nuestro trabajo.

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Introducción

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1. LA PIEL 1.1. ESTRUCTURA Y FUNCIONES La piel es el órgano más extenso del cuerpo. Supone aproximadamente el 15% del peso corporal total. Su composición y grosor varían muchísimo de una parte a otra del cuerpo y respecto de la edad y el sexo. Está constituida por cinco elementos principales: epidermis, unión dérmoepidérmica, apéndices epidérmicos, dermis y tejido subcutáneo (Figura 1).

Figura 1. Esquema de las diferentes capas y estructuras de la piel humana.

La epidermis, es la porción más externa. Se encuentra formada por un epitelio escamoso estratificado que se queratiniza. Histológicamente, está constituida por varios tipos celulares de los cuales destacamos por su importancia, los queratinocitos, los cuales constituyen aproximadamente un 90% de la población celular total del epitelio de la piel. Se pueden disponer en el epitelio formando hasta cinco capas o estratos, que de profundidad a superficie son los siguientes (figura 2): -

Estrato basal o germinativo: capa unicelular situada sobre la lámina basal, la cual separa la epidermis de la dermis (Carrascal, 2001). El

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estrato basal contiene células madre pequeñas y cúbicas con escaso citoplasma situándose los núcleos muy juntos. Las células madre darán origen a los queratinocitos maduros, los cuales van migrando conforme se diferencian, hacia el estrato más superficial donde, finalmente, se descaman (Ross et al., 2004). Las células presentes en el estrato basal, son las únicas células proliferativas dentro de la epidermis. -

Estrato espinoso: formado por varias capas celulares. Sus células son de mayor tamaño que las del estrato basal. Poseen múltiples proyecciones citoplasmáticas o “espinas” de las cuales deriva su nombre.

-

Estrato granuloso: Sus células contienen abundantes gránulos de queratohialina de naturaleza basófila que se tiñen intensamente.

-

Estrato lúcido: Contiene células eosinófilas en avanzado estado de queratinización. El núcleo y las organelas citoplasmáticas desaparecen conforme en la célula aumenta la presencia de queratina.

-

Estrato córneo: posee las células más diferenciadas de la epidermis. Tienen el núcleo y las organelas desintegradas, y la membrana plasmática engrosada. Son células cornificadas, que se van descamando y están ocupadas casi por completo de filamentos de queratina.

Estrato córneo Estrato granuloso

Estrato espinoso

Capa basal

Figura 2. Sección de epidermis visualizada con microscopía óptica con tinción hematoxilina-eosina.

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En la epidermis encontramos otras poblaciones celulares, como los melanocitos, células de Merkel, células de Langerhans y algunas células del sistema linfohistiocítico, en cuya descripción no nos detendremos. La unión dermoepidérmica consta de dos capas fundamentales: la lámina basal y la lámina reticular, formadas por fibrillas de fijación, microfibrillas dérmicas y fibras de colágeno. Actúa como una barrera semipermeable permitiendo el intercambio de células y líquidos entre la epidermis y la dermis, además de suponer un soporte estructural para la epidermis. La dermis es la capa intermedia de la piel y constituye el 95% del espesor total de ésta. Es un sistema de tejido conectivo fibroso que contiene redes nerviosas y vasculares además de los apéndices epidérmicos (folículos pilosos, glándulas, etc.). Está formada por distintos tipos de células y una gran cantidad de matriz extracelular. Las células propias de la dermis son los fibroblastos, los cuales constituyen la población celular más abundante, existiendo, además, un gran número de células procedentes de la piel, incluyendo macrófagos, mastocitos y linfocitos. El componente extracelular consiste en una cantidad variable de sustancia fundamental amorfa en la que aparecen gran cantidad de fibras de colágeno, fibras elásticas y otros tipos de materiales fibrosos y globulares. Por su estructura, se diferencian dos regiones en la dermis (Figura 3): -

Dermis papilar, se compone de tejido conjuntivo laxo con colágenos de tipo I y III principalmente, y fibras elásticas. Posee vasos sanguíneos pertenecientes al plexo subpapilar (Kierszenbaum, 2002), que se extienden hacia arriba para irrigar la epidermis pero sin penetrar en ella. Presenta también prolongaciones nerviosas.

-

Dermis reticular, es más profunda, de mayor espesor y su tejido conjuntivo es más denso, formado por colágeno tipo I principalmente.

En el límite entre las dos capas dérmicas se encuentra un grupo de vasos sanguíneos correspondientes al plexo cutáneo (Kierszenbaum, 2002).

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Demis papilar

Dermis reticular

Figura 3. Corte histológico de piel en la que se visualiza las dos capas de la dermis, tinción hematoxilinaeosina.

El tejido celular subcutáneo es la capa más profunda de la piel. Formado por lóbulos de adipocitos separados por tabiques fibrosos de colágeno y vasos sanguíneos de gran calibre (Kierszenbaum, 2002). Es un tejido muy rico en células madre adultas multipotentes. Los apéndices de la piel son invaginaciones funcionales de la epidermis y dermis papilar hacia la dermis reticular y la capa de grasa subyacente. Consisten en folículos pilosos, glándulas sudoríparas ecrinas y apocrinas, y glándulas sebáceas. Los apéndices epidérmicos sirven como una fuente de células epidérmicas de regeneración después de la lesión dérmica. También suministran una fuente de contaminación bacteriana, debido a que la flora normal de la piel yace en la profundidad en los conductos de estas estructuras (Ashcraft, 2003). En cuanto a las funciones que presenta la piel, destacamos la defensiva, suponiendo una barrera natural contra la invasión de las bacterias, mediante la descamación continua. Presenta una capa externa que resulta mortal para muchos virus y microorganismos gramnegativos. . Recientemente se ha descrito la presencia de agentes antimicrobianos que constituyen el escudo químico natural protector de la piel, tales como β-defensina, catelicidina LL37 y lisozima (Niyonsaba et al., 2005). En condiciones normales, el pH de la piel varía de 4-6 y tiene función de retardar el

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crecimiento de muchas bacterias. Una placa de ácidos grasos yace sobre la piel y es fungistática y bacteriostática. El hecho de que la piel esté colonizada por bacterias no invasivas sirve como medio para dejar fuera patógenos más invasivos mediante la elaboración de antibióticos, competencia por sustratos alimenticios y creación de un ambiente con pH adverso (Ashcraft, 2003).

1.2. PATOLOGÍA DE LA PIEL Múltiples patologías pueden afectar a la piel. Ante cualquier tipo de lesión ya sea congénita, traumática o infecciosa, se debe reponer esta pérdida para que el organismo, vea alterada su homeostasis en la menor medida posible. Por su frecuencia, e importancia, sobre todo en el paciente pediátrico, planteamos las quemaduras como la patología que en más número de ocasiones precisa de coberturas cutáneas, alcanzando especial interés en estos pacientes, por la menor fuente de zonas donantes. No menos importantes son otras patologías como los nevus congénitos gigantes, epidermólisis bullosa, etc, que nos plantean, con menos frecuencia, la necesidad de una fuente alternativa de piel, diferente de la propia del paciente. 1.2.1. QUEMADURAS La gravedad de estas lesiones varía dependiendo del agente causal y el tiempo de exposición, la localización y la calidad de los tejidos afectados, así como de la rapidez y la eficacia del tratamiento realizado. En los niños, nos encontramos con el agravante de que una agresión menor comporta mayor gravedad, dado el menor grosor de su piel, y la fragilidad de su organismo. -

Clasificación histológica de las quemaduras:

Es la principal de las clasificaciones utilizadas. Se basa en la histología y fisiología de la piel y sus capas; especialmente, en su capacidad de regenerarse de forma espontánea y de actuar como barrera cutánea (Church et al., 2006). Así, según la capa alcanzada por la lesión, las quemaduras se clasifican en (Morgan, 2000):

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-

Primer grado (epidérmica): Afecta únicamente a epidermis. Se caracteriza por presentar coloración rosada, de superficie seca o con pequeñas vesículas y presenta sensación dolorosa. La cicatrización sucede en 2-3 días (Figura 4).

Figura 4. Quemadura de primer grado

-

Segundo grado (dérmica): Superficial: Afecta a epidermis y dermis papilar. Se caracteriza por presentar coloración rosada o rojo brillante, ampollas grandes y exudado abundante, presentando sensación dolorosa. En este caso la cicatrización tiene lugar entre 5 y 21 días (Figura 5).

Figura 5. Quemadura de segundo grado superficial

Profunda: Afecta hasta dermis reticular. Su coloración es rojo oscura, blanca y amarillento moteado. Las ampollas son de menor tamaño y en ocasiones están rotas. Ligeramente húmeda. En lo referente a la sensación dolorosa, hay disminución de la misma. La cicatrización ocurre en un plazo superior a 3 semanas (Figura 6).

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Figura 6. Quemadura de segundo grado profundo

-

Tercer grado (subdérmica): Afecta a hipodermis. Coloración blanca o negruzca. Superficie seca con epidermis no viable y vasos trombosados. No hay sensación dolorosa. Para cicatrizar precisa injerto (Ashcraft, 2003) (Figura 7), ya que se ha perdido la dermis donde nos encontramos los queratinocitos capaces de regenerar la piel. Si este tipo de lesiones se dejan evolucionar, finalmente dan lugar a cicatrices retráctiles, hipertróficas y queloideas, que determinan un aspecto estético y funcional pésimo. Esto nos lleva a la búsqueda de sustitutos cutáneos como veremos en sucesivos apartados.

Figura 7. Quemadura de tercer grado

1.2.2. NEVUS CONGÉNITOS GIGANTES Los nevus melanocíticos son neoplasias benignas compuestas por células melanocíticas, que producen pigmento y colonizan la epidermis. Se dividen en congénitos y adquiridos. Son lesiones muy comunes que pueden encontrarse en la

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superficie cutánea de cualquier individuo. Como ya se ha mencionado, los melanocitos son células que, se encuentran en la epidermis, estando las células aisladas. En los nevus forman nidos celulares interactuando unos melanocitos con otros. El nevus melanocítico congénito es una lesión que se encuentra presente desde el nacimiento o bien aparece durante el primer año de vida. Su incidencia aproximada es de 1-2% de todos los recién nacidos vivos. Se habla de nevus congénito gigante (NCG) cuando la lesión supera los 20 cm, aunque algunos autores consideran que se define mejor como aquel cuyo tamaño hace imposible su extirpación total con cierre primario (Figura 8). Su incidencia se estima en 1/2000 recién nacidos (Castilla, 1981). Se asocian a un riesgo aumentado de melanoma, que no ha sido cuantificado con exactitud. Según las series el riesgo varía entre el 2% y el 16% (Hernández, 2003). En cuanto a la relación entre el tamaño del nevus y el riesgo de melanoma, se ha demostrado que existe un riesgo de mortalidad por melanoma mil veces mayor en nevus de más de 20 cm o que ocupan más del 5% de superficie corporal. El potencial maligno de estas lesiones no está del todo claro (Nassan, 1996), según algunos autores alcanza el 5% (Ramos, 2002), y aunque es cierto que la malignización de estas lesiones no es frecuente, cuando sucede, determina tumores muy agresivos y con una elevada tasa de mortalidad (Pappo, 2003). En relación con la edad, el 80% de los melanomas que aparecen en pacientes con NCG lo hacen antes de los 7 años, y el 50% antes de los 2 años (Everett, 1977). En la mayoría de los casos la indicación quirúrgica se basa en el potencial maligno y no en la alteración estética que produce la lesión. El tratamiento debe realizarse de forma precoz, considerándose dos aspectos fundamentalmente: extensión y localización. Esto determinará la técnica quirúrgica a utilizar como movilización cutánea total (Chrétien-Marquet, 1997), expansión tisular, autoinjertos o cultivo de queratinocitos.

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Figura 8. Nevus melanocítico congénito gigante que cubre aproximadamente un 70% de la superficie corporal. Se puede observar los cambios de tonalidad en las lesiones, la superficie rugosa y la presencia de abundante vello.

1.3. TRATAMIENTO: SUSTITUTOS CUTÁNEOS La cirugía en el paciente quemado, indicada como tratamiento de las quemaduras profundas, tiene como objetivos la eliminación del tejido dañado irreversiblemente y la realización de una cobertura definitiva de las heridas. Este tratamiento debe ser completado precozmente para minimizar el riesgo de infección, sepsis y muerte del paciente, además de reducir tratamientos dolorosos largos en el tiempo, disminuir secuelas, etc. Todos los tratamientos empleados como sustitutos cutáneos en el paciente quemado, se pueden extrapolar en el tratamiento de otras patologías como los nevus congénitos gigantes. Actualmente el tratamiento quirúrgico de los pacientes quemados con áreas masivas de quemaduras profundas representa un reto, que no reside en la eliminación de los tejidos no viables, sino en la cobertura de las áreas cruentas. Hoy en día se dispone de una serie de métodos que ofrecen una cobertura definitiva o temporal, si bien ninguno de ellos llega a cumplir las condiciones necesarias para definirlo como ideal. Según Pruitt y Levine, las propiedades ideales de las coberturas cutáneas deberían ser (Pruitt y Levine, 1984; Phillips, 1993):

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

Ausencia de antigenicidad.



Compatibilidad tisular.



Ausencia de toxicidad local y sistémica.



Transmisión de vapor de agua similar a la piel normal.



Ser impermeable a microorganismos.



Adherencia rápida y efectiva a la superficie de la herida.



Permitir el crecimiento fibrovascular en el interior de su estructura.



Ser flexible y plegable, permitiendo adaptarse a superficies irregulares.



Resistencia al estrés.



Prevenir la proliferación en la superficie de la herida de la flora y disminuir la densidad bacteriana.



Que no se rompa cuando es retirada.



Biodegradable.



Bajo coste.



Mínimas condiciones de almacenaje.

1.3.1. TIPOS DE COBERTURAS (Eaglstein, 1998): 1.3.1.A. COBERTURAS SINTÉTICAS: Las coberturas dérmicas sintéticas consisten en biomateriales no reabsorbibles y exentos de células vivas que se pueden utilizar como cubiertas temporales o como agentes inductores de la reparación tisular guiada. Los apósitos hidrocoloides ejercen un efecto de absorción y mantenimiento del exudado, creando un microclima de humedad que favorece la cicatrización. No aportan ningún producto antibacteriano por lo que no están indicados en la cobertura de quemaduras profundas y actúan, en la mayoría de los casos, como barrera que evite pérdida de agua, electrolitos, etc. Además su utilización implica la aparición de un exudado que dificulta, si no se posee mucha experiencia, diferenciar entre infección local y la degradación normal del hidrocoloide. Están indicados en quemaduras menores (dérmicas superficiales no muy exudativas o en zonas donantes). Existen una gran variedad de estas coberturas en el mercado (Canter, 2004).

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1.3.1.B. COBERTURAS BIOSINTÉTICAS: Este tipo de sustitutos cutáneos consisten en un biomaterial de origen sintético no reabsorbible que se asocia a materiales de origen humano o animal biocompatibles y biointegrables. Por la extensión de su uso se exponen las siguientes: Biobrane: Este sustituto está formado por una lámina de silicona que actúa como una barrera epidérmica protectora. Presenta pequeños poros que permiten la eliminación de desechos y la permeabilidad para antibióticos de uso tópico (Yonezawa, 2005). Por debajo presenta un tejido irregular tridimensional (análogo a la dermis) de filamentos de nylon al cual se adhiere colágeno tipo I (Figura 9). La adherencia inicial de Biobrane a la herida se consigue gracias a la unión entre el colágeno de la membrana con la fibrina presente en la superficie de la herida. La segunda fase de adherencia se debe a las células epidérmicas que proliferan entre los filamentos de la matriz de nylon. Su uso consigue aliviar el dolor, aminorar la pérdida de agua, electrolitos, calor, etc., actuar como barrera mecánica frente a infecciones siempre y cuando se aplique algún antimicrobiano (no por sí solo), y favorecer la reepitelización. Actualmente se considera como cobertura de primera elección en quemaduras dérmicas superficiales extensas y en zonas donantes (Smith, 1995).

BIOBRANE

Figura 9. Esquema de lámina de Biobrane®

Otra cobertura que podría clasificarse en este grupo por su composición es el Integra, que consta de una capa profunda constituida por una matriz de colágeno y

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condroitín 6 sulfato y una capa externa de silicona (Yannas, 1980; Violas, 2005). Sin embargo, su filosofía es la de favorecer la migración de células del paciente a la capa interna del sustituto, posibilitando la formación de una neodermis. Tras unas 3 semanas en el lecho receptor, se sustituye la capa de silicona por un autoinjerto fino o por cultivos de queratinocitos autólogos (Figura 10). En este sentido, la capa dérmica del Integra se comportaría como definitiva facilitando que la capa epidérmica que se utilizase (autoinjerto o cultivo) prendiera (Jeng, 2006; Wisser, 2004), con la ventaja de no transmitir enfermedades. Esta cobertura estaría indicada en pérdidas cutáneas de espesor total. Sus principales desventajas son: su escasa resistencia a infecciones, la necesidad de utilizar otra cobertura para sustituir la epidermis y su elevado precio (Burke, 1981).

Figura 10. Esquema de funcionamiento de Integra®

1.3.1.C. COBERTURAS BIOLÓGICAS: Las coberturas biológicas consisten en la utilización de piel humana nativa o bien de sustitutos biológicos de la piel humana en los que existen células vivas y matrices extracelulares que tratan de reproducir la estructura de la piel humana normal.

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1.3.1.C.a. Autoinjertos: Siguen siendo la mejor cobertura definitiva cuando el paciente dispone de suficientes zonas donantes. Se aplican tan pronto como se obtenga un lecho viable, que deberá ser en la mayoría de los casos en la misma intervención en la que se realiza el desbridamiento de la quemadura. En las primeras horas tras la aplicación del injerto se produce una adhesión por fibrina y colágeno. A las 24-48 h, el plasma del lecho receptor va a nutrir al sistema capilar del injerto, y entre el tercer y quinto día se produce una neovascularización capilar definitiva desde el lecho (Harris, 1993; Place, 1996). El grosor ideal de un autoinjerto de piel es 0.20-0.25 mm., excepto para cobertura de cara, cuello, manos y articulaciones donde son preferibles de mayor espesor, usándose más finos en quemaduras masivas en ancianos y niños. A mayor grosor del injerto, menor retracción del mismo, pero mayor dificultad de que prenda. Se pueden aplicar en forma laminar o mallados. El resultado cosmético de los laminares es más aceptable, pero tienen el inconveniente de presentar hematomas con mayor frecuencia. La ventaja de las mallas es su capacidad para cubrir mayor extensión, además de un menor número de hematomas al facilitar el drenaje entre los orificios de la malla. Sin embargo, presentan los inconvenientes de una peor apariencia estética, mayor retracción y el hecho de no actuar como barrera hasta que no se produce la epitelización de la malla. Cuando la quemadura es muy extensa y la zona donante escasa se recurre al patrón en sándwich, en el que se aplican injertos ampliamente mallados sobre los cuales se colocan homoinjertos de cadáver. El objetivo de esta última cobertura es proteger los autoinjertos y actuar como barrera hasta que prenden y epitelizan las mallas (Lorente, 1998). 1.3.1.C.b. Sustitutos biológicos: Este tipo de sustitutos se ha desarrollado fundamentalmente en los Bancos de Piel que surgieron para solventar los problemas de cobertura cutánea que plantean los

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grandes quemados. Los diferentes bancos de piel existentes a nivel mundial difieren en su modo de actuar, en las técnicas empleadas en la conservación y almacenamiento de la piel humana, en el tipo de sustituto que desarrollan (cultivos de queratinocitos, piel artificial celular autóloga, etc.). Actualmente los bancos de piel pueden procesar, almacenar y elaborar, entre otras y como más destacadas, las siguientes coberturas cutáneas: xenoinjertos, homoinjertos (aloinjertos) criopreservados y/o preservados en glicerol, cultivos de queratinocitos (autólogos y alogénicos) y piel artificial celular (autóloga y alogénica) (Sheridan, 1999).  Homoinjertos o aloinjertos: Nos referimos a ellos cuando sus células proceden de piel de donante humano. Los aloinjertos son una de las mejores coberturas cutáneas disponibles en ausencia de la posibilidad de utilizar autoinjertos. La viabilidad de sus células depende del tratamiento que recibe el injerto, de tal manera que si se criopreservan las células permanecen vivas, pero si se preservan en glicerol, las células no son viables. Se usan como cobertura de superficies cruentas actuando como barrera, disminuyendo la pérdida de agua, electrolitos y proteínas, reduciendo la frecuencia de las infecciones y aliviando el dolor. La capa epidérmica de esta cobertura es la que contiene células de Langerhans de gran poder antigénico que provocan la pérdida en pocos días de esta epidermis. Esta reacción depende de la respuesta inmunológica del huésped, que está condicionada por el grado de competencia del receptor y por la incompatibilidad antigénica entre donante y receptor. Sin embargo, la dermis de los aloinjertos tiene capacidad para prender al tener escasa o nula antigenicidad, incorporándose al lecho cruento de forma definitiva. Este hecho es el que favorece que esta dermis del homoinjerto sea en ocasiones la base sobre la que se aplican, tras una escisión tangencial fina del homoinjerto, autoinjertos muy finos, cultivos de queratinocitos autólogos o piel artificial celular autóloga (Zienowicz et al., 2007). Finalmente, otra de sus ventajas frente otras coberturas es su precio, especialmente si se compara con coberturas como el Integra, los cultivos de queratinocitos, piel artificial autóloga, etc. Uno de los principales inconvenientes de esta cobertura es la posible transmisión de enfermedades virales, especialmente si se trata de homoinjertos criopreservados. Por

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este motivo los donantes de piel deben cumplir una serie de requisitos generales establecidos para todos los tejidos y también criterios específicos de exclusión.  Xenoinjertos: Es un injerto cuyas células derivan de otra especie. Su uso es muy limitado, ya que acarrean multitud de complicaciones postoperatorias, entre las que destaca el rechazo en, aproximadamente, unas 72 horas. Los xenoinjertos de piel más comunes proceden del cerdo. El Xenograft® (Figura 11), se emplea como un producto reconstituyente, que consta de dermis de porcinos homogeneizados, que son moldeados en hojas y redes. Esta dermis presenta una superficie de colágeno capaz de asociarse a la superficie de la herida. Se usa para cubrir temporalmente heridas limpias (como quemaduras de segundo grado), y proporciona un control excelente del dolor mientras la herida sana. Se suele combinar con plata para prevenir y evitar las infecciones (Metcalfe y Ferguson, 2007).

Figura 11. Lámina de Xenograft®

 Cultivo de queratinocitos y otros cultivos dérmicos: Green y Rheinwald son los que en 1975 publican la técnica que permite obtener amplias láminas de queratinocitos cultivados a partir de una biopsia de piel sana de un paciente (Rheinwald y Green, 1975). Hoy en día, los avances técnicos han optimizado esta técnica y permiten obtener grandes cantidades de queratinocitos cultivados a partir de pequeñas biopsias

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de piel de 10-12 mm2 procedentes de donantes vivos, incluso del propio paciente o almacenadas en el Banco de Tejidos. Estas biopsias son sometidas a un tratamiento mecánico y enzimático para liberar los queratinocitos más inmaduros del tejido (células madre queratinocíticas). Las células obtenidas de este modo se cultivan en diferentes condiciones, lo que permite obtener, a partir de una misma biopsia, un gran número de células (Moroi et al., 2004; Meana et al., 1998; Del et al., 2002; Llames y cols., 2004; Llames y cols., 2006) Sin embargo, presentan inconvenientes importantes que los alejan de ser la cobertura ideal: son necesarias de 3-4 semanas para obtener un tamaño de la lámina de queratinocitos útil clínicamente; son frágiles, siendo el porcentaje de prendimiento limitado (40-60%); son muy poco resistentes a contaminaciones bacterianas e imposibilitan la utilización de la mayoría de los antisépticos que resultan tóxicos para estas células, además de resultar una cobertura de costo elevado. Gran parte de estos inconvenientes son achacables a la falta de un soporte dérmico adecuado (ElGhalbzouri, 2002; Atiyeh y Costagliola, 2007). Por este motivo, se utilizan coberturas que combinan el cultivo con otros sustitutos que aporten dicho soporte: homoinjertos, Integra, Alloderm, Dermagraft, etc. También se puede disponer de cultivos de queratinocitos alogénicos como cobertura temporal (Yonezawa, 2007). La razón de su uso es que estos queratinocitos segregan sustancias que estimulan los lechos receptores, mejorando las condiciones locales de las superficies cruentas mientras se realiza la cobertura definitiva, además de favorecer la epitelización desde los bordes sanos (Wood, 2006). Todas las posibles fuentes de obtención de estos queratinocitos deben cumplir los mismos requisitos establecidos para la donación de tejidos. Actualmente estos queratinocitos (autólogos y alogénicos) también pueden conservarse criopreservados, y además de su utilización en la cobertura de grandes quemados, se han empleado en el tratamiento de úlceras crónicas, epidermólisis ampollosa, escisión de nevus congénitos gigantes, etc (Boyce, 2002; Kashiwa, 2004).

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También existen productos en el mercado que están basados en cultivos celulares alogénicos como formadores de dermis. Ejemplo es el Dermagraft, que es una cobertura formada por una malla de poliglactin 910 y ácido poliglicólico en la que se cultivan fibroblastos humanos neonatales. Actuaría como una neodermis sobre la que posteriormente habría que implantar un cultivo de queratinocitos o un autoinjerto fino.  Piel artificial celular autóloga y alogénica (injertos compuestos cultivados): Estas son las últimas coberturas sobre las que se está investigando. Se trata de una piel completa que se crea a partir de fibroblastos y queratinocitos procedentes de una biopsia del propio paciente. Utilizando diferentes tipos de soporte (fibrina, plasma y otros geles) (Shahabeddin, 1990) se cultivan los fibroblastos, sembrando los queratinocitos posteriormente sobre estos cultivos (Phillips, 1993; Jun, 2000). Son estos injertos compuestos cultivados los que más expectativas están creando actualmente, siendo su ventaja fundamental, ser el único sustituto que ofrece los dos componentes de la piel de forma definitiva (Figura 12). En esta piel la unión dermoepidérmica se inicia ex vivo, disminuyendo la inestabilidad de la cobertura. También se puede diferenciar ex vivo el estrato córneo, necesario para que el sustituto cutáneo sea eficaz como barrera. Sus inconvenientes radican en su escasa resistencia frente a infecciones, sus “exigencias” en lo que al lecho receptor ser refiere (al igual que los cultivos de queratinocitos, el Integra, etc., que requieren superficie cruenta sin contaminaciones), su incompatibilidad con el uso de la mayoría de los antisépticos, el retraso en su disponibilidad y elevado precio.

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Figura 12. Cultivo de piel humana

Existen productos alogénicos que pueden clasificarse en este apartado de piel artificial como el Graftskin (Eaglstein, 1995; Kirsner, 1998). En esta cobertura, que está compuesta por células alogénicas de prepucio neonatal, la capa dérmica son fibroblastos humanos y colágeno bovino, estando formada la epidermis por queratinocitos alogénicos estratificados y cornificados. Mencionar por último, que en piel artificial, el futuro podría estar en conseguir una cobertura temporal alogénica modificada genéticamente que produjese factores de crecimiento tisular que favoreciesen la curación de los lechos cruentos, y en el desarrollo de un sustituto cutáneo permanente compuesto por las dos capas de la piel, que fuese resistente a infecciones, presentase tasas de prendimiento elevadas y de disponibilidad inmediata (Androutsellis-Theotokis et al., 2006).

2. LA MUCOSA ORAL 2.1. ESTRUCTURA Y FUNCIONES La mucosa oral es la mucosa que encontramos revistiendo la cavidad oral. Se caracteriza por permanecer constantemente húmeda gracias a la secreción salivar, que es necesaria para evitar la aparición de alteraciones en su estructura y funcionamiento (Figura 13).

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Figura 13. Mucosa Oral Humana (Tinción tricrómica de Masson)

El epitelio de la mucosa oral, al igual que la piel, está formado por queratinocitos suponiendo alrededor del 90% de la población celular total de este epitelio. Igualmente, se distribuyen por estratos dependiendo del estado madurativo de la célula (basal, espinoso, granuloso, lúcido y córneo), cuyas características principales son las mismas que las ya comentadas para la piel. A su vez, encontramos otras poblaciones celulares, igualmente citadas en páginas anteriores, tales como melanocitos, células de Merkel, células de Langerhans y células del sistema linfohistiocitario (Ferraris y Campos, 2009) (Figura 14).

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Figura 14. Esquema con la diferenciación celular en un epitelio plano estratificado queratinizado. Ferraris y Campos 2006.

A continuación en profundidad, nos encontramos con la membrana basal, que determina la separación entre el epitelio y el corion. Si se observa con microscopía electrónica, la membrana basal posee dos regiones: la lámina basal, sintetizada por las células del epitelio, y la lámina reticular, sintetizada por las células del tejido conectivo.  Lámina basal: A su vez podemos subdividirla según su densidad, vista con microscopía electrónica, en una doble lámina, la lámina densa y la lámina lúcida. La lámina densa está constituida por colágeno IV, y heparán, mientras que la lámina lucida presenta laminina y entactina.  Lámina reticular: Constituida por diversas proteínas, tales como colágeno VII, reticulina (colágeno I y III) y fibronectina, inmersas en una matriz de glucosaminoglucanos. La membrana basal posee varias funciones. Es una estructura de fijación entre epitelio y conectivo, un filtro físico y químico (malla de colágeno IV), por restringir el paso de cargas negativas. Otro de sus papeles, es servir de guía para la migración celular en el proceso de reepitelización de heridas y como barrera defensiva.

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Finalmente, mencionar la lámina propia o corion. Es una lámina de tejido conectivo de espesor variable que confiere sostén y nutrición al epitelio. Esta función esta reforzada por la presencia de papilas que llevan vasos y nervios al epitelio y que varían en longitud y anchura dependiendo de la zona. El tejido conectivo puede ser laxo, denso o semidenso según la región, al igual que la distribución de células, fibras y sustancia fundamental de acuerdo a la región de la cavidad oral que se considere. Entre las células que podemos encontrar en esta capa están los fibroblastos, macrófagos, linfocitos, células cebadas y células plasmáticas. Existe una estrecha relación entre el fibroblasto y el queratinocito de la población epitelial supradyacente. La secreción de interleuquina 1 del queratinocito activado promueve a la proliferación y actividad del fibroblasto, encargado de la secreción de prostaglandinas que estimulan la proliferación y diferenciación de los queratinocitos. La matriz extracelular de la lámina propia es muy rica en fibras de colágeno, elásticas y reticulares, todas ellas destinadas a evitar la deformación de un epitelio que se encuentra sometido de forma continuada a agresiones externas. A nivel de la lámina propia de la mucosa bucal existe una rica inervación con terminaciones nerviosas sensoriales que recogen información sobre la percepción del dolor, la temperatura, el tacto y la presión. Finalmente, la submucosa está formada por tejido conectivo laxo, que une la mucosa a las zonas adyacentes. Es más gruesa en las zonas sometidas a mayor estrés. En ella nos encontramos glándulas salivares, vasos, nervios y tejido adiposo. La mucosa oral no es uniforme, sino que varía dependiendo de la zona de la cavidad oral que estemos estudiando. Así, podemos clasificarla desde un punto de vista histológico o topográfico. La clasificación histológica parte del grado de queratinización de los queratinocitos (Figura 15): -

Epitelio plano estratificado ortoqueratinizado: encontramos todas las capas que acabamos de describir: basal, espinosa, granulosa y córnea.

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-

Epitelio plano estratificado paraqueratinizado: presenta características similares al anterior a nivel de los estratos basal, espinoso y granuloso, aunque este último presenta gránulos poco desarrollados. Las diferencias fundamentales están en los elementos celulares del estrato córneo, pues en este tipo de epitelio, las células de este estrato conservan sus núcleos y algunas organelas, lo cual indica un metabolismo celular escaso. El epitelio estratificado paraqueratinizado presenta gran cantidad de tonofilamentos.

-

Epitelio plano estratificado no queratinizado: no existe una capa córnea superficial, careciendo de estrato granuloso, aunque se pueden formar gránulos incompletos. De esta manera, podemos encontrar tres capas en el epitelio no queratinizado.

Figura 15. Esquemas con los diferentes tipos de epitelios estratificados planos. A. queratinizado. B. paraqueratinizados. C. no queratinizado. Ferraris y Campos 2006.

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2.2. PATOLOGÍA DE LA MUCOSA ORAL: FISURA PALATINA La fisura de labio y paladar es la malformación congénita más frecuente del macizo cráneo-facial en la infancia, llegando a afectar aproximadamente a 1:700 recién nacidos vivos. Estas anomalías pueden englobar un amplio espectro anatómico que comporta diversa severidad, pudiendo englobarse dentro de síndromes con otras anomalías sistémicas. Aproximadamente la mitad de los individuos con estos problemas presentan fisura de labio y paladar (46%), fisura labial aislada el 21% y fisura sólo de paladar el 33% (La Rossa, 2000). Los tejidos faciales, incluidos labio y paladar, derivan de las células de la cresta neural. La cara normal se va a formar durante los primeros tres meses de vida intrauterina y los primeros centros de desarrollo aparecen hacia la tercera semana de gestación (Figuras 16 y 17). El paladar se forma en dos fases: Paladar primario: de él derivan el labio superior, la columela nasal, el alvéolo maxilar y el paladar óseo anterior hasta el foramen incisivo. Este desarrollo se produce entre la 4ª-8ª semana. Paladar secundario: Derivan el paladar óseo posterior hasta el foramen y el paladar blando. Se desarrollan entre la 8ª-12ª semanas.

Figura 16. Esquema de la formación del macizo facial a partir de los diferentes procesos, y su evolución con el crecimiento del feto.

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Figura 17. Imagen tridimensional de la formación del macizo facial y del paladar en un feto.

Debe de existir una adecuada migración mesodérmica, de ser deficitaria o ausente se forman distintos tipos de fisuras faciales. Por lo tanto, en el paladar primario, la falta de penetración de mesodermo entre los procesos maxilar y medionasal, producirá una fisura labial completa, mientras que si hay una penetración insuficiente, se formará una fisura labial incompleta con una banda de Simonart debajo de la narina. De la misma forma, la falta de penetración mesodérmica del paladar secundario, total o parcial, producirá una fisura palatina completa o incompleta, respectivamente (Figura 18).

Figura 18. Fisura labio-palatina. Se puede observar la amplia separación entre los bordes laterales del paladar.

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El paladar supone una barrera entre las cavidades oral y nasal. Se encuentra cubierto de mucoperiostio y existe una clara delineación entre la mucosa del paladar duro y la de los procesos alveolares. El paladar blando es móvil y funciona como una válvula que separa la nariz de la boca durante la deglución y el lenguaje. Su función depende de los músculos elevadores del velo del paladar, los cuales elevan el paladar blando y lo dirigen hacia la zona más posterior, además de ser responsables del movimiento medial de las paredes laterales de la faringe. El músculo constrictor superior de la faringe y el músculo de la úvula, asisten estos movimientos, incrementando el contacto de la superficie nasal del paladar blando a medida que se dirige hacia la zona posterior. Sin esta acción, el sonido se escapa a través de la nariz y el habla se nasaliza. Esta pronunciación hipernasal es característica de los pacientes con fisura palatina, y a menudo continúa en pacientes que ya han sido sometidos a tratamiento reparador (Oldham, 2005). El tipo de reparación, así como el momento de la misma, vendrá condicionado por otras malformaciones acompañantes, aunque en general, se acepta que el paladar debe estar reparado antes del inicio del lenguaje, es decir, antes de los 18 meses de edad, para optimizar los resultados. En algunas ocasiones, cuando la fisura es muy amplia, la mucosa de los procesos laterales puede ser insuficiente para corregir el defecto, con lo que se hace necesario recurrir a la utilización de otros tejidos, tales como injertos mucosos o de piel. Existen diversas técnicas quirúrgicas en el tratamiento de la fisura palatina, lo común en ellas es la aparición, como complicación más frecuente, de fístulas oronasales. Estas fístulas pueden ocurrir en cualquier punto a lo largo de la fisura original. Generalmente se producen por suturas a tensión. Su incidencia varía entre el 0-34%. El principal problema es la dificultad de cierre, sobre todo dependiendo del tamaño de las mismas, ya que la zona de trabajo es un tejido fibroso con escasa distensibilidad, lo cual dificulta mucho su cierre, pudiendo ser necesario la utilización de colgajos e injertos de otras zonas (Oldham, 2005).

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3. EL CORDÓN UMBILICAL Continuando con la descripción de los elementos fundamentales que conforman esta tesis, pasamos a comentar el cordón umbilical. El interés levantado por la investigación sobre células madre, ha hecho que en estos últimos años, el cordón umbilical se haya convertido en un tejido ampliamente estudiado, ya que constituye una fuente muy importante de estas células. El cordón umbilical es el órgano que representa la unión entre el feto y la madre durante el embarazo. Se desarrolla en la semana 26 de gestación del mesodermo extraembrionario o embrionario (Sadler, 2004), y va creciendo progresivamente hasta formar un cordón helicoidal que mide 60-65 cm de largo y pesa 40 gramos al nacimiento (Raio et al., 1999; Di Naro et al., 2001). Desde un punto de vista histológico, el cordón umbilical está cubierto por un epitelio simple derivado del amnios que recibe el nombre de epitelio umbilical (Copland et al., 2002; Mizoguchi et al., 2004). Dentro del cordón umbilical, nos encontramos con dos arterias y una vena, que se enrollan en espiral quedando inmersos en un tejido conectivo mucoso en donde no hay capilares ni vasos linfáticos. Este tejido conectivo recibe el nombre de gelatina de Wharton, la cual fue descrita por primera vez en 1656 por Thomas Wharton (Wharton, 1996). Como los vasos sanguíneos umbilicales carecen de adventicia, la gelatina de Wharton suple la función de la adventicia y participa en la regulación del flujo sanguíneo del cordón umbilical (Bruch et al., 1997; Weissman et al., 1994). En la gelatina de Wharton distinguimos los siguientes componentes: matriz extracelular, rica en fibras de colágeno; proteoglicanos, siendo el ácido hialurónico el más abundante (Sobolewski et al., 1997), lo cual, confiere a la matriz extracelular una mayor hidratación, quedando así, el cordón umbilical, protegido de las presiones mecánicas (Sakamoto et al., 1996). Sin embargo, no se han observado fibras de elastina (Meyer et al., 1983). El componente celular está compuesto por células estromales. Desde que se comenzaron a estudiar las características del cordón umbilical, las células estromales fueron reconocidas como “fibroblastos inusuales”

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(Parry, 1970). Otros autores consideran que estas células estromales podrían ser un tipo de miofibroblastos (Majno et al., 1971), ante la presencia de características ultraestructurales mixtas de fibroblasto y de células del músculo liso. Entre otras proteínas expresan vimentina (Kasper et al., 1988; Takechi et al., 1993; Nanaev et al., 1997; Karahuseyinoglu et al., 2007) que es un filamento intermedio del citoesqueleto que sólo lo expresan las células de origen mesenquimal como los fibroblastos y no lo expresan las células del músculo liso (Eyden et al., 1994; Chou et al., 1997; Akerman et al., 2002), sin embargo presentan colágeno tipo IV, laminina y proteoglicanos típicos de células del músculo liso (Figura 19). Por tanto, estas células estromales de la gelatina de Wharton contribuyen: 1) a dar elasticidad a la gelatina de Wharton, al sintetizar fibras de colágeno, 2) a regular el flujo sanguíneo, por sus propiedades contráctiles (Takechi et al., 1993). Pero, además de presentar estas propiedades, también presentan capacidad de proliferación y potencial de diferenciación como se ha comprobado en diversos estudios, es decir, poseen las dos cualidades necesarias para ser consideradas células madre (Can y Karahuseyinoglu, 2007). Epitelio amníótico y estroma Estroma intervascular Subamniótico

Estroma perivascular

Pared vascular

Figura 19. Distribución de laminina (señal verde) en células estromales del cordón umbilical humano. A) Laminina predominantemente en lámina basal bajo el epitelio amniótico. B y C) Mayor expresión observada alrededor de las células del estroma intervascular. D) Células del músculo liso de la pared vascular (Karahuseyinoglu, 2007).

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3.1. LA INGENIERÍA TISULAR. CÉLULAS MADRE DEL CORDÓN UMBILICAL Antes de pasar al desarrollo de los distintos componentes celulares del cordón umbilical que presentan características de células madre, paso a exponer brevemente algunos conceptos fundamentales sobre la Ingeniería Tisular. Diferentes enfermedades y agresiones que sufre el organismo, pueden dar lugar a una pérdida de células de un tejido u órgano. Esta pérdida celular puede conllevar a una alteración de la función normal de dicho tejido u órgano. Por tanto, es importante tratar de regenerar y restablecer la función normal de dichos tejidos u órganos. Estos dos objetivos, regeneración y restablecimiento de la función normal de un tejido u órgano dañado, son los fines de la Ingeniería Tisular (Fodor, 2003; Campos, 2004). La utilización de células y tejidos del propio paciente presenta grandes ventajas: -

Reducción significativa del número de infecciones del donante al receptor por agentes infecciosos (McDevitt, 2006; Bingler et al., 2008; Singer et al., 2008).

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Ausencia de rechazo inmune injerto contra huésped (Fodor, 2003), por lo que el paciente no tendría necesidad de tomar tratamiento inmunosupresor con todos los problemas añadidos que presentan los pacientes inmunodeprimidos, como las infecciones secundarias a la neutropenia (Smith et al., 2003; Teraoka et al., 2005; Kamoun, 2006).

-

Reducción de las listas de espera, con lo que se disminuiría la morbimortalidad de la enfermedad en el receptor (Fryer, 2008).

-

Reducción de la morbilidad-mortalidad en los donantes de órganos (Yeh y Olthoff, 2008).

Por lo tanto, todas las investigaciones en el campo de la Ingeniería Tisular buscan conocer y desarrollar células, tejidos y órganos, con la finalidad de poder

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utilizarlos para restablecer la función de un tejido determinado en caso de daño o pérdida. Esto se ha llevado a cabo de varias maneras: -

Implante de agregados celulares que han crecido ex vivo, los cuales pueden proceder del propio paciente (células autogénicas o autólogas) (Brittberg et al, 1994; Pelligrini et al., 1999), de una persona distinta (células alogénicas o heterólogas) (Ryan et al., 2001; Penn et al., 2002) y, finalmente, aquellas procedentes de un donante de distinta especie (células xenogénicas o xenólogas) (Matsumura et al., 1987; Fink et al., 2000).

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Sustitución del tejido dañado por otro tejido nuevo que haya sido elaborado en el laboratorio mediante técnicas de Ingeniería Tisular (Langer y Vacanti, 1993). Básicamente, consiste en cultivar células en una matriz artificial tridimensional, donde estas células pueden crecer para, posteriormente, poder trasplantar el tejido desarrollado a un órgano receptor (Figura 20). La utilidad terapéutica de este tipo de técnicas es prácticamente ilimitada con aplicaciones en todos los campos. Buen ejemplo de esto, son los cultivos de piel previamente comentados.

Figura 20: Cultivo de piel humana a partir de queratinocitos

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Estimulación del crecimiento de las células del propio tejido dañado utilizando fármacos, factores de crecimiento o mediante terapia génica (Androutsellis-Theotokis et al., 2006).

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En la mayoría de los casos, la Ingeniería Tisular se basa en el uso de las células denominadas madre, troncales o estaminales. Se pueden definir como aquellas células que tienen gran capacidad para dividirse y diferenciarse en distintas líneas celulares más especializadas (Smith, 2006), no sólo morfológicamente si no también a nivel funcional. Se pueden clasificar de distintas formas: -

Atendiendo a su potencialidad (Smith, 2006), es decir, a su capacidad para diferenciarse en distintos tipos celulares (Figura 21):

Figura 21: Esquema de la clasificación de las células madre según su potencialidad

o Totipotenciales: Son aquellas células capaces de diferenciarse tanto en tejido embrionario (por ejemplo: sistema nervioso, músculo, etc.) como en tejido extraembrionario (placenta y anejos placentarios). En sentido estricto, sólamente los estadios iniciales del desarrollo (zigoto, blastómeras y células de la mórula) constituirían células madre totipotenciales. o Pluripotenciales: Son aquéllas que tienen la capacidad de diferenciarse a cualquiera de los tejidos existentes en un organismo adulto, y por tanto, a tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo),

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incluyendo las células germinales. Las células pluripotenciales son las del polo embrionario del blastocisto (Figura 22).

Figura 22. Esquema de diferenciación de células madre pluripotenciales.

o Multipotenciales: Serían capaces de diferenciarse a distintos tipos celulares, pero siempre restringiendo su potencialidad a tejidos derivados de una misma capa embrionaria, es decir, tejidos derivados del ectodermo, mesodermo o endodermo. En el organismo adulto y en el feto existen numerosos tipos de células multipotenciales, destacando, por ejemplo, las de la médula ósea, que pueden diferenciarse a eritrocitos, leucocitos o plaquetas. o Unipotenciales: Capacidad para formar un único linaje celular. Por ejemplo: células madre epiteliales de la capa basal de la epidermis. Un concepto interesante a destacar cuando se hace referencia a las células madres es la transdiferenciación. Cada vez es más frecuente encontrar trabajos científicos en donde se hace referencia a la misma. Se define como la transformación de una célula madura en una célula diferenciada de otro linaje sin que ésta tenga que revertir a célula madre o progenitora (Thowfeequ et al., 2007). La existencia de este fenómeno en las células la podemos justificar por:

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1) Mutación en la secuencia de nucleótidos del ADN. 2) Alteraciones epigenéticas, es decir, cambios que ocurren a nivel del genoma que no se deben a modificaciones de la secuencia de nucleótidos, sino a modificaciones en el patrón de expresión génica por procesos de metilación o acetilación del ADN entre otros. 3) Factores ambientales que intervienen en los cambios que se producen en la expresión génica (Thowfeequ et al., 2007). De esa manera, la célula podrá alcanzar una estructura y función especializada (Slack, 2006). En resumen, inducir la transdiferenciación de células diferenciadas con un fin terapéutico, puede ser importante en la Ingeniería Tisular ya que se evitarían, por un lado, los problemas éticos y oncológicos que presentan las células embrionarias, y por otro lado, la dificultad para obtener células madre adultas (Figura 23).

Figura 23. Transdiferenciación de células madre a tejidos de diferente origen embrionario.

-

Atendiendo a su origen, las células madre se han dividido en: o Embrionarias: Existen únicamente durante el periodo embrionario. Se pueden obtener a partir de la masa celular interna del blastocisto (Figura 24) en el estadio de embrión preimplantatorio (Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981; Thomson et al., 1998), o bien, de la cresta gonadal (Matsui et al., 1991; Resnick et al., 1992; Shamblott

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et al., 1998). Son pluripotenciales, incluyendo tejidos somáticos (corazón, hígado, etc.) y germinales (ovocitos y espermatozoides) (Geijsen N et al., 2004).

Ectodermo

Células epiteliales del riñón, pulmones, tracto gastrointestinal

Célula progenitora mesodérmica

Blastocisto

Miocitos, osteoblastos, condrocitos, adipocitos, células endoteliales

Mesodermo Células madre embrionarias

Célula progenitora hematopoyética

Células de la médula ósea, células de la sangre Precursores de queratinocitos, neuronas, oligodendrocitos, células ependimarias

Ectodermo

Figura 24: Células madre embrionarias obtenidas del blastocisto pueden diferenciarse a cualquier tejido del organismo.

o Adultas: Existen en el adulto, el feto y el cordón umbilical. Tienen una capacidad proliferativa y un potencial de diferenciación menores que las células madre embrionarias. Son células multipotenciales o unipotenciales, y se han podido identificar en casi todos los tejidos del organismo (Raff, 2003). Dentro de las células madre adultas, nos encontramos con las células madre mesenquimales, también llamadas células progenitoras mesenquimales, las cuales se encuentran repartidas en el tejido conectivo de diversos órganos, como la médula ósea (Friedenstein et al., 1974), la sangre periférica (Zvaifler et al., 2000), el cordón umbilical (Troyer y Weiss, 2008), el hueso trabecular (Noth et al., 2002), el tejido adiposo (Pittenger et al., 1999), el tejido sinovial (De Bari et al., 2001), en los dientes deciduales (Miura et al., 2003), en el músculo esquelético (Jankowski et al., 2002) y en algunos tejidos del feto (Hu et al., 2003; In´t Aker et al., 2003). Hasta el momento, y desde un punto de vista terapéutico, las células mesenquimales de la médula ósea han sido las más estudiadas, ya sea en la reparación de distintos tejidos dañados (Barry y

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Murphy, 2004) o en la terapia génica (Van Damme et al., 2002); e incluso, en la práctica clínica se utilizan como tratamiento de de algunas enfermedades hematológicas y oncológicas tales como la anemia aplásica (Horowitz, 2000; Fouillard et al., 2003), y el linfoma (Appelbaum et al., 1978). Estas células presentan dos inconvenientes: 1) el método de obtención es invasivo y doloroso para el donante, 2) su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciación decrece con la edad (Rao y Mattson, 2001; Rando, 2006). Por esos motivos, es necesario estudiar otras fuentes de células mesenquimales que no tengan esas desventajas, como son las células madre del cordón umbilical. Hasta el momento, se han identificado hasta cuatro fuentes de células madre en el cordón umbilical (Figura 25): Figura 25. Componentes cordón umbilical Sangre del cordón umbilical

Perivascular

1

Endotelio de la vena umbilical

3 2

Subendotelio de la vena umbilical

Intervascular

3

Subamniótico

4

1. Gelatina de Wharton 2. Vena umbilical 3. Arterias umbilicales 4. Amnios

-

Amnioblastos. Estas células proceden de la membrana amniótica y recubren el tejido conectivo del cordón umbilical (Miki et al., 2005; Sanmano et al., 2005).

-

Células progenitoras hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical. Estas células tienen capacidad para diferenciarse a cualquiera de los tres tipos de células sanguíneas: glóbulos rojos, glóbulos blancos o plaquetas (Ye et al., 1994).

-

Células madre vasculares de la vena umbilical. Las dividimos en: células del subendotelio de la vena umbilical (Romanov et al., 2003; Kestendjieva et al., 2008); células del endotelio de la vena umbilical o

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células HUVEC (Elgjo et al., 1975; Ishisaki et al., 2003; Rodríguez-Morata et al., 2008). -

Células madre de la gelatina de Wharton. Sería McElreavey quien, por primera vez la aislara y cultivara ex vivo (McElreavey et al., 1991) (Figura 26). Se distinguen tres poblaciones celulares distintas (Troyer y Weiss, 2008): o Células madre perivasculares, que se sitúan alrededor de los vasos umbilicales. Se caracterizan por ser más fusiformes en cultivo, estar más diferenciadas a miofibroblastos (expresan citoqueratinas), y tener un menor potencial de diferenciación y proliferación. o Células madre de la gelatina de Wharton de la zona intervascular. o Células madre de la gelatina de Wharton de la región subamniótica.

Estos dos últimos grupos celulares se caracterizan por ser sus células más alargadas ex vivo, estar menos diferenciadas a miofibroblastos (ya que no expresan citoqueratinas), y su potencial de proliferación y diferenciación es mayor (Karahuseyinoglu et al., 2007).

Figura 26. Células madre de la gelatina de Wharton cultivadas.

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3.2. CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON DEL CORDÓN UMBILICAL Independientemente de a qué subpoblación celular de las células de la gelatina de Wharton nos estemos refiriendo, todas ellas son células madre mesenquimales (Karahuseyinoglu et al., 2007; Lu et al., 2006; Conconi et al., 2006; Baksh et al., 2007; Saragaser et al., 2005; Wang et al., 2004; Wu et al., 2007; Campard et al., 2008) y poseen características similares a las células mesenquimales adultas: -

Expresan en su superficie diversos marcadores característicos de las células mesenquimales (SH2, SH3, CD10, CD13, CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, CD105, CD166); siendo negativas para marcadores del linaje hematopoyético (CD14, CD31, CD33, CD34, CD38, CD40, CD45 y CD56).

-

Tienen capacidad para diferenciarse a la línea osteogénica, adipogénica, condrogénica

como

específicamente

lo

hacen

las

células

mesenquimales adultas. A pesar de estas similitudes mencionadas, las células madre de la gelatina de Wharton también presentan ciertas diferencias con respecto a las células mesenquimales adultas: -

Elevada actividad telomerasa (Mitchell et al., 2003).

La telomerasa es un enzima formado por un complejo proteína-ácido ribonucleico con actividad polimerasa que replica telómeros durante la fase S de la mitosis (Greider y Blackburn, 1989) (Figura 27).

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Figura 27. Cromosomas cuyos telómeros se encuentran teñidos con fluoresceína.

Los telómeros son secuencias de ADN (TTAGGG) no codificables que se encuentran en los extremos terminales de los cromosomas, cuya misión es la de proteger a la célula en cada división celular, perdiéndose de manera parcial tras las mismas. Tras cada replicación, el cromosoma se acorta. Si se llega a un límite final del telómero, se interrumpe la mitosis, quedando la célula en fase G0 del ciclo celular, ya que no sería posible continuar la división celular normal porque se producirían alteraciones genéticas. De este modo, las células con telómeros cortos tienen una limitada capacidad para renovarse. Las células que tienen elevada actividad telomerasa, tienen los telómeros largos, por lo que pueden dividirse sin problemas. Esta actividad telomerasa aumentada se ha podido ver en células germinales, tumorales y células embrionarias, y se piensa que es responsable de la capacidad de estas células para renovarse (Artandi, 2006). En las células mesenquimales de la gelatina de Wharton existe gran actividad telomerasa, a diferencia de las células mesenquimales adultas. Esto explica que tengan una gran capacidad de proliferación (Mitchell et al., 2003) y una mayor rapidez de expansión en los cultivos celulares que las células mesenquimales adultas (Figura 28). (Saragaser et al., 2005; Lu et al., 2006; Weiss et al., 2006; Karahuseyinoglu et al., 2007). Diversos autores han estudiado la posible transformación tumoral de estas células, comprobándose, que a diferencia de las células madre embrionarias, no la sufren tras múltiples pases de cultivo ex vivo (Karahuseyinoglu et al., 2007), ni desarrollan teratomas en animales de experimentación (Weiss et al., 2006; Lund et al., 2007; Rachakatla et al, 2007).

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Figura 28. Función de la telomerasa. Este enzima repara los telómeros de los cromosomas mediante la adición de secuencias TTAGGG.

-

Expresión de moléculas del complejo de Histocompatibilidad Mayor clase I:

Las células madre de la gelatina de Wharton tienen muy baja expresión de moléculas del complejo de Histocompatibilidad Mayor clase I (HLA ABC) (Saragaser et al., 2005; Lu et al., 2006; Lupatov et al., 2006; Lund et al., 2007; Wu et al., 2007) y ausencia de expresión del Complejo de Histocompatibilidad Mayor clase II (Kadner et al., 2004; Saragaser et al., 2005; Conconi et al., 2006; Lu et al., 2006; Lupatov et al., 2006; Weiss et al., 2006; Lund et al., 2007; Wu et al., 2007). Por tanto, no deberían desencadenar una respuesta inmune de rechazo de huésped contra injerto (Weiss et al., 2003; Medicetty et al., 2004; Weiss et al., 2006). Esto las convierte en un buen candidato para la terapia celular alogénica (Lu et al., 2006). Por el contrario, un

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reciente trabajo realizado por Cho y colaboradores, evaluó la capacidad de estas células de producir una respuesta inmune. Usaron modelo porcino. Tras la primera inyección de células de la gelatina de Wharton, no hubo respuesta inmune, sin embargo, en una segunda inyección se produjo la misma. Además, cuando se inyectan en piel inflamada o cuando se expone a interferón previamente a la inyección, desencadenan respuesta inmune. Este trabajo es el primero en demostrar la inmunogenicidad de las células de la gelatina de Wharton in vivo, con las consecuencias que ello implica en el uso para tratamientos alogénicos (Cho et al., 2007). -

Expresión de marcadores endoteliales:

Las células perivasculares del estroma del cordón umbilical expresan CD146 que es un marcador característico de células endoteliales circulantes y son negativas para CD31, que es el marcador clásico de las células endoteliales. Las células endoteliales expresan CD146 ante determinadas enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunes, infecciones, neoplasias y enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, su presencia implica que estas células tienen potencial para circular por fluidos biológicos y contribuir a reparar tejidos dañados (Baksh et al., 2007; Rachakatla et al, 2007 y 2008). Las células mesenquimales de la médula ósea también expresan CD146, pero la expresión es más intensa en las células mesenquimales de la gelatina de Wharton (Baksh et al., 2007). Todas estas características que hemos mencionado, confiere a las células madre de la gelatina de Wharton ciertas ventajas para su uso en la práctica clínica: 3.2.1. POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN Múltiples autores han estudiado la capacidad de diferenciación de las diferentes células madre que forman parte del cordón umbilical. Así, se ha comprobado que células de la gelatina de Wharton pueden diferenciarse ex vivo a condroblastos, osteoblastos y adipocitos (Wang et al., 2004; Saragaser et al., 2005; Conconi et al., 2006; Honsawek et al., 2006; Lu et al., 2006; Baksh et al., 2007; Baley et al., 2007; Karahuseyinoglu et al., 2007; Wu et al., 2007). Este potencial de

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diferenciación es similar al de otras células mesenquimales adultas, como las procedentes de la médula ósea, aunque con ciertas diferencias. Existen estudios variados sobre la capacidad de diferenciación de las células de la gelatina de Wharton a otras estirpes celulares. Se ha podido comprobar que bajo las condiciones apropiadas, estas células pueden inducirse a la diferenciación de células precursoras neurales (Mitchell et al., 2003; Fu et al., 2004; Ma et al., 2005; Lu et al., 2006), a cardiomiocitos (Wang et al., 2004), a células del músculo esquelético (Conconi et al., 2006), a células endoteliales (Wu et al., 2007) y a hepatocitos (Campard et al., 2008) en cultivos celulares, y en algunos casos también in vivo. Se han aplicado algunas técnicas de Ingeniería Tisular para fabricación de válvulas cardiacas (Schmidt et al., 2006) y de vasos sanguíneos (Kadner et al., 2004) utilizando células mesenquimales de la gelatina de Wharton. Esto refleja la importancia de esta células en el campo de la Ingeniería Tisular cardiovascular (Breymann et al., 2006). Hasta el momento actual, las células de la gelatina de Wharton no han sido utilizadas con el propósito de generar piel humana. Sanmano y colaboradores (Sanmano et al., 2005), en su trabajo, estudian la diferenciación de las células del epitelio del cordón umbilical hacia queratinocitos. Mediante inmunofluorescencia demuestran la expresión de marcadores de diferenciación epitelial, tales como citoqueratinas 1/10, loricrina, filagrina, involucrina y TGase I (Mizoguchi et al., 2000). Esto implica que deben ser capaces de diferenciarse hacia células córneas con capacidad de estratificación. Durante su estudio, cultivaron queratinocitos procedentes de piel humana y células del epitelio del cordón umbilical, sobre un estroma constituido por fibroblastos humanos inmersos en colágeno tipo I, y posteriormente injertados en ratones atímicos. En los modelos en los cuales las células procedían del epitelio del cordón umbilical, la formación de la membrana basal fue incompleta, al igual que la expresión de colágeno tipo IV y VII y sin formación de hemidesmosomas, aunque estas características mejoran en modelos in vivo. Los modelos realizados con queratinocitos presentaron características propias de la piel normal, con más rapidez y fiabilidad. A pesar de esto, estos resultados apoyan la idea

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de que las células del epitelio del cordón umbilical pueden ser usadas como una alternativa en el tratamiento de los pacientes que precisan sustitutos cutáneos. Sin embargo, la capacidad transdiferenciativa de las células madre de la gelatina de Wharton hacia queratinocitos de la piel o la mucosa oral no se ha podido determinar hasta la fecha.

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OBJETIVOS

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El Objetivo Principal de esta Tesis Doctoral es la obtención de sustitutos de piel y mucosa oral humanas de espesor completo, utilizando células madre de la gelatina de Wharton del cordón umbilical y diferentes tipos de sustratos estromales. Para ello se establecen los siguientes Objetivos Específicos: 1. Aislamiento y cultivo de células madre de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano, fibroblastos de la piel y de la mucosa oral humanas. 2. Generación de un modelo de piel humana heterotípica mediante Ingeniería Tisular utilizando un estroma de fibrina y agarosa con fibroblastos de la piel y células madre de la gelatina de Wharton cultivadas en la superficie de éstos. 3. Generación de un modelo de mucosa oral humana heterotípica mediante Ingeniería Tisular utilizando un estroma de fibrina y agarosa con fibroblastos de la mucosa oral y células madre de la gelatina de Wharton cultivadas en la superficie de éstos. 4. Evaluación y control de calidad histológico ex vivo de los tejidos heterotípicos generados en el laboratorio y mantenidos en cultivo. 5. Evaluación y control de calidad histológico e inmunohistoquímico in vivo de los tejidos heterotípicos generados en el laboratorio mediante implante en un modelo de animal inmunodeficiente.

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Objetivos

MATERIAL Y MÉTODOS

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4. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE PIEL HUMANA Para la investigación llevada a cabo en esta tesis doctoral, se han obtenido muestras de piel humana de espesor total (epitelio y dermis) procedentes de pacientes sanos sometidos a diferentes procedimientos de Cirugía Plástica ambulatoria bajo anestesia local o locorregional. Todos los pacientes incluidos en el estudio fueron tratados en el Servicio de Cirugía Plástica, Reparadora y Estética del Hospital Universitario Virgen de las Nieves de Granada. En todos los casos, se obtuvo el consentimiento firmado del paciente una vez que éste había sido informado acerca de todo el procedimiento. En el momento de la obtención, ninguno de los pacientes seleccionados presentaba enfermedad sistémica grave, proceso neoplásico asociado o enfermedad infecto-contagiosa. En ningún caso se extirpó más tejido del necesario para el tratamiento de la patología quirúrgica que presentaba el paciente. Una vez obtenida la muestra de forma estéril se eliminó el tejido graso subcutáneo hasta dejar expuesta la dermis, tras lo cual los tejidos extraídos fueron introducidos inmediatamente en medio de transporte estéril constituido por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich Ref. D5796, Saint- QuentinFallavier, Francia) suplementado con antibióticos (500 U/ml de penicilina G y 500 µg/ml de estreptomicina) y antimicóticos (1,25 µg/ml de anfotericina B) (Sigma-Aldrich Ref. A5955) para evitar una eventual contaminación de la muestra. Estas muestras de piel humana se utilizaron, por un lado, como controles histológicos de piel humana normal y, por otro lado, para la generación de cultivos celulares primarios de fibroblastos.

5. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE MUCOSA ORAL HUMANA. Igualmente, se han obtenido muestras de mucosa oral normal de espesor total (epitelio y corion) obtenidas de pacientes sanos sometidos a diferentes procedimientos de Cirugía Oral ambulatoria bajo anestesia local. Todos los pacientes

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Material y Métodos

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incluidos en el estudio fueron tratados en el Servicio de Cirugía Oral y Maxilofacial del Hospital Universitario Virgen de las Nieves de Granada. En todos los casos, se contó con el consentimiento informado del paciente al igual que para la obtención de las muestras de piel. Del mismo modo, en el momento de la obtención, ninguno de los pacientes seleccionados presentaba enfermedad sistémica grave, proceso neoplásico asociado o enfermedad infectocontagiosa. En ningún caso se extirpó más tejido del necesario para el tratamiento de la patología quirúrgica que presentaba el paciente. Una vez obtenida la muestra, los tejidos extraídos fueron introducidos inmediatamente en medio de transporte estéril constituido por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).

6. OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE GELATINA DE WHARTON Los cordones umbilicales utilizados para este estudio fueron obtenidos de partos por cesárea de mujeres gestantes a término, que previamente habían aceptado participar en el estudio mediante consentimiento informado. Después de cada nacimiento, 10–15 cm de cordón umbilical obliterado fue inmediatamente conducido al laboratorio en medio de transporte Eagle’s mínimum essential medium (MEM) suplementado con penicilina (10.000 unidades/ml), estreptomicina (10 mg/ml) y anfotericina-B (25 µg/ml) (Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EEUU).

7. AISLAMIENTO DE LAS CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA

DE

WHARTON

DEL

CORDÓN

UMBILICAL Una vez en el laboratorio, la manipulación del cordón umbilical se realizó en condiciones de esterilidad y en la campana de flujo laminar. Con la ayuda de tijeras y pinzas, se diseccionó longitudinalmente el cordón a través de la vena umbilical. Se

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retiraron cuidadosamente las arterias y la vena umbilical para separar la gelatina de Wharton. Posteriormente, se fragmentó la gelatina hasta convertirla en fragmentos de tejido muy pequeño. Estos fragmentos de gelatina de Wharton se incubaron en 30 ml de colagenasa tipo I (Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe, Alemania) a 37ºC en agitación durante aproximadamente 4–6 horas, para posteriormente recoger las células disociadas mediante centrifugación durante 7 minutos a 1050 rpm. A continuación, se eliminó cuidadosamente el sobrenadante y se resuspendió el pellet celular en 5–10 ml de tripsina prediluida (Sigma-Aldrich). De nuevo se incubó a 37ºC en un baño de agitación durante 30 minutos. Después, se neutralizaron los efectos de la tripsina añadiendo 10–20 ml de medio de cultivo M199 suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich), centrifugándose de nuevo a 1050 rpm durante 7 minutos para obtener las células aisladas. Finalmente, se resuspendieron estas células en medio de cultivo Amniomax® (Gibco BRL Life Technologies) en un frasco de cultivo de 25 cm². Todos los cultivos se incubaron a 37ºC en una estufa de CO 2, renovándose el medio de cultivo cada 3 días (Figura 29).

Cordón Umbilical (10–15 cm en condiciones de esterilidad )

Aislamiento de las células vasculares Aislamiento de las células estromales

Retirada de las arterias y vena umbilical

Fragmentación del estroma

Colagenasa tipo I

Tripsinización

Las células/ explante se cultivan en frasco de cultivo

Aislamiento de las células epiteliales

Figura 29. Metodología empleada para el aislamiento y cultivo de las células madre de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano.

8. DESARROLLO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE FIBROBLASTOS DE LA PIEL Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras fueron lavadas dos veces en una solución estéril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 µg/ml y 1,25 µg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extraños que pudieran encontrarse adheridos a las muestras. En primer lugar, para separar la dermis del epitelio, las muestras se

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mantuvieron en una solución estéril con dispasa II a 37ºC que degrada la membrana basal sobre la cual se ancla el epitelio a la dermis, por lo que tras esto se consiguió separar mecánicamente por un lado el epitelio y por otro la dermis. Para llevar a cabo la digestión de la matriz extracelular de la dermis de la piel y conseguir la separación de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras fueron incubadas a 37ºC en una solución estéril de colagenasa tipo I de Clostridium hystoliticum (Gibco BRL Life Technologies Ref. 17100-017, Karlsruhe, Alemania) al 2% en medio de cultivo DMEM durante 6 horas. Esta solución es capaz de digerir el colágeno de la dermis y liberar los fibroblastos estromales. Para la obtención de cultivos primarios de fibroblastos, se centrifugó a 1.000 rpm durante 10 minutos la solución de digestión que contenía las células estromales disgregadas de la dermis, recogiéndose el pellet celular correspondiente a los fibroblastos en frascos de cultivo de 15 cm² de superficie. Como medio de cultivo, se utilizó DMEM enriquecido en glucosa (Sigma-Aldrich Ref. D5796) suplementado con antibióticos y antimicóticos (100 U/ml de penicilina G, 100 µg/ml de estreptomicina y 0,25 µg/ml de anfotericina B; Sigma-Aldrich Ref. A5955) y suero bovino fetal (SBF) (Sigma-Aldrich Ref. F9665) al 10%. A este medio básico de cultivo lo denominamos MF (medio de fibroblastos). Las células fueron incubadas a 37ºC con un 5% de dióxido de carbono, en condiciones estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo fueron renovados cada tres días (Figura 30).

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Figura 30. Esquema de desarrollo de cultivos primarios de fibroblastos orales y de la piel y células de la gelatina de Wharton.

9. DESARROLLO DE CULTIVOS PRIMARIOS DE FIBROBLASTOS DE MUCOSA ORAL Todas las muestras fueron lavadas dos veces en una solución estéril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500

g/ml y 1.25

g/ml,

respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extraños que pudieran encontrarse adheridos a las muestras. Para llevar a cabo la digestión de la matriz extracelular del corion de la mucosa oral y conseguir la separación de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras fueron incubadas a 37ºC en una solución estéril de colagenasa tipo I de Clostridium hystoliticum (Gibco BRL Life Technologies Ref. 17100-017, Karlsruhe, Alemania) al 2% en medio de cultivo DMEM durante 10-12 horas. Como ya se mencionó en el apartado anterior, esta solución es capaz de digerir el colágeno del corion y liberar los fibroblastos estromales, dejando intacto el epitelio oral. Una vez transcurrido este tiempo, se procedió a retirar el epitelio no digerido de la mucosa oral. Para la obtención de cultivos primarios de fibroblastos, se centrifugó a 1.000 rpm durante 10 minutos la solución de digestión que contenía las células estromales disgregadas del

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corion, recogiéndose el pellet celular correspondiente a los fibroblastos en frascos de cultivo de 25 cm2 de superficie. Como medio de cultivo se utilizó MF.

Figura 31. Esquema resumen del procedimiento utilizado para la realización del estudio.

10. SUBCULTIVO DE LAS CÉLULAS PROCEDENTES DE CULTIVOS PRIMARIOS DE PIEL Y MUCOSA ORAL Una vez alcanzada la confluencia celular, los distintos cultivos celulares de fibroblastos se lavaron con PBS estéril y se incubaron en 1-3 ml de una solución de tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l (Sigma-Aldrich Ref. T4799) a 37ºC durante 10 minutos y en colagenasa tipo I de Clostridium hystoliticum (Gibco BRL Life Technologies Ref. 17100-017, Karlsruhe, Alemania) al 2% en medio de cultivo DMEM durante 6 horas. Esta solución es capaz de digerir el colágeno de la dermis y liberar los fibroblastos estromales.

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Así se consigue disgregar los mecanismos de adhesión celular y obtener células individualizadas y no adheridas a la superficie del frasco de cultivo. Para la dermis, una vez que las células se desprendieron de la superficie de los frascos de cultivo, se procedió a inactivar la tripsina utilizada mediante adición de 10 ml de medio de cultivo MF. Posteriormente, las soluciones de fibroblastos de mucosa oral y dermis en las cuales se localizaban las células desprendidas, se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener un pellet o botón celular con las células de interés, desechándose el sobrenadante con la tripsina. El pellet celular se resuspendió cuidadosamente en 5 ml de medio MF y estas células se cultivaron en frascos de cultivo de 15, 25 o 75 cm² de superficie. Los cultivos de fibroblastos se expandieron aproximadamente unas quince veces en frascos de cultivo antes de su uso para fabricar los sustitutos de tejido conectivo. En todos los casos, y para asegurar una adecuada viabilidad celular, para la elaboración de sustitutos de piel y mucosa oral, se utilizaron células correspondientes a los cuatro primeros subcultivos.

11. SUBCULTIVO

CELULAR

DE

LAS

CÉLULAS

MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON DEL CORDÓN UMBILICAL Cuando la monocapa de células madre de la gelatina de Wharton alcanzó la semiconfluencia, las células se lavaron con 5 ml de PBS (tampón fosfato, Sigma-Aldrich ref. P4417) para eliminar cualquier resto del medio de cultivo y de células muertas. A continuación, se cubrió toda la superficie de cultivo con aproximadamente 2 ml de solución de tripsina prediluida (Sigma-Aldrich) para disgregar los mecanismos de

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adhesión celular y obtener células individualizadas y no adheridas a la superficie del frasco de cultivo, incubándose 5–10 minutos a 37ºC. Transcurrido ese tiempo, y tras comprobar que las células se habían separado del frasco, se añadieron 5 ml de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal para inactivar el efecto de la solución de disociación, recogiéndose ambos en un tubo cónico, el cual se centrifugó a 1000 rpm durante 10 minutos. El precipitado o pellet celular que se obtuvo, se resuspendió en medio de cultivo y se sembró en nuevos frascos de cultivo con medio Amniomax®.

12. CONGELACIÓN DE CÉLULAS Una vez alcanzada la confluencia de los cultivos, se procedió a congelar las células para su conservación a largo plazo. Para ello, los fibroblastos se trataron con una solución de tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l (Sigma-Aldrich Ref. T4799) a 37ºC durante 10 minutos para despegarlos de la superficie del frasco de cultivo. Para neutralizar la tripsina, se añadió una cantidad equivalente de medio de cultivo MF (contiene un 10% de SBF), obteniéndose las células separadas mediante centrifugación a 1.000 rpm durante 10 minutos. Tras esto, las células se mantuvieron sobre hielo y se resuspendieron en medio de congelación (10% de DMSO, 10% de SBF y 80% DMEM) en viales especiales para ultracongelación. Para evitar un choque térmico demasiado brusco, las células incluidas en el medio de congelación se congelaron a -20ºC durante las primeras 12-24h, pasándose a continuación a una temperatura de -60º durante 24h y finalmente, a un tanque con nitrógeno líquido (inicialmente en fase vapor y después en fase líquida), donde se almacenaron a largo plazo. Para los fibroblastos, se utilizan dos crioviales por cada frasco confluente de 75 cm².

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13. CONSTRUCCIÓN DE SUSTITUTOS DE PIEL Y MUCOSA

ORAL

HUMANA

HETEROTÍPICA

MEDIANTE INGENIERÍA TISULAR La construcción de sustitutos de piel humana heterotípica de espesor completo (SPH) y de mucosa oral heterotípica de espesor completo (MOH), se llevó a cabo de modo secuencial. 1) Se elaboró un sustituto de estroma procedente de los fibroblastos obtenidos a partir de la piel y de la mucosa oral. 2) En segundo tiempo, se fabricó un equivalente epitelial en la superficie del mismo a partir de células madre de la gelatina de Wharton. Además, para garantizar una correcta diferenciación y estratificación del epitelio construido, se utilizó la técnica de cultivo denominada interfase aire-líquido (Reichl y Müller-Goymann, 2003). Para ello, los constructos de piel se elaboraron en insertos porosos de cultivo Transwell® con membranas porosas de 0,4 µm (Costar, Corning Inc., Corning, Nueva York, EEUU). Estos sistemas de cultivo están compuestos por una placa estéril de 6 pocillos en el interior de los cuales se aloja una pieza de plástico móvil cuya base está formada por una membrana porosa y permeable de nylon o policarbonato. El tamaño de estos poros permite a los nutrientes pasar a través de la membrana de la placa pero evita la migración de las células de un compartimento a otro (Figura 32).

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Figura 32. Elaboración de sustitutos de mucosa oral utilizando una técnica secuencial sobre sistemas de cultivo Transwell®.

La construcción de los sustitutos de piel se llevó a cabo, en primer lugar, elaborando un equivalente o sustituto estromal directamente en los insertos porosos anteriormente descritos, utilizando para ello un modelo de geles de agarosa y fibrina. Para la elaboración de este gel de agarosa y fibrina al 0,1%, se utilizó plasma sanguíneo humano congelado procedente de donantes sanos (cedido por el Centro Regional de Transfusión Sanguínea y Banco de Tejidos de Granada y Almería, CRTS, España) siguiendo las normas y recomendaciones de la Asociación Americana de Bancos de Sangre (American Association of Blood Banks, 1990). La fabricación de sustitutos estromales de la dermis se llevó a cabo utilizando una modificación de la técnica previamente descrita por Meana y colaboradores (Meana y cols., 1998; Llames y cols., 2004) previamente utilizada por nuestro grupo de investigación para el desarrollo de sustitutos artificiales de la mucosa oral y la córnea (Alaminos y cols., 2006, 2007; Sánchez-Quevedo et al., 2007; Garzón et al., 2009). Para ello, se utilizaron 100.000 fibroblastos procedentes de los cultivos primarios, resuspendidos en 750 µl de medio de cultivo DMEM, a los cuales se añadieron unos 7,6 ml de plasma sanguíneo humano. Para evitar la fibrinolisis espontánea de los geles de fibrina, se añadieron 150 µl de ácido tranexámico (Amchafibrín®, Fides Ecofarma, Valencia, España). Finalmente,

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la reacción de coagulación de la fibrina se precipitó mediante la adición de 1 ml de Cl2Ca 1% (p/v) a la mezcla, añadiéndose justo después 0,5 ml de agarosa tipo VII especial para cultivos celulares (Sigma-Aldrich Ref. A9045) disuelta al 2% (p/v) en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusión. La concentración final de agarosa en el gel fue del 0,1% (p/v). Una vez mezclados todos los componente, y evitando un trauma físico excesivo, estos geles se alicuotaron cuidadosamente en los insertos porosos o en placas de Petri (Figura 33) y se dejaron en el incubador a 37ºC con un 5% de CO2, durante 2 horas para que coagularan. Después de este tiempo se cubrieron con 10 ml de medio de cultivo.

Figura 33. Preparación de sustitutos estromales de fibrina humana. La mezcla que contenía el plasma, los fibroblastos, el agente antifibrinolítico, la agarosa y el cloruro cálcico se alicuotó en placas de Petri antes de que comenzara la reacción de coagulación del plasma.

14. EVALUACIÓN IN VIVO DE LOS SUSTITUTOS HETEROTÍPICOS DE PIEL Y MUCOSA ORAL HUMANA La evaluación in vivo de los sustitutos de piel humana se llevó a cabo en la Unidad de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Granada,

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utilizando ratones atímicos desnudos e inmunodeficientes de seis semanas de vida (Fox 1nu/nu immunodeficient athymic mice, Harlan, USA), los cuales exigían que el entorno fuera estéril. Los animales se controlaron dentro de cámaras de flujo laminar estéril, las cuales mantenían adecuados niveles de temperatura y humedad. Las intervenciones fueron realizadas dentro de cabinas de seguridad biológica en un área quirúrgica específica, con paños y material quirúrgico esterilizado. En cuanto a la técnica anestésica, se utilizó el siguiente protocolo: Atropina 0,05 mg subcutánea por kg peso del ratón. Calmoneosan® (acepromacina) 1 mg intraperitoneal por kg peso del ratón. Imalgene® (ketamina) 150 mg intraperitoneal por kg peso del ratón. Se extirpó quirúrgicamente un colgajo de piel dorsal, de espesor total, incluyendo tejido celular subcutáneo, respetando fascia de la musculatura paravertebral, de la zona dorsal del ratón, de unas dimensiones aproximadas de 1,5 x 1,5 cm. Posteriormente, se colocó el constructo de piel artificial humana sobre el área del defecto cutáneo del ratón. Se fijó a la piel mediante sutura cutánea con puntos simples de seda de 4/0, colocándose finalmente una lámina transparente de plástico poroso estéril fijada con puntos de seda 4/0 para proteger el implante (Figura 34).

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Figura 34. Procedimiento quirúrgico llevado a cabo para la extracción de piel e implante del contructo sobre ratones atímicos.

Para valorar el resultado clínico de los injertos de piel generada mediante Ingeniería Tisular, se procedió a la evaluación macroscópica diaria de los animales, determinándose los siguientes parámetros en cada uno de los casos: Tamaño del injerto. Evolución de la herida: Signos de cicatrización, granulación, fenómeno de contracción de la herida, etc. Presencia de complicaciones: hemorragia, signos de infección, dehiscencia, etc. Presencia de costras, exudados, etc. El estudio histológico se realizó tras el sacrificio de los animales en diferentes periodos de evolución. El sacrificio se llevó a cabo utilizando una sobredosis de anestésicos en inyección intraperitoneal.

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15. EVALUACIÓN

HISTOLÓGICA

DE

LOS

SUSTITUTOS DE PIEL Y MUCOSA ORAL 15.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA Para el análisis de los tejidos mediante microscopía óptica, tanto las muestras control como los constructos de piel y mucosa oral humanas heterotípicas artificiales, se fijaron en formaldehído al 4% tamponado y se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (70, 80, 96 y 100%). A continuación, el etanol se sustituyó por xileno y las muestras fueron incluidas en bloques de parafina. Una vez enfriados los bloques, se obtuvieron secciones transversales de 4 m de espesor que se tiñeron con hematoxilina y eosina para su examen histológico mediante el microscopio óptico.

15.2. INMUNOFLUORESCENCIA La detección de proteínas específicas de citoqueratinas, involucrinas y filagrinas humanas se llevó a cabo utilizando secciones transversales de 4

m de

espesor, tanto en controles de piel y mucosa oral normal, como en las muestras artificiales obtenidas mediante Ingeniería Tisular que previamente se habían implantado en los ratones atímicos, incluyendo dichas muestras en parafina. Para llevar a cabo la inmunofluorescencia, las muestras tisulares seccionadas y depositadas en cubreobjetos cubiertos con poli-L-lisina se desparafinaron en xileno, se lavaron en alcohol y se rehidrataron con agua. A continuación, se preincubaron durante 20 minutos en una solución de albúmina sérica bovina al 2% con un 10% de suero de caballo en PBS, utilizándose posteriormente esta misma solución para diluir los diferentes anticuerpos primarios, incubándose las muestras durante 2 h a 37ºC con estos anticuerpos. Las diluciones utilizadas para los anticuerpos primarios se muestran en la tabla 1. Tras ello, se lavaron las muestras en PBS y se aplicó durante una hora un anticuerpo secundario anti-anticuerpo de ratón o anti-anticuerpo de conejo marcado con un pigmento fluorescente (FITC o Cy3), lavándose con PBS a continuación. Tras contrateñir los núcleos con DAPI, se cubrieron las muestras con cubreobjetos de vidrio y se analizaron las mismas en un microscopio fluorescente Nikon Eclipse 90i.

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La evaluación de los resultados se realizó determinando la presencia de señales positivas a dos niveles: 1) Localización de la señal de expresión: homogénea, si existe expresión de la proteína en todo el espesor del epitelio, basal, si existe expresión a nivel del estrato basal, suprabasal, incluyendo en ésta el estrato espinoso, granuloso, hialino y córneo 2) Intensidad de expresión de la proteína: (-) Nula expresión, (+) levemente positiva, (++) positiva, (+++) fuertemente positiva. Tabla 1. Anticuerpos primarios y secundarios usados en este trabajo y la dilución correspondiente para los ensayos de inmunofluorescencia.

Tipo de Anticuerpo

Anticuerpo

Dilución

Origen

Laboratorio Comercial

Referencia

Anti-Pancitoqueratina

Prediluido

Ratón

Master diagnostica, Granada, España

001607QD

Anti-CK1

1:500

Conejo

Sigma

HPA017917

Anti-CK10

Prediluido

Ratón

Master diagnostica, Granada España

000150QD

Anti-involucrinas

1:500

Ratón

Sigma

I9018

Anti-filagrinas

1:50

Ratón

ABCam

SPM181

Anti-CK7

Prediluido

Ratón

Master diagnostica, Granada, España

001004QD

Anti-CK8

Prediluido

Ratón

Master diagnostica, Granada, España

005095QD

1:1000

Ratón

Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA

C 5176

1:400

Ratón

Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA

C 0791

Primarios

Anti-CK4

Anti-CK13

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Material y Métodos

RESULTADOS

Potencialidad queratinocítica de las células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en Ingeniería Tisular

16. CULTIVOS PRIMARIOS DE FIBROBLASTOS DE LA PIEL Y MUCOSA ORAL Los cultivos primarios de fibroblastos (Figuras 35 y 36), tanto de la piel como de la mucosa oral, mostraron un crecimiento celular muy rápido a partir de los primeros días. Tanto en un caso como en el otro, a las 24 horas, la mayor parte de las células se encontraban adheridas al fondo del frasco de cultivo y habían comenzado a emitir pequeñas prolongaciones a modo de pseudópodos. El crecimiento de los fibroblastos se evidenció entre las 48 y 72 horas tras el cultivo. Al 5º día había formado un entramado celular constituido por células con abundantes nucleolos, señal de alto metabolismo celular, y con largas prolongaciones, que finalmente, a partir del 7º día, se convierten en una masa de células fusiformes que ocupa toda la superficie del cultivo (cultivos confluentes) rellenando prácticamente todo el frasco de cultivo.

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Resultados

Potencialidad queratinocítica de las células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en Ingeniería Tisular

Figura 35. Imágenes de microscopía óptica de contraste de fases de cultivos de fibroblastos de piel humana (M.O.100x). Evolución de la confluencia.

Figura 36. Imágenes de microscopía óptica de contraste de fases de cultivos de fibroblastos de mucosa oral humana (M.O.100x). Evolución de la confluencia.

17. CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON DEL CORDÓN UMBILICAL Al igual que los cultivos de fibroblastos, estas células presentaron un potencial proliferativo elevado desde los primeros días. En las primeras 24 horas, se pudieron observar células diseminadas por el frasco de cultivo de morfología redondeada, y con emisión de prolongaciones a modo de pseudópodos. Presentaban grandes núcleos con cromatina laxa. A las 48 horas estas células presentaban subconfluencia, adoptando forma más fusiforme. A las 72 horas, el crecimiento es muy evidente, alcanzando la confluencia total. Presentan, al igual que los fibroblastos, abundantes nucleolos.

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Resultados

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Finalmente, al 7º día se han conformado en una masa celular que cubre por completo el frasco de cultivo (Figura 37).

Figura 37. Imágenes de microscopía óptica de contraste de fases de cultivos de células madre de la gelatina de Wharton (M.O.100x). Evolución de la confluencia.

18. EVALUACIÓN EX VIVO DE LOS SUSTITUTOS HETEROTÍPICOS DE MUCOSA ORAL Y PIEL Mediante microscopía óptica (hematoxilina-eosina) se analizaron los sustitutos heterotípicos de piel y mucosa oral humanas de espesor total obtenidos mediante Ingeniería Tisular. En el corte histológico de mucosa oral obtenida mediante Ingeniería Tisular tras tres semanas en medio de cultivo aire líquido, observamos un gran número de fibroblastos inmersos en la matriz de fibrina y agarosa, no apreciándose vasos sanguíneos ni estructuras típicas del estroma de la mucosa oral. El análisis histológico

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mostró una adecuada integración de los fibroblastos con el sustrato artificial de fibrina y agarosa. En segundo lugar, se observó la presencia de un sustituto epitelial multiestratificado (6-7 capas celulares), resaltando la ausencia de papilas coriales y de crestas epiteliales (Figura 38), así como de glándulas o anexos epiteliales. La estructura de las células madre de la gelatina de Wharton que formaban dicho sustituto epitelial, era parcialmente análoga a la de las células epiteliales de la mucosa oral humana control, formando varias capas de células aplanadas sobre el estroma artificial.

Figura 38. Corte histológico de mucosa oral humana artificial obtenida mediante Ingeniría Tisular (hematoxilina-eosina), tras 3 semanas en cultivo aire-líquido.

En los cortes histológicos de piel humana artificial heterotípica obtenida mediante Ingeniería Tisular tras tres semanas en medio de cultivo aire líquido, observamos, en primer lugar, la presencia de numerosos fibroblastos de morfología fusiforme y estrellada inmersos en la matriz de fibrina y agarosa. Al igual que en el caso de la mucosa oral heterotípica, no se apreciaron vasos sanguíneos ni otras estructuras típicas del tejido conjuntivo nativo. En segundo lugar, el sustituto de la epidermis mostró 6-7 capas celulares de morfología epitelial aplanada, con ausencia de papilas dérmicas, crestas epiteliales y anejos cutáneos. Hallazgos similares a los objetivados en la mucosa oral humana heterotípica obtenida mediante Ingeniería Tisular (Figura 39).

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Figura 39. Corte histológico de piel humana artificial obtenida mediante Ingeniería Tisular (hematoxilinaeosina), tras 3 semanas en cultivo aire-líquido.

19. EVALUACIÓN CLÍNICA DE LOS SUSTITUTOS DE PIEL HUMANA HETEROTÍPICA Y DE MUCOSA ORAL HETEROTÍPICA DE ESPESOR COMPLETO La evaluación de los constructos de piel y de mucosa oral humanas heterotípicas mediante implante en la zona dorsal de los ratones inmunodeficientes se pudo realizar con éxito en todos los casos, apreciándose una excelente tolerancia de todos los animales al proceso anestésico-quirúrgico. Del mismo modo, los animales toleraron el implante con integración de éste. Tanto para los implantes de mucosa oral como para los de piel humana heterotípica, se evaluaron al 5º día postimplante y al 30º día. A los 5 días tras la colocación del implante de mucosa oral humana de espesor completo heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular, los animales presentaban una lesión costrosa, dura, de color anaranjado, sobreelevada, ligeramente disminuida de tamaño debido a la contracción de los bordes de la herida quirúrgica, fenómeno habitual en la fase de cicatrización correcta correspondiente con este momento evolutivo. A los treinta días del injerto, se apreciaba en el área del implante un fenómeno de contracción importante, delimitando la región del

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implante a unos 6 x 8 mm, presentando una piel algo más deprimida, de coloración rosada. En este momento la herida está totalmente cerrada, sin dehiscencias, ni signos de infección (Figura 40).

Figura 40. Evaluación clínica de los implantes de mucosa oral humana heterotípica de espesor completo generada mediante Ingeniería Tisular. Las dos primeras imágenes muestran la evolución al 5º día del implante; las imágenes inferiores muestran la evolución al 30º día postimplante.

En el caso de los implantes de piel humana heterotípica de espesor total generada mediante Ingeniería Tisular, al 5º día postimplante en el dorso de ratones atímicos inmunodeficientes, observamos una evolución paralela a la anterior, con lesión costrosa, dura, anaranjada y sobreelevada, con leve contracción de bordes. En el 30º día postimplante se puede observar una integración total en la piel del animal de experimentación, con una zona discretamente deprimida, de unos 5 mm de longitud, que prácticamente no se diferencia de la piel normal (Figura 41).

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Figura 41. Evaluación clínica de los implantes de piel humana heterotípica de espesor completo generada mediante Ingeniería Tisular. Las dos primeras imágenes muestran la evolución al 5º día del implante; las imágenes inferiores muestran la evolución al 30º día postimplante.

20. EVALUACIÓN HISTOLÓGICA IN VIVO DE LOS SUSTITUTOS DE PIEL HUMANA HETEROTÍPICA Y MUCOSA ORAL HETEROTÍPICA DE ESPESOR COMPLETO. El estudio de microscopía óptica se ha llevado a cabo con tinción de hematoxilina-eosina. (Figura 42) Los sustitutos de piel humana heterotípica han sido evaluados tras 20 y 30 días después de haber sido implantados en ratones atímicos. A los 20 días postimplante, se observa una adaptación completa del tejido injertado en el ratón, como lo demuestra la infiltración existente del tejido propio del animal en el injerto implantado. Existe un estroma

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muy rico en fibras de colágeno, que presentan una disposición homogénea y ordenada. La membrana basal presenta células cuboideas íntimamente unidas entre sí. Como característica diferencial con los cortes de piel normal, podemos decir, que la membrana basal no tiene papilas dérmicas ni presencia de anejos cutáneos. La epidermis consta de entre 8-10 capas de queratinocitos. Existe gran cornificación en la capa más superficial. El constructo de piel humana heterotípica analizado a los 40 días postimplante, se encuentra completamente integrado en el organismo del animal. En el estroma, podemos añadir la presencia de abundantes vasos sanguíneos inmersos en las fibras de colágeno. La epidermis presenta entre 10-15 filas de queratinocitos. En el caso de los sustitutos de mucosa oral humana heterotípica generados mediante Ingeniería Tisular, y estudiados con microscopía óptica mediante tinción con hematoxilina-eosina, los cortes se analizaron en los días 30 y 40 postimplante. En el análisis realizado 30 días después de haber implantado el constructo en el ratón, presenta una magnífica integración con el resto de los tejidos del animal. El tejido submucoso es rico en fibras de colágeno, que al igual que ocurría en los sustitutos de piel, se encuentran homogéneamente distribuidas con perfecta orientación. Cabe destacar que en este momento todavía se puede observar la existencia de restos de agarosa. Tampoco podemos destacar la aparición de crestas epiteliales. El epitelio de la mucosa oral presenta un grosor aproximado de unas 5-7 capas celulares. Transcurridos 40 días postimplante, han desaparecido los restos de agarosa del estroma epitelial. Continúan sin aparecer las crestas epiteliales, y encontramos alrededor de 10 capas de queratinocitos, con cornificación externa debida al contacto con el aire.

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Figura 42. Cortes histológicos de los implantes de mucosa oral heterótipica y piel humana heterotípica de espesor total, a los 30-40, 20-30 días postimplante, respectivamente.

21. EVALUACIÓN POR INMUNOFLUORESCENCIA DE LOS

SUSTITUTOS

DE

PIEL

HUMANA

HETEROTÍPICA 21.1. FILAGRINA. Es una de las proteínas estructurales de la piel más importantes. Desempeña un papel fundamental en la generación y mantenimiento del estrato córneo. Contribuye al colapso del citoesqueleto de los queratinocitos que se aplanarán para formar el estrato córneo (Jensen, 2009). En un corte de piel humana normal usada como control, podemos observar una intensa expresión de filagrina sobre todo en las capas más superficiales de la epidermis, esto es, en el estrato córneo (Figura 43).

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Figura 43. Expresión de filagrina en un corte de piel humana normal.

20 días postimplante de piel humana heterotípica, hay una expresión importante de filagrina, tanto en el estrato córneo como en el granuloso, representativo de la elevada actividad metabólica que presentan las células epidérmicas hacia la diferenciación córnea (Figura 44).

Figura 44. Expresión de filagrina en corte de piel humana heterotípica 20 días postimplante.

Se puede observar como a los 30 días postimplante, continuamos observando intensa positividad para las capas más superficiales. Además, hay una gran cornificación, con un adecuado proceso de descamación de las capas más superficiales (Figura 45).

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Figura 45 Expresión de filagrina en corte de piel humana heterotípica 30 días postimplante.

21.2. INVOLUCRINA La involucrina es una proteína citoplasmática característica de las células epiteliales. Participa en la formación de la membrana queratinocítica (Kubilus, 1990), expresándose, por tanto, mayoritariamente en el estrato córneo y, algo más débilmente en el granuloso. En un corte de piel humana normal usada como control, podemos observar una intensa expresión de involucrina sobre todo en las capas más superficiales de la epidermis, esto es, en los estratos granuloso y córneo (figura 46):

Figura 46. Expresión de involucrina en un corte de piel humana normal.

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20 días postimplante del sustituto de piel humana heterotípica, observamos

expresión

de

involucrina

de

forma

irregular,

concentrándose preferentemente en el estrato córneo (Figura 47).

Figura 47. Expresión de involucrina en un corte de piel humana heterotípica 20 días postimplante.

En las muestras obtenidas 30 días postimplante, se puede observar que la expresión de esta proteína citoplasmática es muy leve y se distribuye uniformemente por todas las capas del epitelio (Figura 48).

Figura 48. Expresión de involucrina en un corte de piel humana heterotípica 30 días postimplante.

21.3. CITOQUERATINAS Las citoqueratinas son proteínas que forman parte del grupo de los filamentos intermedios. Como proteínas de filamento intermedio, las citoqueratinas tienen funciones en el epitelio asociadas al citoesqueleto y a las uniones entre célula y célula. Por este motivo, son necesarias para el mantenimiento de la forma celular, integridad,

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morfología y cohesión entre las células epiteliales. Clásicamente se han dividido en dos grupos: ácidas o tipo I y básicas o tipo II. Siempre se expresan por parejas y tienen diferentes patrones de expresión según su localización (Aquino, 2008; Ujwala et al., 2004). 21.3.1. Pancitoqueratina Esta proteína es un marcador de diferenciación epitelial que incluye numerosos tipos de citoqueratinas de amplia distribución. En la piel humana normal usada como control, podemos observar una intensa expresión de pancitoqueratina sobre todo en las capas más superficiales de la epidermis, incluyendo los estratos espinoso, granuloso y córneo (Figura 49).

Figura 49. Expresión de pancitoqueratina en corte de piel humana normal.

El análisis de las muestras generadas mediante Ingeniería Tisular 20 días postimplante de piel humana heterotípica sobre el ratón atímico, la inmunofluorescencia muestra que la presencia de pancitoqueratinas es levemente positiva en los estratos más superiores y negativa en los estratos basales del epitelio (Figura 50).

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Resultados

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Figura 50. Expresión de pancitoqueratina en corte de piel humana heterotípica 20 días postimplante.

El análisis 30 días postimplante del sustituto generado mediante Ingeniería Tisular, nos revela que la expresión de pancitoqueratina se extiende a todo el espesor de la epidermis, siendo más intensa en los estratos granuloso y córneo (Figura 51).

Figura 51. Expresión de pancitoqueratinas en corte de piel humana heterotípica 30 días postimplante.

21.3.2. Citoqueratinas 1/10. La transición de los queratinocitos de la capa basal a la espinosa se caracteriza por el cambio en la expresión de citoqueratinas. En las capas más superficiales nos encontramos Ck1/Ck10. Forman haces densos característicos de la epidermis suprabasal. La Ck10 inhibe la proliferación celular y la progresión del ciclo celular (Aquino, 2008). Son marcadores de queratinización por excelencia.

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En nuestro control de piel humana observamos intensa positividad para ambas citoqueratinas en los estratos más superficiales del epitelio, especialmente en la capa córnea y en el estrato granuloso (Figura 52).

Figura 52. Expresión de citoqueratinas en un corte de piel humana normal. Ambas se expresan con intensidad en el estrato espinoso y córneo. A) Ck1; B) Ck10.

20 días postimplante de sustituto de piel humana heterotípica generado mediante Ingeniería Tisular, encontramos expresión de Ck1 y Ck10 en las capas más externas de la epidermis, aunque con cierta irregularidad con respecto a la piel normal (Figura 53).

Figura 53. Expresión de citoqueratinas en un corte de piel humana heterotípica 20 días postimplante. A) Ck1; B) Ck10.

30 días postimplante, observamos intensa expresión de Ck1, sobre todo en el estrato córneo y algo menos intensa en el granuloso, con expresión de Ck10 de forma homogénea repartida por todos los estratos del sustituto de piel (Figura 54).

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Resultados

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Figura 54. Expresión de citoqueratinas en un corte de piel humana heterotípica 30 días postimplante. A) Ck1; B) Ck10.

21.3.3. Citoqueratinas 4/13. Ambas citoqueratinas también forman parte del citoesqueleto de las células de la epidermis, en sus capas más superficiales. En los cortes de piel normal usados como control, ambas citoqueratinas tienen expresión, sobre todo en el estrato córneo de la piel normal como se puede observar (Figura 55).

Figura 55. Expresión de Citoqueratinas 4/13 en cortes de piel humana normal. A) Ck4 B) Ck13.

En los cortes histológicos obtenidos 20 postimplante de sustituto de piel humana heterotípica, podemos observar que la expresión de citoqueratinas 4 y 13 es, prácticamente nula, en cualquiera de los estratos observados (Figura 56).

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Resultados

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Figura 56. Nula expresión de citoqueratinas 4 y 13 en cortes de piel humana heterotípica 20 días postimplante. A) Ck4; B) Ck13.

La expresión de ambas citoqueratinas mencionadas se hace presente con el transcurso de los días. A los 30 días postimplante, existe expresión discreta de ambas en capas suprabasales (Figura 57).

Figura 57. Expresión de citoqueratinas 4 y 13 en cortes de piel humana heterotípica 30 días postimplante. A) Ck4; B) Ck13.

21.3.4. Citoqueratinas 7/8. Estas citoqueratinas son características de epitelios simples, tales como el respiratorio, intestinal o urológico. Su expresión en la piel es nula o muy escasa, como se puede observar en estos cortes de piel humana normales usados como controles (Figura 58).

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Resultados

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Figura 58. Expresión de Citoqueratinas 7/8 en cortes de piel humana normal A) Ck7 B) Ck8. Figura 33. Corte histológico de mucosa oral artificial obtenida mediante Ingeniría Tisular (hematoxilina-eosina). Tras 3 semanas en cultivo aire-líquido.

Los sustitutos de piel heterotípica humana estudiados en el día 20 postimplante,

podemos

observar

nula

positividad

de

ambas

citoqueratinas, a nivel de la capa córnea (Figura 59).

Figura 59. Expresión de Citoqueratinas 7 y 8 en sustitutos de piel heterotípica 20 días postimplante. A)Ck7; B)Ck8.

El estudio realizado 30 días postimplante, demuestra prácticamente nula positividad para estas citoqueratinas (Figura 60).

Figura 60 Expresión de citoqueratinas 7 y 8 en sustitutos de piel heterotípica 30 días postimplate A) Ck7; B) Ck8.

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Resultados

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diferenciación epitelial en muestras de piel humana, control y artifical.

Figura 61. Imágenes comparativas de la inmunofluorescencia de los diferentes marcadoes de

Potencialidad queratinocítica de las células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en Ingeniería Tisular

Resultados

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diferenciación epitelial en muestras de piel humana, control y artifical.

Figura 62 Imágenes comparativas de la inmunofluorescencia de los diferentes marcadoes de

Potencialidad queratinocítica de las células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en Ingeniería Tisular

Resultados

Potencialidad queratinocítica de las células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en Ingeniería Tisular

22. EVALUACIÓN POR INMUNOFLUORESCENCIA DE LOS

SUSTITUTOS

DE

MUCOSA

ORAL

HETEROTÍPICA Al igual que para la piel, hemos evaluado mediante inmunofluorescencia cortes de mucosa oral humana normal (control), y los cortes de mucosa oral humana heterotípica creados mediante Ingeniería Tisular, haciendo un estudio comparativo de diferentes proteínas características de estos epitelios.

22.1. FILAGRINA Como se comentó previamente, la filagrina es una proteína muy importante en el desarrollo, diferenciación y mantenimiento del estrato córneo. En la mucosa oral, la filagrina presenta una expresión fuertemente positiva en el estrato granuloso, siendo dicha expresión bastante más débil en el estrato córneo, como podemos ver en el siguiente corte de mucosa oral humana usado como control (Figura 63).

Figura 63. Expresión de filagrina en un corte de mucosa oral humana normal.

En un corte de mucosa oral humana heterotípica obtenida mediante Ingeniería Tisular, y analizada 30 postimplante en un ratón atímico, se observa escasa expresión de filagrina en el estrato granuloso, siendo moderada en el estrato córneo (Figura 64).

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Resultados

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Figura 64. Expresión de filagrina en un corte de mucosa oral heterotípica obtenida mediante ingeniería tisular, 30 días postimplante en ratón atímico.

Cuando el análisis se realiza 40 días postimplante de mucosa oral humana heterotípica obtenida mediante Ingeniería Tisular e implantada en un ratón atímico, observamos intensa expresión de filagrina en el estrato córneo, siendo la expresión igualmente positiva en el estrato granuloso, aunque con menos intensidad que en la mucosa oral humana normal (Figura 65).

Figura 65. Expresión de filagrina en corte de mucosa oral humana heterotípica obtenida mediante Ingeniería Tisular 40 días postimplante en ratón atímico.

22.2. INVOLUCRINA Como ya se comentó previamente, la involucrina es una proteína que participa en el desarrollo de la membrana citoplasmática de los queratinocitos.

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En la mucosa oral humana normal tomada como control, se observa expresión intensa de la misma en todos los estratos suprabasales (Figura 66).

Figura 66. Expresión de involucrina en corte de mucosa oral humana normal.

Al analizar un corte histológico de un injerto de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular, e implantada en un ratón atímico, 30 días postimplante, se observa escasa expresión de involucrina en estratos suprabasales, fundamentalmente en el estrato córneo (Figura 67).

Figura 67. Expresión de involucrina en corte de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular. 30 días postimplante.

En el estudio realizado 40 días postimplante, se hace evidente la positividad para involucrina en el estrato córneo fundamentalmente (Figura 68).

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Figura 68. Expresión de involucrina en corte de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular. 40 días postimplante.

22.3. CITOQUERATINAS 22.3.1. Citoqueratinas 1/10. Al igual que ocurre en la piel, las citoqueratinas, como marcadores de queratinización, presentan una expresión fuertemente positiva en la mucosa oral (Hansson et al., 2001: Tomakidi et al., 1998). Observamos, en mucosa oral humana tomada como control, que la presencia de Ck1 se distribuye por todas las capas suprabasales, mientras que la Ck10 es fundamentalmente positiva en los estratos más superficiales esto es, en el estrato granuloso y en el córneo (Figura 69).

Figura 69. Expresión de citoqueratinas Ck1/Ck10 en cortes de mucosa oral humana normal. A) Ck1; B) Ck10.

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En los cortes realizados a los 30 días postimplante, observamos que ya existe intensa positividad en el estrato córneo para ambas citoqueratinas (Figura 70).

Figura 70. Expresión de citoqueratinas Ck1/Ck10 en cortes de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería tisular, 30 días postimplante. A) Ck1; B) Ck10.

En los cortes realizados 40 días postimplante, la expresividad de Ck1 es fuertemente positiva en los estratos córneo y granuloso, mientras que la de Ck10 es muy escasa en el estrato córneo y levemente positiva en el resto de estratos suprabasales (Figura 71).

Figura 71. Expresión de citoqueratinas 1/10 en cortes de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular. 40 días postimplante. A) Ck1; B) Ck10.

22.3.2. Citoqueratinas 4/13. Ambas citoqueratinas, al igual que las anteriores, presentan intensa positividad en las capas suprabasales de manera homogénea, en cortes

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histológicos de mucosa oral humana normal, tomada como control (Figura 72).

Figura 72. Expresión de citoqueratinas 4 y 13 en cortes histológicos de mucosa oral humana normal. A) Ck4; B) Ck13.

En los cortes realizados 30 días postimplante en ratones atímicos de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular, ambas citoqueratinas son positivas, pero a diferencia de los cortes control, la positividad no es homogénea para todos los estratos, presentándola más intensamente la capa córnea y algo más débilmente, el estrato granuloso (Figura 73).

Figura 73. Expresión de citoqueratinas 4 y 13 en cortes de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular. 30 días postimplante. A) Ck4; B) Ck13.

En la evaluación de la expresión de las citoqueratinas 4/13 en lo cortes de mucosa oral humana heterotípica 40 días postimplante, se observa

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expresión moderadamente positiva en los estratos córneo y granuloso, para ambos cortes (Figura 74).

Figura 74. Expresión de citoqueratinas 4 y 13 en cortes de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular. 40 días postimplante. A) Ck4; B) Ck13.

22.3.3. Citoqueratinas 7/8. Ambas citoqueratinas son propias de los epitelios simples, como ya se comentó previamente. En los cortes tomados como control de mucosa oral humana normal, presentan expresión negativa (Figura 75).

Figura 75. Expresión de citoqueratinas 7 y 8 en cortes de mucosa oral humana normal. A) Ck7; B) Ck8.

El estudio realizado en los cortes histológicos 30 días postimplante de mucosa oral humana heterotípica generada mediante Ingeniería Tisular, observamos escasa expresión de citoqueratina 7 en las capas más externas del epitelio, siendo prácticamente nula la expresión de citoqueratina 8 (Figura 76).

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Figura 76. Expresión de citoqueratinas 7 y 8 en cortes de mucosa oral humana heterotípica generadas mediante Ingeniería Tisular. 30 días postimplante. A) Ck7; B) Ck8.

Por último, en los cortes estudiados 40 días postimplante, estas citoqueratinas presentan moderada positividad en el estrato córneo, más intensamente la Ck7 que la Ck8 (Figura 77).

Figura 77. Expresión de citoqueratinas 7 y 8 en cortes de mucosa oral humana heterotípica generadas mediante Ingeniería Tisular. 40 días postimplante. A) Ck7; B) Ck8.

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diferenciación epitelial en muestras de mucosa oral humana, control y artifical.

Figura 78. Imágenes comparativas de la inmunofluorescencia de los diferentes marcadoes de

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diferenciación epitelial en muestras de mucosa oral humana, control y artifical.

Figura 79. Imágenes comparativa de la inmunofluorescencia de los diferentes marcadoes de

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DISCUSIÓN

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La Ingeniería Tisular es una disciplina sobre la cual se está trabajando mucho en los últimos años, presentando un gran desarrollo, sobre todo en el campo de la Medicina. En nuestro trabajo cotidiano, nos encontramos muchas enfermedades que, hoy por hoy, son incurables. Es precisamente a estos problemas a los que la Ingeniería Tisular busca dar una solución mediante el uso de células y tejidos vivos. Como materia de investigación, la Ingeniería Tisular está dando lugar a grandes avances en multitud de especialidades médicas y quirúrgicas tales como urología, oftalmología, neurología, cardiología, etc. En este contexto, una de las fuentes celulares que más interés ha despertado, son las células madre del cordón umbilical, y en especial, las células madre de la gelatina de Wharton (Can y Karahuseyinoglu, 2007; Troyer y Weiss, 2008). Las células madre de la gelatina de Wharton, independientemente de a qué subtipo nos refiramos, son células multipotentes, con capacidad de diferenciación a tejidos de tipo mesenquimatoso (Karahuseyinoglu et al., 2007; Lu et al., 2006; Conconi et al., 2006; Baksh et al., 2007; Saragaser et al., 2005; Wang et al., 2004; Wu et al., 2007; Campard et al., 2008), al igual que las células madre adultas mesenquimales. Estas últimas, como ya se comentó, presentan dos inconvenientes: 1) el método de obtención es invasivo y doloroso para el donante, 2) su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciación decrece con la edad (Rao y Mattson, 2001; Rando, 2006). Por lo tanto, son varios los motivos que han contribuido a la intensa investigación a la que se está sometiendo a las células madre de la gelatina de Wharton, incluyendo, especialmente, el elevado nivel de proliferación que presentan estas células en cultivo (Mitchell et al., 2003), y su capacidad para diferenciarse o transdiferenciarse en un gran número de tipos celulares (potencial diferenciativo) (Can y Karahuseyinoglu, 2007; Troyer y Weiss, 2008). Múltiples autores han estudiado la capacidad de diferenciación de las diferentes células madre que forman parte del cordón umbilical. Así, se ha comprobado que las células madre de la gelatina de Wharton pueden diferenciarse ex vivo a condroblastos, osteoblastos y adipocitos (Wang et al., 2004; Saragaser et al., 2005; Conconi et al., 2006; Honsawek et al., 2006; Lu et al., 2006; Baksh et al., 2007;

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Discusión

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Baley et al., 2007; Karahuseyinoglu et al., 2007; Wu et al., 2007). Sin embargo, a pesar de su carácter multipotente y su capacidad de diferenciación mesenquimatosa, existen estudios variados sobre la capacidad de transdiferenciación de las células madre de la gelatina de Wharton a otras estirpes celulares de naturaleza no mesenquimal. Se ha podido comprobar que bajo las condiciones apropiadas, estas células pueden diferenciarse hacia células precursoras neurales (Mitchell et al., 2003; Fu et al., 2004; Ma et al., 2005; Lu et al., 2006), cardiomiocitos (Wang et al., 2004), células del músculo esquelético (Conconi et al., 2006), células endoteliales (Wu et al., 2007) y hepatocitos (Campard et al., 2008) en cultivos celulares, y en algunos casos, también in vivo, lo cual confirma su potencial transdiferenciativo y sugiere que estas células podrían tener capacidad pluripotencial. Hasta el momento actual, las células madre de la gelatina de Wharton no han sido utilizadas con el propósito de generar piel o mucosa oral humana. Sanmano y sus colaboradores (Sanmano et al., 2005), estudian la capacidad de transdiferenciación de las células del epitelio del cordón umbilical (amnioblastos) hacia queratinocitos, presentando expresión de marcadores de diferenciación epitelial, tales como citoqueratinas, loricrina, filagrina, involucrina y TGase I (Mizoguchi et al., 2000). Esto implica que las células madre de la gelatina de Wharton deben ser capaces de transdiferenciarse hacia células epiteliales con capacidad de estratificación. Sin embargo, la capacidad transdiferenciativa de las células madre de la gelatina de Wharton hacia queratinocitos de la piel o la mucosa oral no se ha determinado hasta la fecha. La búsqueda de sustitutos cutáneos para el tratamiento de diversas patologías, ha derivado en una amplia investigación, como lo demuestra la gran variedad de sustitutos cutáneos tanto sintéticos como biológicos que existen actualmente en el mercado. Todos estos sustitutos buscan obtener una cobertura “ideal” (Pruitt y Levine, 1984; Phillips, 1993), que sustituya el tegumento perdido, y así evitar las consecuencias sobre la homeostasis corporal que supone esta pérdida. Existen multitud de estos productos, sintéticos, biosintéticos y biológicos, cada uno con sus ventajas y sus inconvenientes. De todas las coberturas, la más idónea es el autoinjerto, aunque no

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siempre es posible su uso, como ocurre en los grandes quemados y en los nevus congénitos gigantes, como ya se desarrolló en la introducción. Al igual que en otros campos de la investigación Biomédica, la Ingeniería Tisular ha intentado ofrecer soluciones en esta materia desarrollando sustitutos cutáneos. Como ya se ha comentado, existe una gran variedad de sustitutos cutáneos, y los encontramos de origen humano (autoinjertos y aloinjertos), de origen animal (xenoinjertos), y finalmente, los grandes avances en el tema son los cultivos de queratinocitos y los injertos compuestos cultivados. La piedra angular la pusieron en este campo Rheinwald y Green (Rheinwald y Green, 1975), cuando publican la técnica para la obtención de láminas de queratinocitos cultivados a partir de una biopsia de piel sana. La técnica propuesta por ellos inicialmente se ha ido optimizando con el paso de los años, permitiendo el aislamiento de células madre queratinocíticas a partir de biopsias de piel (Moroi et al., 2004; Meana et al., 1998; Del et al., 2002; Llames y cols., 2004; Llames y cols., 2006). Esta metodología no está exenta de inconvenientes, sobre todo derivados de la ausencia de un soporte dérmico adecuado (El-Ghalbzouri, 2002; Atiyeh y Costagliola, 2007), lo que lleva a seguir avanzando en la investigación y a la aparición de piel artificial tanto autóloga como alogénica, lo que se denomina injerto compuesto cultivado (Shahabeddin, 1990; Phillips, 1993; Jun, 2000). Con ellos se intenta obviar los inconvenientes propios de la falta de soporte dérmico, con los que se realiza el cultivo, tanto de queratinocitos, como de fibroblastos dérmicos, obteniendo así un constructo completo. Por último, las investigaciones se han orientado a conseguir una cobertura temporal alogénica modificada genéticamente que sea capaz de producir factores de crecimiento que favorezcan la curación del lecho, y que sea resistente a infecciones, gran carencia del sustituto anterior, y que además acorte el tiempo de disponibilidad y que determine altas tasas de prendimiento (Androutsellis-Theotokis et al., 2006). Hasta ahora, en nuestro laboratorio se han realizado trabajos de investigación en el campo de la Ingeniería Tisular, buscando la obtención de piel y de mucosa oral humanas a partir del cultivo de fibroblastos y queratinocitos extraídos de ambos epitelios (Jiménez, 2009; Garzón, 2009). Sin embargo, ante la experiencia previa sobre

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la capacidad de diferenciación y transdiferenciación de las células madre de la gelatina de Wharton, nos preguntamos si estas células serían capaces de derivar en células queratinocíticas de ambos epitelios, mediante la interacción epitelio-mensénquima utilizando estromas tridimensionales artificiales con fibroblastos propios de la piel y de la mucosa oral. Por lo tanto, y en primer lugar, hemos procedido a cultivar en el laboratorio los diferentes tipos de células que constituyen el estroma de ambos epitelios, esto es, fibroblastos obtenidos de biopsias de individuos sanos, mediante sencillos procedimientos quirúrgicos llevados a cabo con anestesia local. La metodología es sencilla de realizar técnicamente hablando, y nos permite la obtención de un elevado número de células procedentes de la misma biopsia, lo cual permite su utilización en estudios diversos, como de tipo farmacológico, genético, toxicológico, y para nuestros propios fines, esto es, en investigaciones sobre Ingeniería Tisular. Los cultivos de fibroblastos, tanto de piel como de mucosa oral mostraron una elevada tasa de proliferación, con un crecimiento rápido, tanto de los cultivos primarios como en los subcultivos, de modo que en el plazo de una semana, quedaron cubiertos los frascos de cultivo. Todos estos resultados coinciden con los datos publicados por otros investigadores y confirman la utilidad de la metodología descrita en el apartado correspondiente de esta Tesis Doctoral (Orwin y Hubel, 2000; Teixeira et al., 2004; Alaminos et al., 2007; Sánchez- Quevedo et al., 2007). En segundo lugar, el cultivo de las células madre de la gelatina de Wharton precisó de una disección delicada para eliminar células madre procedentes del epitelio (amnioblastos) y del endotelio vascular de la vena del cordón umbilical. Una vez que se consiguió aislar la gelatina de Wharton, se procedió a la disociación de sus células y a su cultivo, obteniéndose una masa celular de crecimiento y confluencia rápida, mostrando, al igual que los fibroblastos, una elevada tasa de proliferación, cubriendo el frasco de cultivo en una semana. De nuevo, estos resultados confirman la elevada tasa de proliferación de estas células madre y su carácter indiferenciado y proliferativo.

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Una vez obtenidos los cultivos celulares, y considerando el grado de proliferación de cada tipo celular, se procedió a la construcción de nuestros modelos de piel y mucosa oral humanas heterotípicas. Para llevar a cabo estos constructos, se utilizó un soporte estromal compuesto por fibrina y agarosa. Históricamente, se han usado diferentes tipos de soportes para llevar a cabo la construcción de tejidos tridimensionales en laboratorio, destacando algunos como los geles de quitosán, agarosa, colágeno y fibrina (Meana et al., 1998; Schoop et al., 1999; Bach et al., 2001; Chinnathambi et al., 2003; Llames et al., 2004; Llames et al., 2006; Isenberg et al., 2006; Peretti et al., 2006; Talbot et al., 2006; Alaminos, 2009; González-Andrades, 2009). De acuerdo con estudios previos llevados a cabo en nuestro grupo de investigación, los geles de fibrina y agarosa ofrecen resultados adecuados y buenos niveles de consistencia y elasticidad (Alaminos et al., 2006, 2007, 2009). La fibrina además, al obtenerse del plasma sanguíneo, nos proporciona la ventaja de incorporar citoquinas y factores de crecimiento, lo que proporciona un ambiente idóneo para el crecimiento y multiplicación de las células cultivadas en su seno, lo cual habría que añadir a su posible carácter autólogo. El siguiente paso llevado a cabo fue la generación de constructos estromales tridimensionales consistentes en geles de fibrina y agarosa con células fibroblásticas, tanto de la piel como de la mucosa oral, subcultivadas en su espesor. A continuación, las células madre de la gelatina de Wharton se subcultivaron en la superficie de dichos sustitutos estromales para generar un epitelio heterotípico y evaluar la posible influencia de las células estromales sobre este epitelio procedente de la gelatina de Wharton. Para ello, hemos usado la denominada técnica de cultivo secuencial ( Reichl y Muller-Goymann, 2003 ; Muñoz Ávila, 2006). Este sistema nos aporta varias ventajas que justifican su utilización. En primer lugar, presenta una membrana porosa, la cual permite el paso de nutrientes desde el medio de cultivo al sustituto estromal. En segundo lugar, el diseño de este dispositivo permite utilizar una técnica de cultivo airelíquido, lo cual estimula la estratificación del epitelio localizado sobre el sustituto estromal. Diferentes autores han utilizado dispositivos con membranas porosas de distintas variedades en protocolos de Ingeniería Tisular para la construcción de diversos tejidos (Richard y cols., 1991; Geroski y Hadley, 1992; Casasco y cols., 2001;

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Limat y cols., 2003; Izumi y cols., 2003; Reichl y cols., 2004; Garzón, 2009; Jiménez, 2009). Una vez obtenidos los constructos de piel y mucosa oral humanas heterotípicas es importante evaluar histológicamente el tejido artificial formado tanto ex vivo como in vivo. En primer lugar, realizamos una evaluación ex vivo de los sustitutos de piel y mucosa oral humanas artificiales construidos mediante Ingeniería Tisular. Se observó en los cortes histológicos de ambos sustitutos, tras tres semanas en medio de cultivo aire líquido, fibroblastos inmersos en la matriz de fibrina y agarosa con escasas fibras de colágeno. En ambas muestras aparecía estratificación (4-7 capas celulares con cornificación de las células epiteliales), con ausencia de papilas. Estos resultados son similares a los obtenidos anteriormente por nuestro grupo de investigación en la elaboración de mucosa oral, piel y córnea mediante Ingeniería Tisular con muestras de biopsias de tejido sano humano y animal (Alaminos, 2006, 2007; Sánchez-Quevedo, 2007; Jiménez, 2009; Garzón, 2009; González-Andrades, 2009). En segundo lugar una vez obtenidos los constructos de piel y mucosa oral humanas heterotípicas, hemos procedido a realizar una evaluación in vivo de las mismas, implantando las muestras obtenidas en el dorso de ratones atímicos inmunodeprimidos. De este modo, y tras un periodo de observación, pudimos observar la perfecta y rápida integración de los injertos en el dorso del animal, como lo demuestra la evolución mostrada al quinto día del implante, con un tejido perfectamente acoplado a la piel del animal, y finalmente, a los 30 días se observa una perfecta biointegración del defecto de forma directa, con el desarrollo de un tejido dérmico y epidérmico bien estructurado y correctamente integrado en la piel del animal, sin que hayan aparecido signos de infección, hematoma ni otras complicaciones.

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El estudio de los injertos in vivo mediante microscopía óptica reveló gran similitud estructural de los tejidos obtenidos con los tejidos humanos normales usados como control. El estudio al microscopio óptico de la mucosa oral humana heterotípica mostró adecuados niveles de integración de los tejidos elaborados mediante Ingeniería Tisular con los tejidos nativos del animal, habiendo desaparecido totalmente la fibrina y la agarosa en los cortes evaluados a los 40 días. El sustituto estromal presentó gran riqueza en fibras de colágeno neoformadas y correctamente orientadas, aunque cabe destacar la ausencia de crestas epiteliales en todos los cortes evaluados. Por otra parte, el epitelio elaborado sobre el sustituto estromal presentó similitudes estructurales con el epitelio ortotípico de la mucosa oral humana control, aunque con mayores niveles de queratinización y presentando unas 10 capas celulares y un estrato córneo bien configurado. Probablemente, la existencia de este estrato córneo esté en relación con la zona en la que se implantaron los tejidos en el animal, estando en contacto directo con el aire durante todo el periodo de seguimiento. Del mismo modo, el análisis de los sustitutos heterotípicos de piel humana artificial implantados en el ratón atímico reveló una completa integración con el tejido del animal, con progresiva desaparición de las fibras de fibrina y de la agarosa y neoformación de fibras de colágeno, abundancia en vasos sanguíneos y ausencia de papilas dérmicas. Al igual que en el caso de la mucosa oral, la epidermis heterotípica generada a partir de células madre de la gelatina de Wharton presentó alrededor de 10 capas de queratinocitos y un estrato córneo bien configurado y muy similar al existente en la piel humana control. A pesar de que esta evaluación histológica estructural nos permite predecir el posible comportamiento clínico que va a presentar el tejido, en esta Tesis Doctoral hemos analizado la expresión de los principales marcadores de función queratinocítica, tanto en los constructos de mucosa oral como en los de piel, para así poder evaluar la eficiencia de la transdiferenciación que presentan las células madre de la gelatina de Wharton hacia células queratinocíticas, de uno u otro origen (mucosa oral o piel), estando sometidas al mismo ambiente externo, pero con fibroblastos procedentes de cada uno de dichos tejidos. De este modo, mediante el estudio con inmunofluorescencia de perfiles de expresión de proteínas de función queratinocítica,

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en la mucosa oral y en la piel obtenidas mediante Ingeniería Tisular en diferentes estados de maduración, pudimos establecer la relación existente entre los diferentes patrones de diferenciación morfológica encontrada en los tejidos y la expresión de diferentes grupos de proteínas relacionadas con el proceso de desarrollo durante la interacción epitelio-mesenquimal. Esta información nos permitió comprender mejor los procesos moleculares y genéticos presentes durante el desarrollo de la mucosa oral y la piel humana (Arosarena, 2005; Garzón, 2009). De acuerdo con esto, los resultados obtenidos en nuestro trabajo revelaron que la expresión de citoqueratinas en la mucosa oral humana heterotípica obtenida mediante Ingeniería Tisular por transdiferenciación de células madre de la gelatina de Wharton, comparte muchas similitudes con la expresión que muestra la mucosa oral humana normal tomada como control, aunque es cierto que han mostrado algunas diferencias. En concreto, la filagrina y la involucrina son proteínas muy importantes en el desarrollo, diferenciación y mantenimiento del estrato córneo. Presentan gran expresión en los epitelios maduros a nivel del estrato granuloso. En nuestro estudio hemos podido comprobar que su aparición ha sido tiempo-dependiente, expresándose conforme ha ido madurando el epitelio, lo que nos sugiere que las células que inicialmente conforman el epitelio tienen bajo nivel de diferenciación y maduración, pero que indudablemente se desarrollan in vivo hacia células epiteliales con el paso del tiempo. Las citoqueratinas, como marcadores de queratinización por excelencia, presentan una expresión fuertemente positiva en la mucosa oral. Son proteínas que se expresan por parejas, y según a qué pareja nos refiramos, son más características de unos epitelios que de otros. Las citoqueratinas 1/10 (Hansson et al., 2001: Tomakidi et al., 1998) y 4/13, presentan expresión intensa en el epitelio de la mucosa oral normal, especialmente en aquellas zonas de la mucosa que, debido a su función masticatoria, presentan un estrato córneo en su superficie, mostrando los tejidos generados por Ingeniería Tisular, intensa expresión independientemente del tiempo de evolución del tejido injertado, indicándonos la diferenciación clara de las células madre de la gelatina

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de Wharton hacia células de estirpe queratinocítica. Sin embargo, el estudio de citoqueratinas típicas de epitelios simples, como las citoqueratinas 7/8, y que no se expresan en los controles correspondientes a mucosa oral normal, mostraron expresión tiempo-dependiente en las muestras humanas heterotípicas implantadas in vivo. Probablemente, este hecho se debe al carácter parcialmente indiferenciado de los tejidos fabricados en el laboratorio y que, de acuerdo con estudios llevados a cabo por nuestro grupo de investigación, podrían estar reproduciendo el proceso que ocurre de manera natural durante el desarrollo embrionario de estos tejidos (Garzón et al., 2009). En cuanto a los resultados obtenidos en el estudio de los marcadores de diferenciación queratinocítica de la piel humana heterotípica obtenida mediante Ingeniería Tisular, destaca el hecho de que éstos son parcialmente similares a los expuestos en el párrafo anterior para la mucosa oral, aunque se apreciaron algunas diferencias significativas. En la piel normal, la filagrina y la involucrina presentan intensa expresión dada la función que ejercen sobre la generación y el mantenimiento del estrato córneo, contribuyendo al colapso del citoesqueleto conforme los queratinocitos progresan en su estado madurativo (Jensen, 2009), y como componente esencial de la membrana citoplasmática, respectivamente (Kubilus, 1990). Para ambas proteínas existe expresión intensa en los cortes estudiados, volviendo a mostrarnos la capacidad de transdiferenciación que presentan las células madre de la gelatina de Wharton hacia un tejido no mesenquimatoso. Dentro de la familia de citoqueratinas, hemos realizado el estudio de expresión de las mismas parejas y, además, hemos incorporado el estudio de la pancitoqueratina. Las citoqueratinas 1/10, 4/13 y pancitoqueratina, muestran intensa expresión también en el epitelio cutáneo normal. En los cortes evaluados en diferentes tiempos desde el implante del tejido generado en el laboratorio hasta su estudio, se han mostrado fuertemente positivas, lo propio de un epitelio queratinocítico, estratificado y maduro. Las citoqueratinas 7/8, que como anteriormente señalamos, son propias de los epitelios simples, no muestran positividad en los controles de piel

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humana normal, ni en nuestras muestras generadas por Ingeniería Tisular, lo cual sugiere que el grado de diferenciación del epitelio de la piel heterotípica podría ser mayor que el que se encontró en aquellos tejidos que se construyeron utilizando fibroblastos de la mucosa oral inmersos en matrices de fibrina y agarosa. Por todo lo indicado anteriormente, la expresión de los diferentes grupos de proteínas estructurales que son características de los epitelios estratificados y queratinocíticos, es fundamental para el desarrollo y funcionalidad de los queratinocitos que constituyen los epitelios de la mucosa oral y de la piel. En esta Tesis Doctoral hemos observado cómo el epitelio artificial heterotípico implantado in vivo es capaz de diferenciarse en un epitelio estratificado con un elevado nivel de maduración que es muy similar al epitelio ortotípico control. Además de esto, es posible que el epitelio en desarrollo sea influenciado por múltiples señales de tipo paracrino o interacciones intercelulares provenientes del estroma subyacente que hacen que las células madre de la gelatina de Wharton, cuyo potencial para diferenciarse a células de estirpe mesenquimatosa ya era conocida, sean capaces de transdiferenciarse a queratinocitos, tanto de mucosa oral como epidérmicos, según los fibroblastos que se hayan usado en la realización del estroma epitelial, siendo mayor el nivel de diferenciación celular encontrado en aquellos casos en los que se utilizaron fibroblastos de la mucosa oral que de la piel. Todo ello sugiere que estas células madre habrían de considerarse como células pluripotenciales más que multipotenciales, confirmando, además, su posible utilidad clínica para la generación de distintos tipos tisulares mediante Ingeniería Tisular. Además, la expresión de los diferentes marcadores evaluados, nos indica que los tejidos obtenidos en el laboratorio son capaces de reproducir las características funcionales del epitelio como barrera protectora que permite respuesta rápida a diferentes estímulos. La posible utilidad de estas células en terapéutica humana habrá de demostrarse en trabajos posteriores.

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CONCLUSIONES

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De acuerdo con los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral, establecemos las siguientes Conclusiones: 1. La metodología desarrollada en la presente Tesis Doctoral, permitió el aislamiento y la expansión en cultivo de células madre de la gelatina de Wharton del cordón umbilical y de fibroblastos estromales de la piel y de la mucosa oral humana para su posterior utilización para la elaboración de constructos heterotípicos de piel y de mucosa oral artificial. 2. La asociación de biomateriales constituidos por fibrina y agarosa 0,1% y de poblaciones de fibroblastos procedentes de la piel permitió elaborar un sustituto de la dermis humana mediante ingeniería tisular. El cultivo de células madre de la gelatina de Wharton en la superficie de dicho substituto dérmico permitió desarrollar un epitelio heterotípico sobre el mismo. 3. La asociación de biomateriales constituidos por fibrina y agarosa 0,1% y de poblaciones de fibroblastos procedentes de la mucosa oral permitió elaborar un sustituto del corion de la mucosa oral humana mediante ingeniería tisular. El cultivo de células madre de la gelatina de Wharton en la superficie de dicho substituto permitió desarrollar un epitelio heterotípico sobre el sustituto estromal. 4. El análisis histológico de los substitutos heterotípicos de piel y mucosa oral humanas mantenidos en cultivo reveló la existencia de un estroma artificial bien organizado con abundantes fibroblastos de morfología fusiforme, así como de un sustituto epitelial en la superficie del estroma, el cual se organiza formando hasta 7 capas de células aplanadas equivalentes al epitelio de la piel y de la mucosa oral normal. 5. La evaluación in vivo de los tejidos heterotípicos humanos elaborados de acuerdo con la metodología desarrollada en la presente Tesis Doctoral mostró una

perfecta

integración

de

los

tejidos

implantados

en

animales

inmunodeficientes. El análisis histológico de estos tejidos puso de relieve la

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existencia de un epitelio bien desarrollado en la superficie del estroma, con 710 capas de células en el caso de la mucosa oral y 10 – 15 capas en la piel artificial heterotípica. El análisis de expresión de proteínas mostró un patrón común de expresión de citoqueratinas en el epitelio heterotípico, con expresión de citoqueratinas 1/10 y 4/13, filagrina e involucrina tanto en la piel como en la mucosa oral heterotípicas, lo cual podría deberse al hecho de que ambos tipos tisulares fueron implantados en idénticas condiciones en el animal de laboratorio, estando ambas expuestas al aire. Sin embargo, los constructos de mucosa oral expresaron de forma específica citoqueratinas 7 y 8, lo cual sugiere que los factores inductores de la diferenciación epitelial procedentes de las células estromales podrían jugar un papel fundamental en el desarrollo del epitelio heterotípico.

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