V Seminario de Citogenética- Cádiz 2008

Análisis citológico y molecular de los cromosomas X y B microdiseccionados en dos especies de saltamontes Teruel M (1), Cabrero J (1), Acosta MJ (2), Sánchez A (2) (1) Departamento de Genética, Universidad de Granada, 18071 Granada (2) Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén

Introducción Cromosomas B Eyprepocnemis plorans B24 ADN satélite ADNr Cabrero et al. 1999

Locusta migratoria

B

DAPI negativa DAPI positiva DAPI negativa Camacho et al, 1991

Objetivo Profundizar en la naturaleza molecular y el origen de los cromosomas B de las especies Eyprepocnemis plorans y Locusta migratoria E. plorans: Cromosomas X

Cromosomas B

(López-León et al., 1994)

1. Microdisección de los cromosomas B y X 2. Probar la presencia de varias secuencias de ADN en los microdiseccionados, mediante PCR

Material y Métodos Material

2 especies de saltamontes de la familia Acrididae (Orthoptera) portadores de cromosomas B - Eyprepocnemis plorans

Torrox (Málaga): B24

- Locusta migratoria

Las Gabias (Granada): B

Tejido: Folículos testiculares fijados en etanol: acético (3:1) y guardados a -20ºC en etanol al 70%

Método Microdiseccion Manual Microscopio invertido, Zeiss Axiovert 200, acoplado a un micromanipulador electrónico, Eppendorf TransferMan NK 2

Células en meiosis: diplotene y/o paquitene

B24 2B X

X E. plorans

L. migratoria

Método Microdiseccion Manual

Amplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-Sigma)

Reamplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex® WGA Reamplification Kit (wga3-Sigma)

Generar Sonda Nick translation

Chromosome Painting

Amplificación por PCR de varias secuencias

Localización por FISH

Análisis de la secuencias

GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-Sigma) Ventajas - Poca cantidad de ADN inicial - Mayor representación del genoma Inconvenientes -Fragmentación del ADN - Ligación de adaptadores -Tamaño medio de los fragmentos amplificados es de 400pb

Gribble et al., 2004 http://www.biocompare.com/technicalarticle/1548/

Método Microdiseccion Manual

Amplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-Sigma)

Reamplificación del ADN cromosómico microdisecciondo GenomePlex® WGA Reamplification Kit (wga3-Sigma)

Generar Sonda Nick translation

Chromosome Painting

Amplificación por PCR de varias secuencias

Localización por FISH

Análisis de la secuencias

Amplificación de Secuencias por PCR

Secuencias

Cebadores

Secuencia Oligonucleótidos

ADNr

18S

(ITS-1 e ITS-2)

its4

ATA TGC TTA AAT TCA GCG GG

5S-nRNA.F1

AAC GAC CAT ACC ACG CTG AA

5S-nRNA.R1

AAG CGG TCC CCC ATC TAA GT

ADN 5S

GCT TTT GTA CAC ACC GCC CGT CGC

Histona H3

H3aF

ATG GCT CGT ACC AAG CAG ACV GC

(Juan J. Pasantes)

H3aR

ATA TCC TTR GGC ATR ATR GTG AC

Histona H4

H4F2s

(Pineau et al. 2005)

TSC GIG AYA ACA TYC AGG GIA TCA C

Tm

Tamaño

56ºC

9001000pb

52ºC

90pb

48ºC

400pb

-

-

H4F2er

CKY TTI AGI GCR TAI ACC ACR TCC AT

210 pb

H4F2ir

GTI ACI GTC TTS CKY TTG GCG TGC TC

180pb

Resultados GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit (wga4-Sigma)

Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans

Microdisección de B24 Hibrida con los bloques de heterocromatina de los cromosomas B y A

B24

X

B24

X

B24

X

Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans

Microdisección de B24 Hibrida en todo el cromosoma B1

También hibrida con el cromosoma B que aparece en la poblaciones de Turquía

B1 B

Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans

Microdisección del X 1ª microdisección: región heterocromática de los cromosomas A y B No hibrida con el todo cromosoma X, solamente con la región paracentromérica

X

B24 B24

B24

B24

X

Chromosome Painting Eyprepocnemis plorans

Cromosoma X 2ª microdisección: igual resultado, que en el caso anterior. Pinta el brazo corto del B24

X B24 B24

Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans

Ribosómico ITS-1

18S

ITS-2

5,8S

28S

E. plorans ADN Ribosómico amplificado a partir del microdiseccionado Señal de FISH

ADNr μB

(NORs primarias) S10

X región paracentromérica B24 región distal

S9

S9, S10, S11 banda paracentromérica

S9

S11

S11

X

X

S10

B24

B24

Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans

ADN 5S

E. plorans ADN 5S

Señal de FISH X sin señal B24 sin señal X

L1, L2, L3 sin señal M4, M5 banda intersticial M7 sin señal M6, M8, S9, S10, S11 banda proximal

B24

Amplificación de secuencias Eyprepocnemis plorans

Genes de las histonas: H3 y H4 Cluster de los genes de las histonas en Drosophila melanogaster:

h2b

h2a

h4

h3

h1

Los genes de las histonas H3 y H4 son las más conservadas

E. plorans Histonas Colocalización de H3 y H4

Señal de FISH: X sin señal

B24 sin señal

L2 región distal

H3

X

H4

B24

B24 L2

Amplificación de secuencias Resultados Eyprepocnemis plorans

Genes ADNr

PCR gDNA

FISH X

B

As

X

B

Homología

956

si

si

S9, S10, S11 (a)

si

si

ADNr Chorthippus parallellus

ADN 5S

90

si

si

no

ADN 5S Mytilus edulis

H3

400

si

si

M4, M5, M6,  no S9, S10, S11 L2 no

no

H4‐er

210

no

si

‐

no

no

H3 Locusta migratoria μX‐ H3 Graphocephala atropunctata H4 Mus musculus

H4‐ir

180

si

si

L2

no

no

a

NORs primarias

Chromosome Painting Locusta migratoria

Microdiseccionado del B Pinta los cromosomas B y la región paracentromérica del X y de algunos As

X

B

B B

X X

B

B B

Chromosome Painting Locusta migratoria

Microdiseccionado del X

Pinta la región paracentromérica del X y los cromosomas B

B

B

X B

X

X

X B

B B

Amplificación de secuencias Locusta migratoria

ADNr

ADNr 5S

L. migratoria ADNr amplificado a partir de microdiseccionado Señal de FISH: X sin señal

L2, M6 región distal

B sin señal

S9 región paracentromérica

L2 B

S9 M6 M6 L2 S9

B

L. migratoria ADN 5S Señal de FISH: X sin señal

M4 región intersticial

B sin señal

M8 región proximal

S9, S11 región proximal

X

B

X

X

B

Amplificación de secuencias Locusta migratoria

Genes de las histonas: H3 y H4

L. migratoria Histonas: H3

B

M8

L. migratoria Histonas: H3 y H4 Colocalización de la H3 y H4 Señal de FISH: X sin señal B con señal B

M8 señal proximal

H3

H4

Amplificación de secuencias Resultados Locusta migratoria FISH

PCR gDNA

X

B

956

si

si

L2, M6, S9(a) no

ADN 5S

90

si

si

no

no aun no secuenciado

H3

400

si

si

M8

no

si

H4‐er

210

no

si

‐

‐

‐

H4‐ir

180

si

si

M8

no

Genes ADNr

a

NORs primarias

As

X

B

Homología

no ADNr Chorthippus parallellus H3 Locusta migratoria μX‐ H3 Graphocephala atropunctata H4 Mus musculus

si H4 Mus musculus

Conclusiones Eyprepocnemis plorans Chromosome painting - El cromosoma X y el B24 comparten secuencias de ADN entre ellos y con la mayoría de los autosomas (ADNsat y ADNr)

Amplificación de secuencias: - En el cromosoma X y B24 están presentes los genes ADNr 45S, y también el gen 5S y los genes para las histonas aunque estos dos tipos génicos no se observan por FISH. Por tanto no podemos descartar la hipótesis inicial del origen intraespecifíco del B a partir del X. Esperamos que el análisis comparativo de las secuencias amplificadas a partir de los microdisecionados X y B proporcionen información mas decisiva para esclarecer el origen del B.

Conclusiones Locusta migratoria Chromosome painting: -X y B comparten secuencias repetidas que también están presentes en muchos de los autosomas. Amplificación de secuencias: - Los cromosoma X y B parecen contener secuencias de los genes ADNr 45S y 5S, así como genes para las histonas H3 y H4, aunque en este caso las H3 y H4 se observan por FISH en el cromosoma B pero no en el X. - La presencia mayoritaria de H3 y H4 en los cromosomas 8 y B postula a este autosoma como posible origen del B.

Grupo de Genética Evolutiva. UGR

Gracias por su atención