VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO EN ADENOCARCINOMAS DE CUELLO UTERINO

Investigadores principales: Dr. F. Xavier Bosch José IDIBELL – Institut Català d’Oncologia Dr. Chris J.L.M. Meijer VU University Amsterdam Dr. Massimo Tommasino International Agency for Reseach Cancer Lyon Duración: 3 años

1. Resumen Los dos principales tipos histológicos del cáncer de cuello uterino son el carcinoma de células escamosas (CCE) y el adenocarcinoma (ADC). Y el virus del papiloma humano (VPH) ha sido identificado como la causa central y necesaria de ambos tipos histológicos. Sin embargo, la infección por VPH no es suficiente para causar el cáncer de cuello uterino, y otros factores, exógenos o endógenos, en conjunción con el VPH influyen en el riesgo de progresión de la infección a cáncer de cuello de útero. Se han reportado algunas diferencias en los cofactores asociados al desarrollo de CCE y ADC. Estas diferencias sugieren que estos dos tipos histológicos pueden producirse por mecanismos biológicos diferentes. En cuanto a los tipos de VPH, también se han reportado diferencias en la distribución en CCE y ADC. El VPH 16 y algunos de los VPH filogenéticamente relacionados con este tipo (VPH 31, 33, 52 y 58) son más frecuentes en CEE, mientras que el VPH 18 y algunos de los tipos filogenéticamente relacionados con éste (VPH 45 y 59), son más frecuentes en ADC. Estas diferencias en la distribución de los genotipos de VPH en CCE y ADC sugieren que la variabilidad molecular del virus también es importante. Hipótesis: variantes moleculares del VPH se asocian de forma diferencial con el desarrollo de CCE y ADC. Objetivos del proyecto 1. Evaluar el riesgo de desarrollar CCE y ADC asociado a las variantes moleculares del VPH 16 y el VPH 18, mediante un diseño caso-control. 2. Determinar la distribución geográfica a nivel mundial de las variantes de VPH 16 y 18 en ADC. 3. Identificar variantes de los genotipos VPH 33, 45, 58 y 59, que no han sido investigados en profundidad pero que son importantes en el desarrollo de los ADC.

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Metodología Objetivo 1 Diseño del estudio: para evaluar la distribución y el riesgo de desarrollar ADC y CCE asociado a las variantes del VPH 16 y el VPH 18, hemos identificado casos de ADC, CCE y controles (raspado cervical), diagnosticados entre 1985 y 2000, procedentes de países que muestran un amplio rango de incidencia de cáncer de cuello uterino. Las regiones incluidas son África (Argelia y Marruecos), Sudamérica (Brasil, Paraguay y Perú), y Asia (India, Tailandia y Filipinas).

Estas muestras fueron

seleccionadas del estudio caso-control multicéntrico de la Agencia Internacional de Investigación contra el Cáncer (IARC) (Muñoz et al., 2003). Dos muestras de raspado cervical fueron recogidas para realizar una citología y una prueba de detección de ADN de VPH. También se realizó biopsia del tumor y se conservó congelada. Prueba de VPH: GP5+/6+/Reverse line blotting (Van den Brule et al., 2002). Identificación de las variantes: se ha desarrollado un nuevo ensayo para la identificación de las variantes de VPH 16, que consiste en una PCR multiplex que amplifica cuatro fragmentos pequeños de E6 e identifica las diferentes variantes de VPH 16 por tecnología de hibridación inversa (E6 Multiplex PCR RHA). Para el análisis de las variantes de VPH 18 se ha analizado la región E6. Análisis estadístico: para evaluar el riesgo de CCE y ADC asociado con las variantes moleculares del VPH 16 y 18, se calcularon odds ratios (OR) con sus correspondientes intervalos de confianza del 95% (IC 95%), mediante métodos de regresión logística. Objetivo 2 Para determinar la distribución geográfica a nivel mundial de las variantes de VPH 16 y 18 en ADC, se recolectaron bloques de parafina de casos de cáncer invasor de cérvix, procedentes de archivos de departamentos de anatomía patológica de Europa, África, Asia y América (del sur, central y del norte). Sección con micrótomo e identificación del diagnóstico de histología: con el objetivo de identificar el tumor, confirmar la presencia de tejido 3

tumoral y para la extracción de ADN, se utilizó la técnica del sandwich (sección con micrótomo). Detección de VPH: SPF (Short PCR Fragment)-10 / LiPA25 (version1) (Kleter et al., 1999). La técnica de SPF-10 PCR amplifica 65 pb, que corresponde a un fragmento de amplio espectro de genotipos del VPH. El análisis de las variantes de VPH 16 y 18 se ha realizado mediante las técnicas expuestas en el objetivo 1. Objetivo 3 Para evaluar las variantes moleculares del VPH 33 y 45 detectadas en el estudio caso-control, se ha realizado secuenciación de la región E6/E7. También se ha desarrollado un ensayo de detección de variantes de VPH para VPH 33 y 45 utilizando tecnología luminex. Para analizar las variantes de VPH 58 en los casos CCE de cuello uterino conservados en parafina, se realizó análisis de E6/7.

2. Resultados Resultados del objetivo 1 Variantes del VPH 16 identificadas en el estudio caso-control de la IARC: de 310 muestras positivas para VPH 16 mediante GP5+/6+-PCR y método RLB, en 218 (70,3%) fue posible determinar mediante la técnica VPH 16 Multiplex PCR RHA variantes VPH 16 E6. De estas 218 muestras, 70 fueron controles (32,1%), 98 CCE (45,0%) y 50 ADC (22,9%). Las variantes del virus VPH 16 identificadas fueron: europeas (EU), asiáticas (As), asiáticas-americanas (AA), africanas-1 (AF1) y africanas-2 (AF2). La variante EU representó el 58,8% y 60,0% de las muestras de Asia y Sudamérica y se detectó en sólo el 35,7% de las muestras de los países del noroeste africano. La variante As representó el 29,4% (25/85) de la muestras positivas de Asia, mientras que el 3,8% (3/79) de esta variante se identificó en muestras de Sudamérica. Cabe mencionar que en Asia las variantes EU y As conjuntas (EU-As) representaron el 88,2% de las muestras positivas. La mayoría de las muestras As positivas (82%, 25/28) 4

se detectaron en los tres países incluidos de Asia: India, Tailandia y Filipinas. Las variantes no EU-As (AF, AF1, AF2, NA y AA) se identificaron en el 66,7% (36/54) de las muestras de países del noroeste africano. La mayoría de las muestras positivas de AF, AF1 y AF2 (80,0%, 24/30) correspondieron a países del noroeste africano (Marruecos y Argelia). La variante AA se observó en un alto porcentaje en las muestras procedentes de los países de Sudamérica (34,2%, 27/79). También, la mayoría de las muestras positivas AA (71,1%, 27/38 muestras) se detectaron en los tres países incluidos de Sudamérica: Brasil, Paraguay y Perú. Al analizar la relación entre las variantes de VPH 16 E6 y el cáncer de cuello uterino, no se identificaron diferencias importantes en la distribución entre los controles, CCE y ADC. Las variantes EU-As representaron el 68,5% (50/73), 67,3% (66/98) y 57,7% (30/52) de las infecciones en controles, CCE y ADC, respectivamente. Sin embargo, la variante As fue más común en infecciones en controles (15,1%, 11/73) y ADC (17,3%, 9/52) en comparación al 8,2% (8/98) en CCE. En contraste, la variante compuesta AF2 se detectó en 6,8% (5/73) de las infecciones en controles, mientras que esta variante fue encontrada en un 11,2% (11/98) en CCE y un 13,5% (7/52) en ADC. No se encontró asociación de las variantes con CCE o ADC en los países, pero se identificó una asociación de variantes EU-As con SCC en Sudamérica (OR: 4,0, IC 95%: 1,1-15,7). Variantes de VPH 18 identificadas en el estudio caso-control de la IARC: los resultados mostraron que la E6 de VPH 18 fue menos polimórfica que la E6 de VPH 16. Sólo fueron detectadas unas pocas variaciones silentes en E6 VPH 18. Se han desarrollado nuevos protocolos para el análisis de variantes de VPH 18 (E6/E7 y genes LCR), validados en especímenes cervicales positivos por VPH 18. Resultados del objetivo 2 Hasta finales de 2009 se han reclutado 22.661 bloques de parafina, que corresponden a 15.084 mujeres (casos de cáncer invasivo de cuello uterino 5

y controles) de diferentes países del América (del norte, central y del sur), África, Asia, Europa y Oceanía. De estos, 10.575 casos de cáncer de cuello uterino han sido evaluados histológicamente, considerados apropiados para la detección de VPH y finalmente analizados utilizando SPF-10 PCR, DEIA y LiPA25 (versión 1). En un 7,2% de las muestras de cáncer cervical invasivo se ha diagnosticado un ADC y en un 89,7% un CCE. Un 84,9% (8.977/10.575) de los casos analizados fueron VPH positivos. Infecciones múltiples se detectaron en un 6,5% de los casos VPH positivos. Los cinco tipos más comunes detectados como tipos VPH simples han sido: VPH 16 (57,0%), VPH 18 (9,5%), VPH 45 (5,3%), VPH 33 (3,6%) y VPH 31 (3,4%). Los tipos VPH 16 y 18, conjuntamente (contando infecciones simples y múltiples) representaron más del 70% de los casos analizados. Los casos de ADC con VPH 16 o 18 identificados como infección única fueron seleccionados para el análisis de variantes. Variantes de VPH 16 en ADC de la serie de bloques de parafina de casos de cáncer de cuello uterino: el análisis de variantes se ha realizado en 210 de los 215 casos de ADC de cuello uterino en los que se identificó VPH 16 como infección única. Para éste análisis, se utilizó la prueba E6 Multiplex PCR RHA anteriormente descrita. La mayoría de estos casos eran de América (central y del sur) y Europa (36,7% y 33,8%, respectivamente) y menos frecuentes de Asia, África y del norte de América (18,6%, 8,1% y 2,9%, respectivamente). De las 210 muestras VPH 16 positivas por SPF-10 PCR-DEIA-LiPA25, en 183 (87,1%) se pudo determinar la variante específica E6 VPH 16 tras realizar el test Multiplex PCR RHA VPH 16. La variante AA se identificó en un 48,6%, la EU en un 32,8%, la As en un 8,7%, la NA en un 6,6%, la AF1 en un 1,1%, la AF2 en un 1,1% y la EUAA en un 1,1%. En Europa las variantes más frecuentemente identificadas fueron de EU en un 53,8% y de AA en un 35,4%; en América (central y del sur), la AA fue en un 81,1% y de EU en un 17,4%; en Asia, la As en un 42,1%, EU en un 26,3%, NA en un 21,1% y AA en un 10,5%. Globalmente, las variantes EU eran más jóvenes (47,1 años ± 12,6) que el resto de las 6

variantes (As-52,0 años ± 15,2; AA-50,2 años ± 12,3; NA-52,5 años ± 9,9; AF1-52,5 años ± 10,6; AF2-1 caso de 63 años). Principales conclusiones: 1) las variantes asiático-americanas de VPH 16 fueron las más frecuentes en ADC; 2) las variantes europeas y asiáticas se identificaron en segundo y tercer lugar en frecuencia; 3) se detectó una baja prevalencia de la infección por variantes múltiples de VPH 16s; 4) se observó alta correlación entre las variantes y la región o continente; 5) se identificó cierto intercambio de variantes entre Europa y América (central y del sur); 6) se observó que las variantes europeas son más jóvenes que las no europeas, independientemente de la región. Variantes VPH 18 de ADC de la serie de bloques de parafina de casos de cáncer de cuello uterino: los análisis de variantes de VPH 18 están en curso. Para el análisis de muestras de tejido incluido en parafina del que sólo pequeños fragmentos pueden ser amplificados por cebadores PCR se realizaron alineamientos de secuencias en la región LCR y 4 regiones fueron identificadas para diferenciar las variantes de VPH 18. Posteriormente, se diseñaron cebadores de PCR para la amplificación de las 4 regiones. En los experimentos piloto de pruebas de PCR en muestras fijadas con formalina y muestras de parafina, observamos una buena amplificación en 3 de las 4 regiones. Un nuevo primerset fue diseñado para la región con una amplificación más pobre. Para las 3 regiones con una buena amplificación se realiza una reamplificación en 2 de ellas. El análisis de variantes está en curso en 138 de los 142 casos de ADC de cuello uterino conservados en parafina en los que se ha identificado VPH 18 como único tipo. Resultados del objetivo 3 Variantes de VPH 33 y 45 del estudio caso-control de la IARC: no hubo evidencia de relación de variantes específicas de VPH 33 o 45 con el hecho de ser caso o control o con la región, aunque debe tenerse en cuenta

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que el número de muestras es bajo para poder extraer conclusiones fiables resultado del análisis de subgrupos. Variantes de VPH 58 en casos de CCE de cuello uterino conservados en parafina: las variaciones en el codón 63 en la secuencia VPH 58 E7 fueron identificadas en una frecuencia elevada en CCE. Un estudio previo en Hong Kong mostró variaciones en el codón 63 asociadas con un alto riesgo de CCE corroborando nuestros resultados (Chan PKS et al., 2002).

3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos El diseño de pruebas de detección del VPH que identifiquen específicamente variantes moleculares de VPH involucradas en cáncer podría ser un gran avance en el desarrollo de herramientas para mejorar la especificidad de las pruebas de VPH utilizadas en el cribado (primario). Debido a la rareza y el difícil diagnóstico, poco se sabe acerca de las variantes moleculares del VPH y el ADC. El papel central de VPH en la carcinogénesis de los ADC ha sido recientemente confirmado. Los tipos de VPH 16 y 18 son, con diferencia, los dos tipos más frecuentemente detectados, seguidos por los tipos VPH 45, 59, 35 y 33. Esta observación sugiere que puede existir una relación entre la diversidad molecular del VPH y la diferencia en la distribución de VPH en este tipo de tumores en comparación con el cáncer cervical escamoso. La contribución científica más importante de nuestro proyecto ha sido el avance en el conocimiento en relación al ADC, un tipo de cáncer que está aumentando en muchas poblaciones y que escapa a las técnicas de cribado convencionales, lo que permitirá impulsar el conocimiento y la prevención de cáncer cervical en todo el mundo. Ésta es una oportunidad única en el mundo científico y tecnológico, dada la limitación en el tamaño de la muestra que estudios anteriores han tenido en la identificación de casos de ADC. Para obtener una evaluación precisa de las variantes del VPH, existe la 8

necesidad de estudiar las poblaciones genéticamente mezcladas en la que el origen étnico no está asociado de forma diferencial con el cribado. Nuestro estudio incluye las colecciones más importantes de todo el mundo de: (a) Casos de ADC, CCE de cuello uterino, así como controles (mujeres con citología normal) – Estudio caso-control multicéntrico de la IARC. (b) La mayor colección de casos de cáncer de cuello uterino conservados en parafina - Estudio Internacional del ICO sobre VPH y cánceres relacionados.

4. Publicaciones

Castellsagué X, Klaustermeier J, Carrilho C, Albero G, Sacarlal J, Quint W et al. “Vaccine-related HPV genotypes in women with and without cervical cancer in Mozambique: Burden and potential for prevention”. Int J Cancer. 122, 1901–1904 (2008). Odida M, de Sanjosé S, Quint W, Bosch FX, Klaustermeier J and Weiderpass E. “Human Papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer in Uganda”. BMC Infectious Diseases. 8:85 (2008). Usubütün A, Alemany L, Kücükali T, Ayhan A, Yüce K, de Sanjosé S, et al. Human Papillomavirus Types in Invasive Cervical Cancer Specimens From Turkey Int J Gynecol Pathol. 28 (6), 541-548 (2009). Artículos en curso: Sánchez GI et al. 9

Development and clinical evaluation of a highly sensitive and specific PCRReverse Hybridization Assay for detection and identification of Human Papillomavirus type 16 variants. Sanjosé S de et al. Human Papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: 10,575 cases. The International ICO Survey. También está en curso un artículo describiendo las variantes identificadas en casos VPH 16-18 en ADC de cuello uterino de la serie de casos conservados en parafina. Artículo describiendo las variantes de VPH 33-45 identificadas en el estudio caso-control. Artículo describiendo las variantes de VPH 58 identificadas en casos CCE conservados en parafina.

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