Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006): 147-157

Artículo reseña

VIRUS DE LA INFLUENZA AVIAR: CARACTERÍSTICAS GENÉTICAS, ANTIGÉNICAS Y DIAGNÓSTICO ACTUAL Julia Noda Dpto. de Virología, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las lajas, La Habana, Cuba. Correo electrónico: [email protected] RESUMEN: Los virus de la influenza aviar (VIA), pueden ser devastadores para la producción avícola a la vez que se relacionan con las pandemias de influenza en humanos. Estos virus han sido objeto de estudio sus características antigénicas y patogénicas, pero aun no son totalmente conocidos los aspectos biológicos que determinan el potencial patogénico y la capacidad de cruzar la barrera entre especies. Esta situación ha motivado que en los últimos años se hayan realizado múltiples trabajos de investigación que han aportado mayor conocimiento sobre la estructura y la biología molecular de estos virus. El conocimiento de las características de los virus IA es fundamental para comprender la variabilidad antigénica, las bases moleculares de la patogenicidad, el mecanismo que determina su capacidad para infectar, producir enfermedad en varias especies, fundamentalmente la humana y su importancia para el desarrollo y producción de vacunas más eficaces y seguras, así como sustancias antivirales de amplio espectro. En este trabajo se resumen los conocimientos actuales sobre la composición del virus; su estructura proteica, antigénica y genética y su influencia en las características biológicas. (Palabras clave: virus influenza aviar; genoma; virulencia; características antigénicas; diagnóstico)

AVIAN INFLUENZA VIRUS: ANTIGENICS AND GENETICS CHARACTERISTICS AND UPDATE DIAGNOSTICS ABSTRACT: Avian Influenza viruses (AIV) can be devastables for poultry industry and are associated to human influenza pandemic as well. Both antigenic and pathogenic characteristics of AIV have been deeply studied, but biological aspects determining pathogenic potential and ability of crossing barriers among species are no completed understood. This situation has propitiated several research works about the structure and molecular biology of AIV in the last years. Such knowledge is crucial to understand antigenic variability, pathogenicity molecular base and the mechanisms involved it the ability to infect and cause disease in several species, including human. All these aspects are essential for developing safer and more effective vaccines as well as broad effective antiviral drugs. In this work the current knowledge about AIV composition, protein structure, antigenic and genetic characteristics and its influence on the characteristics is summarized. (Key word: Avian Influenza Virus; genome; virulence; antigenic characteristics; diagnosis)

INTRODUCCIÓN La influenza aviar conocida también como gripe aviar es una enfermedad infecciosa de las aves que puede cursar desde una forma asintomática, hasta la forma clínica severa con mortalidad elevada, lo cual está en dependencia de la virulencia del virus y la susceptibilidad de las aves que afecta (64). En pollos

y pavos se presenta en dos formas: una forma caracterizada por reducción de la producción de huevos y/ o leve afectación del sistema respiratorio y otra muy aguda con signos neurológicos y entéricos severos, muy contagiosa y mortalidad de hasta 100%, debido a que invade múltiples tejidos y órganos internos donde provoca hemorragias de forma masiva (1, 22). Esta forma altamente patógena descrita por primera vez

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en Italia en 1978, se le denominó peste aviar y posteriormente recibió la denominación de influenza aviar altamente patógena (IAAP), en el primer Simposio Internacional en Influenza Aviar (1). Esta denominación se mantuvo durante varios años hasta que se le aplicó el término de Influenza Aviar Notificable (IAN) en la Organización Mundial de Salud Animal, de las siglas en inglés OIE (44). El agente etiológico se demostró que era un virus en 1955, el cual presentaba características similares al virus de la influenza humana A, sin embargo no fue hasta 1965 que se identificó como influenza tipo A (23). Posteriormente, se reconocieron a los serotipos H5 y H7 del virus IA, como los causantes de la peste aviar y se determinó que el principal determinante de la virulencia, de estos dos serotipos se encontraba en el sitio del procesamiento proteolítico de la hemoaglutinina (10). Aunque hasta la actualidad se han reconocido 16 serotipos diferentes de hemoaglutinina (H) y 9 serotipos de neuroaminidasa (N), todos ellos se han aislado de aves acuáticas silvestres (1, 24), sin embargo sólo son asociadas con la influenza aviar altamente patógena (IAAP), las cepas de los serotipos H5 y H7, las que presentan múltiples aminoácidos básicos en el sitio de procesamiento proteolítico de la hemoaglutinina, mientras que el resto de los serotipos y las cepas de los serotipos H5 y H7 que no muestran esas características se los reconoce como de baja patogenicidad (IABP) (45). En los últimos 5 años se ha producido un incremento notable en la presentación de brotes de esta enfermedad por diferentes cepas de estos dos serotipos, los que han provocado pérdidas cuantiosas a la avicultura, como la ocurrida en Italia en el 2000 por el serotipo H7N1 (11), en Holanda en el 2003 por el serotipo H7N7 (Fouchier et al., 2004 y la del Sudeste asiático en el 2004 que involucró múltiples países (14) y el virus causal (H5N1) fue capaz de sobrepasar la barrera ínter especies e infectar directamente, causar enfermedad y la muerte de personas (8). En la actualidad esta situación se ha agravado al extenderse a varios países de Europa, África y Medio Oriente con la afectación de aves silvestres y domésticas y con el riesgo creciente de dar lugar a una nueva pandemia de Influenza (67, 70). Un interés principal ha cobrado el conocimiento de las características de los virus de la influenza aviar basado en los aspectos moleculares, lo cual ha permitido profundizar en los cambios que han hecho posible que este virus proveniente de pollos infecte directamente y cause enfermedad en varias especies de mamíferos y el hombre (53, 67). A la vez que han contribuido a incrementar la eficacia y rapidez del diagRev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

nóstico y el desarrollo de vacunas efectivas para su utilización en aves y humanos, para una mejor preparación frente a una posible pandemia de Influenza. Con este trabajo hacemos un resumen de las características genéticas, antigénicas y patogénicas de los virus de la influenza aviar.

CLASIFICACIÓN Y CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Los virus de la influenza aviar inicialmente clasificados en el género Influenza virus y en el tipo antigénico A de la familia Orthomixoviridae (36), fueron posteriormente constituidos en el género Influenza virus tipo A, basado en las características de la nucleoproteína (NP) y la proteína de la matriz (M) (20). Morfológicamente los virus influenza A en general, se caracterizan por ser esféricos con diámetro entre 80120 nm, aunque pueden presentar formas filamentosas o pleomórficas que pueden alcanzar entre 400-800 nm de largo. La forma esférica es adquirida con el incremento del número de pases y los virus de origen aviar son más frecuentemente esféricos. Estructuralmente presentan una nucleocápsida formada de 8 segmentos con simetría helicoidal y de 9 nm en diámetro, la cual está constituida por dos componentes internos la ribonucleoproteína (RNP o NP) y el ARN viral al cual se unen 3 polipéptidos PB1, PB2 y PA con actividad polimerasa (69) La envoltura está compuesta de una bicapa lipídica derivada de la célula hospedera que presenta proyecciones en la superficie de aproximadamente 16 nanómetros de largo, en forma de espículas denominadas peplómeros que están constituidas por dos proteínas la Hemoaglutinina (H) y la Neuroaminidasa (N), las que se encuentran ancladas en dicha estructura en una relación de 4-5 a 1 y forman la partícula viral 500 moléculas de H y 100de N. La H presenta una forma bacilar y emerge como un trímero de 135Å en tanto que la N, tiene aspecto de hongo y forma un tetrámero de 60Å (Fig.1) (36). Ambas participan del proceso de infección y definen la especificidad de subtipo. En la parte interna, la envoltura viral está recubierta por la proteína matriz (M), la cual esta representada por dos tipos de proteínas M1 y M2 (Fig.1). La M1 es la proteína mayoritaria y junto con la NP le dan las características antigénicas específicas de grupo (tipo A) y la diferencia de género, la M2 se encuentra en la superficie de la envoltura y forma un canal iónico para la entrada del virus a la célula (52). Los virus Influenza tienen un genoma multipartito representado por 8 segmentos de ácido nucleico (ARN) de cadena simple y de polaridad negativa (Fig.

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Hemoaglutinina (H) Neuroaminidasa (N)

M2 M1

NP+ARN

FIGURA 1. Representación esquemática de la estructura del virus de la influenza aviar./ Schematic representation of the avian influenza virus structure. 1). La talla total de todos los segmentos es de 13600 nucleótidos (nt) los cuales portan la información genética para las 10 proteínas virales identificadas (40, 36). Todos los segmentos del genoma tienen altamente conservado los extremos terminales 5' y 3', y están constituido por una secuencia común de 12-13 nucleótidos (5’AGUAGAAACAAGG) para el género Influenza tipo A (30) y en el extremo 3’ una secuencia conservada en muchos segmentos (3’UCGUUUUCGUCC) y diferencian los virus humano del tipo A y del tipo B. Esta secuencia se relaciona con la señal para la traducción en la replicación del ARN viral. Los segmentos 1, 2 y 3 codifican para tres proteínas internas con actividad polimerasa (46), el segmento 1 compuesto de 2350 nucleótidos es el segmento de mayor longitud y codifica para la proteína PB2, la cual es esencial para la síntesis del ARN mensajero viral (36), en tanto que el segmento 2 de 2350 nt lleva la información de la polimerasa PB1 y el 3 con 2250 nt lo hace para la polimerasa PA. Estas proteínas forman un complejo con la NP el cual se localiza en el interior de la partícula viral y son importantes en la replicación del genoma viral (43). Las proteínas estructurales H, NP y N son codificadas por los segmentos 4, 5 y 6 (1780, 1575 y 1420 nt, respectivamente, en tanto que el segmento 7 de 1027 nt porta los genes para las proteínas M1 y M2 y el 8 (890 nt) los de la información genética para las proteínas no estructurales NS1 y NS2 o NEP, las que se relacionan con el ensamblaje del virus y la respuesta antiviral, respectivamente (36, 52, 55). Basado en la naturaleza segmentada del ARN de los virus influenza se ha señalado que se pudieran producir teóricamente 256 combinaciones del genoma por el entrecruzamiento de los ocho segmentos que lo componen (31), aunque en la naturaleza hasta la

actualidad son pocas las combinaciones que logran el número de genes con potencialidad para ser viables. Esta característica del ARN de estos virus permite el reordenamiento (“reassorment”) de genes o su recombinación cuando una célula es infectada con dos o más virus diferentes y de esta forma dar origen a nuevas cepas de virus que difieren de las progenitoras (63, 66). Este mecanismo ha hecho posible el intercambio genético entre virus de influenza de diferentes especies animales o del hombre como entre los virus de origen humano y aviar, las cuales han ocurrido por coinfección en cerdos respecto a virus del serotipo H3 (35). Esto se ha encontrado también en los virus H5N1 y H9N2 surgidos en el Sudeste de Asia, procedentes de humanos, pollos y aves acuáticas (48) los cuales mostraron genes similares y sugieren que los pollos pueden actuar como hospedero intermedio en la transmisión a humanos. Otra evidencia de este mecanismo de intercambio genético se ha revelado por el análisis filogenético, de los virus influenza H5N1 aislados de humanos y pollos en 1997, donde se encontró genes internos con características genéticas similares a los aislados H9N2 de codorniz (Codorniz/Hong Kong/G1/97) (26). Estos hallazgos unido a la incidencia de infección por virus H6N1 que presentan los genes internos y el de la NA genéticamente indistinguibles de los virus H5N1 de 1997 (17) y junto a la susceptibilidad demostrada por esta especie a la infección con 14 serotipos diferentes de virus de la influenza aviar, sugieren que las codornices potencialmente pueden actuar como mezcladores de genes de estos virus y dar lugar al surgimiento de nuevas cepas con incremento en la probabilidad de la transmisión ínter especies (51). Los estudios de secuenciación y el análisis filogenético realizado principalmente del gen de la NP de cepas del virus de la influenza aviar y los que afectan otras especies animales incluyendo al hombre, han revelado la divergencia en linajes específicos relacionados con el hospedero: dos linajes de caballos, uno de gaviotas, uno de aves de Norteamérica, uno de aves Euroasiática, uno de cerdo y uno de humanos (65). Con respecto al gen M, el cual se ha considerado un determinante de especificidad de especie de los virus influenza, (68) encontraron en el análisis de la secuencia de nucleótidos de este gen de los virus influenza aislados de gaviotas y pájaros y de las secuencias reportadas, un principal linaje de virus influenza A asociado a hospederos en particular: uno de humano y de cerdo clásico, uno de virus gaviota, otro de virus aviar no gaviota y virus equino, mientras que los virus aviares se dividían en dos linajes Euroasiático y Norteamérica, los que a su vez fueron separados en sublinajes diferentes. Estos autores Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

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sugieren, que en las aves acuáticas se mantienen diversas ramas de evolución de los virus influenza y concluyen que los genes M de los virus procedentes de gaviotas, pájaros de costa y patos pueden ser potencialmente los precursores de los virus que causan brotes en la avicultura comercial (68). También encontraron recombinación genética de este gen entre virus procedentes de Eurasia y Norteamérica La secuencia de nucleótidos del segmento 4 que codifica para la H de los serotipos H1-H16, ha sido objeto de estudio y se han podido establecer diferencias y homologías entre los mismos (24). Los análisis filogenéticos realizados por Banks y Alexander (5) a partir de la secuencia del gen de la H de diferentes cepas de los serotipos H5 y H7, revelaron también divergencia en dos linajes aviares del serotipo H7 distintos geográficamente, uno de Norteamérica y otro de los virus de Eurasia, África y Australia. En los virus del serotipo H5 se encontró divergencia también en dos linajes, el norteamericano y euroasiático y estos divergieron a su vez en sublinajes de virus históricos y aislados recientes. Los estudios tempranos de la secuencia de los genes PB1 y PB2 y el análisis filogenético realizado por Lin et al., han revelado también la divergencia en 4 linajes de los virus influenza relacionado con el gen PB1: uno de virus humano y los clásicos de cerdo, uno virus equino y otros de virus de aves de Norteamérica y otro de aves de Asia (38). En este último linaje se agruparon los virus humano pandémicos H2N2 y H3N2 y se sugiere el origen aviar de los genes PB1 de estos virus, mientras que los resultados obtenidos por estos autores con los genes NS revelaron dos linajes designados como alelos A y B, en el A se incluyen los virus de humano, cerdo, equino y pocos virus aviares y el B sólo virus aviares que se subdividen en otros dos: norteamericano y euroasiático (38). Todos estos estudios evidencian el importante papel de la diversidad de los genes de los virus influenza en las aves acuáticas silvestres donde se ha encontrado por el análisis filogenético de estos genes la separación también de los virus aislados en linajes euroasiático y norteamericano lo cual indica la importancia de la migración longitudinal en el proceso de evolución de estos virus. Los virus influenza tienen además gran variabilidad genética, con una elevada tasa de mutaciones > de 5x10-5 cambios de nucleótidos y ciclo de replicación (20, 63) lo cual está relacionado con la utilización para su replicación de una polimerasa ARN dependiente viral que por una parte presenta errores de copia y por otra tiene poca capacidad correctora. Esta variabilidad se traduce en sustituciones de aminoácidos en las proteíRev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

nas de la envoltura viral, fundamentalmente la H y N, que pueden dar origen al surgimiento de virus variantes antigénicos o en patogenicidad (4, 33, 50,62). Este fenómeno ocurre en los epitopes de menor magnitud y de forma gradual por la selección de mutantes. Los estudios moleculares y los análisis filogenéticos realizados sobre el gen H a los aislados del serotipo (H5N1) obtenidos hasta el 2001 en Hong Kong, los clasificaban en cinco genotipos de acuerdo a la fuente de cada uno de los segmentos del genoma, los cuales se nombraron como A, B, C, D y E (27). Sin embargo, los estudios posteriores realizados con aislados de este serotipo, responsable de la reemergencia en el 2003 de la enfermedad altamente patógena en pollos y su capacidad de provocar enfermedad y muerte en humanos en varios países del Sureste de Asia; han revelado la emergencia de 8 nuevos genotipos nombrados V, W, X1, X2, X3, Y, Z y Z + (37). En tanto que del análisis realizado a la secuencia de todos los segmentos del genoma de seis aislados del serotipo H5N1 obtenidos de humanos en Tailandia se evidenció que se corresponden con el genotipo Z y por la H y N en el sublinaje Gs/Gd (53). Por los estudios de secuencias de nucleótidos del gen H se ha determinado también, que las cepas altamente patógenas de los virus de la influenza aviar no constituyen linajes diferentes de estos virus. Ellas derivan de cepas de baja patogenicidad que en su multiplicación en pollos adquieren mutaciones en el segmento que codifica el sitio de procesamiento proteolítico de la proteína por las endonucleasas celulares, siendo la condición fundamental de la patogenicidad en los serotipos H5 y H7 y un marcador de virulencia (61). De todos estos estudios se ha considerado la hipótesis de que el gen H de los serotipos H5 y H7 tienen distintiva estructura secundaria de su ARN que puede favorecer la mutación por varios mecanismos: a) Inserción de nucleótidos (duplicación de codones) por copias repetidas de la polimerasa viral de una secuencia rica en purinas que codifica el sitio de procesamiento proteolítico de la H (49); b) Sustitución de nucleótidos o recombinación que permiten la introducción de residuos de aminoácidos adicionales (61). Particular interés presenta los virus influenza del serotipo H9N2 aislados de humanos y de aves en Hong Kong, los que por análisis filogenéticos de los genes H y NP, muestran diferencias con los de Norteamérica y se han dividido en tres linajes que presentan diferencias en patogenicidad para el pollo y en producir infección de varias especies animales, lo que se ha relacionado también con la presencia de genes similares a los virus H5N1 de 1997 (28).

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La secuencia de nucleótidos del segmento 6 del genoma que codifica la neuroaminidasa(N) también ha sido objeto de estudio para la caracterización de cepas relacionadas sobre el origen de los virus influenza, las diferencias en patogenicidad y en la sensibilidad al efecto de los antivirales inhibidores de esta enzima (6, 36). Avances en el conocimiento se han obtenido por generación experimental de cepas altamente patógenas a partir de las de baja patogenicidad y por la genética inversa, a partir de estos estudios se ha determinado la influencia de algunos genes o deleciones de ellos y se ha concluido que en la virulencia de estos virus están involucrados otros segmentos de genes además de la H y la N, los que pueden variar con la cepa viral y el hospedero que infecta (60, 66). Todos estos cambios en el genoma pueden llegar a producir cambios en las proteínas las que muestran modificaciones relacionadas con variaciones antigénicas o en patogenicidad cuando se producen en el gen de la hemoaglutinina y la neuroaminidasa, mientras que en los genes internos se traducen en cambios en la patogenicidad y la potencialidad para la transmisión entre diferentes especies animales.

CARACTERÍSTICAS ANTIGÉNICAS La diversidad antigénica de los virus de la influenza aviar se ha evidenciado en todas las combinaciones posibles de las proteínas de la envoltura la hemoaglutinina (H) y la neuroaminidasa (N) y se describen hasta la actualidad 16 serotipos antigénicos diferentes de H y 9 de N (24) los que pueden originar 144 posibles combinaciones. La variabilidad antigénica se ha podido conocer tempranamente por el análisis de la secuencia deducida de aminoácidos realizada a virus de los serotipos del H1 al H12, donde se pudo revelar que en el péptido señal se presentaban las mayores diferencias entre los subtipos evidenciado por tener una longitud variable y menor homología de los diferentes serotipos con 20-74% de variación entre los mismos (4). Todos estos serotipos se han encontrado en aves acuáticas silvestres, las que actúan como reservorios naturales y genéticos de estos virus donde se originan las mezclas de diferentes poblaciones virales (1,38,27). En tanto que las especies galliformes y los mamíferos son considerados huéspedes no habituales. De las dos proteínas estructurales principales de la envoltura es la H la de mayor importancia, tiene la función de unirse a los sialo-liposacáridos de los receptores que están presentes en la membrana citoplasmática de las células, ya que presenta el dominio de fusión que es necesario para la liberación del ARN en la célula huésped en el proceso de la replicación viral, lo cual

es vital para la transmisión viral y el principal determinante del rango de hospedero (41). Los estudios de la primera fase de la replicación viral de los virus influenza aviar han demostrado que los virus de origen aviar tienen una mayor afinidad por los receptores celulares de ácido siálico Ü 2-3 que es dominante en células epiteliales en tejidos del pulmón y tracto intestinal (25), mientras que los virus adaptados a humanos la tienen por Ü 2 -6 galactosa presente en células epiteliales no ciliadas del tracto respiratorio humano, lo cual puede actuar como barrera entre especies. No obstante, el hecho de encontrarse ambos tipos de receptores en células de cerdos y codornices considerados los mezcladores de cepas de virus humanos y aviares hace posible la transmisión entre especies y el surgimiento de virus pandémicos (48, 51). Se ha señalado también la importancia del sitio o posición una leucina L216Q (L226Q en la numeración de H3) para la especificad de la unión al receptor, la cual está presente en los virus humanos y cerdos mientras que es sustituida por glutamina en los virus aviares (66). En el análisis de aislados del serotipo H9 procedentes de aves acuáticas de China se ha encontrado que contienen leucina en este sitio lo cual puede favorecer la unión a células de mamíferos y explicar la capacidad de estas cepas para la infección en humanos (34). La H es una proteína glucosilada y acilada, estructuralmente forma homotrímeros sobre la superficie viral y presenta 4-5 epitopes o sitios antígénicos dominantes que son los responsables de la inducción de anticuerpos neutralizantes específicos al virus y protectores contra la enfermedad y en ella se encuentra la actividad hemaglutinante (23, 33, 34). Esta proteína presenta 562-566 aminoácidos y está formada por dos cadenas polipetídicas H1 y H2 unidas por dos puentes disulfuro, las cuales derivan de la proteólisis de una molécula precursora (H0), debido a la acción de las proteasas presentes en las células huésped. Este sitio de procesamiento proteolítico en la hemoaglutinina es esencial para la infectividad viral y se relaciona estrechamente con la patogenicidad (10, 62). La neuroaminidasa (N) es una sialidasa que evita la formación de agregados de los viriones que emergen de la membrana celular, lo cual realiza por remoción del ácido siálico de la superficie celular y digestión de los enlaces del ácido neuroamínico entre las membranas del virus y la célula, lo cual favorece la liberación viral (36). El dominio enzimático de la N se encuentra en el polipéptido del pedúnculo que emerge de la envoltura viral y que puede ser de diferente talla, un pedúnculo corto se asocia con ineficiente desagregación y liberación de la progenie viral debido a que no puede acceder a su sustrato (7). Otros Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

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cambios importantes en esta proteína se relacionan con residuos de aminoácidos que están asociados con la resistencia a inhibidores de la neuroaminidasa, como la sustitución de arginina (R) por lisina (K) en el residuo 292 que determina la resistencia al oseltamivir y zanamivir (6). Variaciones antigénicas también se producen en esta proteína aunque en menor magnitud que la hemoaglutinina, lo cual se expresa en los 9 diferentes serotipos de N detectados (1, 36). La N aunque induce anticuerpos los que inhiben la actividad enzimática de forma específica, sólo induce protección parcial cuando se utiliza sólo esta proteína. En la actualidad para la introducción de un programa de control mediante vacunación se ha considerado la estrategia de diferenciar vacunados de infectados sobre la base de revelar la presencia de anticuerpos contra una neuroaminidasa heteróloga en la cepa vacunal utilizada respecto al virus circulante (12). La proteína M2 resulta indispensable en la infección por virus influenza y está determinado por su actividad al formar un canal iónico con incremento de la concentración de iones dentro de la partícula viral, reduce el pH y facilita la fusión a la membrana del endosoma por la H activada y ARN viral puede ser liberado al interior de la célula (9). Esta actividad de la proteína M2 puede ser inhibida por la amantadina, rimantadina y sustancias relacionadas, sin embargo en los estudios moleculares de varias cepas de H5N1 obtenidas de origen de pollos y de humanos de brotes de la enfermedad en el sureste de Asia se han encontrado sustituciones de aminoácidos como aspargina en lugar de serina en el residuo 31 en la cepa aislada en Tailandia, indicativo de resistencia frente al tratamiento con estas drogas (53, 60). Los anticuerpos inducidos por esta proteína aunque no son neutralizantes reducen la penetración viral y por tanto pueden producir protección parcial. La proteína NS1 (no estructural) sólo es producida durante la infección viral, que tiene como función inhibir la transportación del ARNm de la célula permitiendo el transporte del ARN viral a los ribosomas para su traducción su actividad se relaciona con la evasión a la respuesta inmune innata debido a que inhibe y es antagonista del interferón alfa (INFa) (47). Además, es capaz de inducir la producción de anticuerpos que puede ser utilizado para diferenciar también aves infectadas de vacunadas en un programa de control por vacunación (2).

CARACTERÍSTICAS PATOGÉNICAS. Las características de mayor virulencia o patogenicidad observada particularmente en cepas de Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

los serotipos H5 y H7, está determinada por la presencia de múltiples aminoácidos básicos (arginina y/ o lisina) en el sitio de partición enzimática (SPE) de la H (originada por mutaciones o por duplicación de nucleótidos en el gen H), lo que permite el procesamiento proteolítico por diferentes proteasas celulares (54, 49) y no sólo del tipo de la tripsina, lo cual hace posible una mayor capacidad de estos virus para infectar los tejidos internos y provocar una infección generalizada con mortalidad en las aves. Los estudios realizados por análisis de la secuencia traducida de aminoácidos de la H, a los aislados de los brotes de influenza altamente patógena ocurridos en México por el serotipo H5N2 y en Italia por el serotipo H7N1, han demostrado la presencia de múltiples aminoácidos básicos en el SPE en estas cepas, las cuales derivaron de cepas de baja patogenicidad presentes en un período previo a la aparición de la enfermedad (49, 11). Por lo que basado en estos resultados se ha sugerido la hipótesis de que estos cambios se deben al mecanismo de inserción o duplicación de nucleótidos el cual está influenciado por la estructura secundaria del ARN que flanquea este sitio en los serotipos H5 y H7 (62) y estos cambios son considerados como marcadores de virulencia de aislados de estos serotipos del virus de la influenza aviar (50), la determinación de la secuencia de nucleótidos de este segmento del genoma y la traducida de aminoácidos ha sido indicada entre las pruebas a realizar para predecir la patogenicidad junto a las pruebas de patogenicidad en pollos (45). No obstante, se han encontrado otros cambios en la estructura de la H, relacionados con los sitios de glicosilación en el segmento H1, la presencia de varios sitios cercanos al receptor se han asociado con un incremento en la virulencia de los virus influenza virus, debido a que pueden facilitar la entrada del virus a la célula huésped y acelerar la salida desde las células (50). También, la presencia en la N de variabilidad de glicosilación se ha relacionado con supresiones en el pedúnculo de esta proteína, lo cual se ha asociado con un incremento de la virulencia en una variedad de cepas y se ha encontrado que ciertas mutaciones en la H requieren de mutaciones en la neuroaminidasa para una mayor virulencia de los virus influenza (32). Esta interacción afecta la rapidez conque las partículas de virus son liberados de las células y favorece la diseminación a todos los tejidos del ave. Trabajos más recientes indican la importancia de la proteína no estructural NS1, la cual tiene funciones de regulación en el proceso de replicación viral y mutaciones en el gen NS que pueden afectar la actividad antagónica contra el interferón alfa/beta (IFN a/ß) (47).

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Los estudios realizados sobre los genes de las cepas de IA H5N1/97 de Hong Kong, han demostrado que cambios de el gen NS1 pueden ser determinantes para la patogenicidad en mamíferos (39).Todo lo cual ha evidenciado que la virulencia de los virus de la influenza en general y los de origen aviar en particular puede estar determinada por cambios en varios genes (66), por lo que estudios más profundos aún serán necesarios para esclarecer las características patogénicas que diferencian los serotipos H5 y H7 y otros serotipos que han logrado pasar la barrera interespecies e infectar humanos.

DIAGNÓSTICO ACTUAL El incremento del impacto de la Influenza aviar, tanto en la producción avícola como la salud humana a nivel mundial, ha requerido del desarrollo de las capacidades de diagnóstico en múltiples laboratorios en el mundo, dirigido a la detección rápida de antígenos específicos o el ARN viral pero de forma paralela con los métodos clásicos o convencionales (45). La metodología convencional se basa en el aislamiento viral en embrión de pollo considerado como el estándar de oro para el diagnóstico de influenza aviar debido a su elevada sensibilidad, sin embargo presenta algunos problemas ya que no siempre provoca mortalidad del embrión (depende del patotipo) y no produce lesiones características del embrión (42), por lo que la forma de revelar la multiplicación viral en el líquido alantoideo es a través de la hemoaglutinación de glóbulos rojos de pollo, lo cual requiere de la presencia de 106.0 partículas de virus para que ocurra dicho fenómeno y son necesarios dos o más pases en embrión de pollo, sobre todo para el aislamiento de cepas de baja patogenicidad (IABP). Con las de alta patogenicidad (IAAP) con un segundo pasaje se lograría la producción óptima de virus para la hemoaglutinación (29). Una vez obtenido el aislamiento de un virus hemoaglutinante se identifican el serotipo de hemoaglutinina (H) por la prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IHA) para lo cual se necesitan antisueros mono-específicos contra los 16 serotipos de H. Además se deben utilizar antisueros contra los subtipos de paramyxovirus aviares que tienen también actividad hemoaglutinante (45). De revelarse algún serotipo H de virus IA se determina el subtipo de neuroaminidasa (N) con antisueros específicos de las 9 N (71). La determinación del tipo de N en aislados de H5 y H7 reviste gran importancia, la que se relaciona con estrategias de control mediante vacunación con el empleo de virus vacunal con N heteróloga respecto a los virus causantes del brote de la enfermedad y que permite diferenciar las aves

vacunadas de infectadas, conocido con las siglas DIVA (12, 15). Particular cuidado se debe tener en esta prueba cuando se utilizan antisueros contra el virus completo pues los anticuerpos a la H pueden enmascarar o bloquear de forma no específica actividad N, así como también reactividad cruzada entre los subtipos de N (71). Una vez que se tiene identificado un aislado del virus de la IA es necesario determinar su virulencia o patogenicidad para los pollos, sobre todo con los serotipos H5 y H7 en los que se reconocen cepas altamente patógenas para el pollo y está indicado el índice de patogenicidad intravenosa (IPIV) para determinar el patotipo de los mismos. Esta prueba se realiza por inoculación de 10 pollos de 6 semanas de edad por la vía intravenosa con el aislado multiplicado en embrión de pollo y es considerado como altamente patógeno si causa 75% o más de mortalidad dentro de los 10 días de observación o un IPIV >1,2 (45). Si bien esta metodología aunque efectiva en el diagnóstico junto con la determinación del patotipo, tiene la desventaja del tiempo prolongado (10-15 días) que se necesita para obtener los resultados que demuestren la presencia de los virus altamente patógenos. En caso de sospecha o presencia de un brote de influenza aviar la identificación rápida es de vital importancia para la toma de medidas específicas de control, a fin de reducir la diseminación del virus actuante y las pérdidas que pueda producir como consecuencia de la enfermedad altamente patógena. Debido a esto se han desarrollado métodos de diagnóstico dirigidos a la identificación del ARN viral y de antígeno, los que pueden ser utilizados conjuntamente con los métodos convencionales (13, 45). Para revelar la presencia de virus influenza e identificar el serotipo se han empleado múltiples métodos basado en la detección del ARN viral por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa conocido con las siglas RT-PCR, dirigidos a la identificación de virus IA tipo A, la determinación del serotipo de H y la secuenciación del genes relacionadas con la virulencia y/o el origen del virus presente. En la detección del ARN tipo A se ha utilizado cebadores que amplifican regiones conservadas del gen que codifica la proteína M (58,59), los que han logrado amplificar cepas y aislados de los serotipos H5 y H7 evaluados, también del gen de la nucleoproteína (NP) (21), los que permiten identificar cualquier virus influenza tipo A específico, aspecto también importante para la detección de nuevos serotipos emergentes (24) y para determinar el origen por estudios filogenéticos. Respecto a la detección del tipo de H se han empleado también varios RT-PCR para la identificación Rev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

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fundamentalmente de H5 y H7 que han permitido el diagnóstico rápido con la introducción del PCR anidado, NASBA y el de tiempo real (18, 19, 58, 59,61). Con relación a la N también se ha logrado el diagnóstico por RT-PCR que permiten la identificación más rápida que el ensayo convencional sobre todo en la detección del actual virus potencialmente pandémico H5N1 (30, 24).

dología por tanto forma parte del algoritmo de diagnóstico la IA incorporado al actual Programa de Prevención de esta enfermedad del IMV ante la sospecha de enfermedad respiratoria o nerviosa en las aves.

La determinación temprana del patotipo es otro de los aspectos fundamentales para el diagnóstico de IA, lo cual requiere para la toma de medidas más drásticas de control y/o el empleo de la vacunación (45) (Manual OIE, 2005), por lo que la predicción del patotipo por RT-PCR y secuenciación del segmento del gen de la H que codifica el sitio de procesamiento proteolítico, permite revelar la presencia de múltiples aminoácidos básicos en este sitio lo cual se relaciona con las cepas altamente patógenas de los serotipos H5 y H7 (56, 62).

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El diagnóstico de IA por estas técnicas tiene ventajas sobre el aislamiento viral en rapidez cuando se realiza directamente de la muestra clínica al no requerirse del aislamiento viral inicial. Respecto a la prueba de patogenicidad la cual demorar un tiempo mayor de 10 días, con la aplicación de las técnicas moleculares para la predicción del patotipo se puede obtener el resultado en menos de 3 días (61), además de facilitar el diagnóstico diferencial simultáneo con la enfermedad de Newcastle que provoca semejantes signos clínicos, mortalidad y que también se emplea similar metodología (57, 3). Aunque se han empleado también otros métodos para la detección del virus IA y la identificación del serotipo como los ensayos inmunoenzimáticos de captura de antígeno (16) directamente en muestras clínicas, estos no superan al aislamiento viral y al RT-PCR en sensibilidad, lo cual es muy importante, pues basado en este diagnóstico se deben tomar las medidas de control para evitar la propagación del virus entre las aves. En nuestro país, se realiza de forma sistemática la vigilancia epizootiológica de influenza aviar por monitoreos serológicos de las poblaciones de aves comerciales, relacionadas con las zonas de riesgos, aves centinelas de los asentamientos de aves migratorias según lo establecido en el programa de vigilancia y control del Instituto de Medicina Veterinaria (IMV) para esta enfermedad. No obstante ante la situación internacional con la IA desde el 2002 en nuestro laboratorio se han realizado trabajos que han permitido la puesta a punto de los métodos moleculares RT- PCR y la secuenciación de la H para la detección rápida a partir de la muestra clínica, lo cual ofrece una mayor seguridad al no requerir de la multiplicación previa en embrión de pollo. Esta metoRev. Salud Anim. Vol. 28 No. 3 (2006)

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