Recibido 28/06/2012, Aceptado 17/07/2012, Disponible online 07/12/2012

Weissella confusa como un agente bioprotector en la inocuidad alimentaria contra patógenos Gram negativos Liliana Serna-Cock1*, Luisa Fernanda Rubiano-Duque1, Nancy Bonnie Loaiza-Castillo1, Cruz Elena Enríquez-Valencia2 1

Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, Facultad de Ingeniería y Administración, Carrera 32 vía Candelaria, Palmira, Valle del Cauca, Colombia. Tel. 2868888 Ext. 35720. 2 Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, Facultad de ciencias agropecuarias, Carrera 32 vía Candelaria, Palmira, Valle del Cauca, Colombia. *[email protected]

RESUMEN La calidad de los productos de la industria alimentaria, se mide no solamente por factores nutricionales y organolépticos si no por aspectos de inocuidad. Las bacterias ácido lácticas se han considerado microorganismos seguros y agentes bioprotectores para garantizar la inocuidad de algunos alimentos. En este trabajo, se evaluó la actividad antimicrobiana de una bacteria ácido láctica, Weissella confusa, contra Escherichia coli ATCC 25922 y Klebsiella pneumoniae, dos patógenos Gram negativos causantes de enfermedades transmitidas por alimentos. W. confusa se produjo a través de fermentación discontinua, en sustrato comercial MRS. Las fermentaciones se llevaron a cabo por 6 horas, sin aireación, a 33 °C, 100 rpm y agitación continua. Cada hora de fermentación se tomó una muestra del fermentado y se separaron las células de sus compuestos metabólicos mediante centrifugación y posterior lavado de células con NaCl al 0,9%. A las células libres de metabolitos se les denominó W. Se midió la actividad antimicrobiana de W, mediante la técnica de difusión en gel. W presentó actividad antimicrobiana contra los dos patógenos en prueba. En esta investigación se demostró que W. confusa presenta actividad antimicrobiana contra las dos bacterias Gram negativas evaluadas. Los resultados sugieren que W. confusa y sus metabolitos podrían utilizarse en la industria de alimentos, como agente bioprotector contra E. coli ATCC 25922 y K. pneumoniae, lo cual representa un aporte importante en la garantía de inocuidad de alimentos.

Palabras clave: Bacterias ácido lácticas, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, actividad antimicrobiana, enfermedades trasmitidas por alimentos.

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ABSTRACT The quality of the food industry products, is measured by organoleptic, nutritional factors and safety aspects. Lactic acid bacteria have been considered safe and bioprotectors agents to ensure the safety of some foods. The antimicrobial activity of lactic acid bacterium, Weissella confuse was evaluated against two Gram-negative pathogens causing foodborne illness, Escherichia coli ATCC 25922 and Klebsiella pneumoniae. W. confusa was grown by batch fermentation in MRS commercial substrate. Fermentations for 6 hours, without aeration, at 33 °C, 100 rpm and continuous stirring were performed. Every hour of fermentation, a sample was taken, and cells of metabolic compounds were separated. Thereafter, washing cells with 0.9% NaCl were made. The cell-free metabolites were named W. The antimicrobial activity of W was measured using the technique of gel diffusion. W presented antimicrobial activity against both pathogens tested. This research showed that W. confusa has antimicrobial activity against both Gram-negative bacteria tested. The results suggest that W. confusa could be used in the food industry as a biocontroler agent against E. coli ATCC 25922 and K. pneumoniae, which represents an important contribution in ensuring food safety. Key Words: Lactic acid bacteria, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, antimicrobial activity, foodborne diseases.

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I.

INTRODUCCIÓN

En un sentido estricto, la inocuidad de alimentos se ha definido como la probabilidad de no contraer una enfermedad como consecuencia del consumo de cierto tipo de alimento. En un sentido amplio, la inocuidad de un alimento también comprende las características y propiedades nutricionales (Grunert, 2005). De tal manera que, las así llamadas enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’S) están directamente relacionadas con la inocuidad alimentaria. Éste tipo de enfermedades pueden contraerse por la ingestión de alimentos y/o bebidas contaminados con microorganismos patógenos que afectan la salud del consumidor (González-Flores y Rojas-Herrera, 2005). En general, las categorías de alimentos de carnes, productos lácteos y granos son las fuentes más importantes de ETA´S, el agua aunque no es considerada como un alimento revela una fuente importante de enfermedades como E. coli, V. cholerae y Shigella spp (Pires et al., 2012). Las ETA`S constituyen un importante problema de salud pública debido al incremento en su ocurrencia, el surgimiento de nuevas formas de transmisión, el aumento de la resistencia de los patógenos a los compuestos antimicrobianos y el impacto socioeconómico que ocasionan (González-Flores y Rojas-Herrera, 2005). Varios pueden ser los patógenos asociados a ETA`S, patógenos tales como bacterias, virus, parásitos y hongos (Havelaar et al., 2012). Entre las bacterias más reconocidas como causantes de ETA`S se encuentra la cepa de E. coli O157:H7, un importante patógeno en humanos que por más de dos décadas, ha

causado considerables brotes de un amplio rango de enfermedades clínicas en el mundo (Holck et al., 2011; Pires et al., 2012), e importantes índices de mortalidad y morbilidad tanto en países desarrollados como en países en desarrollo (Ho et al., 2012). El impacto de E. coli sobre la salud pública es alto (Karch et al., 2005). Cepas patógenas de E. coli pueden causar diferentes enfermedades. La enfermedad más común es gastroenteritis (Acuña et al., 2012), sin embargo, puede producir otros síndromes como síndrome hemolítico urémico (Gould et al., 2009) dentro del cual se incluyen importantes trastornos de salud como anemia hemolítica, trombocitopenia e insuficiencia renal aguda (Loirat et al., 2012). Dentro del grupo de las Enterobacteriáceas además de cepas mutantes de E. coli resistentes a antibióticos, se encuentran, cepas mutantes de Klebsiella pneumoniae (Wong-Beringer et al., 2002). K. pneumoniae es un importante patógeno nocosomial que al igual que E. coli, puede estar presente en alimentos (Calbo et al., 2011), ambos patógenos son colonizadores normales del tracto gastrointestinal y son causa común de bacteremia (Hsin-Yun et al., 2006). K. pneumoniae, también ha causado preocupación de salud pública en el mundo por su capacidad de producir βlactamasas de amplio espectro (Liu et al., 2012). En pacientes con bacteremias producidas por K. pneumoniae comúnmente se encuentran enfermedades como acceso hepático piógeno (Casella et al., 2009) e infección del tracto respiratorio (Hsin-Yun et al., 2006). Sin embargo,

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también puede producir alteraciones del tracto urinario y diarreas con sangre (Guerin et al., 1998). Desde el comienzo de la década de 1990, la Organización Mundial de la Salud (OMS) desarrolló una estrategia para fomentar la capacidad de vigilancia de enfermedades transmitidas por los alimentos, en respuesta a la creciente incidencia de ETA`S, Sin embargo, las deficiencias en la vigilancia de ETA`S persisten (Pires et al., 2012), lo que hace urgente la búsqueda de nuevos alternativas para su control y mejoramiento de la inocuidad en los alimentos. Las bacterias ácido lácticas (BAL), son bacterias Gram positivas, generalmente no móviles y no esporuladas, las cuales producen ácido láctico (Ringø y Gatesoupe, 1998). Su carácter de GRAS (generalmente reconocidas como seguras) ha permitido que se desarrollen numerosas líneas de investigación relativas a su utilización para asegurar la biopreservación y la inocuidad de los alimentos (Roldán et al., 2011). Weissella confusa es una BAL que ha sido aislada de una gran variedad de nichos naturales (Björkroth, et al., 2002) como vegetales frescos, alimentos fermentados, productos cárnicos (Diez, et al., 2009) y rumen bovino (Serna et al., 2010). Este género al igual que otras BAL, poseen actividad antimicrobiana por la producción de acido láctico, peróxido de hidrogeno, diacetilos y compuestos que actúan como bacteriocinas los cuales no han sido aún identificados (Matamoros, et al. 2009). Las bacteriocinas, generalmente son reconocidas como compuestos “naturales” capaces de influenciar en la inocuidad y calidad de los alimentos (Settanni y Corsetti, 2008); sin embargo, la

sensibilidad de bacterias Gram negativas a bacteriocinas producidas por BAL no es común (Riaz et al., 2010), en general, éstas bacteriocinas son más activas contra bacterias Gram positivas que bacterias Gram negativas (Askari et al., 2012). Existen reportes científicos de la producción de bacteriocinas por el género Weissella. Lee (2005), encontró que una especie de Weissella Kimchi PL 9023, aislada del tracto vaginal de mujeres, presentó actividad antagónica contra patógenos vaginales Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae con la producción de sustancias similares a bacteriocinas. Pal y Ramana (2009), encontraron la producción de compuestos antimicrobianos no asociados a bacteriocinas secretadas por Weissella paramesenteroides DFR- 8; aislado a partir de material vegetal; los cuales tenían amplio espectro de acción sobre patógenos transmitidos por alimentos. Espeche et al. (2009), aislaron compuestos antimicrobianos producidos por especies de Weissella paramesenteroides aisladas de muestras de leche de bovinos sanos, con efecto antimicrobial contra Streptococcus dysgalactiae ATCC 27957 y Escherichia coli. Serna, et al. (2010), reportaron la actividad antimicrobial de especies de Weissella confusa aisladas de líquido ruminal bovino contra especies de Staphylococus aureus y Streptoccocus agalactiae principales patógenos causales de mastitis bovina. De acuerdo con lo anterior, la capacidad antimicrobiana del género Weissella contra patógenos Gram negativos causales de ETA´S representa una importante alternativa de investigación como una estrategia para mejorar la calidad e inocuidad de los alimentos. El

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objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad antimicrobiana de Weissella confusa contra una cepa comercial de E. coli y K. pneumoniae patógenos Gram negativos causales de ETA’S.

II. MATERIALES Y MÉTODOS Bacteria ácido láctica Como bacteria ácido láctica se utilizó una cepa de W. confusa crioconservada en glicerol (-20 °C), obtenida y además caracterizada en investigaciones de Serna et al. (2010), la cual fue seleccionada de un grupo de bacterias ácido-lácticas aisladas de líquido ruminal de hembras bovinas de raza Hartón del Valle. Para la reactivación de la cepa, se inoculó el 10 % (v/v) del cultivo de W. confusa en 5 ml de caldo MRS (Scharlau Microbiology, España) suplementado con 40 g/L de glucosa (Merck, Alemania) y se incubó a 32 °C por 24 horas. Patógenos Indicadores Gram negativos Para evaluar la actividad antimicrobiana de células de W. confusa libres de metabolitos se utilizaron dos cepas patógenas indicadoras, se utilizó una cepa de E. coli ATCC® 25922, a concentración de 108 ufc.ml-1 y una cepa nosocomial de K. pneumoniae (concentración de 107 ufc.ml-1) donada por el laboratorio clínico de Imbanaco, Cali Colombia.

Crecimiento de W. confusa W. confusa se hizo crecer bajo el proceso de fermentación en sustrato comercial MRS. Se realizaron tres fermentaciones en discontinuo por 6 horas. Cada fermentación se realizó en

erlenmeyer de 1000 mL, (800 mL de volumen efectivo) sin aireación, en agitación continua con agitador orbital (model 5000I, VWR, USA) fijado en 33 °C y 100 rpm. En cada una de las fermentaciones, se utilizó un inóculo inicial de W. confusa del 10% con respecto al volumen de sustrato de fermentación. La fermentación se ajustó a pH 6,0 utilizando NaOH (4M). Obtención y separación de células de W. confusa En cada una de las fermentaciones, cada hora se tomaron 45 ml del fermentado. El fermentado se llevó a centrifugación durante 30 minutos a 2860 g (modelo 5804R Eppendorf CITI, Germany). Transcurrido el tiempo de centrifugación, se separaron el precipitado y el sobrenadante. El precipitado, correspondiente a células de W. confusa, se sometió a un proceso de lavado con solución de NaCl al 0,9%, se agitó suavemente, se centrifugó por 5 min a 2860 g y se desechó el sobrenadante. De esta forma se obtuvieron células de W.confusa libres de metabolitos (W). El mismo procedimiento se realizó a las horas 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de fermentación. Evaluación de la capacidad antimicrobiana de células libres de metabolitos (W) contra E. coli y K. pneumoniae La actividad antimicrobiana de W contra cepas comerciales de E. coli ATCC® 25922 y K. pneumoniae se midió a través de la técnica de difusión en pozo. Para el crecimiento de E. coli y K. pneumoniae, se utilizaron placas de agar nutritivo (Scharlau Microbiology, España) de 5 mm de espesor. En las placas en las cuales se midió la actividad antimicrobiana de W se realizaron orificios utilizando un

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sacabocado estéril de 15 mm de diámetro. Cada placa se sembraron por separado con 100 µl de cultivos de E. coli y K. pneumoniae a concentraciones de 108 y 107 ufc.ml-1, respectivamente. Posteriormente, en forma aséptica, se tomaron círculos de agar MRS estéril de 5 mm de espesor y de 15 mm de diámetro, los cuales se inocularon por separado, con 0,06 ml de W (a concentraciones que dependían del tiempo de fermentación). Los círculos de agar inoculados se depositaron en los orificios realizados en las cajas con agar Eosin-azul de Metileno las cuales contenían el patógeno. Finalmente, todas las cajas se incubaron a 33 °C por 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, se midieron los halos de inhibición de crecimiento contra los patógenos, utilizando regla milimétrica. Análisis estadístico Para evaluar la capacidad antimicrobiana de Weissella confusa contra E. coli y K. pneumoniae se utilizó un diseño unifactorial con dos niveles. Como variable de respuesta se midió la actividad antimicrobiana de W contra E. coli y K. pneumoniae en 7 tiempos de fermentación, hora 0, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. La hora 0 correspondió a las condiciones iniciales de fermentación. Los tratamientos se realizaron por triplicado. Los resultados se analizaron a través del programa estadístico SAS versión 9.13. La comparación entre promedios se llevó a cabo a través de la prueba Tukey con una probabilidad de p