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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 068 668 kInt. Cl. : A23C 21/02

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 92200307.4 kFecha de presentaci´on : 04.02.92 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 498 506 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 12.08.92

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54 T´ıtulo: Procedimiento de fabricaci´ on de un complejo de levadura l´ actico, complejo de levadura

obtenido, fabricaci´ on de un complemento alimentario a partir de este complejo de levadura y producto obtenido.

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73 Titular/es: Bioadditive SA

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72 Inventor/es: Chavant, Louis y

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74 Agente: Aguilar Forment, Domenec

30 Prioridad: 08.02.91 FR 9102291

Z.A.C. Parc Technologique Agropole F-47310 Estillac, FR

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.04.95

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.04.95

Aviso:

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Rollan, Serge

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION La invenci´on se refiere a un procedimiento de fabricaci´ on de un complejo de levadura l´ actico, del tipo que consiste en hacer fermentar un lactosuero en presencia de un fermento l´ actico mixto que contiene una simbiosis de levaduras y de bacterias. La invenci´ on se extiende al nuevo complejo de levadura obtenido caracterizado por su naturaleza y por la composici´on de los microorganismos que contiene. La invenci´on apunta igualmente a un procedimiento de fabricaci´ on de un nuevo complemento alimentario en particular para la alimentaci´on animal a partir de dicho complejo de levadura, as´ı como al nuevo complemento alimentario obtenido, que se caracteriza por una composici´on f´ısicoqu´ımica y microbiana nueva. Ya se han sembrado lactosueros por medio de levaduras, en particular levadura Kluyveromyces fragilis, para fabricar prote´ınas unicelulares (P.O.U.) utilizables como producto alimentario. Por lo dem´as, se conocen complejos de levadura l´ acticos que se obtienen por fermentaci´on de una leche a partir de un fermento constituido por semillas o granos de kefir lacteado que contiene en una matriz polisacar´ıdica una simbiosis de levaduras lactosa+ y de diversas bacterias (patente EPA-346.884). Los complejos de levadura de este tipo se han fabricado hasta el presente utilizando leche y por medio de granos de kefir que s´ olo presentan, como levaduras, levaduras lactosa+ que tienen la propiedad de descomponer la lactosa de la leche por medio de doble fermentaci´on. Este complejo de levadura permite fabricar una bebida l´ıquida, burbujeante y ligeramente alcoh´ olica: el kefir, que es bien conocido en la Europa del Norte y en los pa´ıses del Este y que posee un sabor ligeramente agrio, ´acido y de un car´ acter inestable en el tiempo (conservaci´on m´ axima: 4 d´ıas a +4 ◦ C). La presente invenci´on se propone proporcionar un nuevo complejo de levadura l´ actico adaptado para fabricar un complemento alimentario, especialmente para la alimentaci´on animal, del tipo lactosuero fermentado, capaz de mejorar la digestibilidad de los nutrimientos, de desarrollar un efecto protector del sistema digestivo y de presentar un efecto exhaustor del sabor. Otro objetivo de la invenci´on es proporcionar un nuevo complejo de levadura que permita fabricar un complemento alimentario l´ıquido que sea estable en el tiempo y que pueda ser utilizado por s´ı mismo bajo forma l´ıquida, concentrado o no, o liofilizado bajo forma de polvo. Otro objetivo es fabricar un complemento alimentario rico en vitaminas B, en particular en olico (B9 ) (factoacido or´ ´ otico (B13 ) y en a´cido f´ res de crecimiento). El procedimiento de fabricaci´ on del complejo de levadura l´ actico seg´ un la invenci´ on es del tipo que consiste en hacer fermentar un lactosuero en presencia de un fermento l´actico mixto que contiene una simbiosis de levaduras y de bacterias; el procedimiento seg´ un la presente invenci´ on se caracteriza porque: - el fermento utilizado comprende una matriz polisacar´ıdica que engloba, por una parte, 2

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por lo menos dos levaduras: levadura del g´enero Pichia especie membranaefa- ciens y levadura del g´enero Candida especie pseudotropicalis y, por otra parte, por lo menos las dos bacterias siguientes: bacteria del g´enero Lactococcus especie lactis, bacteria del g´enero Lactobacillus especie fermentum, - el lactosuero que contiene al fermento se somete a una primera fermentaci´on a una temperatura sensiblemente comprendida entre 26 ◦ C y 35 ◦ C durante un tiempo sensiblemente comprendido entre 16 horas y 25 horas, - el producto obtenido se somete a una segunda fermentaci´ on a una temperatura sensiblemente comprendida entre 21 ◦ C y 28 ◦ C durante un tiempo sensiblemente comprendido entre 24 y 48 horas. Preferentemente, se utiliza un fermento que contiene los microorganismos siguientes:

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· levadura del g´enero Pichia especie membranaefaciens, · levadura del g´enero Candida especie pseudotropicalis,

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· bacterias del g´enero Lactococcus especie lactis subespecie lactis, · bacterias del g´enero Lactococcus especie raffinolactis,

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· bacterias del g´enero Lactococcus especie lactis, subespecie diacetylactis, · bacterias del g´enero Lactobacillus especie fermentum,

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· bacterias del g´enero Bifidobacterium, · bacterias del g´enero Acetobacter, · bacterias del g´enero Leuconostoc.

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La matriz polisacar´ıdica es ventajosamente a base de glucosa y de galactosa. Es posible utilizar un fermento previamente preparado a partir de cultivos de los microorganismos antes indicados. Es igualmente posible utilizar como fermento un producto natural que es un subproducto de la leche cuajada: este subproducto, que constituye otro tipo de granos de kefir lacteado (de la misma familia que el fermento conocido indicado) no se ha utilizado jam´ as como fermento; se diferencia de forma esencial del fermento conocido ya utilizado, por su composici´ on microbiana espec´ıfica que corresponde a la simbiosis descrita anteriormente: levaduras Pichia membranaefaciens, Candida pseudotropicalis y de bacterias Lactococcus lactis y raffinolactis, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium, Acetobacter y Leuconostoc. Es igualmente posible utilizar como fermento un producto natural que es un subproducto de fermentaci´on de ciertos l´ıquidos azucarados, designado por “granos de kefir azucarado” (a veces “tibi”); este producto se caracteriza por una composici´ on microbiana an´aloga a la del kefir lacteado mencionado anteriormente.

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La originalidad del procedimiento de fabricaci´on de complejo de levadura seg´ un la invenci´ on se sit´ ua pues a tres niveles: por una parte, la utilizaci´on de un lactosuero, por otra parte, la utilizaci´on de un fermento de composici´ on microbiana espec´ıfica, diferente de los fermentos utilizados en los procedimientos conocidos (en particular por la presencia de las levaduras Pichia membranaefaciens y Candida pseudotropicalis), y finalmente el modo de fermentaci´ on que consiste en realizar una doble fermentaci´ on a temperaturas espec´ıficas. El complejo de levadura as´ı obtenido se diferencia radicalmente de los complejos de levadura conocidos y permite, como se ver´a posteriormente, la fabricaci´ on de un complemento alimentario que tiene caracter´ısticas fisicoqu´ımicas y biol´ ogicas nuevas, totalmente diferentes de las caracter´ısticas de los complementos conocidos. Seg´ un un modo de realizaci´ on preferido del procedimiento de fabricaci´ on del complejo de levadura seg´ un la invenci´ on, el fermento mixto antes definido se mezcla con el lactosuero de forma que la mezcla, al principio de la fermentaci´ on, contenga: · entre 105 y 106 g´ermenes de levadura Pichia membranaefaciens por mililitro de lactosuero, · entre 104 y 105 g´ermenes de levadura Candida pseudotropicalis por mililitro de lactosuero,

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sirve para fabricar luego el complemento alimentario. Es igualmente posible, y ello se prefiere por razones de rentabilidad industrial, separar al final de la doble fermentaci´ on la fase l´ıquida y la fase s´olida; la fase s´ olida puede as´ı reciclarse para un nuevo ciclo de fabricaci´ on de complejo de levadura, mientras que la fase l´ıquida puede estabilizarse por congelaci´on o liofilizaci´on y envasarse para ser utilizada posteriormente como complejo de levadura en la fabricaci´ on del complemento alimentario. Debe observarse que la liofilizaci´on mencionada anteriormente se refiere al complejo de levadura (y, por lo tanto, a peque˜ nas cantidades de productos) y no sobrecarga los costes de explotaci´ on. La invenci´on se extiende al nuevo complejo de levadura l´ actico fabricado por medio del procedimiento definido anteriormente; este complejo de levadura se caracteriza por la presencia en un lactosuero: · de polisac´aridos en disoluci´ on, de concentraci´on comprendida entre 0,05 y 0,1 g por gramo de medio,

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· entre 107 y 108 bacterias Lactococcus por mililitro de lactosuero, · y entre 104 y 107 bacterias Lactobacillus por mililitro de lactosuero. En el caso de que el fermento utilizado consista en granos de kefir lacteado o azucarado del tipo citado anteriormente, estas cantidades de g´ermenes corresponden sensiblemente a una concentraci´on de granos de kefir comprendida entre 40 g y 80 g por litro de lactosuero. Por lo dem´ as, los experimentos efectuados han demostrado que, en el procedimiento de la invenci´on, las condiciones ´optimas de la doble fermentaci´on eran las siguientes: primera fermentaci´on a una temperatura sensiblemente igual a 30 ◦ C durante un tiempo sensiblemente igual a 20 horas, segunda fermentaci´ on a una temperatura sensiblemente igual a 25 ◦ C durante un tiempo sensiblemente igual a 36 horas (por “sensiblemente igual” se entiende una igualdad aproximada en +5 %). Estas condiciones favorecen el desarrollo en el lactosuero de los microorganismos deseados, a saber: levadura Candida pseudotropicalis, Pichia membranaefaciens, bacterias del tipo lactococo. El procedimiento de fabricaci´ on del complejo de levadura previsto es compatible con el empleo de cualquier tipo de lactosuero (dulce, a´cido, mixto o permeato); se preferir´ a utilizar un lactosuero que contenga entre 40 g y 52 g de lactosa por litro y que presente un pH comprendido entre 4,3 y 5. Al final de la doble fermentaci´ on, la fase s´olida puede dejarse in situ en la fase l´ıquida, constituyendo el conjunto el complejo de levadura que

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· de levadura Candida pseudotropicalis en una cantidad comprendida entre 106 y 107 g´ermenes por gramo de medio, · de levadura Pichia membranaefaciens, en una cantidad comprendida entre 104 y 106 g´ermenes por gramo de medio, · de bacterias Lactococcus, en una cantidad comprendida entre 107 y 109 bacterias por gramo de medio, · y de bacterias Lactobacillus, en una cantidad comprendida entre 105 y 107 bacterias por gramo de medio.

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Adem´as de estos g´ermenes esenciales, el complejo de levadura seg´ un la invenci´on puede contener igualmente los g´ermenes siguientes (en particular cuando se fabrica a partir de granos de kefir naturales del tipo citado anteriormente) bacterias Bifidobacterium entre 103 y 105 por gramo de medio, bacterias Acetobacter entre 103 y 105 por gramo, bacterias Leuconostoc entre 103 y 105 por gramo. Por lo que se refiere a las relaciones entre los diferentes g´ermenes, los an´alisis microbiol´ ogicos han demostrado que el complejo de levadura de la invenci´on se caracteriza por: · una relaci´on del n´ umero de g´ermenes de la levadura del g´enero Candida al n´ umero de g´ermenes de las otras levaduras comprendida entre 20 y 60, · una relaci´on del n´ umero de bacterias bajo forma de cocos (Lactococcus, Acetobac- ter, Leuconostoc) al n´ umero de bacterias bajo forma de bacilo (Lactobacillus, Bifido- bacterium) comprendida entre 150 y 250. Por lo dem´as, el complejo de levadura se caracteriza igualmente por un pH sensiblemente comprendido entre 3,2 y 3,8 y por la composici´ on fisicoqu´ımica siguiente: 3

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· y de bacterias Lactobacillus fermentum, en una cantidad comprendida entre 105 y 106 bacterias por gramo.

· presencia de polisac´aridos en disoluci´ on constituidos por glucosa y galactosa, en porcentaje relativo comprendido entre 0,6 y 1 g de glucosa por g de galactosa, · presencia de ´acido or´ otico (vitamina B13 ) en proporci´ on comprendida entre 20 y 70 mg por litro de medio. La invenci´on se extiende a la fabricaci´on de un complemento alimentario del tipo lactosuero fermentado, a partir del complejo de levadura anteriormente definido. Esta fabricaci´ on consiste en someter un lactosuero a una doble fermentaci´on y se caracteriza por la utilizaci´on de un complejo de levadura del tipo antes citado, en particular en proporci´ on ponderal con respecto al lactosuero comprendida entre 1 % y 4 %, y por las condiciones espec´ıficas de la doble fermentaci´on que son las siguientes: - primera fermentaci´ on a una temperatura sensiblemente comprendida entre 26 ◦ C y 35 ◦ C, en particular sensiblemente igual a 30 ◦ C, durante un tiempo sensiblemente comprendido entre 24 y 72 horas, en particular sensiblemente igual a 48 horas, - segunda fermentaci´on a una temperatura sensiblemente comprendida entre 21 ◦ C y 28 ◦ C inferior a la primera, en particular sensiblemente igual a 25 ◦ C, durante un tiempo sensiblemente comprendido entre 48 y 96 horas, en particular sensiblemente igual a 72 horas. Tal procedimiento conduce a un complemento alimentario l´ıquido, aromatizado, que es estable en el tiempo: esta rigurosa estabilidad procede de un pH comprendido entre 3,2 y 3,8. Este complemento posee las propiedades siguientes: factor que favorece la digestibilidad de los nutrimentos, exhaustor de sabor, factor de protecci´ on de la flora intestinal. Este complemento alimentario puede, en su caso, ser concentrado, liofilizado o atomizado para ser posteriormente reconstituido: conserva todas sus propiedades despu´es de la reconstituci´ on. Preferentemente, se utiliza un lactosuero que comprende entre 55 y 65 g/l de extracto seco y entre 40 y 52 g/l de lactosa y que presenta un pH comprendido entre 4,3 y 5. El complemento alimentario seg´ un la invenci´on se caracteriza por la presencia en el lactosuero: · de polisac´aridos en disoluci´ on, de concentraci´on comprendida entre 0,01 y 0,05 g por gramo de medio, · de levadura Candida pseudotropicalis en una cantidad comprendida entre 106 y 108 g´ermenes por gramo,

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Adem´as, seg´ un el complejo de levadura utilizado y, especialmente si se utiliza el complejo de levadura ya descrito fabricado a partir de granos de kefir natural, el complemento alimentario de la invenci´on contiene igualmente las bacterias siguientes: Bifidobac- terium entre 103 y 105 por gramo de medio, Acetobacter entre 103 y 105 por gramo, Leuconostoc entre 103 y 104 por gramo. Por lo que se refiere a la acidez, el complemento seg´ un la invenci´ on se caracteriza por un pH sensiblemente comprendido entre 3,4 y 4. El an´ alisis fisicoqu´ımico ha permitido hacer evidente la riqueza vitam´ınica de este complemento que se caracteriza por la presencia: · de polisac´aridos en disoluci´ on constituidos por glucosa y galactosa en porcentaje relativo comprendido entre 0,6 y 1 g de glucosa por g de galactosa, · de a´cido or´ otico (vitamina B13 ) en proporci´ on comprendida entre 30 y 240 mg por litro de producto (30 a 80 mg para el producto directamente obtenido, hasta 240 mg para un producto concentrado), on · de ´acido f´ olico (vitamina B9 ) en proporci´ comprendida entre 0,20 y 1,5 mg por litro de producto (0,20 a 0,50 mg para el producto directamente obtenido; hasta 1,5 mg para un producto concentrado), · de vitaminas B1 , B2 , B5 , B6 y PP, en proporci´ on global comprendida entre 5 y 60 mg por litro de producto (5 a 20 mg para el producto directamente obtenido; hasta 60 mg para un producto concentrado). La descripci´on que sigue proporciona, a t´ıtulo de ilustraci´ on, un ejemplo de fabricaci´ on de un complejo de levadura seg´ un la invenci´ on y de un complementario para animales, obtenido a partir de aqu´el, con sus caracter´ısticas biol´ ogicas, fisicoqu´ımicas y zoot´ecnicas. Los an´alisis microbiol´ ogicos se han efectuado, en estos ejemplos, por medio de los m´etodos siguientes: Medio de aislamiento y de purificaci´ on: - an´ alisis de las levaduras en medio Sabouraud + Gentamicina y medio de P.D.A. y cuenteo por diluci´ on, - an´ alisis de las bacterias en medio MRS, medio M17 , medio Elliker, medio M.S.E. + ´arido y medio P.C.A. y cuenteo por diluci´ on.

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Galer´ıas de identificaci´ on (API):

· de levadura Pichia membranaefaciens, en una cantidad comprendida entre 104 y 105 g´ermenes por gramo, y · de bacterias Lactococcus lactis y raffinolactis, en una cantidad global comprendida entre 107 y 109 bacterias por gramo,

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- API 50 CHL 65

- API 20 C - API 20 NE medio - API 20 E

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Los an´alisis f´ısico qu´ımicos se han efectuado por medio de los m´etodos siguientes: - an´ alisis de los constituyentes del lactosuero por medio de “MILKO-SCAN 104 ”,

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- an´ alisis de los az´ ucares por espectrometr´ıa y cromatograf´ıa, - an´ alisis de las viscosidades por medio del m´etodo de Broockfield,

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- definici´ on del pH por medio de un pHmetro de tipo cl´ asico, - an´ alisis de las vitaminas por m´etodos enzim´aticos y cromatogr´aficos tradicionales. Ejemplo 1 Fabricaci´ on de un complejo de levadura seg´ un la invenci´ on Fermento utilizado El fermento utilizado est´a constituido por granos de kefir natural, subproducto de una leche cuajada, originario de Extremo Oriente, producto que ha sido importado en FRANCIA al principio de los a˜ nos 60; estos granos de kefir transmitidos de mano en mano se han utilizado hasta ahora mezclados emp´ıricamente a la leche para dar una bebida que tendr´ıa ciertas virtudes particulares (revitalizantes). Estos granos de kefir se presentan bajo la forma de una especie de coliflor blancuzca en tama˜ nos que var´ıan entre uno y algunos cent´ımetros. El an´ alisis microbiol´ ogico de estos granos de kefir ha dado los resultados siguientes por gramo de kefir (valor medio): · levadura Pichia membranaefaciens: 2.106 g´ermenes,

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· bacterias Lactococcus lactis diacetylactis: 2.106 bacterias,

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· 7.103 Acetobacter 50

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· bacterias Acetobacter: 104 bacterias, · bacterias Leuconostocs mesenterodes: 2.104 bacterias, · bacterias Lactobacillus casei (densidad menor no descontada).

· 15.105 Lactobacillus, · 104 Bifidobacterium,

· bacterias Lactobacillus fermentum: 4.106 bacterias, · bacterias Bifidobacterium: 104 bacterias,

· 4.105 Pichia membranaefaciens, · 2.108 Lactococcus,

· bacterias Lactococcus lactis lactis : 2.108 bacterias, · bacterias Lactococcus raffinolactis: bacterias,

La cepa de levadura Pichia membranaefaciens ha sido depositada, en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) del Institut Pasteur, el 17.11.88, bajo el n◦ I-817. Lactosuero utilizado El lactosuero utilizado es lactosuero ´acido pasteurizado a 90o/95 ◦ C durante 30 minutos, con la composici´ on siguiente: 59 g/kg + 1 g de materia seca, 1 g/kg de materia grasa, 44 g/kg + 1 g de lactosa y 1,4 g/kg de prote´ınas. El pH de este lactosuero es de 4,3. Fabricaci´ on del complejo de levadura Un recipiente del tipo Erlen Meyer de 0,5 litro con este lactosuero bajo agitaci´on en vaiv´en (80 oscilaciones/minuto) se ha regulado a una temperatura de 30 ◦ C + 0,5 ◦ C. Se ha efectuado una siembra por medio del fermento descrito anteriormente, a raz´on de 50 g de fermento por litro de lactosuero. El producto se ha dejado a 30 ◦ C en el recipiente durante 20 horas bajo agitaci´ on continua. Los controles de pH cada dos horas muestran que el pH, igual inicialmente a 4,3, baja regularmente hasta un valor final de 3,8 al cabo de las 20 horas. Luego el producto se enfr´ıa en menos de 30 mn hasta 25 ◦ C y se deja 36 horas a esta temperatura bajo agitaci´on continua para una nueva fermentaci´ on: el pH final es de 3,4. La fracci´on l´ıquida se extrae as´epticamente del recipiente. Se liofiliza por medio de un procedimiento tradicional, con un aparato “S´erail” on de vac´ıo y subli(congelaci´on a -40 ◦ C, formaci´ maci´on). Complejo de levadura obtenido Antes de la liofilizaci´ on, el complejo de levadura as´ı fabricado se ha analizado y se han obtenido los resultados siguientes (n´ umero de g´ermenes por g, valor medio): · 6.105 Candida pseudotropicalis,

· levadura Candida pseudotropicalis: 105 g´ermenes, · otras levaduras lactosa+ (- densidad menor no descontada),

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· 8.103 Leuconostoc. Despu´es de la liofilizaci´on, se constata una p´erdida de 50 %. Adem´as, el complejo de levadura antes de liofilizaci´ on presenta una concentraci´ on de polisac´aridos en disoluci´ on de 0,03 g por gramo de complejo de levadura; estos polisac´ aridos comprenden glucosa y galactosa en un porcentaje relativo igual a 0,8 g de glucosa por g de galactosa. Adem´as, el complejo de levadura comprende 71 mg de ´acido or´ otico por litro. Ejemplo 2 Fabricaci´ on de un complemento alimentario s´ olido para la alimentaci´ on animal, a partir del complejo de levadura antes citado El lactosuero a´cido utilizado para esta preparaci´on es el mismo que el utilizado para la fabricaci´on del complejo de levadura. 5

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Este lactosuero se introduce en una cuba de maduraci´ on ultralimpia (600 litros) tipo “GOAVEC” regulada a una temperatura de 30 ◦ C + 0,5 ◦ C. La siembra por medio del complejo de levadura liofilizado se realiza en directo con la ayuda de una bomba “MOUVEX S4”, a raz´ on de 2 % en peso, bajo agitaci´ on de 10 r/mn durante el llenado. El producto se deja a 30 ◦ C en la cuba de maduraci´ on durante 48 horas. El pH al cabo de 48 horas es de 3,9. El lactosuero, que ha sufrido esta primera fermentaci´on, se enfr´ıa a 25 ◦ C y se deja a esta temperatura durante 72 horas para sufrir una segunda fermentaci´on; su pH final es de 3,65. Luego el producto se extrae por medio de una bomba positiva de tipo “MOUVEX S4” a velocidad de rotaci´ on lenta y con caudal regulado. El producto se envasa en contenedor de 100 l. Luego se reduce a polvo por atomizaci´ on en condiciones tradicionales. Producto obtenido El producto obtenido realizado a partir del complejo de levadura citado anteriormente, se presenta as´ı, antes de la atomizaci´on:

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- consistencia l´ıquida, - aspecto homog´eneo,

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- ausencia de decantaci´on y de burbujeo, - olor aromatizado. Sus caracter´ısticas son las siguientes:

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- viscosidad a J + 1: 2.500 centipoises, - pH a J + 1: 3,65, - contaje a J + 1 (g´ermenes por g):

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· Candida pseudotropicalis: 106 , · Pichia membranaefaciens: 104 , · Lactococcus lactis y raffinolactis: 108 ,

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· Lactobacillus fermentum: 106 , · Bifidobacterium: 104 , · Acetobacter: 104 ,

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· Leuconostoc: 5.10 , 3

- concentraci´on de a´cido or´ otico: 70 mg/l, - concentraci´on de a´cido f´ olico: 0,35 mg/l, - concentraci´on global de vitaminas B1 , B2 , B5 , B6 y PP: 12 mg/l (cada una de estas vitaminas se ha identificado por medio del an´ alisis),

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- concentraci´on de polisac´arido: 0,03 g/l. Despu´es de atomizaci´on (procedimiento de granulometr´ıa inferior o igual a 180 micras, colo-

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raci´on crema), se constata una p´erdida de menos de 6 % en vitaminas, ´acido f´ olico y a´cido or´ otico; la p´erdida en microorganismos es del orden de 50 %. El polvo obtenido se presta a una compactaci´on para realizar granulados. Se han efectuado ensayos de adici´ on del producto en polvo a una alimentaci´on a base de cereales en un lote de gallinas ponedoras (un lote tratado de 5.200 gallinas y un lote testigo de igual n´ umero, de una edad de 22 semanas). Desde la semana 22 hasta la semana 37, cada gallina de un lote ha recibido 0,5 g por d´ıa del aditivo citado anteriormente. Desde la semana 38 a la semana 62, esta cantidad se ha llevado a 1 g por d´ıa. Se ha constatado que las gallinas del lote que ha recibido el complemento alimentario de la invenci´on han producido 13 % m´ as huevos que las gallinas del lote testigo, siendo el peso de los huevos de las gallinas tratadas superior en 2,3 % con respecto a los del lote testigo, mientras que el porcentaje de huevos defectuosos hab´ıa disminuido en 34 %. Adem´as, el porcentaje de mortalidad de las gallinas hab´ıa disminuido en 54 % con respecto al lote testigo. A la semana 62, las gallinas del lote tratado pesaban como media 10 % m´ as que las del lote testigo. Ejemplo 3 Fabricaci´ on de un complemento alimentario concentrado l´ıquido a partir del complejo de levadura citado anteriormente El producto l´ıquido fabricado en el ejemplo 2 se concentra con la ayuda de un evaporador bajo vac´ıo en capa delgada centrifugada (“EVAPOR tipo CEP1”) a una temperatura de 25 ◦ C. Se concentra de forma que se reduzca su volumen en dos tercios. Luego el producto se envasa en contenedor de 25 l. Despu´es de la concentraci´on, el producto se presenta bajo la forma de un l´ıquido viscoso, de viscosidad igual a 6.200 centipoises, de pH 3,8. No se constata p´erdida alguna de vitamina con respecto al producto antes de la concentraci´ on (menos del 2 %); la p´erdida de microorganismos es del orden del 10 %. Este producto puede utilizarse como complemento, en particular en una proporci´ on de aproximadamente 2 %, en un medio l´ıquido para la alimentaci´on animal. Ejemplo 4 Fabricaci´ on de un complemento alimentario concentrado a partir del complejo de levadura citado anteriormente El producto l´ıquido fabricado en el ejemplo 2 es pasteurizado a 95 ◦ C durante 5 minutos para inactivar sus microorganismos. Luego es atomizado seg´ un el ejemplo 2 o concentrado seg´ un el ejemplo 3 a fin de constituir un complemento alimentario bajo forma de polvo o de l´ıquido concentrado, rico en vitaminas B pero exento de microorganismos vivos; en ciertas aplicaciones, se evita as´ı una evoluci´ on del alimento por fermentaciones indeseables.

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· bacterias del g´enero Bifidobacterium,

REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de fabricaci´on de un nuevo complejo de levadura l´ actico, del tipo que consiste en hacer fermentar un lactosuero en presencia de un fermento l´ actico mixto que contiene una simbiosis de levaduras y de bacterias, caracterizado porque: - el fermento utilizado comprende una matriz polisacar´ıdica que engloba, por una parte, por lo menos dos levaduras: levadura del g´enero Pichia especie membranaefaciens y levadura del g´enero Candida especie pseudotropicalis y, por otra parte, por lo menos las dos bacterias siguientes: bacteria del g´enero Lactococcus especie lactis, bacteria del g´enero Lactobacillus especie fermentum, - el lactosuero que contiene al fermento se somete a una primera fermentaci´on a una temperatura sensiblemente comprendida entre 26 ◦ C y 35 ◦ C durante un tiempo sensiblemente comprendido entre 16 horas y 25 horas, - el producto obtenido se somete a una segunda fermentaci´ on a una temperatura sensiblemente comprendida entre 21 ◦ C y 28 ◦ C durante un tiempo sensiblemente comprendido entre 24 y 48 horas. 2. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque el fermento se mezcla con el lactosuero de forma que la mezcla, al principio de la fermentaci´on, contenga:

· bacterias del g´enero Acetobacter, 5

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· entre 105 y 106 g´ermenes de levadura Pichia membranaefaciens por mililitro de lactosuero, · entre 104 y 105 g´ermenes de levadura Candida pseudotropicalis por mililitro de lactosuero, · entre 107 y 108 bacterias Lactococcus por mililitro de lactosuero,

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· y entre 105 y 107 bacterias Lactobacillus por mililitro de lactosuero. 3. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se utiliza un fermento que contiene una simbiosis de: · levadura del g´enero Pichia especie membranaefaciens, · levadura del g´enero Candida especie pseudotropicalis, · bacterias del g´enero Lactococcus especie lactis subespecie lactis,

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· bacterias del g´enero Lactococcus especie raffinolactis, · bacterias del g´enero Lactococcus especie lactis, subespecie diacetylactis, · bacterias del g´enero Lactobacillus especie fermentum,

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· bacterias del g´enero Leuconostoc. 4. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizado porque se utiliza un fermento cuya matriz polisacar´ıdica es a base de glucosa y de galactosa. 5. Procedimiento seg´ un las reivindicaciones 3 y 4, tomadas conjuntamente, caracterizado porque se utilizan como fermento granos de kefir lacteado o azucarado del tipo que contiene en una matriz polisacar´ıdica una simbiosis de levaduras Pichia membranaefaciens y Candida pseudotropicalis y de bacterias Lactococcus lactis y raffinolactis, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium, Acetobacter y Leuconostoc. 6. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 5, caracterizado porque se mezcla con el lactosuero una cantidad de granos de kefir comprendida entre 40 g y 80 g por litro. 7. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el lactosuero que contiene al fermento se somete a una primera fermentaci´on a una temperatura sensiblemente igual a 30 ◦ C durante un tiempo sensiblemente igual a 20 horas y a una segunda fermentaci´on a una temperatura sensiblemente igual a 25 ◦ C durante un tiempo sensiblemente igual a 36 horas. 8. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utiliza un lactosuero que contiene entre 40 g y 52 g de lactosa por litro y que presenta un pH comprendido entre 4,3 y 5. 9. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al final de la doble fermentaci´on se separa la fase l´ıquida y la fase s´olida, siendo reciclada esta u ´ ltima para un nuevo ciclo de fabricaci´ on, mientras que la fase l´ıquida es estabilizada y envasada para constituir el complejo de levadura. 10. Complejo de levadura l´ actico fabricado por el procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por la presencia en el lactosuero: · de polisac´aridos en disoluci´ on, de concentraci´on comprendida entre 0,05 y 0,1 g por gramo de medio, · de levadura Candida pseudotropicalis en una cantidad comprendida entre 106 y 107 g´ermenes por gramo de medio, · de levadura Pichia membranaefaciens, en una cantidad comprendida entre 104 y 106 g´ermenes por gramo de medio, · de bacterias Lactococcus en una cantidad comprendida entre 107 y 109 bacterias por gramo,

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· y de bacterias Lactobacillus, en una cantidad comprendida entre 105 y 107 bacterias por gramo. 7

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11. Complejo de levadura l´ actico seg´ un la reivindicaci´on 10, caracterizado porque contiene igualmente las bacterias siguientes: Bifidobacterium entre 103 y 105 por gramo del medio, Acetobacter entre 103 y 105 por gramo, Leuconostoc entre 103 y 105 por gramo. 12. Complejo de levadura l´ actico seg´ un una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque: · la relaci´ on del n´ umero de g´ermenes de la levadura del g´enero Candida al n´ umero de g´ermenes de las otras levaduras est´ a comprendida entre 20 y 60, · la relaci´ on del n´ umero de bacterias bajo forma de cocos (Lactococcus, Acetobacter, Leuconostoc) al n´ umero de bacterias bajo forma de bacilo (Lactobacillus, Bifidobacterium) est´a comprendida entre 150 y 250. 13. Complejo de levaduras seg´ un una de las reivindicaciones 10, 11 o 12, caracterizado por un pH sensiblemente comprendido entre 3,2 y 3,8 y por la presencia: · de polisac´aridos en disoluci´ on constituidos por glucosa y galactosa en porcentaje relativo comprendido entre 0,6 y 1 g de glucosa por g de galactosa, · de a´cido or´ otico en proporci´ on comprendida entre 20 y 70 mg por litro de medio. 14. Procedimiento de fabricaci´on de un nuevo complemento alimentario del tipo lactosuero fermentado, que consiste en someter un lactosuero a una doble fermentaci´ on en presencia de un complejo de levadura l´ actico, caracterizado porque:

16. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado porque 5

· la primera fermentaci´ on se realiza a una temperatura sensiblemente igual a 30 ◦ C, durante un tiempo sensiblemente igual a 48 horas,

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· la segunda fermentaci´on se realiza inmediatamente despu´es de la primera a una temperatura sensiblemente igual a 25 ◦ C, durante un tiempo sensiblemente igual a 72 horas.

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- se utiliza un complejo de levadura l´ actico seg´ un una de las reivindicaciones 10 a 13,

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- el lactosuero que contiene a dicho complejo de levadura se somete a una primera fermentaci´ on a una temperatura sensiblemente comprendida entre 26 ◦ C y 35 ◦ C durante un tiempo sensiblemente comprendido entre 24 horas y 72 horas,

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- el producto obtenido se somete a una segunda fermentaci´ on a una temperatura inferior a la primera, sensiblemente comprendida entre 21 ◦ C y 28 ◦ C durante un tiempo sensiblemente comprendido entre 48 y 96 horas. 15. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 14, caracterizado porque se mezcla con el lactosuero una proporci´ on ponderal de complejo de levadura con respecto a dicho lactosuero comprendida entre 1 % y 4 %.

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17. Procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 14, 15 o 16, en el cual se utiliza un lactosuero que comprende entre 40 y 52 g de lactosa por litro y entre 55 y 65 g/l de extracto seco, y que presenta un pH comprendido entre 4,3 y 5. 18. Complemento alimentario del tipo lactosuero fermentado, fabricado por medio del procedimiento seg´ un una de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado por la presencia en un lactosuero: · de polisac´aridos en disoluci´ on, de concentraci´on comprendida entre 0,01 y 0,05 g por gramo de medio, · de levadura Candida pseudotropicalis en una cantidad comprendida entre 106 y 108 g´ermenes por gramo, · de levadura Pichia membranaefaciens, en una cantidad comprendida entre 104 y 105 g´ermenes por gramo, · de bacterias Lactococcus lactis y raffinolactis, en una cantidad global comprendida entre 107 y 109 bacterias por gramo, · y de bacterias Lactobacillus fermentum, en una cantidad comprendida entre 105 y 106 bacterias por gramo. 19. Complemento alimentario seg´ un la reivindicaci´on 18, caracterizado porque contiene igualmente las bacterias siguientes: Bifidobacterium entre 103 y 105 por gramo de medio, Acetobacter entre 103 y 105 por gramo, Leuconostoc entre 103 y 104 por gramo. 20. Complemento alimentario seg´ un una de las reivindicaciones 18 o 19, que se caracteriza por un pH sensiblemente comprendido entre 3,4 y 4 y por la presencia: · de polisac´aridos en disoluci´ on constituidos por glucosa y galactosa en porcentaje relativo comprendido entre 0,6 y 1 g de glucosa por g de galactosa, · de a´cido or´ otico en proporci´ on comprendida

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· de vitaminas B1 , B2 , B5 , B6 y PP, en proporci´ on global comprendida entre 5 y 60 mg por litro de producto.

entre 30 y 240 mg por litro de producto, · de a´cido f´ olico en proporci´ on comprendida entre 0,20 y 1,5 mg por litro de producto, 5

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.

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Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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