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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 092 078 kInt. Cl. : C12P 13/08

11 N.◦ de publicaci´ on: 6

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˜ ESPANA

A23K 1/14 C05F 7/00

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 92420249.2 kFecha de presentaci´on : 22.07.92 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 534 865 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 31.03.93

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54 T´ıtulo: Procedimiento de separaci´ on de la lisina bajo la forma de una disoluci´ on acuosa y utilizaci´ on

de esta disoluci´ on para la alimentaci´ on animal.

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73 Titular/es: EUROLYSINE

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72 Inventor/es: Lucq, Pierre y

30 Prioridad: 26.07.91 FR 91 09778

16, rue Ballu F-75009 Paris, FR

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.11.96

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

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16.11.96

Aviso:

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Domont, Christian

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74 Agente: Aguilar Forment, Domenec

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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Un inconveniente importante de este m´etodo reside en el hecho de que es de cara realizaci´on. En efecto:

DESCRIPCION La presente invenci´on se refiere a un procedimiento de separaci´on de la lisina bajo la forma de una disoluci´ on acuosa a partir de un caldo de fermentaci´on. La invenci´on se refiere igualmente a las disoluciones de lisina base susceptibles de ser obtenidas de esta forma y a su utilizaci´ on para la preparaci´ on de composiciones destinadas a la alimentaci´on animal. En los procedimientos de preparaci´on de lisina por fermentaci´on, se conocen esencialmente dos familias de procedimientos de recuperaci´on de la lisina que han sido objeto de un desarrollo industrial. Una primera familia de procedimientos propone la recuperaci´ on de lisina bajo la forma de monoclorhidrato de lisina deshidratado en estado cristalizado. En este caso, es de pr´ actica corriente recuperar la lisina a partir del caldo de fermentaci´on utilizando una resina de intercambio de cationes. Para hacerlo, se procede seg´ un las etapas principales siguientes: 1. Ajuste del pH del caldo de fermentaci´ on del que se han eliminado eventualmente las bacterias, en un intervalo de valores o´ptimos para la adsorci´ on de la lisina sobre la resina por adici´ on de un a´cido, generalmente el ´acido clorh´ıdrico o el ´ acido sulf´ urico. 2. Paso del caldo de fermentaci´ on acidulado sobre una resina de intercambio de cationes que adsorbe la lisina as´ı como una parte de los cationes presentes tales como: amonio, potasio, calcio y amino´acidos derivados de las substancias que se hallan en el caldo de fermentaci´ on o que se forman durante la fermentaci´ on. Estos iones disminuyen la capacidad de adsorci´ on de lisina de las resinas puesto que son adsorbidos sobre ´estas al mismo tiempo que la lisina. Por esta raz´ on, para mejorar la recuperaci´ on de la lisina, se recurre a tecnolog´ıas complejas y caras que utilizan varias columnas rellenas con una resina de intercambio de cationes y dispuestas en serie. Igualmente, para favorecer esta adsorci´ on, se ajusta el pH del caldo de fermentaci´on a pH fuertemente a´cidos, en general inferiores a 4 (cons´ ultese, por ejemplo, la patente francesa n◦ 2567413). Puesto que la fermentaci´ on se conduce de manera general a valores pr´ oximos a la neutralidad, es necesaria una importante cantidad de a´cido para llevar su pH a estos valores. 3. Eluci´ on de la lisina adsorbida sobre la resina por medio de una disoluci´ on alcalina, generalmente de amon´ıaco, y regeneraci´on de la resina. 4. Recuperaci´on de la lisina del eluato bajo forma de cristales de monoclorhidrato de lisina deshidratado por concentraci´ on de la disoluci´ on eluida cuyo pH se ha ajustado previamente a un valor inferior a 6, seguida por la cristalizaci´on y, finalmente, la separaci´on y el secado de los cristales obtenidos. 2

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- es relativamente complejo y necesita numerosas instalaciones, por ejemplo columnas de resinas, - la eluci´on de la lisina necesita importantes cantidades de agua, - son igualmente necesarias importantes cantidades de agua para regenerar la resina,

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- las aguas residuales as´ı producidas, esencialmente durante la eluci´ on de la lisina y la regeneraci´on de la resina que est´an cargadas con materias minerales y/o con diversas materias org´anicas, deben sufrir un tratamiento en estaci´on de depuraci´ on antes de ser reutilizadas o devueltas al medio natural. Por consiguiente, la extracci´on de la lisina seg´ un este primer m´etodo ocasiona un gasto importante de energ´ıa. Adem´as, este procedimiento es igualmente caro debido al consumo importante de reactivos que implica. Una segunda familia de procedimientos propone la recuperaci´ on de lisina bajo la forma de una composici´ on deshidratada que puede comprender igualmente la biomasa y/o los diferentes constituyentes presentes en el medio de fermentaci´on. As´ı, es conocido, por la patente SU-183581, un procedimiento de preparaci´on de L-lisina pura seg´ un el cual: a) la fermentaci´ on se realiza con ´acidos grasos de bajo peso molecular, como fuentes de carbono; b) el caldo de fermentaci´on es hervido y luego liberado de los microorganismos; c) el filtrado es acidulado con HCl a pH 5 y luego tratado con 4-5% de carb´ on activo a 50-55 ◦ C durante treinta minutos con una agitaci´ on constante: esta etapa tiene el objetivo de provocar la decoloraci´ on del filtrado; d) despu´es de filtraci´ on para eliminar el carb´ on activo, se a˜ nade hidr´ oxido de calcio, a fin de eliminar el sulfato de amonio bajo la forma de sulfato de calcio y de hidr´ oxido de amonio, y la sacarosa que queda bajo la forma de sacarosa y calcio;

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e) la disoluci´on se filtra y se concentra por evaporaci´ on: esto tiene por efecto descomponer el hidr´ oxido de amonio en agua y amon´ıaco, siendo destilado entonces este u ´ ltimo; 65

f) debido a la evaporaci´ on, se obtienen disoluciones muy concentradas en L-lisina, que se cristaliza durante el enfriamiento;

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d) recoger la disoluci´ on acuosa que contiene la lisina y que constituye las aguas madres de cristalizaci´on;

g) los cristales se disuelven en una peque˜ na cantidad de agua y luego se precipitan por adici´on de etanol; h) despu´es de filtraci´ on y de secado, se recogen cristales de L-lisina pura. Tal procedimiento es incontestablemente complejo. Adem´ as, estas composiciones deshidratadas conducen a s´ olidos pastosos, que se pegan y que son muy higrosc´ opicos, por lo que son dif´ıcilmente manipulables. Finalmente, la estabilidad al almacenaje de estas composiciones deshidratadas es mediocre. Para resolver estos problemas, se ha propuesto el empleo de aditivos en los mostos de fermentaci´on productora de lisina, lo que permitir´ıa limitar su car´acter higrosc´opico. Esta soluci´ on no es totalmente satisfactoria puesto que exige elevadas cantidades de aditivo y, en consecuencia, conduce a la producci´ on de composiciones deshidratadas con un contenido de lisina relativamente peque˜ no. Igualmente se ha propuesto efectuar la fermentaci´on productora de lisina en condiciones bien definidas. En particular, en la patente franon de cesa n◦ 2541867, se preconiza la utilizaci´ fuente de carbono con elevado contenido de materias fermentables con respecto a la materia seca total, es decir una fuente de carbono que contenga una materia carbonada oxigenada asimilable con una tasa de pureza suficientemente elevada, tal como la glucosa, la sacarosa, los hidrolizados de almid´ on. Un procedimiento de este tipo es relativamente caro de realizaci´on, puesto que excluye el empleo mayoritariamente de fuente de carbono econ´omica, tales como las melazas de remolacha o de ca˜ na de az´ ucar. Adem´ as, necesita un gasto importante de energ´ıa durante la deshidrataci´ on. Por lo dem´as, la deshidrataci´on debe conducirse en condiciones particulares para que el producto final no sea degradado. Este procedimiento es pues relativamente complejo. Un objetivo de la presente invenci´ on es proponer un procedimiento de separaci´ on de la lisina a partir de un caldo de fermentaci´ on que sea a la vez simple, econ´omico y que conduzca a la obtenci´on directa de disoluciones acuosas y concentradas de lisina. Otro objetivo de la invenci´on es la utilizaci´on de tales disoluciones acuosas y concentradas de lisina como aditivo de los alimentos para animales. Seg´ un la invenci´ on, para alcanzar estos objetivos, se prev´e un procedimiento de separaci´ on de la lisina a partir de un caldo de fermentaci´ on que la contiene bajo la forma de una disoluci´ on acuosa, caracterizado porque consiste en: a) ajustar el pH del caldo de fermentaci´ on a un valor comprendido entre 9 y 11; b) cristalizar las sales minerales presentes en el caldo de fermentaci´on por concentraci´on y eventualmente enfriamiento de este caldo; c) separar estas sales minerales del caldo de fermentaci´ on;

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y porque comprende igualmente una etapa cuyo objetivo es eliminar del caldo de fermentaci´on los microorganismos que han determinado la producci´ on de lisina, pudi´endose ejecutar esta etapa o bien antes o bien despu´es de la etapa a) o bien despu´es de la etapa c). El procedimiento presenta la ventaja principal de realizar de forma simult´ anea y simple la eliminaci´on de ciertos constituyentes del caldo de fermentaci´ on, a saber los microorganismos y una gran proporci´ on de las materias minerales, as´ı como la concentraci´on de lisina del medio tratado. Esto permite obtener disoluciones estables con una fuerte concentraci´ on de lisina (comprendida entre el 25 y el 50% en peso). Igualmente, se elimina del caldo de fermentaci´on la biomasa, lo que permite llegar a una disoluci´ on acuosa, concentrada en lisina, que presenta una estabilidad al almacenaje perfectamente satisfactoria. Gracias al procedimiento seg´ un la invenci´on, las disoluciones acuosas y concentradas en lisina que se producen del mismo son particularmente econ´omicas. En efecto: - como aditivo, s´olo es necesaria para su realizaci´on una base tal como NaOH, NH4 OH o KOH - el consumo de agua es particularmente reducido, o incluso nulo - no es necesaria ninguna instalaci´ on espec´ıfica para la realizaci´on de la invenci´ on. En otras palabras, las instalaciones habitualmente utilizadas en fermentaci´on, que comprenden un fermentador equipado con medios de separaci´ on de la biomasa y de las materias minerales, no necesitan ninguna adaptaci´ on compleja para la realizaci´on del procedimiento seg´ un la invenci´ on, - finalmente, debido a su elevado contenido de lisina y a su estabilidad, la explotaci´on y la conservaci´on industriales de las disoluciones seg´ un la invenci´ on son a la vez simples y econ´ omicas. Otra ventaja importante del procedimiento seg´ un la invenci´on reside en el hecho de que no comprende ninguna operaci´ on susceptible de degradar la lisina, tal como la deshidrataci´on que se emplea ampliamente en los procedimientos conocidos. Las composiciones alimentarias que contienen las disoluciones seg´ un la invenci´ on presentan una eficacia, para el crecimiento de los animales, equivalente a la de las composiciones que comprenden clorhidrato de lisina purificado. Adem´as de su estabilidad al almacenaje, la disoluci´ on acuosa y concentrada de lisina obtenida del procedimiento seg´ un la invenci´on posee las propiedades siguientes: 3

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· contenido elevado de lisina base que, a t´ıtulo de ejemplo, expresado como lisina base (lisina bajo la forma libre) es por lo menos igual a 25% en peso cuando la fuente de carbohidrato utilizada para realizar la fermentaci´on es la melaza de remolacha o de ca˜ na de az´ ucar, · una elevada relaci´on en peso de lisina base respecto a materias secas, generalmente por lo menos igual al 35% en peso, · las disoluciones acuosas y concentradas de lisina base seg´ un la invenci´ on son l´ıquidos cuya mezcla con alimentos para animales no presentan ninguna dificultad. Adem´ as, la adici´ on de las disoluciones seg´ un la invenci´on en alimentos compuestos para animales puede realizarse siempre de tal manera que los contenidos de lisina correspondan a la respectiva necesidad de los animales. La operaci´on de separaci´on de la lisina debe conducirse a un pH comprendido entre 9 y 11, puesto que de lo contrario se favorece la precipitaci´ on de la lisina. Seg´ un un modo de realizaci´ on preferido, la separaci´on de la lisina se realiza a partir de un caldo de fermentaci´ on productora de lisina cuyo pH se ha ajustado a un valor comprendido entre 9,5 y 10. En efecto, a estos valores se han alcanzado las concentraciones m´as elevadas de lisina. De manera general, los caldos de fermentaci´on conocidos para producir lisina son adecuados para la invenci´on. Ventajosamente, se eligen los caldos producidos por la fermentaci´ on de una fuente de nitr´ ogeno y de una fuente de carbono con la ayuda de un microorganismo que tenga una fuerte productividad en lisina, perteneciente por ejemplo al g´enero Brevibacterium o Corynebacterium. Preferentemente, como fuente de carbono, se eligen las melazas de remolacha o de ca˜ na de az´ ucar o las fuentes de carbono con elevado contenido de materias fermentables tales como la glucosa, la sacarosa, los hidrolizados de almid´on o una mezcla de dos o varias de las diferentes fuentes de carbono previamente citadas. Cuando la concentraci´ on de fuente de carbono es suficientemente d´ebil, se detiene la fermentaci´on y puede emprenderse la separaci´on de la lisina en disoluci´ on acuosa: puesto que la fermentaci´ on se realiza de manera general a valores de pH pr´ oximos a la neutralidad, la lisina se halla entonces esencialmente en estado de cation monovalente, bajo forma de una sal y de manera general bajo forma de sulfato o de clorhidrato. Seg´ un el modo de realizaci´ on preferido de la invenci´on, en una primera etapa, se eliminan, por ejemplo por ultrafiltraci´ on, microfiltraci´ on, separaci´on centr´ıfuga o filtraci´ on, las materias en suspensi´ on y en particular los microorganismos. Se ajusta luego el pH de la disoluci´ on clarificada a un valor comprendido entre 9 y 11 y,

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preferentemente entre 9,5 y 10, a˜ nadi´endole una base tal como NaOH, KOH y NH4 OH. Ventajosamente, a t´ıtulo de base, se utiliza KOH o NH4 OH o la mezcla de estas dos bases, a fin de producir sales minerales que puedan emplearse en el campo de los piensos. A continuaci´ on, se puede proceder, en una segunda etapa, a la cristalizaci´ on de las sales minerales por concentraci´ on y eventualmente enfriamiento de la disoluci´on clarificada. De manera general, la concentraci´ on se realiza seg´ un t´ecnicas bien conocidas para este tipo de operaci´ on. Las condiciones operatorias de esta concentraci´on se eligen de modo que los compuestos contenidos en la disoluci´on acuosa final no se degraden. Por ejemplo, la concentraci´on puede realizarse con la ayuda de aparatos de evaporaci´ on bajo vac´ıo. En el curso de esta etapa, se eliminan ventajosamente todas las sales cuya solubilidad es inferior a la de la lisina. Entre las sales que pueden eliminarse de esta forma, gracias a la invenci´ on, − + + + se pueden citar SO2− 4 , Cl , Na , K , NH4 . Los cristales de las sales minerales que se forman durante la operaci´ on de concentraci´ on se eliminan, por ejemplo, por centrifugaci´ on o filtraci´ on. Paralelamente con la eliminaci´ on de las sales minerales, se recoge la disoluci´on madre de cristalizaci´on que contiene la lisina. Ejemplo 1 : Preparaci´ on de una disoluci´ on de lisina a partir de un caldo de fermentaci´ on realizado con un hidrolizado de almid´ on (jarabe de alto contenido de glucosa) que comprende 10% en peso de melaza de remolacha y 90% en peso de glucosa, como fuente de carbono. El procedimiento de fermentaci´ on que utiliza un microorganismo productor de lisina y que utiliza como fuente de carbono un hidrolizado de almid´ on (disoluci´ on de glucosa) conduce a la obtenci´on de un mosto de fermentaci´ on que tiene las caracter´ısticas siguientes: lisina base/ materia seca total: Sulfatos: pH:

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El mosto de fermentaci´ on se ha ajustado as´ı a pH 10 por adici´ on de una disoluci´ on de potasa. El mosto ajustado se ha tratado luego por centrifugaci´on para eliminar la biomasa. El mosto as´ı tratado se ha concentrado luego por evaporaci´ on bajo vac´ıo y se ha obtenido una suspensi´on de cristales de sulfato de potasio a 60 ◦ C. La suspensi´on de cristales se ha enfriado a 10 ◦ C en un cristalizador para asegurar un buen agotamiento de las sales minerales. Las sales minerales se han eliminado por centrifugaci´on y se ha obtenido una disoluci´ on de lisina base que tiene las caracter´ısticas siguientes:

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l´ıquido pardo claro densidad: 1,30 pH : 10 contenido de lisina base: 45% composici´on centesimal: - materia seca: - prote´ınas: - materias minerales: iones sulfato de las mismas

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La estabilidad de esta disoluci´ on se ha verificado y la p´erdida de t´ıtulo de lisina es inferior a 1% despu´es de 6 meses de almacenaje en condiciones de temperatura ambiente (variando entre -5 ◦ C y 20 ◦ C). No se ha constatado ninguna alteraci´ on de la calidad bacteriol´ogica ni la aparici´ on de precipitado. Esta disoluci´ on se caracteriza pues por una buena estabilidad en el tiempo, desde todos los puntos de vista. Ejemplo 2 : Preparaci´ on de una disoluci´ on de lisina a partir de un caldo de fermentaci´ on realizado con 100% en peso de melaza de remolacha, como fuente de carbono. Se realiza el mismo tipo de procedimiento de fermentaci´ on pero utilizando la melaza de remolacha como fuente de carbono por parte del microorganismo productor de lisina. El mosto de fermentaci´ on obtenido posee la composici´ on siguiente: -

Lisina base/materia seca total: Sulfatos: Potasio: pH:

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El mosto de fermentaci´ on se ha ajustado luego a pH 9,50 por adici´ on de amon´ıaco. El mosto ajustado se ha tratado luego en una instalaci´ on de microfiltraci´on tangencial a fin de eliminar las bacterias y las materias en suspensi´ on. El mosto as´ı obtenido se ha concentrado por evaporaci´on bajo vac´ıo y luego se ha enfriado a 10 ◦ C a fin de obtener la cristalizaci´ on de una mezcla de sulfato de potasio y de amonio. La separaci´on de los cristales de sales minerales ha conducido a la obtenci´on de una disoluci´ on de lisina base que tiene las caracter´ısticas siguientes: -

l´ıquido pardo fuerte densidad: 1,35 pH: 9,5 contenido de lisina base: 25% composici´on centesimal: - materia seca: - prote´ınas: - materias minerales: iones sulfatos de las mismas:

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Se ha verificado la estabilidad de la disoluci´ on y la p´erdida de t´ıtulo de lisina es inferior a 1% despu´es de 6 meses de almacenaje en condiciones de temperatura ambiente (variando entre -5 ◦ C y 20 ◦ C). No se ha constatado ninguna alteraci´ on de la calidad bacteriol´ogica ni de aparici´ on de precipitado. Esta disoluci´ on est´a pues caracterizada por una buena estabilidad en el tiempo desde todos los puntos de vista.

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REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de separaci´on de lisina, a partir de un caldo de fermentaci´ on que la contiene, bajo la forma de una disoluci´ on acuosa, caracterizado porque consiste en:

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a) ajustar el pH del caldo de fermentaci´ on a un valor comprendido entre 9 y 11; b) cristalizar las sales minerales presentes en el caldo de fermentaci´on por concentraci´ on y eventualmente enfriamiento de este caldo; c) separar estas sales minerales del caldo de fermentaci´ on;

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taci´on se ajusta a un valor comprendido entre 9,5 y 10. 3. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1 o 2, caracterizado porque el pH se ajusta con la ayuda de KOH o NH4 OH. 4. Disoluci´ on de lisina susceptible de ser preparada seg´ un el procedimiento descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5. Disoluci´ on de lisina seg´ un la reivindicaci´ on 4, caracterizada porque posee las propiedades siguientes: - un contenido de lisina base por lo menos igual a 25% en peso,

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d) recoger la disoluci´ on acuosa que contiene la lisina que constituye las aguas madres de cristalizaci´on; 20

y porque presenta igualmente una etapa que est´a destinada a eliminar del caldo de fermentaci´ on los microorganismo que han determinado la producci´ on de lisina, pudi´endose realizar esta etapa ya sea antes ya sea despu´es de la etapa a) ya sea despu´es de la etapa c). 2. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque el pH del caldo de fermen-

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- una relaci´on en peso de lisina base respecto a materias secas totales por lo menos igual a 35% en peso, - un pH comprendido entre 9 y 11. 6. Disoluci´ on de lisina seg´ un la reivindicaci´ on 5, caracterizada porque su pH est´ a comprendido entre 9,5 y 10. 7. La utilizaci´on de una disoluci´ on de lisina seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para la preparaci´ on de una composici´ on destinada a la alimentaci´on animal.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.

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Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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