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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on: 6

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93915178.3 kFecha de presentaci´on : 01.06.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 659 083 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 28.06.1995

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54 T´ıtulo: Prevenci´ on y tratamiento de la neuropat´ıa perif´ erica.

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30 Prioridad: 12.06.1992 US 899070

16.04.1993 US 51191

145 Brandywine Parkway West Chester, PA 19380, US ALBERT EINSTEIN COLLEGE OF MEDICINE OF YESHIVA UNIVERSITY

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72 Inventor/es: Lewis, Michael E.;

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74 Agente: Curell Su˜ nol, Marcelino

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.03.2000

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.03.2000

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73 Titular/es: CEPHALON, INC.

Aviso:

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Apfel, Stuart C. y Kessler, John A.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 140 463 T3 DESCRIPCION Prevenci´on y tratamiento de la neuropat´ıa perif´erica. 5

Antecedentes de la invenci´ on La presente invenci´on se refiere a la utilizaci´on de un factor de crecimiento I de tipo insul´ınico para prevenir o tratar la neuropat´ıa perif´erica.

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El factor de crecimiento I de tipo insul´ınico (IGF-I; somatomedina C) constituye un miembro de una familia de polip´eptidos estructural y funcionalmente relacionados que incluye tambi´en la insulina y los factores de crecimiento II de tipo insul´ınico (IGF-II) y III (IGF-III). Todos estos factores proteicos pueden jugar un papel en el desarrollo y mantenimiento neuronal (Recio-Pinto, E., et al., 1988, Neurochem. as, existen pruebas de que los niveles de IGF-I e IGF-II aumentan sustancialInt. 12:397-414). Adem´ mente durante la regeneraci´on despu´es de la secci´on transversal del nervio ci´ atico (Hansson, H.A., et al., 1986, Acta Physiol. Scand., 126: 609-614). Se ha mostrado que promueven la supervivencia de neuronas simp´aticas y sensitivas (Ishii, D.N. et al., 1987, en: Insulin, IGFs and Their Receptors in the Central Nervous System, eds., Raizada, M.K. et al., Plenum Press, NY, pp. 315-348) y, en el caso de IGF-I, promueven la supervivencia de las neuronas corticales (Aizenman, Y., et al., 1987, Brain Res., 406:3242). Finalmente, estudios tanto in vitro como in vivo han demostrado que IGF-I e IGF-II promueven la supervivencia de las neuronas motoras y el crecimiento en exceso de las neuritas (Caroni, P. et al., 1990, J. Cell Biol., 110: 1307-1317). El documento WO-A-90148338 se refiere a un procedimiento para potenciar la supervivencia de c´elulas neuronales en los mam´ıferos, encontr´andose dichas c´elulas en peligro de muerte a causa de la edad o de varias enfermedades degenerativas. Dicho procedimiento comprende la administraci´ on de IGF-I a dicho mam´ıfero, pero se limita al tejido nervioso del sistema nervioso central. El documento US-A-5068224 da a conocer la utilizaci´on de IGF-I para mejorar la regeneraci´ on de los nervios perif´ericos seccionados, pero no da a conocer ni sugiere la utilizaci´ on de dicho compuesto para reducir la neuropat´ıa perif´erica. La neuropat´ıa perif´erica se refiere generalmente a una alteraci´on que afecta a los nervios perif´ericos, manifest´ andose m´ as a menudo como una disfunci´ on o una combinaci´ on de disfunciones neurales motoras, sensitivas, sensomotoras o auton´omicas. Cada una de la amplia variedad de morfolog´ıas que exhiben las neuropat´ıas perif´ericas puede atribuirse u ´ nicamente a una variedad igualmente amplia de causas. Por ejemplo, las neuropat´ıas perif´ericas pueden adquirirse gen´eticamente, pueden ser producidas por una enfermedad sist´emica,o pueden inducirse mediante un agente t´ oxico. Algunos agentes t´ oxicos que dan lugar a neurotoxicidades son f´ armacos terap´euticos, agentes antineopl´ asicos, contaminantes en bebidas o medicamentos, y sustancias contaminantes ambientales e industriales. En particular, entre los agentes quimioterap´euticos que se sabe que provocan neuropat´ıas sensoriales y/o motoras se incluye la vincristina, un f´ armaco antineopl´asico utilizado para tratar los c´anceres hematol´ ogicos y los sarcomas. La neurotoxicidad se relaciona con la dosis y exhibe movilidad intestinal reducida y neuropat´ıa perif´erica, especialmente en los m´ usculos distales de las manos y pies, hipotensi´ on postural y aton´ıa de la vejiga urinaria. Problemas similares se han documentado con el taxol y el cisplatino (Mollman, J.E., 1990, New England Jour. Med. 322:126-127), aunque la neurotoxicidad relacionada con el cisplatino puede aliviarse con el factor de crecimiento nervioso (NGF) (Apfel, S.C. et al., 1992, Annals of Neurology 31:76-80). Aunque la neurotoxicidad es a veces reversible tras la eliminaci´on del agente neurot´ oxico, la recuperaci´on puede ser un proceso muy lento (Legha, S., 1986, Medical Toxicology 1:421-427; Olesen, et al., 1991, Drug Safety 6:302-314).

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Existen diversas neuropat´ıas perif´ericas heredadas, entre las que se incluyen: la enfermedad de Refsum, la abetalipoproteinemia, la enfermedad de Tangier, la enfermedad de Krabbe, la leucodistrofia metacrom´atica, la enfermedad de Fabry, el s´ındrome de Dejerine-Sottas y otras. De todas las neuropat´ıas heredadas, la m´ as habitual es la de Charcot-Marie-Tooth.

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La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) (tambi´en conocida como atrofia muscular peroneal, o neuropatia sensomotora hereditaria (HMSN) es la enfermedad neurol´ ogica hereditaria m´ as habitual. Se caracteriza por debilidad y atrofia, principalmente de los m´ usculos peroneales, debido a la desmielinizaci´on segmental de los nervios perif´ericos y la degeneraci´on asociada de los axones y c´elulas de las astas medulares anteriores. La herencia autos´omica dominante es habitual, como tambi´en lo son las alteraciones degenerativas del CNS, tales como la ataxia de Friedreich.

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Existen dos formas primarias de enfermedad CMT. Se pens´ o que el tipo I (70 % de los casos) mostraba 2

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desmielinizaci´on como patofisiolog´ıa inicial, pero la implicaci´on cl´ınica distal sugiere una degeneraci´on ax´onica primaria, como en el tipo II. El tipo II (30 % de los casos) es primariamente una degeneraci´on ax´onica sin desmielinizaci´on y puede no ser tan grave como el tipo I. El fallo en la conducci´ on nerviosa est´a a menudo presente en el nacimiento, aunque esto no predice la edad posible del comienzo de la gravedad de la progresi´ on. Existen tambi´en formas muy raras, tipos III y IV, que est´an ligadas recesivamente. Sumario de la invenci´ on

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La presente invenci´on describe un m´etodo para reducir una neuropat´ıa perif´erica que no est´a causada por un nivel anormal de insulina en un mam´ıfero. El m´etodo implica la administraci´on al mam´ıfero de una cantidad del factor -I de crecimiento de tipo insul´ınico (IGF-I) o del factor -III de crecimiento de tipo insul´ınico (IGF-III) que reduce la neuropat´ıa. En varias formas de realizaci´ on preferidas, el mam´ıfero es humano, relacionado con la agricultura, o dom´estico, que desarrolla una neuropat´ıa, por ejemplo como resultado del tratamiento de un neoplasma con un agente quimioterap´eutico. IGF-I o IGF-III pueden administrarse de la forma que se considere efectiva por el experto en la materia; los modos de administraci´ on preferidos son la intravenosa y la inyecci´on subcut´ anea. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresi´on “neuropat´ıa perif´erica” se refiere a una alteraci´on que afecta a un segmento del sistema nervioso perif´erico. La invenci´on implica la utilizaci´on de IGF-I o IGF-III, miembros de la familia insul´ınica de los factores de crecimiento, para reducir una neurotoxicidad que no est´ a causada obvia o directamente por un nivel anormal de insulina que incluye, pero no se limita a, neuropat´ıa sensomotora distal, o a neuropat´ıas auton´omicas, tales como la motilidad reducida del tracto gastrointestinal o la aton´ıa de la vejiga urinaria. Las neuropat´ıas preferidas que pueden ser tratadas eficazmente con IGF-I o IGF-III incluyen las neuropat´ıas asociadas con la enfermedad sist´emica, por ejemplo, s´ındrome post-polio, neuropat´ıas adquiridas gen´eticamente, por ejemplo la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, y neuropat´ıas causadas por un agente t´ oxico, por ejemplo un agente quimioterap´eutico, preferentemente la vincristina.

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En el caso de que el IGF-I o el IGF-III se utilice para tratar una neuropat´ıa inducida por un agente t´ oxico, puede administrarse antes, simult´aneamente o despu´es de la exposici´on al agente t´ oxico, o antes, durante o despu´es de la administraci´ on de un agente quimioterap´eutico. Preferentemente, el IGF-I y el agente quimioterap´eutico se administran cada uno a intervalos efectivos de tiempo, durante un per´ıodo de tratamiento que se solapa. El IGF-I o el IGF-III pueden administrarse al mam´ıfero tras exposici´on al agente neurot´ oxico, o tras quimioterapia, para restaurar por lo menos una parte de la neurofunci´ on destruida por el agente neurot´ oxico o quimioterape´ utico. El agente quimioterap´eutico puede ser cualquiera que produzca neurotoxicidad, preferentemente vincristina, taxol, dideoxiinosina o cisplatino. En un ejemplo preferido, la relaci´ on ponderal de IGF-I o IGF-III (des-(1-3) IGF-I), en relaci´ on a la vincristina se encuentra entre 1:400 y 75:1, preferentemente entre 1:40 y 8:1. Para el caso de que el IGF-I se administre simult´ aneamente con un agente quimioterap´eutico, la invenci´on describe una composici´ on que incluye un IGF-I sustancialmente puro y un agente quimioterap´eutico, en una relaci´ on ponderal de entre 1:400 y 75:1. El agente quimioterap´eutico es preferentemente vincristina, cisplatino, dideoxinosina o taxol. El t´ermino “sustancialmente puro” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a IGF-I o IGF-III los cuales, antes de mezclarlos con otro componente de la composici´on, representan por lo menos el 50 % (en peso) de la prote´ına presente en la preparaci´ on. En formas de realizaci´ on preferidas, por lo menos el 75 %, m´as preferentemente por lo menos el 90 %, y muy preferentemente por lo menos el 99 % (en peso) de la prote´ına presente en la preparaci´ on es IGF-I o IGF-III. Muy preferentemente, el IGF-I o IGF-III utilizado en la composici´on de la invenci´ on es puro tal como se juzga mediante el an´alisis secuencial amino´acido amino terminal. Por la expresi´on “agente t´ oxico” o agente neurot´ oxico debe entenderse una sustancia que a trav´es de su acci´ on qu´ımica, lesiona, impide o inhibe la actividad de un componente del sistema nervioso. La lista de agentes neurot´ oxicos que causan neuropat´ıas es larga, e incluye, pero no se limita a, agentes anti neopl´ asicos tales como vincristina, vinblastina, cisplatino, taxol o compuestos dideoxi, por ejemplo, dideoxinosina; alcohol, metales; toxinas industriales implicadas en la exposici´ on ambiental u ocupacional; contaminantes de los alimentos o de los medicamentos, o sobredosis de vitaminas o f´ armacos terape´ uticos, por ejemplo antibi´ oticos tales como penicilina o cloramfenicol, o megadosis de vitaminas A, D, ´o B6. Una lista extensa, aunque no completa, de compuestos qu´ımicos con efectos secundarios neurot´oxicos, se encuentra en la Tabla 5. Aunque esta lista proporciona ejemplos de compuestos neurot´ oxicos, se expone a t´ıtulo de ejemplo, y en ning´ un caso limitativo, ejemplificar del alcance de la invenci´on. Otros agentes 3

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t´ oxicos pueden causar neuropat´ıas, y pueden caracterizarse mediante m´etodos conocidos por el experto en la materia. Por la expresi´on “exposici´on a un agente t´ oxico” debe entenderse que el agente t´oxico se hace accesible a, o se pone en contacto con, un mam´ıfero de la invenci´on. La exposici´on a un agente t´ oxico puede tener lugar mediante administraci´ on directa, por ejemplo, mediante ingesti´ on o administraci´ on de una comida, medicamento o agente terap´eutico, por ejemplo, un agente quimioterap´eutico, mediante contaminaci´ on accidental o mediante exposici´on ambiental, por ejemplo exposici´on al aire o al agua. Los t´erminos IGF-I y IGF-III incluyen fragmentos o sus an´alogos que exhiben la actividad biol´ogica de la invenci´on, esto es, la capacidad para reducir una neuropat´ıa inducida por un agente t´ oxico. Seguidamente se describen m´etodos para determinar si un fragmento de IGF-I o IGF-III o an´alogos poseen la actividad biol´ ogica de la invenci´ on. Generalmente, los an´alogos apropiados y fragmentos compartir´ an por lo menos una homolog´ıa del 65 % con los IGF-I o IGF-III que se encuentran de modo natural. Los polip´eptidos de los fragmentos de IGF-I o IGF-III son subconjuntos de las mol´eculas de IGF-I o IGFIII (respectivamente), que contienen menos residuos amino´acidos que las mol´eculas nativas. Tal como aqu´ı se utiliza, un fragmento de IGF-I o IGF-III puede tener ordinariamente por lo menos alrededor de 5 amino´ acidos contiguos, y puede tener por lo menos de alrededor de 30-40 amino´ acidos de longitud, y preferentemente alrededor de 50-65 amino´ acidos de longitud. Las secuencias preferidas son de 6-25 amino´ acidos. Una parte de los amino´ acidos del fragmento puede sustituirse con reemplazamientos conservadores o deleciones que mejoran la estabilidad qu´ımica o biol´ ogica de los p´eptidos producto. Preferentemente, no se reemplazan o delecionan m´as del 35 %, y m´as preferentemente no m´as del 20 %, de los residuos amino´ acidos. Los ejemplos siguientes de las secuencias IGF-I preferidas caen dentro del alcance de la invenci´on: 1) IGF-I (55-70) (SEC ID NO:1), descrita en una solicitud de patente transferida en on que est´ a com´ un de Lewis et al. USSN 07/869.913); y 2) Long R3 IGF-I, que es una prote´ına de fusi´ formada por IGF-I humano con un p´eptido de extensi´ on de 13 amino´acidos en el extremo N y la sustituci´ on de Arg por Glu en posici´on 3 (Francis, G.L. et al. 1992) Art to Sci. en Tissue Culture. HyClone Laboratories, Inc. 11. 3-7; GROPEP PTY.LTD. solicitud PCT W089/05822; patente US n◦ 5.164.370; PCT /AU90/00210). Los fragmentos pept´ıdicos aqu´ı listados se incluyen u ´ nicamente a t´ıtulo de ejemplo, y en ning´ un caso limitan el alcance de los fragmentos pept´ıdicos de IGF-I u ´ tiles para la invenci´on. El t´ermino “Homolog´ıa”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la similitud secuencial entre dos mol´eculas polip´eptidas. Cuando una posici´ on en ambas secuencias que se comparan est´a ocupada por id´entica subunidad monom´erica amino´acida, por ejemplo, si una posici´ on en cada una de las mol´eculas polipept´ıdicas est´a ocupada por la lisina, entonces las mol´eculas son hom´ologas en esta posici´on. La homolog´ıa entre dos secuencias es una funci´on del n´ umero de apareamientos o de posiciones hom´ ologas compartidas por ambas secuencias. Por ejemplo, si 6 de las 10 posiciones en dos secuencias coinciden o son hom´ ologas, entonces las dos secuencias son hom´ologas en un 60 %. Por ejemplo, las secuencias amino´acidas LTVSFR y LPVSAT comparten una homolog´ıa del 50 %. Un an´ alogo del IGF-I o del IGF-III puede diferir de un IGF-I o IGF-III que se encuentre naturalmente por diferencias secuenciales amino´acidas conservadoras o mediante modificaciones que no afecten a la secuencia, o por ambas. Entre las modificaciones se incluyen derivatizaci´on qu´ımica de polip´eptidos, por ejemplo acetilaci´on, carboxilaci´ on, glicosilaci´ on o fosforilaci´on; la sustituci´ on o deleci´on de residuos amino´acidos que alteran la afinidad de prote´ınas de uni´ on, pero no alteran sustancialmente la afinidad del receptor y/o alteran la actividad biol´ ogica del polip´eptido; o alteraciones qu´ımicas al polip´eptido que aumentan la estabilidad polip´eptida. A pesar de las morfolog´ıas ampliamente dispares y de las causas atribuidas a las neuropat´ıas perif´ericas in vivo, los solicitantes han emitido la hip´otesis de que el IGF-I puede constituir un medio efectivo de evitar o tratar tales neuropat´ıas en un mam´ıfero, a pesar del hecho de que dichas neuropat´ıas pueden no estar directa u obviamente ligadas a una deficiencia en, o de otro modo nivel anormal de, insulina. Para ilustrarlo, los solicitantes han mostrado que la administraci´ on del IGF-I a animales a los que se proporciona un f´ armaco con efectos secundarios neurot´oxicos, esto es la droga antitumoral vincristina, reduce la neurotoxicidad asociada. Este hallazgo no s´ olo alivia el efecto secundario del neurot´oxico, sino que tambi´en aumenta sustancialmente la utilizaci´on de vincristina como agente antitumoral. La utilizaci´on de vincristina, por otra parte un efectivo quimioterap´eutico, ha estado limitada hasta la fecha por la neurotoxicidad asociada a la misma. Este hallazgo podr´ıa tambi´en aumentar de modo similar la utilizaci´on de otros compuestos limitados por problemas neurotoxicol´ ogicos. La administraci´on conjunta de IGF-I o IGF-III puede hacer disminuir la presencia de dichas neuropat´ıas perif´ericas asociadas. Otras caracter´ısticas y ventajas de la invenci´on se pondr´ an de manifiesto a partir de la siguiente descripci´on de formas de realizaci´ on preferidas y a partir de las reivindicaciones.

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ES 2 140 463 T3 Descripci´ on detallada En primer lugar se describir´ an los dibujos. 5

Dibujos La figura 1 es un gr´ afico de barras que muestra el efecto de rhIGF-I sobre la funci´ on motora tras el tratamiento con vincristina.

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La figura 2 es un gr´ afico de barras que muestra el efecto de rhIGF-I sobre la funci´ on nerviosa tibial tras el tratamiento con vincristina. La figura 3 es un gr´ afico de barras que muestra el efecto de rhIGF-I sobre la funci´ on nerviosa caudal tras el tratamiento con vincristina.

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La figura 4 es un gr´ afico de barras que muestra el efecto del taxol y de rhIGF-1 sobre los estados latentes de los movimientos r´apidos de la cola.

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La figura 5 es un gr´ afico de barras que muestra el efecto del taxol y de rhIGF-1 sobre los estados latentes de las placas calientes. Descripci´ on de la invenci´ on

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A los solicitantes se les ocurri´o que el IGF-I, as´ı como las prote´ınas y p´eptidos relacionados con el IGF-I, podr´ıan promover el funcionamiento y/o la supervivencia de neuronas, con el riesgo, de otro modo, de que perdieran la funci´on y/o murieran, debido a la exposici´ on a agentes t´oxicos. Para demostrar esta idea espec´ıficamente, los solicitantes han investigado si la administraci´on de IGF-I es capaz de evitar la neurotoxicidad que proviene de la administraci´ on del agente antitumoral vincristina en un modelo animal. Cl´ınicamente, la utilidad de la vincristina est´ a limitada porque se presenta neuropat´ıa con disfunci´ on motora importante, as´ı como anormalidades sensitivas y auton´omicas (Legha, SS.,supra). Hasta la fecha, no existen medios efectivos de evitar dicha neuropat´ıa, salvo limitando la dosis de vincristina. Los solicitantes han demostrado que la administraci´ on de IGF-I es capaz de evitar dicho efecto secundario debilitante y limitativo de la dosis de vincristina. En un segundo ensayo de esta idea, los solicitantes han investigado si la administraci´ on de IGF-I es capaz de evitar la neurotoxicidad proveniente de la administraci´ on del agente antitumoral taxol en un modelo animal. Ejemplo experimental: vincristina

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M´etodos Administraciones del f´ armaco 45

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Se administr´ o el sulfato de vincristina (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a una dosis de 2 mg/kg por v´ıa intraperitoneal dos veces por semana durante seis semanas consecutivas. Se formul´ o a una concentraci´on de 0,16 mg/ml de soluci´ on salina normal. El IGF-I recombinante (rhIGF-I) para utilizaci´ on experimental fue suministrado por Cephalon Inc. (West Chester, PA) y est´ a tambi´en disponible comercialmente en RD Systems, Inc. (Minneapolis, MN), U.B.I. (Lake Placid, NY) y Kabi Pharmacia AS (Stockholm, Sweden). El rhIGF-I se formul´ o para el grupo de dosis alta a una concentraci´ on de 1 mg/ml, y para el grupo de dosis baja a una concentraci´ on de 0,3 mg/ml, en una soluci´ on tamponada de a´cido ac´etico con un pH de 6,0. Los grupos de dosis alta (Grupos 4 y 6) recibieron 1,0 mg/kg de IGF-I tres veces por semana subcut´ aneamente durante seis semanas consecutivas. Los grupos tratados con dosis baja (Grupos 3 y 5) recibieron 0,3 mg/kg de IGF-I tres veces por semana subcut´aneamente durante id´entico per´ıodo de tiempo. Los grupos que no recibieron IGF-I recibieron inyecciones subcut´ aneas del veh´ıculo de tamp´ on de a´cido ac´etico en el mismo volumen por peso y seg´ un el mismo esquema, que los animales que recibieron IGF-I. Animales Para este estudio se seleccionaron ratones machos CD1 que pesaban entre 15-20 g al principio. Se 5

ES 2 140 463 T3 distribuyeron al azar 12 animales para cada uno de los siguientes grupos de tratamiento: Grupo # 1: Control, s´ olo inyecciones del veh´ıculo. 5

Grupo # 2: Vincristina m´ as veh´ıculo de IGF-I. Grupo # 3: Vincristina m´ as dosis baja de IGF-I. Grupo # 4: Vincristina m´ as dosis alta de IGF-I.

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Grupo # 5: Dosis baja de IGF-I solo. Grupo # 6: Dosis alta de IGF-I solo. 15

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Ensayo de comportamiento Ensayo de inclinaci´ on: Tras seis semanas de tratamiento, los ratones se ensayaron de forma ciega. Para esta prueba, cada animal se emplaz´o individualmente sobre una tabla recubierta de espuma, la cual se elev´o entonces a una posici´ on vertical. Se midi´ o el tiempo en que los animales pod´ıan mantenerse suspendidos de la tabla sin caerse. La prueba finaliz´ o arbitrariamente a los 30 segundos. Se registr´o el mejor tiempo de tres pruebas. Ensayo electrofisiol´ ogico

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Tras el ensayo de comportamiento, los ratones se sometieron al ensayo electrofisiol´ ogico. Cada rat´ on se anestesi´o con halotano antes de registrar. Se midieron en el nervio caudal de la cola las amplitudes del compuesto y los estados latentes distales. Las colas se confinaron y se dispusieron electrodos superficiales (agujas de platino-irio) a lo largo de la secci´ on distal del nervio caudal. El electrodo activo de registro se dispuso a una distancia fija de 40 mm, distal al c´ atodo estimulador. Impulsos breves de estimulaci´on voltaica constante se llevaron a cabo a trav´es de un par a´nodo-c´ atodo situado sobre una secci´ on pr´ oxima del nervio caudal. Se condujeron ortodr´ omicamente los registros motores desde el nervio tibial con un emplazamiento del electrodo sobre la inserci´on distal del m´ usculo gastrocnemio. Los registros sensitivos se condujeron ortodr´ omicamente desde el nervio sural con una distancia de 10 mm entre electrodos. Para cada registro, se promediaron de cinco a diez est´ımulos, repiti´endose el procedimiento. El estado latente se determin´o a partir del comienzo de la despolarizaci´on inicial y se midi´o hasta los 0,1 mseg m´as pr´ oximos. La amplitud se midi´o desde la linea basal al pico y al 0,1 µV m´as pr´ oximo. Se control´ o la temperatura rectal de cada rat´ on se monitoriz´o y se mantuvo dentro de 0,5◦C. Estad´ısticas

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Los datos se analizaron utilizando un an´ alisis de varianza (ANOVA) en todos los casos. Resultados 45

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Ensayo de comportamiento Cl´ınicamente, la vincristina provoca una neuropat´ıa sensomotora mezclada, con debilidad motora distal como principalmente el s´ıntoma temprano. Se utiliz´ o entonces un ensayo sencillo de comportamiento, para investigar la fuerza motora de los animales en cada grupo. Los datos del ensayo de inclinaci´ on se sumarizan en la Tabla 1 y en la Fig 1. Los animales tratados con vincristina sola pudieron mantenerse sobre la tabla sin caerse durante s´ olo la mitad del tiempo m´ aximo. Los otros grupos ensayados fueron todos capaces de mantenerse durante aproximadamente la totalidad de los 30 segundos permitidos. El grupo tratado con la vincristina sola difiri´ o de los otros grupos con una p < 0,0001 mediante ANOVA. Resultados electrofisiol´ ogicos La conducci´on motora se midi´o desde el nervio tibial, y los resultados se sumarizan en la Tabla 2 y en la Fig 2. El grupo tratado con vincristina s´ ola mostraba un estado de latencia prolongado y una amplitud del potencial de acci´on significativamente reducida comparada con el grupo de control (p 0,05, es significativamente diferente. Terapia

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Cualquiera de los agentes IGF-I reductores de la neuropat´ıa que se han descrito en la presente memoria puede administrarse a un paciente en un tamp´ on farmac´euticamente aceptable (por ejemplo, soluci´on salina fisiol´ ogica o tamp´ on de a´cido ac´etico). Aunque puede ser conveniente administrar IGF-I o IGF-III por v´ıa subcut´ anea, oral, nasal o t´ opica, por ejemplo en forma l´ıquida o con un rociador, la preparaci´ on terap´eutica se administra de acuerdo con la condici´ on que va a tratarse. Por ejemplo, puede ser necesario administrar IGF-I por v´ıa intravenosa o quir´ urgicamente al tejido apropiado, o mediante un cat´eter. Una dosis apropiada es una cantidad de un factor-I de crecimiento de tipo insul´ınico, fragmento o 7

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an´ alogo que da lugar a una reducci´ on en el grado de la neuropat´ıa. IGF-I, por ejemplo, puede administrarse a dosis de 0,03-10 mg/kg/dosis unitaria, como un bolo o mediante infusi´ on, administrado bien diariamente, intermitentemente, o seg´ un las necesidades. Esta dosis corresponde aproximadamente a una relaci´on ponderal de IGF-I con respecto a la vincristina de entre 1:400 y 75:1, preferentemente de 1:40 a 8:1. Dosis de otros factores I de crecimiento de tipo insul´ınico, fragmentos o an´ alogos, o de sus relaciones ponderales respecto al agente t´ oxico de que se trate, pueden determinarse por el experto en la materia, seg´ un los m´etodos que aqu´ı se describen. La efectividad del tratamiento de las neuropat´ıas con IGF-I puede evaluarse por los siguientes s´ıntomas de recuperaci´ on: 1) recuperaci´on de la funci´ on sensitiva normal, la cual puede investigarse mediante la sensibilidad t´ermica de las extremidades; 2) recuperaci´on de la funci´ on motora normal, la cual puede investigarse mediante la medici´on de la debilidad muscular, control de la funci´on motora fina y reflejos tendinosos profundos; y 3) normalizaci´ on de la velocidad de conducci´ on nerviosa, la cual se eval´ ua electrofisiol´ogicamente. Los m´etodos para investigar la neuropat´ıa perif´erica son descritos por Asbury et al (Asbury et al., 1992, en Diseases of the Nervous System, Clinical Neurobiology, eds. Asbury et al. W.B. Saunders Inc. Philadelphia, PA. 1:252-269) y pueden utilizarse por los expertos en la materia para determinar la efectividad del factor-I de crecimiento de tipo insul´ınico para aliviar la neuropat´ıa. Otras formas de realizaci´ on

20

25

Otras formas de realizaci´ on se encuentran contenidas en las siguientes reivindicaciones. Por ejemplo, los agentes u ´ tiles para reducir la neuropat´ıa t´ oxica pueden incluir cualquiera de la familia de los factores I de crecimiento de tipo insul´ınico y de las neurotrofinas relacionadas, mol´eculas potenciadoras del factor nervioso de crecimiento, factor neurotr´ ofico ciliar, fragmentos pept´ıdicos derivados de IGF-I, an´alogos de un factor I de crecimiento de tipo insul´ınico, o combinaciones de dichos agentes.

30

Mientras que la neurotoxicidad de la vincristina se manifiesta t´ıpicamente en su mayor parte como una neuropat´ıa perif´erica, el m´etodo de la invenci´on puede tambi´en utilizarse para reducir otras neuropat´ıas t´ oxicas, por ejemplo neuropat´ıas del sistema nervioso craneal o auton´ omico, y puede utilizarse para mitigar los efectos de otros agentes t´oxicos.

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55

La presente invenci´on incluye adem´ as neuropat´ıas asociadas con enfermedades sist´emicas: uremia, enfermedad hep´ atica colest´atica infantil, insuficiencia respiratoria cr´onica, polineuropat´ıa alcoh´ olica, fallo org´ anico m´ ultiple, sepsis, hipoalbuminemia, s´ındrome eosinof´ılico-mi´algico, hepatitis, porfiria, hipoglucemia, deficiencia vitam´ınica, enfermedad hep´ atica cr´ onica, cirrosis biliar primaria, hiperlipidemia, lepra, enfermedad de Lyme, herpes zoster, s´ındrome de Guillain-Barre, polirradiculoneuropat´ıa desmielinizante inflamatoria cr´onica, perineuritis sensitiva, neuropat´ıa asociada al s´ındrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), s´ındrome de Sjogren, vasculitis primaria (tal como la poliarteritis nudosa), angiitis granulomatosa al´ergica (Churg-Strauss), angiitis de hipersensibilidad, granulomatosis de Wegener, artritis reumatoide, lupus sist´emico eritematoso, enfermedad del tejido conjuntivo mixto, escleroderma, sarcoidosis, vasculitis, vasculitis sist´emica, polineuropat´ıa desmielinizante inflamatoria aguda, s´ındrome post-polio, s´ındrome del t´ unel carpiano, pandisautonom´ıa, amiloidosis sist´emica primaria, hipotiroidismo, enfermedad pulmonar obstructiva cr´ onica, acromegalia, malabsorci´on (sprue, enfermedad cel´ıaca), carcinomas (sensitivo, sensomotor, tard´ıo y desmielinizante), linfoma (incluyendo el de Hodgkin), policitemia vera, mieloma m´ ultiple (tipo l´ıtico, osteoscler´otico, o plasmacitoma solitario), gammopat´ıa monoclonal benigna, macroglobulinemia y crioglobulinemia, tal como se describe por Asbury et al. supra. La presente invenci´on incluye asimismo neuropat´ıas adquiridas gen´eticamente: atrofia muscular peroneal (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, tipos I, II y X), neuropat´ıas amiloides hereditarias, neuropat´ıa sensorial hereditaria (tipo I y tipo II), neuropat´ıa porf´ırica tendencia hereditaria a la par´ alisis presora, enfermedad de Fabry, adrenomieloneuropat´ıa, s´ındrome de Riley-Day, neuropat´ıa de Dejerine-Sottas (neuropat´ıa-III sensomotora hereditaria), enfermedad de Refsum, ataxia-telangiectasia, tirosinemia hereditaria, anafalipoproteinemia, abetalipoproteinemia, neuropat´ıa ax´ onica gigante, leucodistrofia metacrom´atica, leucodistrofia celular globoide y ataxia de Friedrich (Asbury et al supra).Tambi´en se incluyen en la invenci´on la mononeuropat´ıa multiplex, la plexopat´ıa, y la neuropat´ıa motora pura, tal como se describe por Asbury et al. supra.

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8

ES 2 140 463 T3 TABLA 1 Ensayo de inclinaci´ on Grupo

5

Control VIN solo VIN + IGF bajo VIN + IGF alto IGF bajo IGF alto

10

15

Medias

S.E.M.

27,6 15,4∗ 30 27,7 30 27

2,4 6,5 0 2,3 0 3

Datos del ensayo de la inclinaci´ on. Los valores representan el tiempo que los animales pudieron permanecer suspendidos de una tabla en posici´ on vertical, por un per´ıodo m´ aximo de 30 segundos. ∗

Significa que dicho valor difiri´ o de los otros grupos con una p < 0,0001.

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TABLA 2 Nervio motor tibial Latencia (mseg)

25

Grupo Control VIN solo VIN + IGF bajo VIN + IGF alto IGF bajo IGF alto

30

Amplitud (mV)

Media

S.E.M.

Media

S.E.M.

1,21 1,35 1,38 1,43 1,21 1,23

0,03 0,05 0,05 0,08 0,02 0,03

22,98 13,94∗ 17,12 18,48 19,8 20,76

1,06 2,11 1,53 1,89 1,81 1,47

35

Mediciones electrofisiol´ogicas a partir del nervio tibial. ∗

Significa que dicho grupo difiri´ o del control con una p < 0,02.

40

TABLA 3 Nervio compuesto -caudal Latencia (mseg)

45

Grupo Control VIN solo VIN + IGF bajo VIN + IGF alto IGF bajo IGF alto

50

Media

S.E.M.

1,39 1,74∗∗ 1,55∗ 1,58∗ 1,46 1,45

Amplitud (mV) Media

0,03 0,09 0,03 0,03 0,03 0,03

57,32 30,66∗ 37,01∗ 36,05∗ 55,93 51,96

55

Mediciones electrofisiol´ogicas a partir del nervio caudal. ∗

60

Significa que dichos valores difirieron del control con una p < 0,05.

∗∗

Significa que dicho valor difiri´ o del control con una p < 0,001.

9

S.E.M. 3,47 8,56 2,59 1,65 5,68 4,25

ES 2 140 463 T3 TABLA 4 Nervio sensitivo sural Latencia (mseg)

5

Grupo

10

15

Control VIN solo VIN + IGF bajo VIN + IGF alto IGF bajo IGF alto

Amplitud (mV)

Media

S.E.M.

Media

S.E.M.

0,54 0,62 0,61 0,57 0,55 0,5

0,01 0,04 0,02 0,03 0,02 0,02

35,29 55,66 44,49 37,27 30,52 43,06

3,55 7,46 7,09 5,4 3,34 7,73

Mediciones electrofisiol´ogicas a partir del nervio sural. No existieron diferencias estad´ısticamente significativas entre los grupos. TABLA 5

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Agentes que causan neuropat´ıa perif´erica Agente

Actividad

acetazolamida acrilamida adriamicina alcohol (etanol) almitrina amiodarona amfotericina ars´enico aurotioglucosa barbituratos espino cerval carbamatos disulfuro de carbono (CS2 ) cloramfenicol cloroquina colestiramina cisplatino clioquinol colestipol colchicina colistina cicloserina citarabina dapsona dideoxicitidina dideoxiinosina dideoxitimidina disulfiram doxorubicina

diur´etico floculento, agente de relleno antineopl´ asico solvente, f´ armaco recreativo estimulante respiratorio antiarr´ıtmico antimicrobiano herbicida, insecticida antirreum´atico anticonvulsivo, sedante fruto t´ oxico insecticida industrial antibacteriano antimal´ arico antihiperlipoprotein´emico antineopl´ asico amebicida, antibacteriano antihiperlipoprotein´emico suprime la gota antimicrobiano antibacteriano antineopl´ asico dermatol´ ogica, incluyendo la lepra antineopl´ asico antineopl´ asico antiv´ırico antialcohol antineopl´ asico

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10

ES 2 140 463 T3 TABLA 5 (Continuaci´on) Agente

Actividad

etambutol etionamida glutetimida oro hexacarbonos contraceptivos hormonales hexametilolmelamina hidralazina hidroxicloroquina imipramina indometacina plomo inorg´ anico isoniazida litio metilmercurio metformina metilhidrazina metronidazol misonidazol nitrofuranto´ına mostaza nitrogenada ´oxido nitroso organosfosfatos ospolot penicilina perhexilina maleato de perhexilina fenito´ına platino primidona procarbazina piridoxina cianato s´ odico estreptomicina sulfonamidas suramina tamoxif´en taxol talidomida talio triamtireno trimetiltin L-tript´ ofano vincristina vinblastina vindesina vitamina A vitamina D

antibacteriano antibacteriano sedante, hipn´ otico antirreum´ atico solventes

5

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ign´ıfugo, a prueba de dobleces antihipertensor antirreum´ atico antidepresivo anti-inflamatorio metal t´ oxico en pinturas, etc antituberculoso antidepresivo desecho industrial antidiab´etico intermediario sint´etico antiprotozoario radiosensibilizador antis´eptico urinario antineopl´ asico, gas nervioso anest´esico insecticidas anticonvulsivo antibacteriano antiarr´ıtmico antiarr´ıtmico anticonvulsivo componente de droga anticonvulsivo antineopl´ asico vitamina B6 antian´emico de la hemat´ıa de hemat´ıes falciformes. antimicrobiano antimicrobiano antineopl´ asico antineopl´ asico antineopl´ asico antileproso veneno de rata diur´etico metal t´ oxico aditivo de comida sana antineopl´ asico antineopl´ asico antineopl´ asico mega dosis mega dosis

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ES 2 140 463 T3 TABLA 6 Efecto del taxol y de rhIGF-I sobre los estados latentes del movimiento de la cola y de la placa caliente 5

Tratamientoa,b

Veh´ıculo de rhIGF-I Veh´ıculo de taxol rhIGF-I (1 mg/kg) Veh´ıculo Taxol/rhIGF-I Veh´ıculo Taxol/rhIGF-I

10

Estado latente del movimiento de cola

Estado latente de la placa

3,49 ± 0,15 3,70 ± 0,30 3,43 ± 0,14 4,99 ± 0,15∗ 3,70 ± 0,19

8,72 ± 7,34 ± 8,10 ± 11,96 ± 7,74 ±

0,40 0,44 0,39 0,54∗ 0,61

15 ∗

Significativamente diferente de los grupos tratados con veh´ıculo, rhIGF-I o Taxol/rhIGF-I, p