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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

A61K 38/16 (2006.01) A61K 38/28 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) C07K 14/00 (2006.01) C07K 14/435 (2006.01) C07K 14/62 (2006.01) C12N 9/88 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 283 084

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

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86 Número de solicitud europea: 98966066 .7

86 Fecha de presentación : 23.12.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 0999848

87 Fecha de publicación de la solicitud: 17.05.2000

54 Título: Proteínas quiméricas para el tratamiento de diabetes.

30 Prioridad: 23.12.1997 US 68648 P

73 Titular/es: ALEXION PHARMACEUTICALS, Inc.

25 Science Park, Suite 360 New Haven, Connecticut 06511, US

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.10.2007

72 Inventor/es: Mueller, John, P.;

Matis, Louis, A. y Wang, Yi

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

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16.10.2007

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 283 084 T3 DESCRIPCIÓN Proteínas quiméricas para el tratamiento de diabetes. 5

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Antecedentes de la invención La discusión en esta sección no se limita a la materia objeto que se califica como “técnica anterior” frente a la presente invención. Por lo tanto, no se debe de presuponer o inferir la admisión de tal estado de técnica anterior por la inclusión de la materia objeto particular en esta discusión, y no se debe presuponer ninguna declaración contra los intereses de los presentes inventores por razón de dicha inclusión. Diabetes mellitus

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La diabetes mellitus es la enfermedad endocrina más habitual, y se caracteriza por anormalidades del metabolismo de la glucosa. El metabolismo anormal de la glucosa asociado con esta enfermedad da como resultado hiperglucemia (glucemia elevada) y eventualmente provoca complicaciones de múltiples sistemas orgánicos, incluyendo los ojos, riñones, nervios, y vasos sanguíneos. Generalmente, los pacientes con hiperglucemia persistente o con una tolerancia anormal a la glucosa se diagnostican con la enfermedad, aunque muy habitualmente los pacientes presentan inicialmente una micción excesiva (poliuria) y una necesidad frecuente de beber debido a la sed extrema (polidipsia). Estos síntomas iniciales típicos resultan de los efectos osmóticos de la hiperglucemia. La patogénesis de la diabetes mellitus está asociada típicamente con disfunción pancreática, particularmente de las células beta de los islotes pancreáticos de Langerhans. Esta disfunción puede conducir a la destrucción de las células beta de los islotes, que producen insulina, una hormona peptídica reguladora de la glucosa. La diabetes mellitus se ha categorizado generalmente como insulinodependiente o de tipo 1, frente a la no insulinodependiente, o de tipo 2. Sin embargo, esta terminología ha evolucionado a medida que la enfermedad se ha comprendido mejor. Por ejemplo, se ha encontrado que en algunos pacientes que sufren diabetes no insulinodependiente, la enfermedad avanza hacia una forma insulinodependiente, mientras que en otros pacientes no se desarrolla una dependencia de la insulina. De este modo, los pacientes se categorizan a menudo en extremos de los mecanismos de patogénesis de la destrucción de los islotes, y la denominación de tipo 1 se usa ahora para hacer referencia a la patogénesis de los islotes autoinmunitaria, es decir, a diabetes provocada por un ataque autoinmunitario específico de los islotes, y como tal se usa aquí en este documento. La expresión diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) se refiere a diabetes de tipo 1 que ha evolucionado hasta una etapa en la que se ha producido una destrucción autoinmunitaria suficiente de las células beta pancreáticas para producir síntomas manifiestos. El extremo pre-IDDM se refiere a un estado autoinmunitario que se puede detectar mediante biopsia o mediante análisis de las respuestas autoinmunitarias, en las que las células beta de los islotes pancreáticos están siendo sometidas a un ataque autoinmunitario específico en un grado en el que algunas células pueden estar sometidas a la destrucción. Sin embargo, en pre-IDDM, la destrucción (si la hay) no ha progresado hasta un grado suficiente para requerir la administración de insulina. Puesto que puede haber un punto en las etapas tempranas de la diabetes de tipo 1 en el que se observan síntomas manifiestos pero aún continúan funcionando los islotes (lo que se conoce con el nombre de “período de luna de miel”), no todas las diabetes de tipo 1 se clasifican como IDDM, y no todas las pre-IDDM se presentan sin síntomas manifiestos. Complicaciones de la diabetes de tipo 1. Las complicaciones metabólicas asociadas con el metabolismo anormal provocado por la insuficiencia de insulina pueden afectar a numerosos sistemas orgánicos. La complicación metabólica aguda más habitual es aquella de la cetoacidosis diabética, caracterizada por una grave hiperglucemia (y la hipovolemia resultante provocada por diuresis osmótica), así como la acidosis metabólica inducida por la liberación de ácidos grasos libres en exceso y la producción de cuerpos cetónicos. Además de la complicación metabólica aguda de la cetoacidosis, el paciente diabético es susceptible a una serie de complicaciones tardías que provocan una considerable morbilidad y una mortalidad prematura. La aterosclerosis se produce de forma más extendida y de forma más temprana en los diabéticos que en la población general como resultado de anormalidades tanto en el metabolismo de la glucosa como en el de los lípidos. Esta patología vascular puede conducir, entre otras, a arteriopatía coronaria, a apoplejía, y a insuficiencia venosa periférica con gangrena. La retinopatía es otra complicación vascular de la diabetes. La retinopatía diabética es una causa principal de ceguera, y se inicia por el aumento de permeabilidad de los capilares retinianos, lo que puede evolucionar hasta la oclusión, hemorragia, formación de aneurismas, y neovascularización conocida como retinopatía proliferativa. Además de las complicaciones vasculares, las complicaciones habituales de la diabetes son las enfermedades del riñón y neurológicas (nefropatías y neuropatías). La nefropatía diabética provoca aproximadamente la mitad de la nefropatía terminal en los Estados Unidos de América. Histológicamente, la nefropatía se caracteriza porque la membrana basal glomerular se hace más ancha, y por un engrosamiento mesangial. Las señales iniciales incluyen un aumento de la proteinuria, conduciendo la azotemia en último lugar a la insuficiencia renal. La neuropatía diabética puede afectar a cualquier parte del sistema nervioso, con la posible excepción del cerebro. La neuropatía se observa más habitualmente como polineuropatía periférica, con síntomas que incluyen entumecimiento, parestesias, hiperestesias graves, y dolor. La neuropatía neurovegetativa puede provocar disfunción gastrointestinal, hipotensión ortostática, disfunción de la vejiga o parálisis, e impotencia. Las úlceras de pie de los diabéticos representan un problema especial de los diabéticos, y parece que son debidas principalmente a la distribución anormal de la presión como consecuencia de 2

ES 2 283 084 T3 la neuropatía diabética. Las lesiones ulcerosas empeoran a menudo por la insuficiencia venosa periférica concomitante y por la infección. 5

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Como se mencionó anteriormente, el control meticuloso de la glucemia se ha asociado con una mejora de las complicaciones tardías de la diabetes de tipo 1, sugiriendo que la conservación o restauración de la función de las células beta podría reducir o eliminar la mayoría de las complicaciones patológicas de la enfermedad. Patogénesis de la diabetes de tipo 1. La diabetes de tipo 1 sólo se desarrolla en individuos genéticamente susceptibles, y los síntomas generalmente aparecen antes de los 40 años de edad, produciéndose la incidencia pico del comienzo de la sintomatología manifiesta en la segunda década de la vida. La patogénesis de la diabetes tipo 1 se caracteriza por una fase inicial de infiltración leucocitaria en los islotes, denominada insulitis, seguido durante un período de tiempo de la destrucción real de las células beta de los islotes por ataque autoinmunitario. La fase de insulitis se caracteriza por la infiltración de islotes pancreáticos tanto por linfocitos como por células del linaje de monocitos/macrófagos, e implica tanto la inflamación mediada por células así como el ataque por anticuerpos citotóxicos específicos de los islotes. Los síntomas clínicos manifiestos de la diabetes mellitus se manifiestan generalmente cuando se destruye aproximadamente el 90% de las células beta de los islotes; sin embargo, como se explica de forma más completa a continuación, ahora es posible detectar de forma exacta individuos que sufren etapas tempranas de la patogénesis de tipo 1, es decir, antes de que se hayan perdido suficientes células beta de los islotes para producir síntomas clínicos manifiestos.

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Generalmente se piensa que el proceso autoinmunitario está inducido por un estímulo medioambiental. Una razón para esta creencia es que un gemelo idéntico sólo tiene una posibilidad de cincuenta/cincuenta de desarrollar IDDM si el hermano idéntico tiene la enfermedad. 25

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Células T. La destrucción autoinmunitaria de las células beta de los islotes pancreáticos en la diabetes de tipo 1 se cree que está iniciada por células blancas de la sangre (leucocitos), de forma más importante por las células T. Las células T, o linfocitos T, son células sanguíneas blancas mononucleares que proporcionan muchas funciones inmunitarias esenciales. La importancia de las células T en enfermedades autoinmunitarias humanas se ha apreciado de forma creciente en las últimas dos décadas. Los estudios que usan tratamientos que dan como resultado una inmunosupresión generalizada han definido un papel crítico para un subconjunto de células T, conocido como CD4+ o células T auxiliares, como reguladores principales de todas las respuestas inmunitarias (tanto celulares como humorales) frente a antígenos proteínicos o peptídicos. Las células T median la lesión tisular a través de medios indirectos y directos. Las células T de los subconjuntos tanto de CD8+ (citotóxicas) como CD4+ (auxiliares) segregan una variedad de citoquinas inflamatorias que pueden dañar tejidos indirectamente activando otros diversos tipos de células blancas de la sangre. Los ejemplos de tales efectos de las células T incluyen la activación de células B que segregan anticuerpos (que estimulan la actividad inmunitaria humoral), y la activación de macrófagos, lo que puede provocar un daño agudo de los tejidos y la inflamación al liberar enzimas hidrolíticas, especies oxigenadas reactivas, y citoquinas proinflamatorias adicionales. Además de estos efectos indirectos de la actividad de las células T, el daño directo de los tejidos puede estar mediado por células T citotóxicas CD8+ que atacan células que presentan antígenos diana. Un aspecto único de la fisiología de las células T es la presencia, sobre sus superficies celulares, de estructuras de unión semejantes a anticuerpos unidos a membrana, denominadas receptores de células T (TCR). Al igual que los anticuerpos, los TCR se unen con una especificidad elevada a antígenos particulares. Al igual que las células productoras de anticuerpos, que se desarrollan como clones multitudinarios de células, produciendo cada clon anticuerpos con especificidades únicas, las células T se desarrollan como un basto número de clones distintos, y cualquier clon de célula T particular expresa un único tipo de TCR con una especificidad de unión definida. Los clones de células T con TCR que se unen específicamente a autoantígenos son los responsables del desarrollo de enfermedades autoinmunitarias.

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Los estudios de las interacciones de anticuerpos y TCR con sus antígenos específicos han mostrado que un antígeno polipeptídico particular comprende típicamente numerosas características submoleculares, conocidas como epítopos, que pueden servir cada una como un sitio de unión distinto para un anticuerpo o TCR particular. 55

Células T y enfermedades autoinmunitarias. En las enfermedades autoinmunitarias, sólo un número limitado de clones de células T, que reaccionan con diversos epítopos de un número pequeño de autoantígenos, se activa y se ve implicado en la patogénesis. Incluso en individuos que sufren enfermedades autoinmunitarias, se sabe que sólo un pequeño porcentaje de clones de células T (0,1-1%) reconocen los autoantígenos.

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Se han postulado diversos mecanismos que desempeñan un papel en la activación patogénica de células T autorreactivas que provocan una enfermedad. La activación principal de células que presentan antígenos (APC) por infección o inflamación local está implicada en uno de tales mecanismos. Las APC activadas de esta manera pueden proporcionar entonces una coestimulación poderosa para las células T hasta ahora no reactivas.

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Otros mecanismos propuestos implican la activación policlonal, mediante superagentes, tales como toxinas bacterianas, de las células T autorreactivas previamente inactivas; o una imitación molecular con incidente entre autoantígenos y antígenos extraños (Abbas et al. 1994). En este último caso, el sistema inmunitario del hospedante organiza una respuesta a un epítopo sobre una proteína expresada por un patógeno, tal como un virus, que se asemeja a un epí3

ES 2 283 084 T3 topo homólogo en una proteína del hospedante. El ataque autoinmunitario resulta entonces de la respuesta inmunitaria reactiva cruzada que sigue. 5

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Además de factores externos, subyacente a la aparición de toda enfermedad autoinmunitaria mediada por células T existe un patrón complejo de susceptibilidad heredada determinada por factores multigénicos. Para discusiones adicionales de estos diversos factores, Steinman, 1995, repasa teorías actuales de autoinmunidad. Las alteraciones en el repertorio de células T se producen naturalmente durante el desarrollo de las células T. Sólo una pequeña fracción de timocitos (células T inmaduras) sobreviven al desarrollo intratímico y a sucesos de selección que dan como resultado la emigración de células T en desarrollo a la circulación periférica y la terminación de su maduración (von Boehmer, 1988; Marrack y Kappler, 1987). Las pruebas experimentales sugieren fuertemente que inicialmente están presentes en el timo un gran número de timocitos que poseen receptores para autoantígenos. Estudios recientes han dado pruebas que sugieren que un proceso denominado muerte celular programada, o apoptosis, destruye estos timocitos autorreactivos en el timo, mientras que perdona a los timocitos que no son autorreactivos. De este modo, la apoptosis desempeña un papel importante a la hora de conformar y mantener el repertorio de células T, y contribuye al establecimiento de la autotolerancia eliminando activamente células que expresan TCR autorreactivos. Se ha descubierto recientemente que las células T son sensibles a la muerte celular apoptótica inducida por una variedad de estímulos en múltiples puntos de su vida (véase, por ejemplo, Lenardo 1991; Boehme y Lenardo 1993; Critchfield et al. 1994). También se cree que factores de selección positiva desempeñan un papel a la hora de regular la supervivencia de clones de células T específicos. La reducción o expansión del número de células T individuales de un clon particular en un organismo, por estos y otros mecanismos, sirve para modular la sensibilidad del sistema inmunitario del organismo frente a un antígeno particular. Ahora está firmemente establecido en varios modelos de enfermedad autoinmunitaria, así como en ciertas infecciones víricas, que la apoptosis se puede inducir (con la exposición a antígeno en ciertas condiciones definidas) en linfocitos T periféricos maduros, específicos de antígenos, así como en timocitos inmaduros. La apoptosis se produce en muchos sistemas biológicos (véase, por ejemplo, Kerr et al. 1991; Lockshin y Zakeri, 1991; Cohen et al. 1992; Duvall y Wyllie, 1986; Cotter et al. 1990). Una célula que sufre apoptosis sufre un programa específico de sucesos - procesos celulares y bioquímicos que dependen del metabolismo activo y contribuyen a la autodestrucción de la célula. En las células T apoptóticas, el núcleo se contrae, la cromatina se condensa, el material genético (ADN) se degrada progresivamente en pequeños fragmentos (de tamaño repetido nucleosómico), existe una compactación citoplásmica, la membrana celular forma ampollas, y la célula eventualmente colapsa (Kawabe y Ochi, 1991; Smith et al. 1989). Las células no se pueden recuperar de la apoptosis, y dan como resultado la muerte celular irreversible (Kawabe y Ochi, 1991; Smith et al. 1989). Informes recientes han sugerido un papel para la citoquina relacionada con TNF, conocida como el ligando FAS y su receptor, CD95 (el receptor de FAS), en la inducción de la apoptosis en células T (Crispe et al. 1994; Nagata y Suda, 1995; Strasser, 1995; Dhein et al., 1995; Brunner et al., 1995; y Ju et al., 1995). Autoantígenos de las células beta de los islotes. Como se ha discutido anteriormente, el comienzo de la diabetes de tipo 1 se considera que está mediado por células T. Se cree que la enfermedad es una consecuencia de las respuestas inapropiadas de las células T específicas a ciertas proteínas de las células beta de los islotes, que actúan como autoantígenos. Además de las células T autorreactivas, también se han dado a conocer en pacientes con IDDM anticuerpos contra diversos autoantígenos. Los antígenos que se afirma que son unidos por estos autoanticuerpos incluyen muchos de aquellos que se afirma que son reconocidos por células T autorreactivas. Los autoantígenos que son el objeto de respuestas autoinmunitarias en pacientes con diabetes de tipo 1 incluyen los autoantígenos GAD (glutamatodescarboxilasa) de 64-65 kDa y GAD de 67 kDa; la insulina; sialiglucolípido; un antígeno de 38 kD procedente de los gránulos secretores de células beta; un antígeno que reacciona de forma cruzada con anticuerpos frente a albúmina bovina, denominado como la proteína p69 de las células beta, PM-1, o un antígeno que modifica la enfermedad, una proteína citoesquelética de las células beta conocida como periferina, proteínas transportadoras de glucosa, incluyendo GLUT-2; la proteína 65 del choque de calor (HSP 65), incluyendo el péptido p277; la carboxipeptidasa H; un mimético molecular de 52 kD del antígeno del virus de la rubéola; una proteína de 150 kDa asociada a la membrana de las células beta; un antígeno proteínico localizado en el polo secretor de la estirpe celular RINm38 del insulinoma de rata, denominado como el antígeno polar RIN; y antígenos (en principio) malamente caracterizados aislados mediante inmunocribado de una librería de expresión de ADNc de los islotes, denominados como ICA12 e ICA512. ICA512, ahora también conocido como IA-2, está relacionado inmunológicamente con fogrina, que también es objeto de respuestas autoinmunitarias en pacientes con diabetes de tipo 1 (Hatfield et al., 1997). La importancia relativa de estos diversos autoantígenos en la patogénesis autoinmunitaria, y la oportunidad con la que cada uno desempeña un papel durante el transcurso del comienzo y desarrollo de la enfermedad, son el objeto de una considerable incertidumbre y de la controversia consiguiente en la técnica. Otra incertidumbre deriva del hecho de que cada autoantígeno supuesto comprende numerosos epítopos, algunos de los cuales pueden tener efectos promotores de la enfermedad, mientras que otros pueden tener efectos supresores de la enfermedad. 4

ES 2 283 084 T3 Aunque no se desea estar atados por ninguna teoría particular de operación, según ciertos aspectos de la invención se cree que la insulina y GAD proporcionan los efectos terapéuticos más eficaces en el desarrollo de la diabetes de tipo 1 de cualquiera de los autoantígenos implicados en el desarrollo de un papel en la patogénesis de la enfermedad. 5

Los autoanticuerpos frente a GAD de 64-65 kD (en lo sucesivo GAD 65) normalmente se detectan antes del comienzo de la diabetes mellitus de tipo 1 clínica insulinodependiente, y entre familiares no diabéticos de pacientes con IDDM así como de otros que tengan riesgo. Se ha sugerido que estos autoanticuerpos son el mejor marcador predictivo de anticuerpos para diabetes de tipo 1 inminente.

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GAD 65 y GAD 67 están codificados por diferentes genes en diferentes cromosomas, teniendo los genes aproximadamente 70% de homología. Los islotes humanos sólo expresan GAD 65, aunque ambas formas proteínicas se encuentran en el cerebro. Se han demostrado pruebas de inmunidad específica linfocitaria frente a GAD 65, y se ha encontrado que está estrechamente asociada con IDDM. Estudios recientes en el modelo de ratón NOD de diabetes han indicado que las respuestas de células T frente a GAD 65 preceden a las de otros autoantígenos putativos, y que la inducción temprana de la tolerancia de las células T a GAD 65 puede prevenir el comienzo de la enfermedad.

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Kaufman et al (1993) y Tisch et al (1993) han presentado datos que sugieren que las respuestas frente a GAD son lo más importante en el desarrollo de la enfermedad, puesto que se informó que se elevaban durante el desarrollo de la diabetes de tipo 1, apareciendo respuestas frente a otros autoantígenos de las células beta sólo mucho más tarde durante el transcurso de la enfermedad, estando la reactividad a la insulina entre las últimas en aparecer. Se interpretó que estos hallazgos indicaban que GAD 65 es el autoantígeno clave en la diabetes de tipo 1, y que la modulación de la reactividad autoinmunitaria con GAD sería la diana más apropiada para reducir la patología de la enfermedad. Según esta comprensión teórica de la progresión de la enfermedad, la modulación de las células T reactivas a insulina sería como cerrar la puerta del granero después de que todos los caballos se hubiesen ido, observándose las reacciones frente a la insulina tan tarde en la progresión de la enfermedad que no sería de esperar que su modulación afectase el comienzo o la gravedad de la enfermedad. Los autoanticuerpos frente a la insulina (IAA) se pueden detectar en aproximadamente el 50% de nuevos pacientes con comienzo de la enfermedad, y están muy asociados con los autoanticuerpos de las células de los islotes (ICA) y con el fenotipo HLA-DR4. Otros estudios sugieren que los individuos tanto con ICA como IAA tienen un riesgo mucho mayor de desarrollar diabetes de tipo 1 manifiesta que aquellos con cualquiera de los marcadores solo. También se han descrito las respuestas de las células T frente a la insulina como autoantígeno. En un estudio, las respuestas celulares frente a insulina humana estuvieron presentes en casi el 90% de los familiares en primer grado, positivos a ICA, de pacientes con IDDM. También, como se expone más abajo en los ejemplos, las células T reactivas a insulina procedentes de ratones NOD diabéticos pueden transferir la diabetes a ratones NOD no diabéticos. Las respuestas de las células T de pacientes con diabetes de tipo 1 o de individuos en riesgo a preparaciones de células de los islotes indefinidas han sugerido que las células T también responden a otros antígenos de las células de los islotes. Estos incluyen un antígeno de 38 kD procedente de los gránulos secretores de células beta, y seroalbúmina. Además, se ha implicado a la proteína de choque térmico (HSP) 65 como un autoantígeno de células T basándose en el hallazgo de que las células T específicas de HSP transfieren la enfermedad en ratones NOD. La carboxipeptidasa H es una molécula encontrada en gránulos secretores de los islotes, y está asociada con la producción de hormonas peptídicas y neurotransmisores. Se identificó como un autoantígeno potencial de los islotes mediante la identificación sistemática de librerías de expresión de ADNc con sueros procedentes de pacientes con IDDM o pre-IDDM. Otros diversos antígenos putativos de las células de los islotes, tales como ICA12 e ICA512, también se han identificado mediante identificación sistemática de librerías de expresión de ADNc.

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La diseminación intraantigénica e interantigénica de la autorreactividad (“diseminación de epítopos”) son fenómenos relacionados asociados con enfermedades autoinmunitarias en las que epítopos adicionales dentro de un antígeno, o antígenos adicionales dentro de un tejido diana, son seleccionados como dianas por las células T autorreactivas durante la progresión de la enfermedad. Tal diseminación antigénica se ha observado durante el transcurso del proceso autoinmunitario inflamatorio en los modelos murinos de encefalomielitis alérgica experimental (EA) y de diabetes insulinodependiente (Lehmann et al. 1992; McCarron et al. 1990; Kaufman et al. 1993; Tisch et al. 1993). Estos hallazgos de la diseminación antigénica/epitópica sugieren que, para que un tratamiento terapéutico proporcione una tolerancia inmunitaria eficaz a autoantígenos de células beta de los islotes, el tratamiento necesitará seleccionar como diana una población heterogénea de células T autorreactivas específicas. Por lo tanto, a fin de que la administración antigénica sea eficaz máximamente en la prevención y tratamiento de la diabetes de tipo 1, es deseable que se presente una pluralidad de los epítopos inmunodominantes de tanto la insulina como GAD 65 a los linfocitos T autorreactivos que producen la enfermedad. Predicción y diagnóstico de la enfermedad de tipo 1. Como se ha explicado anteriormente, hay un aspecto genético de la incidencia de la diabetes de tipo 1. En consecuencia, los ensayos genéticos pueden identificar a ciertos individuos con riesgo mayor de desarrollar la enfermedad (véase, por ejemplo, Walston et al. 1995). Además, los individuos con un antecedente familiar conocido de la enfermedad se pueden monitorizar en busca de señales preclínicas 5

ES 2 283 084 T3 tempranas del desarrollo de la enfermedad, por ejemplo monitorizando los niveles de los autoanticuerpos y de células T autorreactivas explicados aquí. 5

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Autoanticuerpos. Entre los autoanticuerpos que se sabe están asociados con la diabetes de tipo 1, aquellos dirigidos contra GAD 65 son los que aparecen de forma más temprana y están presentes en el mayor número de pacientes. Globalmente, estudios recientes han mostrado que aproximadamente el 80% de los individuos con diabetes preclínica tienen autoanticuerpos específicos contra GAD. En este caso, un individuo con enfermedad preclínica se define como un familiar de primer grado de un paciente con diabetes de tipo 1 con ICA. Los antígenos identificados mediante ICA están definidos por la enfermedad, pero junto con autoanticuerpos específicos contra IAA y GAD producen un valor altamente predictivo del comienzo de diabetes en individuos preclínicos. De forma interesante, en la enfermedad de comienzo temprano real, disminuye la frecuencia de anticuerpos específicos contra GAD. Esto podría ser debido al hecho de que la reactividad de GAD 65 desciende con la destrucción de las células beta. La predicción de la diabetes de tipo 1 también se puede facilitar monitorizando los niveles de glucemia del sujeto, preferentemente en conjunción con la administración al sujeto de un ensayo de tolerancia a la glucosa. Tales procedimientos se llevan a cabo preferentemente en combinación con la monitorización de los títulos de los autoanticuerpos circulantes anti-IAA, ICA y GAD del sujeto.

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Según la presente invención, las proteínas quiméricas de la invención son proteínas de fusión que se pueden usar como sustratos antigénicos para la detección de autoanticuerpos circulantes, particularmente autoanticuerpos anti-IAA y/o GAD 65, en ensayos de diagnóstico tales como transferencia western, ELISA, RIA, ELISPOT, y similares.

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Células T. Los ensayos para la detección de células T con reactividades específicas son conocidos en la técnica, e incluyen la reacción linfocítica mixta (MLR) y el ensayo ELISPOT. Los ensayos ELISPOT se describen, por ejemplo, en Taguchi et al., J Immunol Meth 1990, 128:65 y Sun et al., J Immunol 1991 146:1490. Según la invención, las proteínas de fusión quiméricas de la invención se pueden usar como sustratos en tales ensayos para la detección y cuantificación de células T reactivas a insulina y/o células T reactivas a GAD 65 y/o células T reactivas a IA-2.

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Métodos actuales para la prevención y tratamiento de la diabetes de tipo 1. Aunque la diabetes se ha estudiado durante siglos, sólo existen unos pocos tratamientos eficaces para la enfermedad de tipo 1. La primera línea de tratamiento es la dieta, con una ingesta calórica apropiada basada en el peso corporal ideal y una distribución definida entre proteína, glucosa y grasa. Sin embargo, en pacientes con IDDM, el componente más importante de la terapia es la administración de insulina, cuya meta es mantener los niveles de glucosa tan próximos al intervalo normal como sea posible durante el día. La insulina está disponible en formulaciones de actuación rápida, intermedia y prolongada, que varían en el comienzo, el pico y la duración de la acción, y se pueden usar en calendarios variables de administración en un intento por regular óptimamente los niveles de glucosa en plasma. La terapia intensiva con insulina se refiere a un régimen riguroso de administración de insulina hormonalmente eficaz, y a la monitorización de los niveles de azúcar en la sangre. Este régimen se diseña para controlar la glucemia de forma tan precisa como sea posible. Los resultados del ensayo multicéntrico del control y de las complicaciones de la diabetes establecieron que las complicaciones de la diabetes disminuyen significativamente mediante un mejor control de los niveles de glucemia, y de este modo demostraron el deseo de la terapia intensiva con insulina. Un problema con este enfoque es que la terapia intensiva con insulina requiere un alto grado de conciencia y de cumplimiento por parte del paciente, así como un equipo sanitario de médicos, enfermeras y bromatólogos altamente especializados. De este modo, las metas de la terapia intensiva con insulina son extremadamente difíciles de lograr, incluso con pacientes motivados y educados. Otro problema es que se observa una mayor tasa de hipoglucemia en tales pacientes rigurosamente tratados que en pacientes que reciben regímenes de insulina estándares, menos rigurosos. El Ensayo de Control y de Complicaciones de la Diabetes resaltó no sólo el beneficio de mantener los niveles normales de glucemia para la salud metabólica general, sino también un problema fundamental asociado con el tratamiento de la diabetes de tipo 1, a saber, que los síntomas manifiestos de la enfermedad se manifiestan sólo cuando se destruyen esencialmente todos los islotes de los pacientes. Los agentes orales para la diabetes, tales como las sulfonilureas, actúan principalmente estimulando la liberación de insulina a partir de células beta disfuncionales, y de este modo no son útiles para la mayoría de los pacientes con la enfermedad de tipo 1, es decir, para aquellos pacientes con IDDM. Un objetivo principal en el tratamiento de la diabetes ha sido el desarrollo de terapias capaces de abortar el ataque autoinmunitario sobre las células beta de los islotes antes de su destrucción total, conservando de ese modo suficiente función endógena para mantener el control metabólico normal.

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Inducción de tolerancia. En el modelo de diabetes de ratón NOD (diabético no obeso), se ha mostrado que la alimentación oral de insulina retrasó el comienzo y redujo la gravedad de la enfermedad. El mecanismo propuesto para explicar la tolerancia oral es que la administración oral de antígenos induce poblaciones de células T Th2, específicas contra antígenos, que segregan citoquinas antiinflamatorias tales como IL-4, IL-10, y TGF-beta. Estas células T circulan y se activan para segregar citoquinas sólo en presencia de su antígeno específico. De este modo, las células T Th2, específicas de la insulina, se activarían sólo en el páncreas, donde producirían citoquinas supresoras para modular el proceso autoinmunitario. Este mecanismo no requiere, por lo tanto, que el antígeno oral represente realmente un autoantígeno específico de la enfermedad, sino más bien sólo que se exprese de una manera específica de tejidos. 6

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Por el contrario, los métodos diseñados para producir tolerancia a las células T (por ejemplo, mediante anergia o apoptosis) requieren la identificación de los autoantígenos reales específicos de la enfermedad, que son seleccionados como dianas mediante el ataque autoinmunitario. Tales antígenos se administran entonces a pacientes de una manera apropiada tolerante (que también puede inducir efectos tolerantes no específicos de antígenos). Dado que la diabetes de tipo 1 es en gran medida una enfermedad mediada por células T autorreactivas específicas de los islotes, en principio la terapia de este tipo debería de ser factible. De este modo, la inducción de tolerancia neonatal a GAD 65, como se cita anteriormente, evitó el comienzo de la enfermedad en ratones NOD. Además, la inyección de extractos brutos de los islotes de forma intratímica, donde tiene lugar la tolerancia para desarrollar células T, también ha protegido tanto a ratones NOD como a ratas BB prediabéticas de desarrollar la enfermedad clínica.

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Un enfoque tomado para inducir tolerancia a la insulina implica la administración parenteral de insulina, en combinación con un adyuvante convencional (por ejemplo, el adyuvante de Freund). Típicamente, este enfoque implica la administración de dosis de insulina que no serían suficientemente grandes para esperar que se provocase un choque insulínico en el paciente. De forma notable, los fragmentos de insulina de las proteínas de fusión quiméricas de la presente invención son hormonalmente ineficaces, y de este modo son adecuados para uso según los métodos de la solicitud PCT WO 97/09061, presentada a nombre de Yi Wang. Apoptosis. La apoptosis es una forma de muerte celular programada que se produce en muchos sistemas biológicos (Kerr et al., 1991; Lockshin y Zakeri, 1991; Cohen et al., 1992; Duvall y Wyllie, 1986; Cotter et al., 1990). Como se explica anteriormente, una célula apoptótica sufre un programa específico de sucesos que dependen del metabolismo activo y contribuyen a su propia autodestrucción. Las células T que no sufren apoptosis, pero que se han activado, llevarán a cabo sus funciones “efectoras” provocando citolisis, o segregando linfoquinas que provocan respuestas de células B u otros efectos inmunitarios (Paul, 1989, p. 3-38). Estas funciones “efectoras” son la causa del daño al tejido en enfermedades autoinmunitarias y en otras enfermedades. Un enfoque poderoso para evitar la enfermedad es, de este modo, eliminar permanentemente, mediante apoptosis, sólo aquellas células T que reaccionen con antígenos que inciten a una enfermedad autoinmunitaria, dejando intacto la mayoría del repertorio de células T. El uso de autoantígenos para llevar a cabo este enfoque se describe en la publicación de patente PCT nº 94/28926, presentada a nombre de Michael J. Lenardo, y titulada “muerte celular de linfocitos T estimulada por interleuquina-2 para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, trastornos alérgicos y rechazo de injertos”, y en la publicación de patente PCT nº 94/03202, presentada a nombre de Michael J. Lenardo, Stefen A. Boehme, y Jeffrey Critchfield, y titulada “muerte celular de linfocitos T estimulada por interleuquina-4”. Transplante. El transplante de páncreas sano, tejido pancreático, o islotes pancreáticos aislados, en pacientes que sufren diabetes de tipo 1, proporciona una modalidad de tratamiento eficaz. Desafortunadamente, la duración del beneficio terapéutico de tales transplantes está actualmente limitada por los mismos fenómenos autoinmunitarios que provocan la enfermedad de tipo 1 en primer lugar. En consecuencia, el tratamiento de un paciente diabético usando las proteínas de fusión quiméricas de la invención según los métodos de la presente invención, cuando se lleva a cabo antes, concomitantemente con, y/o poco después de tal transplante, aumentará la longevidad de tales transplantes y, de ese modo, potenciará el efecto terapéutico de tales procedimientos de transplante.

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Las figuras adjuntas, que se incorporan en la memoria descriptiva y constituyen parte de ella, ilustran ciertos aspectos de la invención, y junto con la descripción sirven para explicar los principios de la invención. Se entenderá, por supuesto, que tanto las figuras como la descripción son solamente explicativas, y no son limitativas de la invención. 45

El documento WO 96/26218 describe péptidos que comprenden proinsulina y un epítopo de GAD 65 y su uso potencial en el tratamiento de IDDM y pre-IDDM. Breve descripción de los dibujos

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La Figura 1a muestra un diagrama esquemático de la proteína de fusión IG1 (SEC ID nº:1). Los números después de las barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican el fragmento peptídico de GAD 65 al que corresponde la región. Para hGAD 65/473-5--, 5-- indica 555. La Figura 1b muestra un diagrama esquemático de la proteína de fusión IG2 (SEC ID nº:2). Los números después de las barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican el fragmento peptídico de GAD 65 al que corresponde la región. Para hGAD 65/473-5--, 5-- indica 555.

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La Figura 1c muestra un diagrama esquemático de la proteína de fusión IG3 (SEC ID nº:3). Los números después de las barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican el fragmento peptídico de GAD 65 al que corresponde la región. Para hGAD 65/473-5--, 5-- indica 519.

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La Figura 2 muestra los resultados de experimentos de IDDM inducida por CYTOXAN, en los que se trataron ratones NOD con seroalbúmina bovina (BSA, como control), con la cadena B de insulina (ICB), con el péptido 250273 de GAD 65 humana, o el péptido 520-555 de GAD 65 humana (un péptido con una secuencia que corresponde a los residuos de aminoácidos 139-173 de SEC ID nº:2). La Figura 3 muestra los resultados de experimentos de IDDM inducida por CYTOXAN, en los que se trataron ratones NOD con seroalbúmina bovina (BSA, como control), o con las siguientes mezclas de cadena B de insulina 7

ES 2 283 084 T3 (ICB) y péptidos de GAD 65 humana: 1) 100 µg de cada uno de ICB y del péptido 250-273 de GAD 65 humana, 2) 250 µg de cada uno de ICB y del péptido 250-273 de GAD 65 humana, 3) 100 µg de cada uno de ICB, del péptido 250-273 de GAD 65 humana, y del péptido 520-555 de GAD 65 humana, y 4) 250 µg de cada uno de ICB, del péptido 250-273 de GAD 65 humana, y del péptido 520-555 de GAD 65 humana. 5

La Figura 4 muestra los resultados de los experimentos de IDDM inducida por CYTOXAN, en los que se trataron ratones NOD con seroalbúmina bovina (BSA, como control) o con 100 µg de la proteína quimérica IG1, 250 µg de la proteína quimérica IG1, 100 µg de la proteína quimérica IG2, o 250 µg de la proteína quimérica IG2. 10

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La Figura 5 muestra los resultados de la transferencia adoptiva de experimentos de IDDM. La Figura 6 muestra un diagrama esquemático de la proteína de fusión IG4 (SEC ID nº:4). Los números después de las barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican la posición del componente del fragmento peptídico indicado en GAD 65 humana nativa a partir del cual se derivó su secuencia, mientras que los números aa en paréntesis indican los números de aminoácidos correspondientes en SEC ID nº:4, y la notación GGG indica la incorporación en ese punto de un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas. La Figura 7 muestra un diagrama esquemático de la proteína de fusión IG5 (SEC ID nº:5). Los números después de las barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican la posición del componente del fragmento peptídico indicado en GAD 65 humana nativa a partir del cual se derivó su secuencia, mientras que los números aa en paréntesis indican los números de aminoácidos correspondientes en SEC ID nº:5, y la notación GGG indica la incorporación en ese punto de un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas. La Figura 8 muestra un diagrama esquemático de la proteína de fusión IG6 (SEC ID nº:6). Los números después de las barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican la posición del componente del fragmento peptídico indicado en GAD 65 humana nativa a partir del cual se derivó su secuencia, mientras que los números aa en paréntesis indican los números de aminoácidos correspondientes en SEC ID nº:6, y la notación GGG indica la incorporación en ese punto de un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas. Como se indica en la leyenda, IG6 comprende, además de las porciones indicadas de insulina humana y GAD 65 humana (hGAD 65), una porción C-terminal de IA-2 humano (hIA2) que abarca los aminoácidos 771-979 de la proteína humana nativa (aminoácidos 176-387 de SEC ID nº:6), con un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas incorporado en el extremo N de esta porción de IA-2. La Figura 9 muestra un diagrama esquemático de la proteína de fusión IG7 (SEC ID nº:7). Los números después de las barras inclinadas hacia la derecha, en la leyenda, indican la posición del componente peptídico de la proteína humana nativa a partir del cual se derivó su secuencia, mientras que los números aa en paréntesis indican los números de aminoácidos correspondientes en SEC ID nº:7, y la notación GGG indica la incorporación en ese punto de un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas. Como se indica en la leyenda, IG7 comprende, además de las porciones indicadas de insulina humana y GAD 65 humana (hGAD 65), una porción C-terminal de IA-2 humano (hIA2) que abarca los aminoácidos 771-979 de la proteína humana nativa (aminoácidos 228-439 de SEC ID nº:7), con un ligador de ruptura de hélice de tres glicinas incorporado en el extremo N de esta porción de IA-2. Sumario de la invención

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A la vista de lo anterior, los objetos de esta invención incluyen la provisión de nuevas proteínas de fusión quiméricas que actúan como entidades moleculares individuales que 1) facilitan la evaluación de diagnóstico y pronóstico de individuos que se sospecha que tienen predisposición a desarrollar IDDM, así como también aquellos que sufren IDDM y/o el síndrome de Stiff-Man, y 2) proporcionan efectos beneficiosos potenciados cuando se administran a animales (incluyendo pacientes humanos) que sufren o tienen riesgo de desarrollar diabetes autoinmunitaria (de tipo 1). Para estos fines, la invención proporciona proteínas de fusión quiméricas que comprenden epítopos tanto de GAD (glutamato descarboxilasa) 65 como de insulina. Preferentemente, la GAD y la insulina son GAD e insulina humanas.

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Según la invención, la combinación de péptidos de GAD 65 y de insulina en una única proteína de fusión proporciona un reactivo de diagnóstico más conveniente para la detección y evaluación del pronóstico de diabetes o del síndrome de Stiff-Man. La explicación del síndrome de Stiff-Man se puede encontrar, por ejemplo, en la patente US nº 5.691.448.

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Según la invención, (y como se establece en los ejemplos, descritos a continuación) la combinación de cadenas y/o péptidos de GAD 65 y de insulina en una única proteína de fusión quimérica proporciona además un compuesto que se puede administrar para proporcionar un tratamiento terapéutico inmunomodulador más eficaz que la combinación de los mismos péptidos y/o cadenas de insulina como fragmentos peptídicos y cadenas de insulina individuales discretos. Más específicamente, las proteínas de fusión quiméricas preferidas de la invención, cuando se estudian en un ensayo en un modelo de ratón de IDDM, proporcionan una reducción en la frecuencia de comienzo de diabetes mayor que una mezcla de control que contiene cantidades equimolares de cada uno de los diversos fragmentos peptídicos y cadenas de insulina individuales discretos comprendidos por la proteína de fusión quimérica, no estando cada uno de dichos fragmentos peptídicos y cadenas de insulina individuales unidos covalentemente a ningún otro de dichos fragmentos peptídicos y cadenas de insulina individuales en dicha mezcla, en el que el ensayo se lleva a cabo mediante la administración parenteral repetida de un número de dosis medidas, teniendo cada dosis una cantidad molar predeterminada de dicha proteína de fusión quimérica en un vehículo farmacéuticamente eficaz, o de dicha mezcla de control en el ve8

ES 2 283 084 T3 hículo farmacéuticamente eficaz, realizándose la administración a intervalos no menores que doce horas y no mayores que 72 horas entre cada una de las dosis.

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Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase “los mismos péptidos y cadenas de insulina como fragmentos peptídicos individuales discretos”, usada en comparación con una proteína de fusión quimérica particular de la invención, indica una combinación de péptidos y cadenas de insulina aislados que no están enlazados covalentemente entre sí (por ejemplo, mediante enlaces peptídicos), en el que la unión (vía enlaces peptídicos) de los péptidos y cadenas de insulina juntos en el orden apropiado (por ejemplo, la misma posición relativa en la secuencia desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, como se encuentra en GAD 65 de longitud completa y en las cadenas de insulina de longitud completa) produciría la proteína de fusión quimérica particular de la invención.

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Aunque no se desea estar atados por ninguna teoría particular de operación, se cree que los complejos efectos de procesamiento y presentación de antígenos in vivo son los responsables de los inesperados efectos sinérgicos procedentes de la combinación de los péptidos y/o polipéptidos de GAD 65 y de insulina en una única proteína de fusión quimérica.

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Las proteínas de fusión quiméricas de la invención combinan cada una en una única entidad molecular los epítopos autoantigénicos clave (inmunodominantes) tanto de la insulina como de GAD 65. Al hacerlo así, proporcionan compuestos de diagnóstico y terapéuticos de un único componente. Las proteínas de fusión quiméricas de la invención proporcionan efectos beneficiosos potenciados tras la administración a animales (incluyendo pacientes humanos), cuando se comparan con la administración de combinaciones de los péptidos individuales que representan los mismos epítopos inmunodominantes tal como están comprendidos dentro de las proteínas de fusión quiméricas. Las proteínas de fusión quiméricas de la invención comprenden la cadena B de insulina (por ejemplo, los aminoácidos 1-31 de la insulina humana), y preferentemente comprenden además la cadena C de insulina (el “fragmento C”, por ejemplo, los aminoácidos 32-38 de insulina humana). Se conocen las secuencias de aminoácidos de las cadenas de insulina. Véase, por ejemplo, la patente US nº 4.431.740 para la descripción de cadenas de insulina, y el contenido de las secuencias de insulina allí. Véase también la patente US nº 5.008.241. Las proteínas de fusión quiméricas de la invención comprenden además al menos un péptido de GAD. Según la invención, el al menos un péptido de GAD es un péptido de GAD 65 seleccionado de entre el grupo que consiste en los péptidos 115-127 de GAD 65 humana (un péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos 3950 de SEC ID nº:2), 247-286 (un péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos 51-90 de SEC ID nº:2), y 473519 (un péptido que corresponde a los residuos de aminoácidos 92-144 de SEC ID nº:2). Se conocen las secuencias de aminoácidos completas de los polipéptidos de GAD 65. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.691.448. Los resultados de estudios descritos más abajo sugieren que la inclusión del péptido 520-555 de GAD 65 humana (un péptido con una secuencia de aminoácidos que corresponde a residuos de aminoácidos 139-173 de SEC ID nº:2) tiene un efecto nocivo con el resultado inmunomodulador de la administración de proteínas o péptidos de insulina y de GAD. En consecuencia, aunque dentro del alcance de la invención, las proteínas de fusión quiméricas que comprenden el péptido 520-555 de GAD 65 humana están desfavorecidas. Las proteínas de fusión quiméricas de la invención no incluyen secuencias peptídicas que corresponden a aquellos péptidos de GAD 65 humana (particularmente aquellos péptidos de GAD 65 aminoterminales) identificados como inhibidores de la solubilidad de GAD en la patente US nº 5.691.448, y que no contienen regiones peptídicas de GAD 65 que están asociadas con la patogénesis del síndrome de Stiff-Man. De este modo, según las enseñanzas de Butler et al., 1993, con respecto a epítopos dominantes de GAD reconocidos por autoanticuerpos en el síndrome de Stiff-Man, las proteínas de fusión quiméricas de la invención no incluyen regiones peptídicas que comprenden los aminoácidos 1-95 de GAD 65; adicionalmente, no incluyen regiones peptídicas que comprenden cualquiera o ambos aminoácidos 475-484 ó 571-585 de GAD 65.

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Preferentemente, los péptidos de GAD están dispuestos adyacentemente entre sí (es decir, sin que intervengan más de aproximadamente tres aminoácidos entre ellos) en el mismo orden como se encuentran en GAD 65, y las cadenas de insulina están dispuestas adyacentemente entre sí en el mismo orden como se encuentran en preproinsulina. En algunas formas de realización de la invención, también se prefiere una disposición en la que las cadenas de insulina están en aminoterminal con respecto a los péptidos de GAD. En algunas formas de realización preferidas, al menos uno (preferentemente cada uno) de los residuos de cisteína en las secuencias de aminoácidos de los diversos antígenos y péptidos antigénicos combinados para formar las proteínas de fusión quiméricas de la invención se sustituye por un aminoácido no cargado (es decir, un aminoácido que no está cargado a un pH entre 6 y 7) que tiene un peso molecular menor que aproximadamente 150. En otra forma de realización preferida, no se sustituye ninguno de tales residuos de cisteína, es decir, no se realizan sustituciones de ninguno de los residuos de cisteína presentes en cualquiera de los diversos antígenos y péptidos antigénicos combinados para formar la proteína de fusión quimérica. Cuando se sustituyen los residuos de cisteína, el aminoácido no cargado es preferentemente un aminoácido estándar. Preferentemente, el aminoácido estándar es alanina o serina. Preferentemente, la sustitución de cisteína por otro aminoácido neutro es una sustitución neutra de epítopo, es decir, no da como resultado una conversión de epítopo en ninguno de los epítopos inmunodominantes conocidos de la proteína de fusión quimérica, particularmente los de GAD o de insulina. 9

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En el documento WO 9634622 (solicitud US nº de serie 08/431.644, presentada el 2 de mayo de 1995 a nombre de Steven H. Nye et al.), por ejemplo en las páginas 34-36 de la memoria descriptiva de esa solicitud tal como se presentó, se pueden encontrar explicaciones detalladas de las sustituciones neutras de epítopos y de la conversión de epítopos. Los expertos en la materia comprenderán fácilmente la aplicación de aquellas enseñanzas a las proteínas de fusión quiméricas de la presente invención.

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Es un objetivo adicional proporcionar métodos inmunomoduladores tanto para la prevención como para el tratamiento de diabetes mellitus de tipo 1 y la mejora de los defectos autoinmunitarios subyacentes a esta enfermedad. En consecuencia, es un objetivo adicional de la invención proporcionar el uso de las proteínas de fusión quiméricas de la invención en la fabricación de medicamentos inmunomoduladores.

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Para alcanzar estos y otros objetos, la invención proporciona métodos para tratar un paciente que necesite tal tratamiento, por ejemplo un paciente seleccionado de entre el grupo de pacientes que consiste en pacientes con riesgo de desarrollar diabetes de tipo 1 y pacientes que sufren diabetes de tipo 1, para retrasar el comienzo o reducir los síntomas de diabetes en el paciente, y/o para mejorar la destrucción autoinmunitaria de las células beta pancreáticas en pacientes tratados. Tal tratamiento es particularmente ventajoso, y preferentemente se lleva a cabo, durante el “período de luna de miel”, durante una fase temprana de la progresión de la enfermedad, antes de que todas las células beta del paciente hayan sido destruidas por la enfermedad, o en una fase tardía de la progresión de la enfermedad, cuando un paciente es un candidato para el transplante de células de los islotes o de tejidos que contienen tales células.

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Estos métodos comprenden la administración de al menos un polipéptido de la invención al paciente. En una forma de realización preferida, dicha administración se lleva a cabo en un programa modulador de células T terapéutico, es decir, un programa diseñado para inducir apoptosis, anergia, u otra modulación de la actividad autoinmunitaria de células T que reaccionan con al menos un epítopo del al menos un polipéptido. Las características particulares de tales programas moduladores de células T terapéuticos se exponen más abajo. Otros métodos preferidos de tratamiento de la invención incluyen la administración de al menos un polipéptido de la invención al paciente mediante las vías oral, intravenosa, o, preferentemente, subcutánea, o vía administración parenteral con, o preferentemente sin, un adyuvante tal como el adyuvante incompleto de Freund, el adyuvante completo de Freund, el adyuvante de alumbre, u otros adyuvantes inmunogénicos conocidos ahora o desarrollados subsiguientemente.

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Descripción detallada de las formas de realización preferidas

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Proteínas de fusión quiméricas. Todos los polipéptidos sintetizados en sistemas biológicos están formados inicialmente con un residuo de metionina N-terminal. Los residuos de aminoácidos N-terminales y C-terminales extremos no se consideran esenciales para el uso funcional de los polipéptidos de la invención, que, aunque no se prefiere particularmente, se pueden producir sin dichos residuos. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden sintetizar químicamente sin las metioninas N-terminales. Las proteínas quiméricas de la invención incluyen así IG1 (que comprende los residuos de aminoácidos que comienzan en aproximadamente el residuo 2 y que terminan en aproximadamente el residuo 153 de SEC ID nº:1), IG2 (que comprende los residuos de aminoácidos que comienzan en aproximadamente el residuo 2 y que terminan en aproximadamente el residuo 173 de SEC ID nº:2). Preferentemente, IG1 comprende los residuos de aminoácidos 1-154 de SEC ID nº:1, e IG2 comprende los residuos de aminoácidos 1-174 de SEC ID nº:2. En ciertas formas de realización preferidas, estas proteínas quiméricas pueden comprender además una etiqueta de histidina (es decir, un tramo de al menos cinco y preferentemente seis residuos de histidina contiguos, lo que facilita la purificación de la proteína de fusión quimérica mediante cromatografía mediante quelación con un metal). Preferentemente, la etiqueta de histidina está localizada en el extremo C extremo de la proteína de fusión quimérica. Las etiquetas de histidina se explican con mayor detalle en el documento WO 9634622 (solicitudes de patentes US nº de serie 08/431.644 y nº 08/482.114). En consecuencia, en algunas de estas formas de realización preferidas, IG1 comprende los residuos de aminoácidos 1-160 de SEC ID nº:1 y tiene un peso molecular predicho de aproximadamente 18,8 kDa, e IG2 comprende los residuos de aminoácidos 1-180 de SEC ID nº:2 y tiene un peso molecular predicho de aproximadamente 21,2 kDa. Consideraciones de las estructuras secundarias

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Al diseñar IG4 (SEC ID nº:4), IG5 (SEC ID nº:5) e IG6 (SEC ID nº:6), se puso atención particular a las estructuras secundarias predichas de los polipéptidos de la invención. IG4 se diseñó inicialmente uniendo hipotéticamente epítopos peptídicos de interés para formar una única secuencia hipotética, IG4NHB (SEC ID nº:8). 60

La predicción de la estructura secundaria de IG4NHB (SEC ID nº:8) según Chou y Fasman, 1978, según Chou 1990, y según Garnier et al., 1978, se realizó usando el programa de ordenador de análisis de secuencia LASERGENE (DNASTAR, Madison WI). Este algoritmo predice la estructura secundaria de proteínas a partir de sus secuencias de aminoácidos. También se pueden usar para este fin otros programas de ordenador de análisis de secuencias, incluyendo otro programa de ordenador comercialmente disponible tal como GCG o MACVECTOR.

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Se predijo que toda la secuencia, desde el aminoácido 77 (Phe 77) hasta el aminoácido 134 (Thr 134), de IG4NHB (SEC ID nº:8) tiene características formadoras de hélice. La tendencia a la formación de hélice larga real disminuye muy rápidamente para secuencias superiores de 20 aminoácidos, no conteniendo las hélices más largas no rotas típi10

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camente más de 26 aminoácidos. De este modo, sería de esperar que la secuencia de 57 aminoácidos formadora de hélice, desde el aminoácido 77 hasta el 134 de IG4NHB (SEC ID nº:8), se rompiese en puntos impredecibles, si no aleatorios, para formar una variedad de estructuras diferentes. Tales estructuras son indeseables en las proteínas de fusión quiméricas, puesto que probablemente tendrían tendencia a la agregación incontrolable, y sería de esperar que difiriesen de las estructuras secundarias nativas de los epítopos en los péptidos aislados comprendidos por las proteínas de fusión quiméricas y en las proteínas nativas de las que se derivan los péptidos (por ejemplo, insulina, GAD 65, o IA-2), cuyas estructuras secundarias nativas se prefieren para los epítopos contenidos dentro de las proteínas de fusión quiméricas. Por lo tanto, en ciertas formas de realización preferidas, se insertan rompedores de hélices (véase el siguiente párrafo) entre los epítopos para 1) bloquear la formación de una hélice muy larga y 2) separar de forma predecible los epítopos en distintas entidades estructurales con distintas estructuras secundarias. Los rompedores de hélices son aminoácidos, o grupos de aminoácidos secuenciales, que actúan bloqueando la propagación de las estructuras secundarias helicoidales en cadenas polipeptídicas nacientes. Se sabe que Gly y Pro son fuertes rompedores de hélices, Asn y Tyr son débiles rompedores de hélices. La inserción de cualquiera de estos aminoácidos o sus combinaciones en un polipéptido tenderá a provocar que una hélice de estructura secundaria polipeptídica naciente termine en el punto de la inserción. Para asegurar la terminación de la hélice y la separación de los epítopos deseados, se prefiere un rompedor de hélices que tenga una longitud de al menos dos aminoácidos (en el que cada uno de los aminoácidos es igual o diferente del otro, y se selecciona del grupo que consiste en Gly, Pro, Asn y Tyr), más preferentemente tal rompedor de hélices tiene una longitud de al menos tres aminoácidos. Lo más preferible, el rompedor de hélices tiene una longitud de exactamente tres aminoácidos. Los rompedores de hélices muy preferidos son Pro-Pro-Pro (SEC ID nº:9) y Gly-Gly-Gly (SEC ID nº:10), siendo éste último el más preferido de estos. Dosificación. Según la presente invención, cuando se usan como agentes terapéuticos, las proteínas quiméricas de la invención se administran a pacientes que necesitan tal tratamiento en cantidades que oscilan desde aproximadamente 6,9 pM/kg/paciente hasta aproximadamente 8,6 µM/kg/paciente. Preferentemente, las cantidades oscilan desde aproximadamente 34,5 pM/kg/paciente hasta aproximadamente 5,2 µM/kg/paciente. Más preferentemente, las cantidades oscilan desde aproximadamente 170 pM/kg/paciente hasta aproximadamente 3,5 µM/kg/paciente. Lo más preferible, las cantidades oscilan desde aproximadamente 0,5 µM/kg/paciente hasta aproximadamente 3,5 µM/kg/paciente.

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En algunos de sus aspectos, la presente invención también proporciona la administración repetida de dosis que contienen menores cantidades de las proteínas de fusión quiméricas de la invención a un paciente que necesite tal tratamiento. Aunque se prefieren menos, en la práctica de la presente invención se pueden usar dosis que contienen cantidades por debajo de aproximadamente 6,9 pM/kg/paciente, y tan bajas como aproximadamente 1 pM/kg/paciente.

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Preferentemente, las proteínas quiméricas se administran sin la administración concomitante de un adyuvante; sin embargo, cuando se usan para realizar ensayos con células T (por ejemplo, en ratones transgénicos tales como los descritos en Wong et al. 1998), la administración inicial a animales experimentales se realiza preferentemente con adyuvante.

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Administración en programas moduladores de células T terapéuticos

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Según la invención, un programa modulador de células T terapéutico implica la administración de dosis que contienen las proteínas quiméricas de la invención, preferentemente en un vehículo farmacéuticamente eficaz, de forma repetida al paciente, al menos dos veces en un intervalo de al menos seis, y preferentemente al menos doce horas, con un intervalo no mayor de siete días, preferentemente no más de 72 horas, más preferentemente no más de 48 horas, y lo más preferible no más de 24 horas entre dosis. Según la presente invención, las proteínas de fusión quiméricas de la invención se administran preferentemente de forma parenteral sin la administración concomitante de un adyuvante. La administración mediante una vía parenteral será típicamente vía inyección, tal como la inyección intravascular (por ejemplo, infusión intravenosa), inyección subcutánea, o inyección intramuscular. Si se desea, se pueden usar otras vías de administración no orales, por ejemplo mucosal, mediante inhalación, transdérmica, mediante ultrasonidos, y similares, y pueden ser practicables para el polipéptido particular a administrar. Aunque menos preferido, las proteínas de fusión quiméricas de la invención también se pueden administrar oralmente; sin embargo, las dosificaciones para la administración oral serán típicamente uno o dos órdenes de magnitud mayores que las explicadas anteriormente en el encabezado de “Dosificación”. Las formulaciones adecuadas para inyección y para otras vías de administración son bien conocidas en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17ª edición (1985). Las formulaciones preferidas para la administración parenteral de las proteínas de la invención son aquellas descritas para la insulina en la USP 23/NF 18 (1995). Las formulaciones parenterales deben ser estériles y apirógenas, y generalmente incluirán un vehículo farmacéuticamente eficaz, tal como disolución salina, disolución salina tamponada (por ejemplo, tamponada con fosfato), disolución de Hank, disolución de Ringer, dextrosa/disolución salina, disoluciones de glucosa, y similares. Las formulaciones también pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según se requiera, tales como agentes que ajustan la tonicidad, agentes humectantes, agentes bactericidas, conservantes, estabilizantes, y similares. 11

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Otras discusiones de la dosificación y administración de polipéptidos usando programas moduladores de células T terapéuticos se pueden encontrar en los documentos WO 9634622 (solicitudes de patentes US nº de serie 08/431.644 y nº 08/482.114) (discutido anteriormente) y WO 9709065 (solicitud de patente US nº de serie 08/565.769, presentada el 1 de diciembre de 1995 a nombre de Yi Wang), para describir de forma más completa el estado de la técnica a la que pertenece la presente invención. Sin pretender limitarla de ninguna manera, la presente invención se describirá de forma más completa mediante los siguientes ejemplos.

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Métodos Experimentales Los ratones diabéticos no obesos (NOD) son una raza de ratones que tienen tendencia a desarrollar diabetes, y representan un sistema de modelo aceptado para el estudio de diabetes mellitus. Estos ratones, denominados NOD/MrkTacfBR, se adquirieron de Taconic Farms (Germantown, NY). Los ratones NOD SCID, denominados NOD/SCID, están disponibles de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. La incidencia de diabetes a los 200 días de edad en estos ratones es de 80% en hembras y 50% en machos. A los 110 días de edad, poco más del 15% de los ratones NOD machos se hicieron diabéticos. Experimentos de inducción con CYTOXAN: El tratamiento con CYTOXAN (ciclofosfamida) puede incrementar la incidencia y acelerar el comienzo de diabetes en ratones NOD no diabéticos. Se inyectaron (ip) ratones NOD machos no diabéticos, seleccionados al azar, que tenían 100 a 110 días, con ciclofosfamida (250 mg/kg) en el día 0. Todos los ratones se sometieron a medida de glucosuria 2-3 veces por semana durante un período de 21 días después de la inyección de ciclofosfamida. El comienzo de la diabetes se registró como el primer punto en el que se obtuvieron dos días consecutivos de resultados positivos de glucosuria. También se midió la glucemia para confirmar los resultados de la glucosuria. (ExacTech, MediSense Inc., Cambridge, MA). En todos los ratones ensayados con glucosuria positiva, los niveles de glucemia fueron mayores que 150 mg/dl. En el día 21, estos ratones se sacrificaron y se examinaron histológicamente. Experimentos en el modelo de transferencia adoptiva de NOD/SCID: Se cosecharon células mononucleares del bazo procedentes de ratones NOD diabéticos de comienzo reciente de la enfermedad (diabéticos desde hace no más de 3 semanas), y aproximadamente 35 x 106 de estas células del bazo en 0,2 ml de PBS se inyectaron intravenosamente en ratones NOD/SCID de 6-8 semanas. El comienzo de la diabetes se monitorizó bisemanalmente mediante el ensayo de glucosuria, y se confirmó mediante ensayo de la glucemia en el día 28 con relación al tiempo de la transferencia de las células del bazo. En el día 28, estos ratones se sacrificaron y se examinaron histológicamente. Reactivos

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Se disolvió CYTOXAN (ciclofosfamida, Mead Johnson Oncology Products) en agua destilada (25 mg/ml). La cadena B de insulina bovina oxidada se adquirió de Sigma (número de catálogo I-6383). Tanto la cadena B de insulina como la proteína de control de BSA (Miles Inc., #81-001) se disolvieron en PBS/HCl 1 M, pH 2, antes de la diálisis contra PBS, pH 7,2, la filtración estéril y el almacenamiento de alícuotas congeladas. Ejemplos

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Genes para la expresión de proteínas quiméricas de la invención

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IG1. Se construyó un gen quimérico sintético, que codifica la proteína quimérica IG1 (SEC ID nº:1), en dos rondas de PCR que solapan (HO et al., 1989). Cada subdominio génico se sintetizó en una reacción de PCR estándar de 100 µl usando 10 pmoles de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos apropiados, como se describe más abajo. El segmento génico 5’ se amplificó usando los cebadores que solapan: prIG1 (SEC ID nº:11) y prIG2 (SEC ID nº:12). El segmento génico 3’ se amplificó usando los cebadores que solapan prIG3 (SEC ID nº:13) y prIG4 (SEC ID nº:14). El oligonucleótido prIG1 (SEC ID nº:11) se diseñó para permitir la creación de un único sitio de restricción NdeI en el extremo 5’. El cebador de prIG4 (SEC ID nº:14) incluyó un único sitio BamHI, un codón de parada (TAA) y 18 nucleótidos que codificaron una secuencia de etiqueta de histidina para la purificación de la proteína quimérica recombinante mediante cromatografía de afinidad metálica. Los dos subdominios se combinaron usando oligonucleótidos de flanqueo prIG5 (SEC ID nº:15) y prIG6 (SEC ID nº:16) en una segunda reacción de PCR, para producir un producto génico de 492 pb. El producto de la PCR se clonó en el vector plasmídico de expresión pCR2.1 como se describe por el proveedor (Invitrogen, San Diego, CA). Se seleccionaron transformantes DH10B resistentes a canamicina, y los clones correctos y las orientaciones se determinaron mediante restricción y análisis de la secuencia. Se combinaron fragmentos de restricción procedentes de dos clones (nº 6 y nº 18), para eliminar las mutaciones indeseadas. Tras el análisis de la secuencia nucleotídica, se digirió un plásmido independiente pCR2.1IG1 con NdeI y BamHI, y el fragmento de 492 pb se insertó en los sitios compatibles del plásmido de expresión MP4 pET22b-MP4 (Elliott et al., 1996), produciendo el plásmido pIG1. El inserto procedente de pCR2.1-IG1 también se subclonó en el vector plasmídico pBLUSCRIPTSK+ (STRATAGENE CLONING SYSTEMS, La Jolla; CA) para producir el plásmido pSK+IG1. El gen IG1 sintético (SEC ID nº:17) codifica una proteína de fusión quimérica con una masa predicha de aproximadamente 18,8 kDa. 12

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IG2. Se construyó un gen quimérico sintético, que codifica la proteína quimérica IG2 (SEC ID nº:2), mediante amplificación por PCR de un fragmento génico IG1 interno usando pIG1 como molde junto con el cebador de sentido prIG7 (5’-AGATCTGATG AACATTCTGC TGCAGTATGT TGTTAAAAGC TTCGATAACA TGTATGCCAT GATG-3’ - SEC ID nº:18; se subraya el sitio de BglII) en combinación con el cebador oligonucleotídico antisentido prIG8 (5’-TGTACAGATA TTCCGCCAGT TCCAGACATT TTTTCAGAGA AAAATGGCTA TGTTCAGAGG TAAAGGCAAT CAGACGCG-3’ - SEC ID nº:19; se subraya el sitio de BsrG1). El fragmento de PCR de BglII-BsrG1 de 197 pb se subclonó en pCR2.1. El análisis de secuencias reveló una sustitución C > G en la posición 183 en la hebra codificante del fragmento de PCR de BglII-BsrG1 de 197 pb para todos los subclones analizados, y el plásmido se denominó pCR2.1-IG7/8C183G. El análisis subsiguiente reveló un error en la secuencia del cebador prIG8 original (SEC ID nº:19). Se sintetizó un cebador de reparación, prIG12 (SEC ID nº:20), para corregir la sustitución C > G en pCR2.1-IG7/8C183G. El segmento de ADN de BglII-BsrG1 de 197 pb interno se corrigió mediante PCR usando pCR2.1-IG7/8C183G como molde junto con los cebadores prIG7 (SEC ID nº:18) y prIG12 (SEC ID nº:20). Los fragmentos de la PCR se subclonaron en pCR2.1, su secuencia se determinó usando una secuenciación didesoxi estándar, para confirmar que se había obtenido la secuencia deseada, y se aisló y se amplificó un único clon denominado pCR2.1-IG7/12. El fragmento de restricción de BglII-BsrG1 de 137 pb en pSK+IG1 se intercambió con el fragmento de BglIIBsrG1 de 197 pb procedente de pCR2.1-IG7/12, para crear pSK+/IG7/12. El fragmento de NdeI-BamHI de 552 pb procedente de pSK+/IG7/12 se subclonó en los sitios compatibles de pIG1, para crear el plásmido pIG2. El gen de IG2 sintético (SEC ID nº:21) codifica una proteína de fusión quimérica con una masa predicha de aproximadamente 21,2 kDa. IG3. Se construyó un gen quimérico sintético, que codifica la proteína quimérica IG3 (SEC ID nº:3), eliminando un fragmento de restricción de NdeI-BamHI de 552 pb a partir del plásmido pET22b-IG2 y sustituyéndolo por un producto de PCR de 444 pares de bases digerido mediante NdeI-BamHI. Este producto de PCR de 444 pares de bases se obtuvo usando los cebadores prIG5 (SEC ID nº:15) y prIG13 (SEC ID nº:22), con el gen IG2 sintético como molde. El gen IG3 sintético (SEC ID nº:23) codifica una proteína de fusión quimérica con una masa predicha de aproximadamente 17,1 kDa. IG4. Se presenta más abajo, como SEC ID nº:24, una secuencia génica que codifica la proteína quimérica IG4 (SEC ID nº:4), y codifica una proteína de fusión quimérica con una masa predicha de aproximadamente 19,8 kDa. IG5. Se construyó un gen quimérico sintético, que codifica la proteína quimérica IG5 (SEC ID nº:5), vía ligación de productos de PCR usando cebadores prIG14 (SEC ID nº:25), prIG15 (SEC ID nº:26), prIG16 (SEC ID nº:27), prIG17 (SEC ID nº:28), prIG18 (SEC ID nº:29), prIG19 (SEC ID nº:30), prIG20 (SEC ID nº:31), prIG21 (SEC ID nº:32), prIG22 (SEC ID nº:33), y prIG23 (SEC ID nº:34). El gen sintético de IG5 (SEC ID nº:35) codifica una proteína de fusión quimérica con una masa predicha de aproximadamente 25,3 kDa. IG6. Se presenta más abajo, como SEC ID nº:36, una secuencia génica que codifica una proteína quimérica IG6 (SEC ID nº:6), y codifica una proteína de fusión quimérica con una masa predicha de aproximadamente 43,7 kDa. IG7. Se presenta más abajo, como SEC ID nº:37, una secuencia génica que codifica la proteína quimérica IG7 (SEC ID nº:7), y codifica una proteína de fusión quimérica con una masa predicha de aproximadamente 49,2 kDa.

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Expresión y purificación de proteínas de fusión IG recombinantes. Para cada construcción plasmídica de expresión de la proteína de fusión IG que se expresó bacterianamente, se transformó la cepa BL21(DE3) electrocompetente de E. coli con el plásmido de expresión, y se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina para cultivo líquido. El lisógeno 1DE3 en la cepa BL21(DE3) contiene el gen para T7 polimerasa detrás del promotor lacUV5 de E. coli para la expresión eficiente de genes diana bajo el control de las fuertes señales transcripcionales y de traducción del bacteriófago T7 (Studier et al., 1990). La proteína de fusión quimérica recombinante se purificó a partir de peletes solubilizados de células completas mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, y se analizó mediante SDS-PAGE/tinción con azul de Coomassie. Se hicieron crecer cuatro litros de cultivos hasta una OD600 de 0,8 en medio Terrific Broth (TB) (Sambrook et al., 1992). La expresión de la proteína se indujo durante 5 horas con 1 mM de isopropiltiogalactósido (IPTG). Las células inducidas se cosecharon mediante centrifugación, y se congelaron toda la noche a -20ºC. Los peletes celulares se descongelaron a temperatura ambiente y se homogeneizaron en 10 ml/g de Tampón A (6 M de guanidina-HCl/glicerina al 10%/20 mM de Tris-Cl pH 7,8/500 mM de NaCl/200 mg de sulfito de sodio/280 mg de tetrationato de sodio), usando un homogeneizador TEKMAR (The Tekmar Co., Cincinnati, OH). Las células se congelaron a -70ºC durante 1 hora, y se descongelaron a temperatura ambiente para promover la lisis celular. La suspensión celular se mezcló suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente usando un agitador magnético. La fracción soluble que contiene la proteína IG se recogió como el sobrenadante tras la centrifugación del lisado celular a 10.000 x g durante 30 min. a 4ºC en un rotor Beckman JA-10. El sobrenadante se cargó en una columna de Ni-NTA (QIAGEN Inc., Chadsworth, CA) equilibrada previamente en Tampón A a un caudal de 8 ml/min. La columna se lavó hasta una absorbancia inicial usando Tampón A. La columna se lavó posteriormente con Tampón B (6 M de urea/glicerina al 10%/20 mM de Tris-Cl/500 mM de NaCl, pH 7,8), y las proteínas de E. coli contaminantes se eliminaron con Tampón C (6 M de urea/glicerina al 10%/20 mM de Tris-Cl/500 mM de NaCl, pH 5,0). La proteína IG se eluyó con Tampón D (6 M de urea/glicerina al 10%/20 mM de Tris-Cl/500 mM de NaCl, pH 4,0). Todas las 13

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fracciones se recogieron en un lote y se analizaron en un gradiente de SDS-gel de poliacrilamida al 4-20%, en presencia de un agente reductor. Las fracciones que contienen IG (lavado con Tampón D) se concentraron 10 veces usando AMICON STIRCELL que usa una membrana PM10. La muestra se dializó contra dos cambios de agua MILLI-Q a 4ºC. Las preparaciones de IG se esterilizaron por filtración, y la concentración se determinó espectrofotométricamente usando un factor de conversión de 1,06 mg/ml/OD280 . Se analizaron cinco microgramos en condiciones reductoras y no reductoras mediante SDS-PAGE, para obtener una indicación inicial de pureza e integridad de las preparaciones proteínicas. Tratamiento con proteínas de fusión quiméricas - modelo de CYTOXAN: Se inyectaron intravenosamente, dos veces al día, grupos de ratones NOD seleccionados al azar ya sea con BSA como control, o con péptidos de GAD, con cadena B de insulina (ICB) o con diversas combinaciones de péptidos de GAD y/o cadena B de insulina, a las dosis indicadas en las figuras en los días 1, 3 y 5 tras el tratamiento con CYTOXAN (día 0). Los animales que recibieron inyecciones de BSA (controles) manifestaron una incidencia mayor que el 80% de diabetes a los 21 días tras la inducción con CYTOXAN (Fig. 2). Por el contrario, los animales tratados con ICB o con los péptidos 250-273 ó 520-555 de GAD 65 experimentaron reducciones hasta una incidencia de menos del 50% de la diabetes. Se examinaron entonces (Fig. 3) los efectos terapéuticos del tratamiento con combinaciones de ICB y los dos péptidos de GAD. La reducción en la incidencia de la diabetes hasta un 25% menos se logró mediante la combinación de GAD 250-273 e ICB a dosis de 100 µg ó 250 µg por inyección. Sorprendentemente, la adición del péptido 520-555 de GAD (residuos de aminoácidos 139-173 de SEC ID nº:2) parece inhibir la eficacia terapéutica de la ICB con la combinación con GAD 65 250-273. La evaluación en el modelo de CYTOXAN de las proteínas de fusión quiméricas IG1 e IG2 de la invención mostró que el tratamiento con cualquiera de estos polipéptidos medió una reducción dependiente de la dosis en la incidencia de la diabetes, en comparación con los animales del control tratados con BSA (Fig. 4). En este experimento, las dosis de 300 µg fueron más eficaces que las dosis de 100 µg, e IG2 redujo la incidencia de diabetes hasta un grado mayor que IG1. El tratamiento con dosis de 300 µg de IG2 redujo la incidencia de la enfermedad a menos del 12%, en comparación con una incidencia de la enfermedad mayor que ele 80% en los animales del control tratados con BSA. Tratamiento con proteínas de fusión quiméricas - modelo de transferencia adoptiva: Se cosecharon células mononucleares del bazo diabetogénicas a partir de ratones NOD recientemente diabéticos (comienzo desde hace menos de 3 semanas previas). Para iniciar la destrucción de las células beta de los islotes y el desarrollo de diabetes, se inyectaron intravenosamente ratones NOD/SCID de 8-12 semanas con 35 x 106 células de bazo diabetogénicas. La incidencia y el comienzo de diabetes se monitorizó bisemanalmente mediante ensayo de glucosuria, y se confirmó mediante ensayo de glucemia al final del experimento. El tiempo medio de comienzo de la diabetes después de la inducción de la enfermedad fue aproximadamente 25 días. El tratamiento IV con IG2, IG3 o con antígenos de células beta de los islotes se inició en el día 3º. Los animales se trataron con 300 µg de antígeno dos veces al día cada dos días, durante un período de seis días (desde el día 3 hasta el día 9, en el que el tiempo de la transferencia de las células del bazo fue el día 0). Los resultados de estos experimentos se presentan en la Figura 5. Sorprendentemente, demuestran que sólo la proteína de fusión quimérica IG2 evitó el comienzo de la enfermedad en los receptores NOD/SCID. Por el contrario, en este modelo sólo se observó un ligero retraso en el comienzo de la enfermedad en receptores de IG1, de la cadena B de insulina (ICB) o de la combinación de ICB y del péptido 250-273 de GAD. Estas profundas diferencias en los efectos del tratamiento con IG2 en comparación con los otros regímenes de tratamiento fueron inesperadas. Sin desear estar atados por ninguna teoría particular de operación, se cree que este hallazgo inesperado es un resultado del procesamiento in vivo de IG2 en péptidos antigénicos únicos que son particularmente eficaces provocando un estado de tolerancia inmunitaria que protege contra la diabetes autoinmunitaria, incluso en las condiciones exigentes que resultan de la exposición con poblaciones de células T heterogéneas derivadas de los bazos de ratones NOD completamente diabéticos.

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1. Proteína de fusión quimérica que comprende un extremo amino y un extremo carboxilo, en la que la proteína comprende la cadena B de insulina y fragmentos peptídicos individuales que consisten en al menos un péptido(s) de GAD 65 capaz de provocar una respuesta de células T humanas, en la que la cadena B de insulina y el al menos un péptido(s) de GAD 65 humana están enlazados covalentemente y la proteína de fusión quimérica es capaz de provocar una respuesta de células T humanas a la cadena B de insulina y a cada uno del al menos un péptido(s) de GAD 65, en la que la proteína de fusión quimérica se denomina IG1 que comprende los residuos de aminoácidos 2 a 154 de SEC ID nº:1. 2. Proteína de fusión quimérica que comprende un extremo amino y un extremo carboxilo, en la que la proteína comprende la cadena B de insulina y fragmentos peptídicos individuales que consisten en al menos un péptido(s) de GAD 65 capaz de provocar una respuesta de células T humanas, en la que la cadena B de insulina y el al menos un péptido(s) de GAD 65 humana están enlazados covalentemente y la proteína de fusión quimérica es capaz de provocar una respuesta de células T humanas a la cadena B de insulina y a cada uno del al menos un péptido(s) de GAD 65, en la que la proteína de fusión quimérica se denomina IG2 que comprende los residuos de aminoácidos 2 a 174 de SEC ID nº:2. 3. Proteína de fusión quimérica según la reivindicación 1 ó 2, en la que, cuando se ensaya en un ensayo en un modelo de ratón de IDDM, la proteína de fusión quimérica proporciona una reducción en la frecuencia del comienzo de diabetes mayor que una mezcla de control que contiene cantidades equimolares de cada uno de los diversos fragmentos peptídicos individuales comprendidos por la proteína de fusión quimérica, no estando cada uno de dichos fragmentos peptídicos individuales y las cadenas de insulina enlazados covalentemente a ningún otro de dichos fragmentos peptídicos individuales y cadenas de insulina en dicha mezcla, en la que el ensayo se lleva a cabo mediante la administración parenteral repetida de un número de dosis medidas, teniendo cada dosis una cantidad molar predeterminada de dicha proteína de fusión quimérica en un vehículo farmacéuticamente eficaz o de dicha mezcla de control en el vehículo farmacéuticamente eficaz, realizándose la administración a intervalos no menores de doce horas y no mayor de 72 horas entre cada una de las dosis.

30

4. Proteína de fusión quimérica según la reivindicación 3, en la que el modelo de ratón de IDDM es el modelo de diabetes inducida por CYTOXAN del ratón NOD. 35

5. Proteína de fusión quimérica según la reivindicación 3, en la que el modelo de ratón de IDDM es el modelo de diabetes de transferencia adoptiva del ratón NOD/SCID.

40

6. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 en la preparación de un medicamento para tratar un paciente seleccionado de entre el grupo que consiste en: pacientes que se predice que tienen riesgo de desarrollar diabetes de tipo 1 y pacientes que sufren diabetes de tipo 1, en el que el uso comprende la administración repetida de una dosis de una cantidad medida del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2. 7. Uso según la reivindicación 6, en el que la administración repetida comprende la administración de al menos dos dosis en un intervalo no menor de doce horas y no mayor de 72 horas.

45

50

8. Proteína de fusión quimérica que comprende un extremo amino y un extremo carboxilo, en la que la proteína comprende la cadena B de insulina y fragmentos peptídicos individuales que consisten en uno o más péptidos de GAD 65 capaces de provocar una respuesta de células T humanas, en la que la cadena B de insulina y el uno o más péptidos de GAD 65 humana están enlazados covalentemente y la proteína de fusión quimérica es capaz de provocar una respuesta de células T humanas a la cadena B de insulina y a uno o más de los péptidos de GAD 65, en la que el péptido de GAD 65 se selecciona del grupo que consiste en GAD 65 115-127 (residuos de aminoácidos 39-51 de SEC ID nº:2), GAD 65 247-286 (residuos de aminoácidos 52-91 de SEC ID nº:2), y GAD 65 473-519 (residuos de aminoácidos 92-138 de SEC ID nº:2), y en la que la proteína de fusión no comprende los péptidos de GAD seleccionados de cualquiera de los siguientes: los residuos 1-95 de GAD 65; los residuos 475-484 de GAD 65; los residuos 520-554 de GAD 65 y los residuos 571-585 de GAD 65.

55

9. Proteína de fusión quimérica según la reivindicación 8, en la que la proteína comprende por orden, partiendo desde el extremo amino, los péptidos 115-127, 247-286 y 473-519 de GAD 65 humana. 60

10. Proteína de fusión quimérica según la reivindicación 9, en la que la proteína comprende por orden, partiendo desde el extremo amino, la cadena B de insulina, la cadena C de insulina y los péptidos 115-127, 247-286 y 473-519 de GAD 65 humana.

65

19

ES 2 283 084 T3

20

ES 2 283 084 T3

21

ES 2 283 084 T3

22

ES 2 283 084 T3

23

ES 2 283 084 T3

24

ES 2 283 084 T3

25

ES 2 283 084 T3

26

ES 2 283 084 T3

27

ES 2 283 084 T3

28

ES 2 283 084 T3 LISTA DE SECUENCIAS

5

Wang, Yi Mueller, John P. Matis, Louis A. Proteínas quiméricas y sus usos para el diagnóstico, prevención y tratamiento de diabetes

10

ALX-156 PCT No asignado todavía 18-12-1998

15

20

60/068.648 22-12-1997 37 PatentIn Ver. 2.0

25

1 160 PRT Secuencia artificial

30

Descripción de la secuencia artificial: proteína de fusión IG1 35

1

40

45

50

55

60

65

2 180 PRT Secuencia artificial

1

ES 2 283 084 T3 Descripción de la secuencia artificial: proteína de fusión IG2 5

2

10

15

20

25

30

35

40

45

3 144 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: proteína de fusión IG3

50

55

60

65

2

ES 2 283 084 T3 3

5

10

15

20

25

30

4 181 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: proteína de fusión IG4

35

4

40

45

50

55

60

65

3

ES 2 283 084 T3

5

5 232 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: proteína de fusión IG5

10

5

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 393 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: proteína de fusión IG6

65

4

ES 2 283 084 T3 6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7 444 PRT Secuencia artificial 5

ES 2 283 084 T3 Descripción de la secuencia artificial: proteína de fusión IG7 5

7

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

8 173

6

ES 2 283 084 T3 PRT Secuencia artificial 5

Descripción de la secuencia artificial: proteína de fusión hipotética IG4NHB 8

10

15

20

25

30

35

40

45

9 3 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: rompedor de hélice 9

50

55

60

Pro Pro Pro 1 10 3 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: rompedor de hélice 10

65

Gly Gly Gly 1 7

ES 2 283 084 T3

5

11 139 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG1

10

11

15

20

25

12 143 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG2 12

30

35

40

45

50

55

13 138 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG3 13

14 132 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG4

60

14

65

15 8

ES 2 283 084 T3 18 ADN Secuencia artificial 5

Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG5 10

15 catatgttcg ttaaccag

15

18

16 18 ADN Secuencia artificial

20

Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG6 25

16 ggatccttaa tggtgatg

30

18

17 492 ADN Secuencia artificial

35

Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG1 40

17

45

50

55

60

18 64 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG7 18

65

9

ES 2 283 084 T3

5

19 78 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG8

10

19

15

20

20 27 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG12

25

20 tgtacagata ttccgccagt tccagac 30

35

27

21 552 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG2

40

21

45

50

55

60

22 46 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG13

65

22 ggatccttaa atggtgatgg tgatggtggt tatcttccag ggtacg

46 10

ES 2 283 084 T3

5

23 444 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG3

10

23

15

20

25

24 555 ADN Secuencia artificial

30

Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG4 24

35

40

45

50

25 24 ADN Secuencia artificial

55

Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG14 25

60

65

catatgttcg ttaaccagca tctg

24

26 69 ADN Secuencia artificial 11

ES 2 283 084 T3 Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG15 5

10

15

26

27 66 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG16

20

27

25

30

35

28 69 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG17 28

40

45

29 69 ADN Secuencia artificial

50

Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG18 29

55

60

30 69 ADN Secuencia artificial

65

Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG19 12

ES 2 283 084 T3 30

5

10

31 68 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG20

15

31

20

25

32 69 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG21

30

32

35

40

45

50

33 60 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG22 33 ttagggattg gaacagacag cgtgattgga ggcggttaca tcccgccgag cctgcgtacc

55

60

65

60

34 24 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: cebador prIG23 34 ggatccttaa tggtgatggt gatg

24 13

ES 2 283 084 T3

5

35 708 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG5

10

35

15

20

25

30

35

36 1191 ADN Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG6 36

40

45

50

55

60

65

37 1344 14

ES 2 283 084 T3 ADN Secuencia artificial 5

Descripción de la secuencia artificial: secuencia codificante de la proteína de fusión IG7 37

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15