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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 234 768

51 Int. Cl. : C07C 211/27

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C07C 211/30 C07C 217/58 C07C 211/28 A61K 31/135

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 01204920 .1

86 Fecha de presentación: 23.10.1995

87 Número de publicación de la solicitud: 1203761

87 Fecha de publicación de la solicitud: 08.05.2002

54 Título: Compuestos capaces de modular la actividad del receptor de calcio.

30 Prioridad: 21.10.1994 WO PCT/US94/12117

08.12.1994 US 353784

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.07.2005

73 Titular/es: NPS PHARMACEUTICALS, Inc.

420 Chipeta Way, Suite 240 Salt Lake City, Utah 84108-1256, US

72 Inventor/es: Van Wagenen, Bradford C.;

Balandrin, Manuel F.; Moe, Scott T.; Delmar, Eric G. y Nemeth, Edward F.

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

ES 2 234 768 T3

01.07.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 234 768 T3 DESCRIPCIÓN Compuestos capaces de modular la actividad del receptor de calcio. 5

Campo de la invención La presente invención se refiere al diseño, desarrollo, composición y utilización de compuestos capaces de modular una o más actividades de receptores iónicos inorgánicos.

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Antecedentes de la invención Ciertas células en el organismo responden no sólo a señales químicas, sino también a iones tales como los del calcio extracelular (Ca2+ ). Cambios en la concentración del Ca2+ extracelular (al que en la presente memoria se aludirá como “[Ca2+ ]”), alteran las respuestas funcionales de estas células. Una célula que se especializa de este modo es la paratiroidea, que secreta la hormona paratiroidea (PTH). PTH es el principal factor endocrino que regula la homeostasis del Ca2+ en la sangre y en los fluidos extracelulares.

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PTH, actuando sobre las células óseas y renales, aumenta el nivel de Ca2+ en la sangre. Este aumento en [Ca2+ ] actúa entonces como una señal de retroacción negativa, disminuyendo la secreción de PTH. La relación recíproca entre la secreción de [Ca2+ ] y la de PTH constituye el mecanismo esencial que mantiene la homeostasis corporal del Ca2+ .

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El Ca2+ extracelular actúa directamente sobre las células paratiroideas para regular la secreción de PTH. Se ha confirmado la existencia de una proteína superficial de la célula paratiroidea que detecta cambios en [Ca2+ ]. Brown et al., 366 Nature 574, 1993. En las células paratiroideas, esta proteína actúa como un receptor para el Ca2+ extracelular (“el receptor cálcico”), y detecta cambios en [Ca2+ ] y para iniciar una respuesta celular funcional, la secreción de PTH.

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El Ca2+ extracelular puede ejercer efectos sobre distintas funciones celulares, revisadas en Nemeth et al., 11 Cell Calcium 319, 1990. El papel del Ca2+ extracelular en las células parafoliculares (células-C) y en las células paratiroideas, es considerado en Nemeth, 11 Cell Calcium 323, 1990. Se ha mostrado que estas células expresan receptores similares de Ca2+ . Brown et al., 366 Nature 574, 1993; Mithal et al., 9 Supl. 1 J. Bone and Mineral Res. s282, 1994; Rogers et al., 9 Supl. 1 J. Bone and Mineral Res. s409, 1994; Garret et al., 9 Supl. 1 J. Bone and Mineral Res. s409, 1994. El papel del Ca2+ extracelular sobre los osteoclastos óseos se considera en Zaidi, 10 Bioscience Reports 493, 1990. Además los queratinocitos, las células yuxtaglomerulares, los trofoblastos, las células beta pancreáticas y las células grasas/adiposas responden todas a aumentos en el calcio extracelular que reflejan probablemente la activación de los receptores cálcicos de estas células.

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La capacidad de varios compuestos para imitar al Ca2+ extracelular in vitro se trata en Nemeth et al., (espermina y espermidina) en “Calcium-Binding Proteins in Health and Disease”, 1987, Academic Press, Inc., páginas 33-35; Brown et al., (por ejemplo, neomicina) 128 Endocrinology 3047, 1991; Chen et al., (diltiazem and its analog, TA3090) 5 J. Bone and Mineral Res. 581, 1990; y Zaidi et al., (verapamil) 167 Biochem. Biophys. Res. Commun. 807, 1990. Nemeth et al., PCT/US93/01642, Publicación internacional nº WO 94/18959, y Nemeth et al, PCT/US92/07175, Publicación internacional número WO 93/04373, describen varios compuestos que pueden modular el efecto de un ión inorgánico sobre una célula que posea un receptor iónico inorgánico.

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Las referencias que se proporcionan en el apartado titulado “Antecedentes de la invención” no se admiten como técnica anterior. Sumario de la invención

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La presente invención describe compuestos capaces de modular una o más actividades de un receptor iónico inorgánico y procedimientos para tratar enfermedades o trastornos modulando la actividad de los receptores de iones inorgánicos. Los compuestos pueden imitar o bloquear el efecto del calcio extracelular sobre un receptor cálcico superficial celular.

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Las enfermedades o trastornos que pueden ser tratados modulando la actividad de los receptores de iones inorgánicos incluyen uno o más de los tipos siguientes: (1) los caracterizados por una homeostasis anormal de los iones inorgánicos, preferentemente de la homeostasis cálcica; (2) los caracterizados por una cantidad anormal de un mensajero intra o extracelular, cuya producción pueda verse afectada por la actividad de los receptores iónicos inorgánicos, preferentemente por la actividad del receptor cálcico; (3) los caracterizados por un efecto anormal (por ejemplo, un efecto distinto en la índole o en la magnitud) de un mensajero intra o extracelular que puede él mismo mejorarse por la actividad del receptor iónico inorgánico, preferentemente la actividad del receptor cálcico; y (4), otras enfermedades o trastornos en los que la modulación de la actividad del receptor iónico, preferentemente la actividad del receptor cálcico, ejerza un efecto beneficioso, por ejemplo, en patologías o trastornos en los que la producción de un mensajero intra o extracelular estimulado por la actividad del receptor, compense una cantidad anormal de un mensajero distinto. Ejemplos de mensajeros extracelulares cuya secreción y/o efecto pueda verse afectada por la modulación de la actividad de los receptores iónicos inorgánicos incluyen los iones inorgánicos, hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, y quimioquinas. Ejemplos de mensajeros intracelulares incluyen AMPc, cGMP, IP3 , y diacilglicerol.

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De este modo, un compuesto de la presente invención modula preferentemente la actividad del receptor cálcico y se utiliza en el tratamiento de enfermedades o trastornos que pueden verse afectados por la modulación de una o más actividades de un receptor cálcico. Las proteínas del receptor cálcico permiten que ciertas células especializadas respondan a cambios en la concentración del Ca2+ extracelular. Por ejemplo, el Ca+2 extracelular inhibe la secreción de la hormona paratiroidea a partir de las células paratiroideas, inhibe la resorción ósea por los osteoclastos, y estimula la secreción de calcitonina a partir de las células-C. En una forma de realización preferida, el compuesto se utiliza para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por una homeostasis mineral y ósea anormal, más preferentemente la homeostasis cálcica. El Ca2+ extracelular se encuentra bajo un férreo control homeostático y controla varios procesos, tales como la coagulación sanguínea, la excitabilidad muscular y nerviosa, y una formación ósea apropiada. La homeostasis cálcica anormal se caracteriza por una o más de las actividades siguientes: (1) una elevación o disminución anormal en el calcio sérico; (2) una elevación o disminución anormal en la excreción urinaria de calcio; (3) una elevación o disminución anormal en los niveles de calcio óseo, por ejemplo, tal como se valora mediante mediciones de la densidad mineral ósea; (4) una absorción anormal del calcio dietético; (5) una elevación o disminución anormal en la producción y/o la liberación de mensajeros que afectan a los niveles séricos de calcio, tal como la hormona paratiroidea y la calcitonina; y (6) un cambio anormal en la respuesta provocada por los mensajeros que afecta a los niveles séricos de calcio. El aumento o disminución anormal en estos distintos aspectos de la homeostasis del calcio, se refiere a lo que ocurre en la población general y se asocia generalmente con una enfermedad o trastorno.

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Las enfermedades y trastornos que se caracterizan por la homeostasis anormal del calcio, pueden deberse a distintos defectos celulares tales como una actividad receptora cálcica defectuosa, un número defectuoso de receptores del calcio, o una proteína intracelular defectuosa guiada por un receptor del calcio. Por ejemplo, en las células paratiroideas, el receptor cálcico se une a la proteína Gi , que a su vez inhibe la producción de AMP cíclico. Los defectos en la proteína Gi pueden afectar a su capacidad para inhibir la producción de AMP cíclico. De este modo, un primer aspecto de la invención describe un compuesto de estructura:

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o una sal o complejo farmacéuticamente aceptable del mismo. 40

Los compuestos según la invención comprenden por lo tanto un compuesto de la estructura (I) anterior, así como sus sales y complejos farmacéuticamente aceptables. 45

Los compuestos de la presente invención poseen una estereo-química preferida. El CH3 de la Estructura I se encuentra en un centro quiral y proporciona una estructura α-(R)-metilo. Las actividades del receptor de iones inorgánicos son aquellos procesos provocados como resultado de la activación del receptor del ión inorgánico. Dichos procesos incluyen la producción de moléculas que pueden actuar como mensajeros intra o extracelulares.

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El compuesto que modula el receptor del ión inorgánico incluye ionomiméticos, ionolíticos, calcimiméticos y calcilíticos. Los ionomiméticos son compuestos que se unen a un receptor iónico inorgánico e imitan (es decir., producen o potencian) los efectos de un ión inorgánico en un receptor iónico inorgánico. Preferentemente, el compuesto afecta a una o más actividades del receptor cálcico. Los calcimiméticos son ionomiméticos que afectan a una o más actividades del receptor cálcico y se unen a un receptor de calcio.

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Los ionolíticos son compuestos que se unen a un receptor iónico inorgánico y bloquean (es decir., inhiben o disminuyen) una o más actividades causadas por un ión inorgánico en un receptor iónico inorgánico. Preferentemente, el compuesto afecta a una o más actividades del receptor cálcico. Los calcilíticos son ionolíticos que bloquean una o más actividades del receptor cálcico producidas por el calcio extracelular y que se unen a un receptor del calcio.

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Los ionomiméticos y los ionolíticos pueden unirse al mismo sitio receptor, pues el ligando iónico inorgánico nativo se une o puede unirse a un sitio diferente (por ejemplo, un sitio alostérico). Por ejemplo, la unión de NPS R-467 a un receptor cálcico da lugar a la actividad del receptor cálcico y, de este modo, NPS R-467 se clasifica como un calcimimético. Sin embargo NPS R-467 se une al receptor cálcico en un sitio diferente (es decir., un sitio alostérico) que el calcio extracelular. Puede realizarse una medición de la efectividad de un compuesto calculando la EC50 o la IC50 para ese compuesto. 3

ES 2 234 768 T3 La EC50 es la concentración de un compuesto que provoca la mitad de un efecto imitativo máximo. La IC50 es la concentración del compuesto que causa la mitad de un efecto bloqueante máximo. 5

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Para los compuestos en un receptor cálcico, pueden determinarse EC50 e IC50 ensayando una o más de las actividades del calcio extracelular en un receptor cálcico. Ejemplos de ensayos para la medición de EC50 e IC50 se describen en Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959, y Nemeth et al, PCT/US92/017175, Publicación internacional número WO 93/04373, (estas dos publicaciones se incorporan por tanto aquí como referencia) y a continuación. Dichos ensayos incluyen ensayos de expresión en oocitos y la medición del aumento en la concentración intracelular del ión cálcico ([Ca2+ ]i ) debido a la actividad del receptor cálcico. Preferentemente, dichos ensayos miden la liberación o inhibición de una hormona particular asociada con la actividad de un receptor cálcico. Un compuesto que module un receptor de un ión inorgánico se focaliza selectivamente, de modo preferente, en la actividad del receptor iónico inorgánico en una célula particular. Por ejemplo, la focalización selectiva de la actividad del receptor cálcico se obtiene mediante un compuesto que ejerce un efecto mayor sobre la actividad de un receptor cálcico en un tipo celular que en otro tipo celular, para una concentración dada de un compuesto. Preferentemente, el efecto diferencial es 10 veces superior o más cuando se mide in vivo o in vitro. Más preferentemente, el efecto diferencial se mide in vivo y la concentración del compuesto se mide como la concentración plasmática o la concentración del fluido extracelular, y el efecto medido es la producción de mensajeros extracelulares tales como la calcitonina plasmática, la hormona paratiroidea, o el calcio del plasma. Por ejemplo, en una forma de realización preferida, el compuesto se focaliza selectivamente en la secreción de PTH respecto a la secreción de calcitonina.

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Preferentemente, el compuesto es uno calcimimético o calcilítico, con una EC50 o IC50 en un receptor cálcico menor o igual a 5 µM, y más preferentemente, incluso menor o igual a 1 µM, 100 nmolar, 10 nmolar, o 1 nmolar, utilizando uno de los ensayos que se describen a continuación. Más preferentemente, el ensayo mide el Ca2+ intracelular en células HEK 293 transformadas con un ácido nucleico que expresa el receptor cálcico paratiroideo humano y que se cargan con fura-2. Las EC50 o IC50 inferiores presentan ventajas, pues permiten concentraciones más bajas de compuestos que van a utilizarse in vivo o in vitro. El descubrimiento de compuestos con EC50 e IC50 bajas, permite el diseño y síntesis de compuestos adicionales que posean una potencia, efectividad, y/o selectividad similares o mejoradas. Otro aspecto de la presente invención describe una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la invención y un vehículo fisiológicamente aceptable. Una “composición farmacológica” se refiere a una composición en una forma apropiada para la administración a un mamífero, preferentemente al hombre. Preferentemente, la composición farmacéutica contiene una cantidad suficiente de un compuesto según la invención en una forma farmacéutica apropiada para ejercer un efecto terapéutico en el hombre.

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Consideraciones respecto a formas apropiadas para la administración se conocen en la técnica, e incluyen efectos tóxicos, solubilidad, vía de administración y conservación de la actividad. Por ejemplo, las composiciones farmacológicas inyectadas en la corriente sanguínea deben ser solubles. 40

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Las composiciones farmacéuticas pueden también ser formuladas como sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo., sales ácidas de adición) y sus complejos. La preparación de dichas sales puede facilitar la utilización farmacológica de un compuesto, alterando sus características físicas sin evitar que ejerza un efecto fisiológico. Los compuestos según la invención pueden utilizarse en un procedimiento para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente, modulando la actividad de los receptores iónicos inorgánicos. El procedimiento implica administrar al paciente una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto según la invención. En una forma de realización preferida, la enfermedad o trastorno se trata modulando la actividad del receptor cálcico mediante la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención que module el receptor cálcico.

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Estos compuestos, y las composiciones que los contienen, pueden utilizarse para tratar pacientes. Un “paciente” alude a un mamífero en el que la modulación de un receptor iónico inorgánico tendrá un efecto beneficioso. Utilizando técnicas estándar conocidas por los profesionales médicos, pueden identificarse pacientes que requieran tratamiento que implique la modulación de receptores iónicos inorgánicos. 55

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Preferentemente, un paciente es un hombre que presenta una enfermedad o trastorno caracterizado por una o más de las siguientes características: (1) homeostasis anormal de iones inorgánicos, más preferentemente homeostasis anormal del calcio; (2) un nivel anormal de un mensajero cuya producción o secreción está afectada por la actividad del receptor iónico inorgánico; más preferentemente afectado por la actividad del receptor cálcico, y (3) un nivel anormal o actividad de un mensajero cuya función está afectada por la actividad del receptor iónico inorgánico, más preferentemente afectado por la actividad del receptor cálcico. Las enfermedades caracterizadas por una homeostasis anormal del calcio incluyen el hiperparatiroidismo, la osteoporosis y otros trastornos óseos y minerales relacionados, y similares (como los descritos, por ejemplo, en los libros de texto de medicina, tales como “Harrison’s Principles of Internal Medicine”). Dichas enfermedades se tratan utilizando compuestos que modulan los receptores cálcicos que imitan o bloquean uno o varios de los efectos del Ca2+ extracelular sobre un receptor cálcico, y, por eso, afectan directa o indirectamente los niveles de las proteínas o de otros compuestos en el organismo del paciente. 4

ES 2 234 768 T3 “Cantidad terapéuticamente efectiva” significa una cantidad de un compuesto que alivia hasta cierto punto uno o varios síntomas de la enfermedad o del trastorno en el paciente; o normaliza parcial o completamente uno o varios parámetros bioquímicos o fisiológicos asociados con, o que provocan, la enfermedad o el trastorno. 5

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En una forma de realización preferida, el paciente presenta una enfermedad o trastorno caracterizado por un nivel anormal de uno o varios componentes regulados por el receptor cálcico y el compuesto es activo sobre un receptor cálcico de una célula seleccionada a partir del grupo formado por: célula paratiroidea, osteoclasto óseo, célula renal yuxtaglomerular, célula renal del túbulo proximal, célula renal del túbulo distal, célula del sistema nervioso central, célula del sistema nervioso periférico, célula de la rama ascendente gruesa del asa de Henle y/o túbulo colector, queratinocito en la epidermis, célula parafolicular en el tiroides (célula-C), célula intestinal, plaqueta, célula muscular lisa vascular, célula auricular cardíaca, célula gastrointestinal, célula secretora de glucagón, célula mesangial renal, célula mamaria, célula beta, célula grasa/adiposa, célula inmune, célula del tracto gastrointestinal, célula de la piel, célula adrenal, célula pituitaria, célula hipotalámica y célula del órgano subfornical.

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Más preferentemente, las células se seleccionan a partir del grupo formado por célula paratiroidea, célula del sistema nervioso central, célula del sistema nervioso periférico, célula de la rama gruesa ascendente del asa de y/o túbulo colector en el riñón, célula parafolicular en el tiroides (célula-C), célula intestinal, célula del tracto gastrointestinal, célula pituitaria, célula hipotalámica y célula del órgano subfornical.

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En una forma de realización preferida, el compuesto es un calcimimético que actúa sobre un receptor cálcico de la célula paratiroidea y reduce el nivel de la hormona paratiroidea en el suero del paciente. Más preferentemente, el nivel se reduce hasta un grado suficiente para causar una disminución en el Ca2+ plasmático. Más preferentemente, el nivel de la hormona paratiroidea se reduce hasta el que se encuentra en un individuo normal.

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En otra forma de realización preferida, el compuesto es un calcilítico que actúa sobre un receptor cálcico de la célula paratiroide y aumenta el nivel de la hormona paratiroidea en el suero del paciente. Más preferentemente, el nivel aumenta hasta un grado suficiente para causar un aumento en la densidad mineral ósea de un paciente.

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Los pacientes que requieren dichos tratamientos, pueden identificarse mediante técnicas médicas estándar, tales como análisis de la sangre y de la orina. Por ejemplo, detectando la deficiencia de una proteína cuya producción o secreción es afectada por cambios en las concentraciones de iones inorgánicos, o detectando niveles anormales de iones inorgánicos o de hormonas que llevan a cabo la homeostasis iónica inorgánica. En otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de los compuestos según la invención, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por la homeostasis ósea y mineral anormal. Las enfermedades o trastornos que pueden ser tratados incluyen el hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, osteoporosis, hipertensión y osteodistrofia renal. Varios ejemplos se utilizan a través de toda la solicitud de patente. Estos ejemplos no tienen la intención de limitar en ningún modo la invención. Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de las figuras siguientes, de la descripción detallada de la invención, de los ejemplos y de las reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos Las Figuras 1 y 2 proporcionan datos para el compuesto de referencia R-568 y para el compuesto de estructura (I), respectivamente.

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Descripción de las formas de realización preferidas La presente invención describe compuestos capaces de modular una o más actividades de los receptores iónicos inorgánicos, siendo capaz el compuesto preferentemente imitar o bloquear el efecto de un ión extracelular sobre una célula que posea un receptor iónico inorgánico, siendo el Ca2+ , más preferentemente, el ión, y el efecto, el ejercido sobre una célula que posea un receptor cálcico. Las publicaciones relacionadas con la actividad del calcio, el receptor cálcico y/o los compuestos que modulan el receptor del calcio, incluyen las siguientes: Brown et al., Nature 366: 574, 1993; Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959; Nemeth et al, PCT/US92/07175, Publicación internacional número WO 93/04373; Shoback y Chen, J. Bone Mineral Res. 9:293 (1994); y Racke et al., FEBS Lett. 333:132, (1993). Estas publicaciones no son admitidas como de la técnica anterior con respecto a la invención que se reivindica. I. Receptores de calcio

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Los receptores de calcio se encuentran en distintos tipos celulares y pueden tener diferentes actividades en éstos. Los efectos farmacológicos de las células siguientes, en respuesta al calcio, están de acuerdo con la presencia de un receptor cálcico: célula paratiroidea, osteoclasto óseo, célula renal yuxtaglomerular, célula renal del túbulo proximal, célula renal del túbulo distal, célula del sistema nervioso central, célula del sistema nervioso periférico, célula de la rama ascendente gruesa del asa de Henle y/o túbulo colector, queratinocito en la epidermis, célula parafolicular en el 5

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tiroides (célula-C), célula intestinal, plaqueta, célula muscular lisa vascular, célula auricular cardíaca, célula secretora de gastrina, célula secretora de glucagón, célula mesangial renal, célula mamaria, célula beta, célula grasa/adiposa, célula inmune, célula del tracto gastrointestinal, célula de la piel, célula adrenal, célula pituitaria, célula hipotalámica y célula del órgano subfornical. Además, la presencia de receptores de calcio en la célula paratiroidea, célula del sistema nervioso central, célula del sistema nervioso periférico, célula de la rama gruesa ascendente del asa de Henle y/o túbulo colector en el riñón, célula parafolicular en el tiroides (célula-C), célula intestinal, célula del tracto gastrointestinal, célula pituitaria, célula hipotalámica y célula del órgano subfornical, ha sido confirmada mediante datos físicos. El receptor del calcio en estos distintos tipos celulares puede ser diferente. Asimismo, es posible que una célula pueda tener más de un tipo de receptor cálcico. La comparación de las actividades del receptor cálcico y de las secuencias aminoácidas de células distintas, indica que existen distintos tipos de receptor del calcio. Por ejemplo, los receptores cálcicos pueden responder a distintos cationes di- y trivalentes. El receptor cálcico paratiroideo responde a calcio y Gd3+ , mientras que los osteoclastos responden a cationes divalentes tales como el calcio, pero no responden a Gd3+ . Así, el receptor cálcico paratiroideo es farmacológicamente distinto del receptor cálcico en el osteoclasto.

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Por otra parte, las secuencias ácido nucleicas que codifican receptores cálcicos que se encuentran en las células paratiroideas y en las células-C, indican que estos receptores poseen una estructura aminoácida muy similar. Sin embargo, los compuestos calcimiméticos exhiben una farmacología diferente y regulan actividades distintas en las células paratiroideas y en las células-C. Así, las propiedades farmacológicas de los receptores del calcio pueden variar significativamente dependiendo del tipo celular o del órgano en el que se expresan, incluso aunque los receptores cálcicos puedan tener estructuras similares o incluso idénticas. Los receptores cálcicos, en general, poseen una afinidad escasa para el Ca2+ extracelular (la Kd aparente es generalmente mayor que 0,5 mM aproximadamente). Los receptores del calcio pueden incluir un mecanismo efector unido o libre, tal como se define por Cooper, Bloom y Roth, “The Biochemical Basis of Neuropharmacology”, Ch. 4, y son por tanto distintos de los receptores cálcicos intracelulares, por ejemplo, calmodulina y las troponinas. Los receptores cálcicos responden a cambios en los niveles del calcio extracelular. Los cambios exactos dependen del receptor particular y de la progenie celular que contenga al receptor. Por ejemplo, el efecto in vitro del calcio sobre el receptor cálcico en una célula paratiroidea, incluye los siguientes: 1. Un aumento en el calcio interno. El aumento se debe al flujo de entrada del calcio externo y/o a la movilización del calcio interno. Las características del aumento en el calcio interno incluyen las siguientes:

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(a) Un aumento rápido (el tiempo máximo se alcanza en menos de 5 segundos) y transitorio del [Ca2+ ]i , que es resistente a la inhibición por 1 µM La3+ o 1 µM Gd3+ y que es abolido por pretratamiento con ionomicina (en ausencia del Ca2+ extracelular); (b) El aumento no es inhibido por las dihidropiridinas;

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(c) El aumento transitorio es abolido por el pretratamiento durante 10 minutos con 10 mM de fluoruro de sodio;

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(d) El aumento transitorio disminuye por pretratamiento con un activador de la proteína quinasa C (PKC), tal como el forbol miristato acetato (PMA), la mezereina o el (-)-indolactam V. El efecto total del activador de la proteína quinasa C es cambiar la curva de respuesta-concentración del calcio a la derecha, sin afectar a la respuesta máxima; y (e) El pretratamiento con la toxina pertussis (100 ng/ml durante un tiempo superior a 4 horas) no afecta al aumento.

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2. Un rápido (inferior a 30 segundos) aumento en la formación de inositol-1,4,5-trifosfato o diacilglicerol. El pretratamiento con la toxina pertussis (100 ng/ml) durante un tiempo superior a 4 horas) no afecta a este aumento; 55

3. La inhibición de la formación de AMP cíclico estimulada por dopamina- e isoproterenol-. Este efecto es bloqueado mediante el pretratamiento con la toxina pertussis (100 ng/ml durante un tiempo superior a 4 horas); y 4. La inhibición de la secreción de PTH. El pretratamiento con la toxina pertussis (100 ng/ml durante un tiempo superior a 4 horas) no afecta a la inhibición en la secreción de PTH.

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Utilizando procedimientos conocidos en la técnica, el efecto del calcio u de otros receptores cálcicos en distintas células puede determinarse fácilmente. Dichos efectos pueden ser similares con respecto al aumento en el calcio interno, observado en las células paratiroideas. Sin embargo, se espera que el efecto difiera en otros aspectos, tales como provocar o inhibir la liberación de una hormona distinta a la hormona paratiroidea.

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II. Compuestos que modulan el receptor iónico inorgánico Los compuestos que modulan los receptores iónicos inorgánicos modulan una o más actividades de los receptores iónicos inorgánicos. Los compuestos preferidos que modulan el receptor cálcico son los calcimiméticos y los calcilíti6

ES 2 234 768 T3 cos. Los compuestos que modulan los receptores iónicos inorgánicos pueden identificarse rastreando compuestos que son modelados después de que un compuesto haya mostrado tener una actividad particular (por ejemplo, un compuesto de plomo). 5

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Un procedimiento preferido para medir la actividad del receptor cálcico es medir cambios en [Ca2+ ]i . Los cambios en [Ca2+ ]i pueden medirse utilizando distintas técnicas tales como la utilización de células HEK 293 transducidas con un ácido nucleico que exprese el receptor cálcico paratiroideo humano y que se cargan con fura-2; y midiendo un aumento en la corriente de Cl− en un oocito de Xenopus al que se ha inyectado un ácido nucleico que codifique un receptor cálcico. (Véase Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959). Por ejemplo, el poly(A)+ ARNm puede obtenerse a partir de células que expresen un receptor cálcico, tales como una célula paratiroidea, osteoclasto óseo, célula renal yuxtaglomerular, célula renal del túbulo proximal, célula renal del túbulo distal, célula del sistema nervioso central, célula del sistema nervioso periférico, célula de la rama ascendente gruesa del asa de Henle y/o del túbulo colector, queratinocito en la epidermis, célula parafolicular en el tiroides (célula-C), célula intestinal, plaqueta, célula muscular lisa vascular, célula auricular cardíaca, célula secretora de gastrina, célula secretora de glucagón, célula mesangial renal, célula mamaria, célula beta, célula grasa/adiposa, célula inmune, y célula del tracto gastrointestinal. Preferentemente, el ácido nucleico es de una célula paratiroidea, célula-C u osteoclasto. Más preferentemente, el ácido nucleico codifica un receptor cálcico y se encuentra sobre un plásmido o vector. En formas de realización preferidas el receptor cálcico que modula el compuesto es un calcimimético que inhibe la resorción ósea in vivo mediante un osteoclasto; inhibe la resorción ósea in vitro mediante un osteoclasto; estimula la secreción de calcitonina in vitro o in vivo a partir de una célula-C; inhibe la secreción de la hormona paratiroidea a partir de una célula paratiroidea in vitro y disminuye la secreción de PTH in vivo; eleva los niveles de calcitonina in vivo; o bloquea la resorción osteoclástica del hueso in vitro e inhibe la resorción ósea in vivo. En otra forma de realización preferida el compuesto que modula el receptor cálcico es un calcilítico que provoca la secreción de hormona paratiroidea a partir de las células paratiroideas in vitro y eleva el nivel de la hormona paratiroidea in vivo. Preferentemente, el compuesto focaliza selectivamente la actividad de los receptores iónicos inorgánicos, más preferentemente de la actividad del receptor cálcico, en una célula particular. Por “selectivamente” se quiere significar que el compuesto ejerce un efecto mayor sobre la actividad del receptor iónico inorgánico en un tipo celular que en otro tipo celular, para una concentración dada del compuesto. Preferentemente, el efecto diferencial es de 10 veces o mayor. Preferentemente, la concentración se refiere a la concentración plasmática sanguínea, y el efecto que se mide es la producción de mensajeros extracelulares tales como la calcitonina plasmática, la hormona paratiroidea o el calcio plasmático. Por ejemplo, en una forma de realización preferida, el compuesto se focaliza selectivamente en la secreción de PTH respecto a la de la calcitonina. En otra forma de realización preferida, el compuesto tiene una EC50 o una IC50 menor que o igual a 5 µM en una o más, pero no en todas las células seleccionadas a partir del grupo formado por: célula paratiroidea, osteoclasto óseo, célula renal yuxtaglomerular, célula renal del túbulo proximal, célula renal del túbulo distal, célula del sistema nervioso central, célula del sistema nervioso periférico, célula de la rama ascendente gruesa del asa de Henle y/o túbulo colector, queratinocito en la epidermis, célula parafolicular en el tiroides (célula-C), célula intestinal, plaqueta, célula muscular lisa vascular, célula auricular cardíaca, célula secretora de gastrina, célula secretora de glucagón, célula mesangial renal, célula mamaria, célula beta, célula grasa/adiposa, célula inmune, célula del tracto gastrointestinal, célula de la piel, célula adrenal, célula pituitaria, célula hipotalámica y célula del órgano subfornical. Más preferentemente, las células se seleccionan a partir del grupo formado por la célula paratiroidea, célula del sistema nervioso central, célula del sistema nervioso periférico, célula de la rama gruesa ascendente del asa de Henle y/o túbulo colector en el riñón, célula parafolicular en el tiroides (célula-C), célula intestinal, célula del tracto gastrointestinal, célula pituitaria, célula hipotalámica y célula del órgano subfornical. La presencia de un receptor del calcio en este grupo de células se ha confirmado mediante datos físicos tales como la hibridación in situ y la tinción de anticuerpos. Preferentemente, los compuestos que modulan los receptores iónicos inorgánicos imitan o bloquean los efectos de un ión extracelular sobre una célula que tenga un receptor iónico inorgánico, de forma que los compuestos alcanzan un efecto terapéutico. Los compuestos que modulan los receptores iónicos inorgánicos pueden tener los mismos o distintos efectos sobre las células que muestran diferentes tipos de morfología del receptor ión inorgánico, (por ejemplo, como las células que poseen receptores iónicos inorgánicos normales, un número normal de receptores iónicos inorgánicos, un receptor iónico inorgánico anormal, y un número anormal de receptores iónicos inorgánicos). Los compuestos que modulan el receptor de calcio imitan o bloquean preferentemente todos los efectos del ión extracelular en una célula que posea un receptor cálcico. Sin embargo, los calcimiméticos no requieren poseer todas las actividades biológicas del Ca2+ extracelular. De modo similar, los calcilíticos no requieren bloquear todas las actividades causadas por el calcio extracelular. Además, distintos calcimiméticos y distintos calcilíticos no requieren unirse al mismo sitio en el receptor del calcio, como lo hace el Ca2+ para ejercer sus efectos. Los compuestos moduladores inorgánicos no requieren realizar la actividad del receptor inorgánico en el mismo grado o exactamente de la misma manera que el ligando natural. Por ejemplo, un calcimimético puede llevar a cabo la actividad del receptor cálcico en un grado distinto, con una duración diferente, uniéndose a un sitio de unión distinto, o con una afinidad diferente, cuando se compara con la actuación del calcio en un receptor cálcico. 7

ES 2 234 768 T3 Actividad calcimimética

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La capacidad de los compuestos para imitar la actividad del Ca2 + en los receptores cálcicos puede determinarse utilizando procedimientos que se conocen en la técnica y que son descritos por Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959. Por ejemplo, los calcimiméticos poseen una o más y preferentemente todas las actividades siguientes, cuando se ensayan sobre células paratiroideas in vitro: 1. El compuesto provoca un aumento rápido (el tiempo máximo se alcanza en menos de 5 segundos) y transitorio en la concentración del calcio intracelular, que es resistente a la inhibición por 1 µM La3+ o 1 µM Gd3+ . El aumento en [Ca2+ ]i persiste en ausencia del Ca2+ extracelular, pero es abolido por el pretratamiento con ionomicina (en ausencia del Ca2+ extracelular); 2. El compuesto potencia aumentos en [Ca2+ ]i provocados por concentraciones submáximas del Ca2+ extracelular;

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3. El aumento en [Ca2+ ]i , potenciado por el Ca2+ extracelular, no es inhibido por las dihidropiridinas; 4. El aumento transitorio en la [Ca2+ ]i causado por el compuesto, es abolido por el pretratamiento durante 10 minutos con 10 mM de fluoruro de sodio;

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5. El aumento transitorio en [Ca2+ ]i , causado por el compuesto, disminuye por el pretratamiento con un activador de la proteín quinasa C (PKC), tal como el forbol miristato acetato (PMA), la mezereína o el (-)-indolactam V. El efecto total del activador de la proteína quinasa C es desplazar la curva de respuesta-concentración del calcio a la derecha, sin afectar a la respuesta máxima;

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6. El compuesto causa un rápido (inferior a 30 segundos) aumento en la formación de inositol-1,4,5-trifosfato y/o diacilglicerol; 7. El compuesto inhibe la formación de AMP cíclico estimulada por el isoproterenol o la dopamina;

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8. El compuesto inhibe la secreción de PTH; 9. El pretratamiento con la toxina pertussis (100 ng/ml durante un tiempo superior a 4 horas) bloquea el efecto inhibitorio del compuesto sobre la formación del AMP cíclico, pero no tiene efecto ni sobre aumentos en [Ca2+ ]i , inositol-1,4,5-trifosfato, o diacilglicerol, ni sobre disminuciones en la secreción de PTH;

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10. El compuesto provoca aumentos en la corriente de Cl− en oocitos de Xenopus a los que se inyectó ARNm de células paratiroideas humanas o bovinas enriquecido con poly (A)+ , pero no tiene efecto en los oocitos de Xenopus a los que se inyectó agua o ARNm hepático; y 40

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11. De modo similar, utilizando un receptor cálcico clonado a partir de una célula paratiroide, el compuesto provocará una respuesta en los oocitos de Xenopus a los que se inyectó con el ADNc o ARNm específico que codifica el receptor. Distintas actividades del calcio pueden medirse utilizando técnicas disponibles. (Véase Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959). Definiciones paralelas de compuestos que imitan la actividad del Ca2+ sobre otra célula sensible al calcio, preferentemente en un receptor cálcico, son evidentes a partir de los ejemplos proporcionados en la presente memoria y en Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959). Preferentemente, el compuesto medido por los bioensayos descritos en la presente memoria, o por Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959, posee una o más, más preferentemente todas las actividades siguientes: provoca un aumento transitorio en el calcio interno, con una duración menor que 30 segundos (movilizando preferentemente el calcio interno); provoca un aumento rápido en [Ca2+ ]i , que tiene lugar en treinta segundos; provoca un aumento sostenido (mayor que treinta segundos) en [Ca2+ ]i , provocando preferentemente una entrada del calcio externo); provoca un aumento en los niveles de inositol-1,4,5-trifosfato o diacilglicerol, preferentemente en menos de 60 segundos; e inhibe la formación de AMP cíclico estimulado por el isoproterenol o la dopamina. El aumento transitorio en [Ca2+ ]i es abolido preferentemente por tratamiento de la célula durante diez minutos con 10 mM de fluoruro sódico, o el aumento transitorio disminuye por el tratamiento breve (de no más de diez minutos) de la célula con un activador de la proteín quinasa C, preferentemente, forbol miristato acetato (PMA), merezeína o (-) indolactam V. Calcilíticos

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La capacidad de un compuesto para bloquear la actividad del calcio extracelular en un receptor cálcico puede determinarse utilizado técnicas estándar basadas en esta exposición. (Véase también Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959.) Por ejemplo, los compuestos que bloquean el efecto del calcio 8

ES 2 234 768 T3 extracelular cuando se utilizan respecto a una célula paratiroidea, poseen una o más o preferentemente todas las características siguientes, cuando se ensayan sobre células paratiroideas in vitro: 5

1. El compuesto bloquea, parcial o completamente, la capacidad del aumento de la concentración del Ca2+ extracelular para: (a) aumentar [Ca2+ ]i , (b) movilizar el Ca2+ intracelular

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(c) aumentar la formación de inositol-1,4,5-trifosfato. (d) disminuir la formación de AMP cíclico estimulado por la dopamina o el isoproterenol, y 15

(e) inhibir la secreción de PTH; 2. El compuesto bloquea aumentos en la corriente de Cl− en oocitos de Xenopus a los que se inyectó poli(A)+ ARNm procedente de células paratiroideas humanas o bovinas, aumentos provocados por el Ca2+ extracelular o los compuestos calcimiméticos, pero no en los oocitos de Xenopus a los que se inyectó agua o ARNm hepático;

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3. De modo similar, utilizando un receptor cálcico clonado a partir de una célula paratiroide, el compuesto bloqueará una respuesta en los oocitos de Xenopus a los que se inyectó ADNc, ARNm o ARNc específicos que codifican el receptor cálcico, respuesta provocada por el Ca2+ extracelular o por un compuesto calcimimético. 25

Las definiciones paralelas de los compuestos que bloquean la actividad de Ca2+ en una célula sensible al calcio, preferentemente en un receptor cálcico, son evidentes a partir de los ejemplos que se proporcionan en la presente memoria y en Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959. III. Tratamiento de las enfermedades o trastornos

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Las enfermedades o trastornos que pueden tratarse modulando la actividad de los receptores cálcicos son conocidas en la técnica. Por ejemplo, las enfermedades o trastornos que pueden tratarse modulando la actividad de los receptores cálcicos pueden identificarse basándose en las respuestas funcionales de las células que están reguladas por la actividad del receptor cálcico. Las respuestas funcionales de las células reguladas por el receptor cálcico se conocen en la técnica, incluyendo la secreción de PTH por las células paratiroideas, la secreción de calcitonina por las células-C y la resorción ósea por los osteoclastos. Dichas respuestas funcionales se asocian con distintas enfermedades o trastornos. Por ejemplo, el hiperparatiroidismo da lugar a niveles elevados de PTH en el plasma. La disminución de los niveles plasmáticos de PTH ofrece un medio efectivo para tratar el hiperparatiroidismo. Del mismo modo, el aumento de los niveles plasmáticos de la calcitonina, se asocia con una inhibición de la resorción ósea. La inhibición de la resorción ósea constituye un tratamiento efectivo para la osteoporosis. Por lo tanto, la modulación de la actividad de los receptores cálcicos puede utilizarse para tratar enfermedades tales como el hiperparatiroidismo y la osteoporosis. Los compuestos que modulan la actividad de los receptores iónicos inorgánicos, preferentemente la actividad de los receptores cálcicos, pueden utilizarse para conferir efectos beneficiosos a los pacientes que sufren distintas enfermedades o trastornos. Por ejemplo, la osteoporosis es un trastorno asociado con la edad, caracterizado por la pérdida de masa ósea y por un aumento del riesgo de la fractura de los huesos. Pueden utilizarse compuestos para bloquear la resorción ósea osteoclástica, directa (por ejemplo, un compuesto ionomimético osteoclástico) o indirectamente aumentando los niveles endógenos de la calcitonina (por ejemplo, un calcimimético de una célula-C). Alternativamente, un calcilítico activo sobre el receptor cálcico de la célula paratiroidea aumentará los niveles circulantes de la hormona paratiroide, estimulando la formación ósea. La totalidad de estos planteamientos dará lugar a efectos beneficiosos para los pacientes que sufran osteoporosis.

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Además, es conocido que una dosificación baja intermitente con PTH da lugar a un efecto anabólico sobre la masa ósea y a una apropiada remodelación ósea. De este modo, los compuestos y regímenes de dosificación que potencien aumentos transitorios en la hormona paratiroidea (por ejemplo., una dosificación intermitente con un ionolítico de la célula paratiroidea), puede aumentar la masa ósea en pacientes que sufran osteoporosis.

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Otras enfermedades o trastornos pueden ser identificados evaluando otras respuestas funcionales celulares, asociadas con una enfermedad o trastorno, que estén reguladas por la actividad del receptor cálcico. La enfermedades o trastornos que pueden ser tratados modulando otros receptores iónicos inorgánicos pueden identificarse de forma análoga.

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Los compuestos que modulan los receptores iónicos inorgánicos de la presente invención pueden ejercer un efecto en un receptor iónico inorgánico, provocando uno o más efectos celulares que producen finalmente un efecto terapéutico. Los compuestos que modulan los receptores cálcicos de la presente invención pueden ejercer un efecto en un receptor cálcico provocando uno o más efectos celulares que producen finalmente un efecto terapéutico. Distintas 9

ES 2 234 768 T3 enfermedades pueden ser tratadas por la presente invención focalizando las células que poseen un receptor cálcico.

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Por ejemplo, el hiperparatiroidismo primario (HPT) se caracteriza por hipercalcemia y niveles elevados anormales del PTH circulante. Un defecto asociado con el tipo principal de HPT es una disminución en la sensibilidad de las células paratiroideas respecto a la regulación mediante retroacción negativa llevada a cabo por el Ca2+ extracelular. Por lo tanto, en los tejidos de los pacientes con HPT primario, el “punto de referencia” para el Ca2+ extracelular cambia a la derecha, de modo que son necesarias concentraciones más elevadas que las normales del Ca2+ extracelular, para disminuir la secreción de PTH. Además, en el HPT primario, incluso concentraciones elevadas del Ca2+ extracelular, disminuyen a menudo, sólo parcialmente, la secreción de PTH. En el HPT secundario (urémico), se observa un aumento similar en el “punto de referencia” para el Ca2+ extracelular, aunque el grado al cual el Ca2+ suprime la secreción de PTH es normal. Los cambios en la secreción de PTH se correlacionan con los cambios en [Ca2+ ]i : el “punto de referencia” para los aumentos en [Ca2+ ]i inducidos por Ca+2 , se desplaza a la derecha, y la magnitud de dichos aumentos se reduce. Los pacientes que sufren de HPT secundaria, pueden también tener osteodistrofia renal. Los calcimiméticos parecen ser útiles para tratar tanto la secreción anormal de PTH como la osteodistrofia en dichos pacientes. Los compuestos que imitan la acción del Ca2+ extracelular son beneficiosos en el manejo a largo plazo de la HPT, tanto primaria como secundaria. Dichos compuestos proporcionan el ímpetu añadido necesario para suprimir la secreción de PTH que la situación hipercalcémica sola no puede alcanzar y, por lo tanto, ayudan a mitigar ésta. Los compuestos con una eficacia superior al Ca2+ extracelular pueden superar el evidente componente que no puede suprimirse de la secreción de PTH, que es particularmente molesto en la forma más importante de la HPT primaria causada por el adenoma de la glándula paratiroide. Alternativa o adicionalmente, dichos compuestos pueden disminuir la síntesis de PTH, ya que la hipercalcemia prolongada ha mostrado que disminuye los niveles de preproPTH ARNm en el tejido paratiroideo adenomatoso humano. La hipercalcemia prolongada disminuye también la proliferación de células paratiroideas in vitro, por lo que los calcimiméticos pueden también ser efectivos para limitar la hiperplasia de la célula paratiroidea característica de la HPT secundaria. Células distintas a las paratiroideas pueden responder directamente a cambios fisiológicos en la concentración del Ca2+ extracelular. Por ejemplo, la secreción de calcitonina a partir de las células parafoliculares en el tiroides (célulasC), es regulada por cambios en la concentración del Ca2+ extracelular. Los osteoclastos aislados responden a aumentos en la concentración del Ca2+ extracelular con los correspondientes aumentos en [Ca2+ ]i , que aumenta parcialmente a partir de la movilización del Ca2+ intracelular. Aumentos en el [Ca2+ ]i en los osteoclastos están asociados con la inhibición de la resorción ósea. La liberación de fosfatasa alcalina a partir de los osteoblastos que forman el hueso, está estimulado directamente por el calcio. La secreción de renina a partir de las células yuxtaglomerulares en el riñón, como la secreción de PTH, es disminuida por el aumento de concentraciones del Ca2+ celular. El Ca2+ extracelular causa la movilización del Ca2+ intracelular en estas células. Otras células renales responden al calcio de la siguiente forma: el Ca2+ elevado inhibe la formación de 1,25 (OH)2 -vitamina D por las células tubulares proximales, estimula la producción de la proteína que se une al calcio en las células tubulares distales, e inhibe la reabsorción tubular del Ca2+ y del Mg2+ y la acción de la vasopresina en la rama gruesa ascendente del asa de Henle (MTAL), reduce la acción de la vasopresina en las células del túbulo colector cortical, y afecta a las células del músculo liso vascular en los vasos sanguíneos del glomérulo renal.

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El calcio promueve asimismo la diferenciación de las células caliciformes intestinales, células mamarias, y células epiteliales; inhibe la secreción del péptido natriurético auricular a partir de la aurícula cardíaca; reduce la acumulación de AMPc en las plaquetas; altera la secreción de la gastrina y del glucagón; actúa sobre las células musculares lisas vasculares para modificar la secreción celular de factores vasoactivos; y afecta a las células del sistema nervioso periférico y central.

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De este modo, existen suficientes indicaciones para sugerir que el Ca2+ , además de su papel ubicuo como señal intracelular, funciona también como una señal extracelular para regular las respuestas de ciertas células especializadas. Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con las respuestas alteradas del Ca2+ en estas células.

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Enfermedades y trastornos específicos que podrían ser tratados o evitados, basados en las células afectadas, incluyen también a los del sistema nervioso central tales como convulsión epiléptica, ictus, traumatismo craneoencefálico, lesión medular, daño de células nerviosas inducido por hipoxia tal como en la parada cardíaca o en el sufrimiento neonatal, epilepsia, enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson, demencia, tensión muscular, depresión, ansiedad, trastorno de pánico, trastorno obsesivocompulsivo, trastorno de estrés postraumático, esquizofrenia, síndrome maligno neuroléptico, y síndrome de Tourette; enfermedades que implican un exceso de reabsorción acuosa por el riñón, tales como el síndrome de secreción inapropiada de ADH (SIADH), cirrosis, insuficiencia cardíaca, y nefrosis; hipertensión; evitación y/o disminución de la toxicidad renal de los antibióticos catiónicos (por ejemplo., antibióticos aminoglicósidos); trastornos de la motilidad intestinal tales como diarrea, y colon espástico; enfermedades ulcerosas gastrointestinales; enfermedades gastrointestinales con una absorción cálcica excesiva tal como la sarcoidosis; y enfermedades autoinmunes y rechazo del injerto de órganos. 10

ES 2 234 768 T3 Aunque los compuestos que modulan los receptores cálcicos de la presente invención se utilizarán típicamente en la terapia para los pacientes humanos, pueden también emplearse para tratar enfermedades similares o idénticas en otras especies animales de sangre caliente, tales como otros primates, animales de granja tales como cerdos, ganado y aves de corral; y animales deportivos y mascotas tales como caballos, perros y gatos. 5

IV. Administración

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Los compuestos descritos por la presente invención pueden utilizarse para tratar distintas enfermedades o trastornos modulando la actividad de los receptores iónicos inorgánicos, preferentemente la actividad del receptor cálcico. Los compuestos de la invención pueden formularse para distintos modos de administración, que incluyen la administración tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones pueden encontrarse generalmente en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA. La administración de ionomiméticos e inolíticos se considera en Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959. Formas apropiadas de dosificación, en parte, dependen de la utilización o de la vía de entrada, por ejemplo, oral, transdérmica, o mediante inyección. Dichas formas de dosificación permitirán que el compuesto alcance un célula diana si ésta se encuentra en un huésped multicelular o en cultivo. Por ejemplo, los compuestos farmacológicos o composiciones que se inyecten en la corriente sanguínea serán solubles. Otros factores son conocidos en la técnica, e incluyen consideraciones tales como toxicidad y forma de dosificación, que retrasan que el compuesto o composición ejerzan su efecto. El compuesto de estructura (I) puede también formularse como sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, sales ácidas de adición) y sus complejos. Las sales farmacéuticamente aceptables no son tóxicas a la concentración a la que se administran. La preparación de dichas sales puede facilitar la utilización farmacológica alterando la característica física del compuesto sin evitar que ejerza su efecto fisiológico. Alteraciones útiles en las propiedades físicas incluyen la disminución de la temperatura de fusión para facilitar la administración través de la mucosa y el aumento de la solubilidad para facilitar la administración de concentraciones más elevadas del medicamento.

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Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales ácidas de adición tales como las que contienen sulfato, clorhidrato, maleato, fosfato, sulfamato, acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluensulfonato, ciclohexilsulfamato y quinato. (Véase por ejemplo, el documento de patente PCT/US92/03736, que se incorpora por tanto en la presente memoria como referencia). Las sales farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse a partir de ácidos tales como clorhídrico, maleico, sulfúrico, fosfórico, sulfámico, acético, cítrico, láctico, tartárico, malónico, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluensulfónico, ciclohexilsulfámico, y quínico.

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Las sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse mediante técnicas estándar. Por ejemplo, la forma de base libre de un compuesto se disuelve en un disolvente apropiado, tal como una solución acuosa o acuoso-alcohólica que contiene el ácido apropiado, aislando entonces las sales evaporando la solución. En otro ejemplo, una sal se prepara haciendo reaccionar la base libre y el ácido en un disolvente orgánico.

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Los vehículos o excipientes pueden utilizarse asimismo para facilitar la administración del compuesto. Ejemplos de vehículos y excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, varios azúcares tales como lactosa, glucosa, o sacarosa, o tipos de almidón, derivados celulósicos, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y disolvente fisiológicamente compatibles. Las composiciones o la composición farmacéutica pueden administrarse mediante distintas vías que incluyen la intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, tópica o a través de la mucosa. Para la administración sistémica, se prefiere la administración oral. Alternativamente, puede utilizarse la inyección, por ejemplo., intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, los compuestos de la invención se formulan en soluciones líquidas, preferentemente en tampones compatibles fisiológicamente tales como la solución de Hank o la solución de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse en forma sólida y volver a disolverse o suspenderse inmediatamente antes de utilizarlos. Asimismo pueden producirse formas liofilizadas. La administración sistémica puede también llevarse a cabo a través de la mucosa o transdérmicamente, o los compuestos pueden administrarse oralmente. Para la administración transdérmica o transmucosa, en la formulación se utilizan sustancias penetrantes apropiadas para que puedan introducirse a través de las barreras del organismo. Dichas sustancias penetrantes son conocidas generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración a través de la mucosa, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además, pueden utilizarse detergentes para facilitar la penetración. La administración a través de la mucosa puede llevarse a cabo mediante rociadores nasales, por ejemplo, o utilizando supositorios. Para la administración oral, los compuestos pueden formularse en formas de dosificación convencionales para la administración oral, tales como cápsulas, comprimidos y preparaciones líquidas. Para la administración tópica, los compuestos de la invención pueden formularse en pomadas, ungüentos, geles, o cremas, como se conoce generalmente en la técnica.

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Mediante procedimientos estándar pueden determinarse las cantidades de varios compuestos que van a administrarse. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva está aproximadamente entre 1 nmol y 3 µmoles, preferentemente entre 0,1 nmoles y 1 µmoles, dependiendo de sus Ec50 o IC50 y de la edad y tamaño del paciente, y de 11

ES 2 234 768 T3 la enfermedad o trastorno asociado a éste. Generalmente, es una cantidad entre 0,1 y 50 mg/kg aproximadamente, preferentemente entre 0,01 y 20 mg/kg del animal que va a ser tratado. V. Ejemplos 5

A continuación se proporcionan ejemplos que ilustran distintos aspectos y formas de realización de la presente invención. Estos ejemplos no tienen la intención de limitar la invención que se reivindica. Ejemplo 1 10

Clonación del receptor cálcico paratiroideo humano a partir de un tumor tipo adenoma de la glándula paratiroidea humana 15

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Este ejemplo describe la clonación de un receptor cálcico paratiroideo humano a partir de un tumor tipo adenoma de la glándula paratiroidea, utilizando pBoPCaR1 como sonda de hibridización (Véase, Nemeth et al., PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959). La sonda se utilizó para identificar el ácido nucleico que codifica el receptor cálcico de la glándula paratiroidea humana mediante hibridación cruzada con un rigor reducido. Se preparó ARN mensajero a partir de un tumor tipo adenoma de la glándula paratiroidea humana extraído de un hombre caucasiano de 39 años de edad con hiperparatiroidismo primario. El análisis de transferencia Northern de este ARNm utilizando pBoPCaR1 como sonda de hibridización, identificó los transcritos del receptor cálcico de aproximadamente 5 Kb y 4 Kb. Se construyó una genoteca ADNc a partir del ARNm. Sobre un gel de agarosa, se seleccionó, en cuanto al tamaño, un ADNc bicatenario de un tamaño superior a 3 Kbp, y se unió al vector de clonación lambda ZapII. Se rastrearon mil quinientos fagos recombinantes primarios con el inserto ADNc de 5,2 Kbp de pBoPCaR1 como sonda de hibridación. El inserto pBoPCaR1 se marcó mediante síntesis cebada al azar utilizando [32 P]-dCTP a una actividad específica de 1 x 109 cpm/µg. El rastreo de la genoteca se llevó a cabo con un rigor de hibridización de 400 mM Na+ , formamida al 50% a una temperatura de 38ºC. Se hibridizaron filtros de elevaciones de las calvas con una concentración de sondas de 500.000 cpm/ml durante 20 horas. Después de la hibridización, los filtros se lavaron en 1 X SSC a 40ºC durante 1 hora. El rastreo primario identificó alrededor de 250 clones positivos identificados por hibridización a pBoPCaR1. Siete de estos clones se obtuvieron a través de rastreos secundarios y terciarios para aislar clones únicos que se hibridizaban a la sonda pBoPCaR1. Estos siete clones se analizaron mediante elaboración de mapas de los enzimas de restricción y análisis de transferencia Southern. Tres de los clones contenían insertos de ADNc de 5 Kbp aproximadamente y parecían ser clones enteros (de longitud total) que correspondían al ARNm de 5 Kb. Dos de los clones contenían insertos de ADNc de alrededor de 4 Kbp y parecían ser clones de longitud total que correspondían al ARNm de 4 Kb. La elaboración de mapas de enzimas de restricción de los dos insertos con tamaño distinto indica que comparten regiones de similitud secuencial en sus extremos 5’, pero divergen en sus secuencias del extremo 3’. Los análisis de las secuencias del ADN indican que el inserto más pequeño puede provenir de la poliadenilación alternativa por encima del sitio de poliadenilación utilizado en el inserto más grande. Los insertos de ADNc representativos de ambos tipos de tamaños, se subclonaron en el vector plasmídico pBluescript SK. La linearización seguida por la transcripción in vitro utilizando la T7 ARN polimerasa, produjo transcritos ARNc. Los transcritos ARNc se inyectaron en oocitos de Xenopus (150 ng/µl ARN; 50 nl/oocito) para análisis funcional. Después de períodos de incubación de 2 a 4 días, los oocitos se ensayaron respecto a la presencia de receptores funcionales de calcio. Ambos tipos de clones dieron lugar a receptores funcionales cálcicos, tal como se evaluó mediante la estimulación de corrientes de cloruro activadas por calcio después de añadir agonistas apropiados del receptor cálcico. Conocidos agonistas del receptor cálcico, incluyendo NPS R-467 y NPS R-568 (véase Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional nº WO 94/18959), activaron el receptor expresado por el oocito a aproximadamente las mismas concentraciones conocidas por ser efectivas para el receptor nativo de la célula paratiroidea. De este modo, ambos clones codifican un receptor funcional cálcico de la célula paratiroidea humana. Se prepararon plásmidos subclonando cada tipo de tamaño del inserto en pBluescript, dando lugar de este modo a pHuPCaR 5.2 y pHuCaR 4.0. La secuencia ácido nucleica y la secuencia aminoácida de los insertos se muestra en SEC. ID. nº 1 y nº 2. Se observaron varias diferencias entre las secuencias ácido nucleicas de los dos insertos de ADNc. Los análisis secuenciales de los dos insertos de ADNc indican la existencia de por lo menos dos variantes secuenciales que difieren en la región no traducida del extremo 3’ y que pueden provenir de la poliadenilación alternativa. Además, existe variación secuencial en el extremo 5’ de los insertos. Estas secuencias distintas corresponden a regiones no traducidas y pueden haber surgido debido al inicio transcripcional alternativo y/o al corte y empalme. En el interior de las regiones codificantes de los clones ADNc pHuPCaR5.2 y pHuPCaR4.0. (véase SEC. ID. nº 1 y nº 2) se observaron tres sitios adicionales de variación secuencial, demostrando que estos clones ADNc codifican proteínas diferentes. El análisis secuencial del gen CaR humano indica que los 30 pares de bases adicionales del ADN en el clon ADNc pHuPCaR5.2, cuando se comparan con el clon ADNc pHuPCaR 4.0, proviene del corte y empalme 12

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alternativo del ARNm. Está previsto que el corte y empalme alternativo del ARNm inserte 10 aminoácidos adicionales en el polipéptido CaR codificado por el pHuPCaR5.2 ADNc en un sitio entre aa#536 y aa#537 en el polipéptido codificado por pHuPCaR4.0 ADNc. Además, pHuPCaR4.0 codifica glutamina (Gln) an aa#925 y glicina (Gly) en la posición 990, mientras que pHuPCaR5.2 codifica arg (Arg) en las dos posiciones equivalentes. El gen humano CaR codifica Gln y Arg, respectivamente, en estas posiciones. La diferencia entre el pHuPCaR4.0 ADNc comparado con el ADN humano parece representar un verdadero polimorfismo secuencial en la población humana, mientras que el único cambio de bases en pHuPCaR5.2 refleja probablemente una mutación que tuvo lugar durante su clonación. Ambos ADNcs codifican receptores cálcicos funcionales, tal como se demuestra por la capacidad de los oocitos de Xenopus a los que se había inyectado ARNc preparado a partir de estos clones ADNc, para responder a 10 mM del calcio extracelular como se comprobó por la conductancia del Cl-. Sin embargo, es posible que estas dos isoformas del receptor sean funcional y/o farmacológicamente distintas. Ejemplo 2

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Selección de células recombinantes estables que expresen el receptor cálcico Se aislaron progenies celulares de clones que expresan establemente los dos receptores cálcicos humanos y el bovino. Los ADNc receptores cálcicos se subclonaron en dos vectores de expresión distintos, disponibles comercialmente: pMSG (obtenido de Pharmacia) y Cep4B (obtenido de Invitrogen). El primer vector contiene el gen informador seleccionable para la xantina-guanina fosforibosiltransferasa (gpt), que permite a las células transfectadas establemente superar el bloqueo de la vía biosintética de la purina impuesta por la adición de 2 µg/ml de aminopterina y 25 µg/ml de ácido micofenólico. El segundo vector codifica un gen que confiere resistencia al antibiótico higromicina (utilizado a 200 µg/ml). HuPCaR 5.2 y HuPCaR 4.0 ADNc (SEC.ID. nº 1 y nº 2, respectivamente) se eliminaron del plásmido parental bluescript con los enzimas de restricción Not I y Hind III y se unieron entonces directamente a Cep4B que se había digerido con Not I + Hind III, o fueron tratados con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa antes de llevar a cabo una unión con los extremos romos al pMSG digerido con Sma I. El subclon pMSG que contiene el inserto HuPCaR 5.2 se transfectó a las células CHO, tal como se consideró anteriormente. La selección dió lugar a 20 clones resistentes que se están caracterizando. El subclón Cep4B que contiene el inserto HuPCaR 5.2 se transfectó a las células HEK 293 tal como se ha descrito anteriormente. La selección con higromicina dio lugar a un conjunto de clones estables. Los clones que expresaban la isoforma del receptor HuPCaR 4.0 se prepararon de modo similar. Las células obtenidas a partir del conjunto de células HEK 293 seleccionadas por la higromicina transfectadas con Cep4B conteniendo el inserto HuPCaR 5.2, se sembraron en cuadrados Aklar recubiertos con colágeno que se habían situado en pocillos individuales de placas de cultivo tisulares con 12 pocillos. De dos a seis días después, el medio se eliminó y las células se lavaron con solución salina equilibrada y 1 ml de tampón que contenía 1 µM fura2-AM, 1 mM CaCl2 y 0,1% BSA y 1 mM CaCl2 . Las mediciones de la fluorescencia en respuesta a los agonistas del receptor cálcico se llevaron a cabo a 37ºC en un espectrofluorímetro utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 340 y 510 nm, respectivamente. Para la calibración de la señal, se determinó Fmax después de añadir ionomicina (40 µM) y el Fmin aparente se determinó añadiendo 0,3 M EGTA, 2,5 M Tris-HCl; pH 10. Se observaron aumentos vigorosos en [Ca2+ ]i en respuesta a la adición de los siguientes agonistas del receptor cálcico: Ca2+ (10 mM), Mg2 (+ 20 mM) y NPSR-467. Las células de control que expresan los receptores funcionales de la sustancia K, no respondieron a estos compuestos calcimiméticos.

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Se obtuvieron aislamientos clonales adicionales de las células HEK 293 transfectadas con pHuPCaR4.0. Éstos se ensayaron respecto a la sensibilidad a los calcimiméticos, tal como se describe anteriormente, excepto porque las células se ensayaron mientras se encontraban en suspensión. 50

Ejemplo 3 Utilización de las células paratiroideas cargadas con fura-2 para medir la actividad del receptor cálcico

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Esta sección describe procedimientos utilizados para obtener células paratiroideas a partir de los terneros y del hombre, y para utilizar las células paratiroideas en la medición de la actividad del receptor de calcio.

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Las glándulas paratiroides se obtuvieron a partir de terneros recién sacrificados (de 12 a 15 semanas de edad) en un matadero local y se transportaron al laboratorio en tampón de células paratiroideas enfriado con hielo (PCB) que contiene (mM): NaCl, 126; KCl, 4; MgCl2 , 1; Na-HEPES, 20; pH 7,4; glucosa, 5,6, y cantidades variables de CaCl2 , por ejemplo., 1,25 mM. Las glándulas paratiroideas humanas se obtuvieron a partir de pacientes que experimentaban la remoción quirúrgica del tejido paratiroideo para el hiperparatiroidismo primario o urémico (HPT urémico), y se trataron de modo similar al tejido bovino.

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A las glándulas se les quitó el exceso de grasa y el tejido conjuntivo, desmenuzándose con unas tijeras finas en cubos de 2 a 3 mm de lado aproximadamente. Se prepararon células paratiroideas disociadas mediante digestión colagenásica, y entonces se purificaron mediante centrifugación en tampón Percoll. La preparación resultante de células paratiroideas fue desprovista esencialmente de hematíes, adipocitos, y tejido capilar, tal como se evaluó mediante 13

ES 2 234 768 T3 microscopía de contraste de fase y tinción con negro Sudán B. Las células paratiroideas disociadas y purificadas se encontraron como pequeños conjuntos que contenían de 5 a 20 células. La viabilidad celular, determinada mediante exclusión del azul de tripan o del bromuro de etidio, fue rutinariamente del 95%. 5

Aunque en este momento las células pueden utilizarse con propósitos experimentales, las respuestas fisiológicas (por ejemplo., la supresibilidad de la secreción de PTH y los niveles de base de [Ca2+ ]i , deberán determinarse después de cultivar las células durante la noche. El cultivo primario tiene asimismo la ventaja de que las células pueden ser marcadas con isótopos para aproximarse al equilibrio isotópico, pues es necesario para estudios que impliquen mediciones del metabolismo del fosfato de inositol.

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Después de la purificación en gradientes del Percoll, las células se lavaron varias veces en una mezcla 1:1 de medio de Ham’s F12-Eagle modificado por Dulbecco (GIBCO) suplementado con 50 µg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 5 µg/ml de gentamicina e ITS+ . ITS+ es una solución premezclada que contiene insulina, transferrina, selenio, y albúmina sérica bovina (BSA)-ácido linolénico (Collaborative Research, Bedford, MA). Las células se transfirieron entonces a matraces de plástico (75 ó 150 cm2 ; Falcón) y se incubaron por la noche a 37ºC en una atmósfera húmeda de CO2 al 5%. No se añadió suero a estos cultivos nocturnos, ya que su presencia permite que las células se unan al plástico, experimenten proliferación, y se diferencien. Las células cultivadas bajo las condiciones anteriores, se eliminaron de los matraces mediante decantación, y muestran la misma viabilidad que las células recién preparadas.

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Células paratiroideas purificadas se volvieron a suspender en 1,25 mM de CaCl2 -2% BSA-PCB que contenía 1 µM de fura-2-acetoximetil-éster y se incubaron a 37ºC durante 20 minutos. Las células se sedimentaron entonces, se volvieron a suspender en el mismo tampón, pero sin el éster, y se incubaron otros 15 minutos a 37ºC. Las células se lavaron a continuación dos veces con PCB que contenía 0,5 mM CaCl2 , y 0,5% BSA y se conservaron a temperatura ambiente (alrededor de 20ºC). Inmediatamente antes de su utilización, las células se diluyeron cinco veces con 0,5 mM CaCl2 -PCB precalentado para obtener una concentración final de BSA del 0,1%. La concentración de células en la cubeta utilizada para el registro de la fluorescencia fue de 1 a 2 x 106 /ml. La fluorescencia de las células cargadas con el indicador se midió a 37ºC en un espectrofluorímetro (Biomedical Instrumentation Group, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA) equipado con un sujetador de cubeta termostatada y un agitador magnético utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 340 y 510 nm, respectivamente. Esta fluorescencia indica el nivel del Ca2+ citosólico. Las señales de la fluorescencia se calibraron utilizando digitonina (50 µg/ml, final) para obtener la fluorescencia máxima (Fmax ), y EGTA (10 mM, pH 8,3, final) para obtener la fluorescencia mínima (Fmin ), y una constante de disociación de 224 nM. La fuga del colorante depende de la temperatura y la mayor parte tiene lugar en los 2 minutos primeros después de calentar las células en la cubeta. La fuga del colorante aumenta sólo por tanto, muy lentamente. Para corregir la calibración respecto a la fuga del colorante, las células se dispusieron en la cubeta y se agitaron a 37ºC durante 2 a 3 minutos. La suspensión celular se eliminó entonces, las células se sedimentaron, y el sobrenadante volvió a una cubeta limpia. El sobrenadante se trató entonces con digitonina y EGTA para evaluar la fuga del colorante, que es típicamente del 10 al 15% de la señal fluorescente total dependiente del Ca2+ . Esta evaluación se restó de la Fmin aparente. Ejemplo 4 Utilización de las células HEK 293/pHuPCaR4.0 cargadas con fura-2 para medir la actividad del receptor cálcico

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Esta sección describe procedimientos utilizados para ensayar la actividad del receptor del calcio utilizando células HEK 293/pHuPCaR4.0 cargadas con fura-2. Células HEK 293 transfectadas con pHuPCaR4.0 se cargaron con fura-2 y se incubaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco tamponado con 20 mM de HEPES que contenía alrededor de 5 µM de fluo-3/AM, durante una hora a temperatura ambiente. Las células se enjugaron entonces con una solución salina equilibrada de Hank tamponada con 20 mM de HEPES que contenía 1 mM de CaCl2 y 1 mM de MgCl2 . Los compuestos que se iban a ensayar se añadieron entonces a las células y se midió la fluorescencia (longitudes de onda de excitación y emisión de 340 y 510 nm, respectivamente). Ejemplo 5

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Medición de la capacidad de los compuestos para modular la actividad del receptor cálcico

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La capacidad de los compuestos para modular la actividad del receptor cálcico se ensayó midiendo los aumentos en [Ca2+ ]i en las células HEK 293 transfectadas con el ácido nucleico que codifica pHuPCaR4.0 utilizando células cargadas con fura-2 o utilizando células paratiroideas cargadas con fura-2. Los resultados de los distintos experimentos se sumarizan en la Tabla 1. La Tabla 1 sumariza los efectos de compuestos, a diferentes concentraciones, sobre la actividad del receptor cálcico ensayada tal como se describe en el Ejemplo 4 (es decir, utilizando células HEK 293 transfectadas con ácido nucleico que codifica pHuPCaR4.0, que se cargaron con fura-2). El compuesto R-568 de referencia presenta la estructura

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ES 2 234 768 T3 TABLA 1

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Ejemplo 6 Síntesis de compuestos

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Los compuestos que se describen en la presente memoria pueden sintetizarse utilizando técnicas estándar tales como las descritas por Nemeth et al, PCT/US93/01642, Publicación internacional número WO 94/18959).

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ES 2 234 768 T3 REIVINDICACIONES 1. Compuesto que presenta la estructura: 5

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o una sal o complejo farmacéuticamente aceptable del mismo.

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2. Composición farmacéutica que comprende un compuesto, sal o complejo farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 3. Utilización del compuesto, sal o complejo farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que padece una enfermedad o trastorno caracterizado por una homeostasis mineral y ósea anormal.

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4. Utilización del compuesto, sal o complejo farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que padece hiperparatiroidismo. 5. Utilización del compuesto, sal o complejo farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que padece la enfermedad de Paget. 6. Utilización del compuesto, sal o complejo farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que padece osteoporosis.

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7. Utilización del compuesto, sal o complejo farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que padece hipertensión. 8. Utilización del compuesto, sal o complejo farmacéuticamente aceptable según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente que padece osteodistrofia renal.

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ES 2 234 768 T3 LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: 5

(i) SOLICITANTE: NPS Pharmaceuticals, Inc. (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS ACTIVOS DE RECEPTORES DE CALCIO (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: Lyon & Lyon First Interstate World Center, Suite 4700 633 West Fifth Street (C) CIUDAD: Los Angeles (D) ESTADO: California (E) PAÍS: USA

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(F) CP: 90017 (v) MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR (A) TIPO DE MEDIO: disquete 3.5”, capacidad 1.44 Mb

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(B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: FastSeq

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(vi) FECHA DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C) CLASIFICACIÓN:

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(vii) FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR: nº total de solicitudes, incluyendo la solicitud descrita más abajo: 2 (A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/353.784 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 8 diciembre 1994

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(A) NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US/94/12117 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 21 octubre 1994 (viii) INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Herbert, Sheldon

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(B) NÚMERO DE REGISTRO: 38.179 (C) REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: 215/304 (ix) INFORMACIÓN DE CONTACTO:

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(A) TELÉFONO: (213) 489-1600 (B) FAX: (213) 955-0440 (C) TELEX: 67-3510

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5006 pares de bases

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(B) TIPO: ácido nucleico (C) Nº DE HEBRAS: única 1

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(ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE / CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 436...3699 (D) OTRAS INFORMACIONES

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(ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40

(A) LONGITUD: 3809 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Nº DE HEBRAS: única

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(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm (ix) CARACTERÍSTICAS:

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(A) NOMBRE / CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 373...3606 (D) OTRAS INFORMACIONES

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(ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 2

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