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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

A61K 35/56 (2006.01) C07G 17/00 (2006.01) A61P 37/06 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 281 195

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 99954125 .3

86 Fecha de presentación : 02.11.1999

87 Número de publicación de la solicitud: 1126860

87 Fecha de publicación de la solicitud: 29.08.2001

54 Título: Factores inmunomoduladores para el tratamiento inmunosupresor y antialérgico.

30 Prioridad: 03.11.1998 GB 9824034

73 Titular/es: The Secretary of State for Defence

Defence Science and Technology Laboratory Porton Down Salisbury, Wiltshire SP4 0JQ, GB

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.09.2007

72 Inventor/es: Pritchard, David Idris y

Williams, Paul

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Curell Suñol, Marcelino

ES 2 281 195 T3

16.09.2007

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 281 195 T3 DESCRIPCIÓN Factores inmunomoduladores para el tratamiento inmunosupresor y antialérgico. 5

Campo de la invención La presente invención se refiere a unos factores inmunomoduladores para la utilización en un tratamiento inmunosupresor y antialérgico.

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Antecedentes de la invención La rinitis alérgica (por ejemplo, la fiebre del heno) y el asma son los resultados típicos de la respuesta del sistema inmunitario frente a moléculas inhaladas como alérgenos y antígenos. Se ha establecido que el entrecruzamiento de los anticuerpos inicia una serie de sucesos bioquímicos y farmacológicos que comprenden la liberación de mediadores potentes de la inflamación, que dan como resultado las reacciones alérgicas, que incluyen: dificultad para respirar, picor, exceso de secreción mucosa, etc.., llegando incluso a las reacciones alérgicas que suponen un peligro para la vida en algunas situaciones poco frecuentes.

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Terapéuticamente, se utilizan muchos agentes para intentar evitar la liberación de los mediadores y/o para tratar los sucesos derivados mediante el bloqueo o la reducción de los efectos de los mediadores en los tejidos diana. Ninguno de los tratamientos disponibles actualmente resulta ideal, y cada uno de ellos presenta problemas como los efectos adversos y el abandono del tratamiento.

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Los compuestos inmunosupresores inducen una inhibición de la respuesta del sistema inmunitario. El proceso de rechazo mediado por una respuesta inmunitaria es la causa principal del fracaso en los transplantes de órganos. Gracias a los compuestos inmunosupresores se han obtenido unas mejoras sorprendentes en la inmunosupresión y el transplante posterior de un órgano así como en la supervivencia de los pacientes.

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Las enfermedades autoinmunes son unos trastornos en los que la discriminación por parte del huésped de lo “propio” frente a lo “no propio” deja de funcionar y el sistema inmunitario de la persona (tanto los componentes adquiridos como los innatos) atacan a los propios tejidos. Existen indicios de que el error principal y fundamental responsable de la inducción y persistencia de la mayoría de las enfermedades autoinmunes se sitúa en los linfocitos T proliferativos autorreactivos.

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Los fármacos inmunosupresores disponibles en la actualidad presentan como inconveniente un intervalo terapéutico estrecho. Se sabe que los compuestos resultan nefrotóxicos, neurotóxicos y potencialmente diabetogénicos y por lo consiguiente su uso es limitado. Se presentan asimismo problemas en la administración de dichos compuestos, con su biodisponibilidad y en la monitorización de sus niveles tanto clínicamente como en el laboratorio.

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El nematodo murino Heligmosomoides polygyrus es resistente al sistema inmunitario y habita en el duodeno del ratón durante 8 meses o incluso más a lo largo de la infección primaria. Cuando se genera una respuesta inmunitaria contra dicho parásito en unas condiciones experimentales artificiales, parece estar mediada por células Th2 y sus citoquinas asociadas. Sin embargo, el parásito aparentemente ha desarrollado unos mecanismos para contraatacar la respuesta Th2 potencialmente protectora, dando lugar a la cronicidad de las infecciones naturales. Simultáneamente, las infecciones por Heligmosomoides polygyrus suprimen la respuesta inmunitaria frente a una variedad de antígenos heterólogos como las eritrocitos ovinos y otros parásitos nematodos expulsados normalmente mediante lo que se conoce como los mecanismos inmunitarios mediados por Th2. La actividad supresora es asimismo demostrable in vivo e in vitro utilizando unos extractos de parásito o productos de excreción secreción (ES) (Pritchard et al., Immunology (1984); 51: 633-642 y Pritchard et al, Int. J. Para. (1994); 24: 495-500).

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Sumario de la invención

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La presente invención se basa en el aislamiento de un factor inmunomodulador (IMF) a partir del nematodo Heligmosomoides polygyrus que actúa interfiriendo en la función de las células T, posiblemente incrementando la producción de células T CD8+ junto a una disminución simultánea de las células T CD4+ . Por tanto, según la presente invención, se da a conocer un agente inmunosupresor, en la que el agente se puede obtener a partir de los productos de excreción secreción (ES) del nematodo Heligmosomoides polygyrus fraccionados en una columna de Sephacryl S2500 F equilibrada con un perfil de elución isocrático de acetato de amonio 100 mM, y se caracteriza por presentar un peso molecular inferior a 12 KDa estimado o bien por filtración en un gel en Sephacryl S-200 SF o mediante SDSPAGE y está sustancialmente libre de enlaces polipéptidos. El agente puede ser no proteico.

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El agente se puede utilizar en la preparación de un medicamento para el tratamiento de los trastornos alérgicos o autoinmunes. En particular, el agente se puede utilizar en la preparación de un medicamento para la prevención de un rechazo durante el transplante de un órgano o tejido. El agente se puede utilizar también en el tratamiento de otros trastornos autoinmunes, por ejemplo la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple.

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ES 2 281 195 T3 Descripción de las figuras La Figura 1a ilustra el perfil de elución del agente inmunosupresor activo (IMF) durante la cromatografía de filtración en gel utilizando Sephacryl S-200SF; 5

la Figura 2 ilustra el efecto del agente inmunosupresor en la producción del anticuerpo anti-KLH en el ensayo KAP; la Figura 3 ilustra el efecto del agente en la producción de IgE; 10

la Figura 4 ilustra el efecto del agente en la producción de IgG1; la Figura 5 ilustra el efecto del agente en la producción de IgG4; y 15

la Figura 6 ilustra el efecto del agente en los diferentes subconjuntos de células murinas. Descripción de la invención

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Los agentes de la presente invención se pueden obtener a partir del nematodo Heligmosomoides polygyrus. Los agentes actúan reduciendo la respuesta inmunitaria mediada por Th2. Sin ninguna intención de ceñirse a la teoría, la actividad de los agentes puede ser debida a una estimulación de la producción de las células CD8+ y una reducción simultánea en las células CD4+ .Las células CD8+ se han implicado en la supresión de la producción de IgE, posiblemente a través de la producción o inducción del interferón γ. La invención se ilustrará con mayor detalle únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a las figuras adjuntas. Infección de animales y recuperación de los gusanos

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Se infectaron ratones CFLP, criados en laboratorio, por vía oral con 400 l3 de larvas de H. polygyrus y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los gusanos adultos se recuperaron diez días después mediante el uso del procedimiento de Baermann modificado (Pritchard et al., 1994, supra). Recogida de productos de Excreción /Secreción (ES)

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Los H. polygyrus adultos se desinfectaron por lavado durante 4 horas cambiando varias veces la solución salina (0,9% NaCl p/v) que contiene penicilina a 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml. Se transfirieron a una solución de Hank equilibrada con sales y se cultivaron durante 24 horas a una temperatura de 37ºC. Los productos ES resultantes se filtraron estérilmente con un filtro estéril de 0,22 µm y se almacenaron congelados a una temperatura de -20ºC. Las concentraciones de proteínas se calcularon utilizando el método de Lowry. Fraccionamiento de los productos ES

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El agente inmunosupresor (IMF) no sobrevive en estado activo durante la cromatografía de intercambio de iones, por lo tanto los productos ES se fraccionaron en una columna Sephacryl S-200SF (Pharmacia Biotech) equilibrada con un perfil de elución isocrático de acetato de amonio 100 mM. Se recogieron fracciones de 5 ml, se secaron por congelación, se disolvieron de nuevo en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), se ensayó a continuación la actividad inmunosupresora utilizado un ensayo de producción anticuerpo de hemocianina de lapa murina (KAP) (Pritchard et al., 1994, supra) y el contenido de proteína se calculó utilizando el método de ensayo de Lowry. Se mezclaron las fracciones activas, se etiquetaron cono IMF y se almacenaron congeladas. Ensayo (KAP) de producción de anticuerpo de hemocianina de lapa (KLH) para la detección de la actividad inmunomoduladora

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El ensayo KAP es impulsado por los linfocitos, que producen unos niveles elevados de interleuvina -4 (IL-4) tras la estimulación por los linfocitos B presentadores de antígeno y por lo tanto constituye un buen modelo in vitro para la respuesta inmunitaria dirigida por TH2. Se cultivaron 100 µl de células de bazo de los animales marcados con KLH in vivo (2,5x107 células/ml en RPMI 1640 + 10% suero bovino fetal (SBF) + L-glutamina + 2-mercaptoetanol + penicilina + estreptomicina), 50 µl de producto de ensayo y 100 µl de KLH a una concentración de 16,7 µg/ml a una temperatura de 37ºC durante 6 días en una atmósfera de CO2 /aire al 5%. Se lavaron las células por centrifugación a 300 xg en una centrífuga Centra 7R y mediante la eliminación y sustitución de 175 µl de medio, el procedimiento de repitió dos veces. Tras 24 horas más de incubación, se extrajeron los sobrenadantes y se mezclaron los replicados y se almacenaron congelados a una temperatura de -20ºC. Las muestras se ensayaron más tarde para los anticuerpos antiKLH mediante ELISA. Las placas de microtitulación de 96 pocillos se cubrieron durante la noche a una temperatura de 4ºC con 150 µl de KLH a una concentración de 10 µg/ml en un tampón de 50 mM carbonato/bicarbonato, pH 9,6. Las placas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2, que contiene Tween 20 (PBs/tween) al 0,05%. Se diluyeron 150 µl muestras de 1 a 4 de PBS/tween, se añadieron y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente (TA). Después de lavar las placas, se añadieron 150 µl de IgG antirratón (molécula 3

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total) conjugado con fosfatasa alcalina, a una concentración 1 en 500 PBS/tween, y se incubaron a TA durante 2 horas. Las placas se lavaron y se les añadieron 150 µl de p-nitrofenil fosfato a una concentración de 1 mg/ml en tampón carbonato 50 mM pH 9,8 + MgCl2 1 mM. Después de 30 minutos de la aparición del color, se midió la densidad óptica en un lector de placas a una longitud de onda de 405 nm. Con el fin de investigar las propiedades proteicas del IMF, se trataron los ES con una proteínasa K inmovilizada (500 µl ES + 100 µl agarosa proteinasa K como una papilla en PBS, durante 2 horas a una temperatura de 37ºC). Como controles, se sustituyeron agarosa o agarosa proteinasa K tratada con calor (100ºC, 5 min). Producción de factor inmunomodulador (IMF) a partir de productos ES

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El fraccionamiento de los productos ES mediante filtración de gel en Sephacryl S-200SF produjo un pico que contiene IMF como se indica mediante la actividad en el ensayo KAP. El rastro está representado en la Fig. 1. La calibración de la columna con los estándares de proteína de pesos moleculares conocidos indicó la presencia de actividad asociada al material de un tamaño inferior a 12 KDa. Los estándares de pesos moleculares bajos se coeluyeron con la fracción IMF. El SDS-PAGE indicó también la presencia de un material con una masa