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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

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A61K 31/335

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93908379.6 kFecha de presentaci´on : 23.03.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 706 373 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 17.04.1996

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54 T´ıtulo: Taxol encapsulado en liposomas y m´ etodo para su uso.

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73 Titular/es: GEORGETOWN UNIVERSITY

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72 Inventor/es: Rahman, Aquilur;

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74 Agente: D´ avila Baz, Angel

30 Prioridad: 23.03.1992 US 855667

37th & “O” Streets, Northwest Ryan Administration Building Washington, DC 20057, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.10.2000

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 148 223 T3

16.10.2000

Aviso:

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Rafaeloff, Rafael y Husain, Syed Rafat

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 148 223 T3 DESCRIPCION Taxol encapsulado en liposomas y m´etodo para su uso. 5

La presente invenci´on se relaciona con taxol encapsulado en liposomas y con un m´etodo para su uso. Estado de la t´ ecnica

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El taxol, consistente en ´ester de 6,12b - bis(acetiloxi) - 12 - (benzoiloxi) - 2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 12a, 12b - dodecahidro - 4,11 - dihidroxi - 4a,8, 13,13 - terametil - 5 - oxo - 7,11 - metano - 14 - ciclodeca(3,4)benz(1,2 - 6)oxet - 9 - ilo de ´acido (2aR - (2aα,4β,4aβ,6β,9α(αR∗,βS∗ ), 11a,12α,12aα,12bα)) β - (β - (benzoilamino) - α - hidroxibencenopropanoico, tiene la f´ ormula (I):

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El taxol fue aislado por primera vez a partir de la corteza del a´rbol de tejo del Pac´ıfico, Taxus breviofolia Taxaceae, y se ha comprobado que exhibe importante actividad antineopl´ astica contra el melanoma B16 intraperitonealmente implantado (i.p.), leucemia L1210, leucemia P388 y contra el xenoinjerto de tumor mamario humano MX-1. M´ as recientemente, se determin´o que el taxol exhib´ıa una contracci´on de los tumores en el 30-40 % de mujeres con tumores ov´aricos avanzados. Igualmente, el taxol ha demostrado ser considerablemente prometedor en el tratamiento del c´ ancer de mama metast´ atico. El taxol inhibe la replicaci´ on celular normal in vitro al promover la reuni´ on de microt´ ubulos y estabilizar los pol´ımeros de tubulina contra la despolimerizaci´on. El taxol funciona como un veneno de bastoncitos mit´ oticos y es un potente inhibidor de la replicaci´ on celular in vitro. El taxol mejora notablemente todos los aspectos de la polimerizaci´on, iniciaci´ on y alargamiento de la tubulina, los cuales se hacen m´as r´apidos. Como se ha observado en pruebas cl´ınicas, el taxol ha mostrado una actividad suficiente contra linfomas y c´anceres de ovarios y mama. Debido a su limitada solubilidad en agua, el taxol se prepara y administra en un veh´ıculo que contiene cremophor EL, un aceite de ricino polioxietilado y etanol en una reacci´on de 50:50 (vol/vol). Esta soluci´ on se diluye adicionalmente 1:10 en salina antes de su administraci´on a humanos. En pruebas cl´ınicas, se ha encontrado un problema consistente de reacci´ on anafil´ actica, disnea, hipertensi´ on y enrojecimiento. La toxicidad cardiaca del taxol es un factor limitativo del tratamiento y, debido a ello, el paciente ha de ser hospitalizado durante la infusi´ on continua de f´ armaco.

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Por otro lado, la estabilidad del taxol una vez diluido en soluci´ on de salina es muy baja. El f´ armaco de degrada en un espacio de 24 horas y, por tanto, la manipulaci´ on de la dosis para el paciente llega a ser muy dif´ıcil. Adem´as, el f´ armaco precipita de una soluci´ on diluida y, en consecuencia, se utiliza un filtro en l´ınea para realizar la infusi´ on del f´ armaco en el paciente.

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Los intentos realizados para evitar la cardiotoxicidad y reacci´on anafil´ actica del taxol han incluido la realizaci´ on de un tratamiento previo de los pacientes con antihistamina y corticosteroides y la prolongaci´ on del tiempo de infusi´ on desde 6 a 24 horas. Incluso con estas manipulaciones, los pacientes experimentan serias toxicidades que con frecuencia son fatales.

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Adem´as, el taxol se ha obtenido tradicionalmente a partir de a´rboles del tejo del Pac´ıfico en bosques del noroeste de Pac´ıfico, requiriendo el sacrificio de 6 ´arboles para obtener una cantidad suficiente de f´ armaco para tratar un solo paciente. Aunque recientemente se ha anunciado que el taxol podr´ıa producirse por v´ıa sint´etica v´ease The Wall Street Journal, 18 de Marzo, 1992, el rendimiento obtenido es necesariamente peque˜ no como consecuencia del gran n´ umero de etapas involucradas en la s´ıntesis. De este modo, incluso en el caso de que pudieran desarrollarse s´ıntesis de taxol mejoradas, seguir´ıan existiendo un n´ umero de inconvenientes inherentes al taxol.

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La Patente US No. 4.534.899 describe un compuesto de fosfol´ıpido que comprende un material formador de l´ıpidos y taxol. Sin embargo, los problemas asociados con el uso de taxol no son resueltos de forma completa por el hecho de proporcionar taxol encapsulado en liposomas tal y como ha sido descrito en la Patente US No. 4.534.899.

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De este modo, existe la necesidad de disponer de un medio por el cual los inconvenientes anteriores puedan ser evitados o por el cual puedan reducirse al m´ınimo sus impactos. Descripci´ on de la invenci´ on

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En consecuencia, un objeto de la presente invenci´ on consiste en proporcionar taxol encapsulado en liposomas, que reduce al m´ınimo los inconvenientes anteriores. Igualmente, un objeto de la presente invenci´ on consiste en proporcionar un m´etodo para el tratamiento de c´ancer en mam´ıferos.

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Adem´as, un objeto particular de la presente invenci´ on consiste en proporcionar un m´etodo para el tratamiento de linfoma, c´ anceres de mama, ovarios, pulm´ on y colon en mam´ıferos.

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En consecuencia, los objetos anteriores as´ı como otros objetos se consiguen mediante taxol encapsulado en liposomas y por sus derivados antineopl´ asticos. Breve descripci´ on de los dibujos La Figura 1 ilustra la estabilidad del taxol lipos´ omico a diferentes temperaturas.

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La Figura 2 ilustra una evaluaci´ on de la toxicidad del taxol libre y del taxol lipos´ omico en ratones normales. La Figura 3 ilustra la citotoxicidad del taxol en c´elulas de leucemia parentales HL 60. 40

La Figura 4 ilustra la absorci´on de taxol por las c´elulas parentales HL 60. La Figura 5 ilustra la citotoxicidad del taxol en c´elulas HL 60/VCR. 45

La Figura 6 ilustra a absorci´ on de taxol por c´elulas HL 60/VCR. Mejor modo de llevar a cabo la invenci´ on

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La presente invenci´on se relaciona en general con taxol encapsulado en liposomas y con m´etodos para su uso. En general, de acuerdo con la presente invenci´on se puede poner en pr´actica cualquier m´etodo de utilizaci´on del taxol con un objetivo terap´eutico convencional, obteni´endose resultados sorprendentemente mejorados. En parte, la presente invenci´ on proporciona un sistema de suministro de taxol a un anfitri´ on mam´ıfero que se caracteriza por 1) evitaci´on de problemas de solubilidad del taxol, 2) estabilidad mejorada del taxol, 3) evitaci´on de reacciones anafil´ acticas y de cardiotoxicidad, 4) posibilidad de administrar taxol como un bolo o como una infusi´ on corta en lugar de realizar una infusi´ on prolongada (24 horas) de taxol libre, 5) mayor eficacia terap´eutica del taxol y 6) modulaci´ on de la resistencia a m´ ultiples f´ armacos en c´elulas de c´ancer.

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Tal y como aqu´ı se emplea, el t´ermino “liposoma” significa una estructura cerrada constituida por bicapas de l´ıpidos que rodean a un espacio acuoso interno. 3

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Adem´as, tal y como aqu´ı se emplea, la frase “taxol o un derivado antineopl´ astico del mismo” significa taxol o cualquier derivado de taxol que se utiliza o puede ser utilizado, en quimioterapia del c´ ancer como consecuencia de sus propiedades antineopl´ asticas. Ha de apreciarse particularmente que aunque se cree que el taxol funciona como un compuesto antineopl´ astico al promover la reuni´ on de microt´ ubulos y estabilizar los pol´ımeros tubulina contra la despolimerizaci´on, los derivados de la presente invenci´ on, quedan limitados a aquellos que funcionan mediante cualquier mecanismo en particular. Por ejemplo, adem´ as del taxol, quedan incluidos de forma expl´ıcita dentro de la presente invenci´on los derivados tales como taxasm u otros mencionados en Syntesis and Anticancer Activity of Taxol derivatives D.G.I Kingston et al, Studies in Organic Chemistry, volumen 26, titulado “New Trends in Natural Products Chemistry” 1986, Atta-ur-Rahman, P.W. le Quesue, Eds. (Elvesier, Amsterdam 1986), pp. 219-235.

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En general, de acuerdo con la presente invenci´ on, el taxol o un derivado del mismo se disuelve en un disolvente adecuado. Como disolvente, se puede emplear cualquier disolvente no polar o ligeramente polar, tales como etanol, metanol, cloroformo o acetona. A continuaci´on, se disuelve cardiolipina en un disolvente adecuado como los descritos para el taxol y se mezclan las soluciones.

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El material formador de l´ıpidos se disuelve entonces en un disolvente adecuado, el cual es generalmente un disolvente de baja polaridad, tal como cloroformo, o en un disolvente no polar, tal como n-hexano. La mezcla disolvente anterior y la soluci´on que contiene el material formador de l´ıpidos se mezclan y los disolventes de separan para proporcionar una pel´ıcula seca y fina de l´ıpido y f´ armaco.

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Los liposomas se forman entonces a˜ nadiendo soluci´ on de salina a los mismos. A continuaci´on, los liposoma multi-laminares se pueden formar mezclando los liposomas, por ejemplo, someti´endolos a movimiento vorticial.

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En general, los liposomas pueden ser liposomas neutros, negativos o positivos. Por ejemplo, los liposomas positivos se pueden formar a partir de una soluci´ on que contiene fosfatidilcolina, colesterol y estearilamina. Los liposomas negativos se pueden formar, por ejemplo, a partir de soluciones que contienen fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidilserina.

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Por otro lado, a la hora de mezclar la soluci´on de salina con la pel´ıcula seca y fina de l´ıpido y f´ armaco, se puede emplear cualquier forma de dispersi´ on con la condici´on de que la mezcla resulte fuertemente homogeneizada. Por ejemplo, dicha homogeneizaci´on se puede efectuar utilizando un v´ ortice, agitador magn´etico y/o sonicaci´on.

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La cardiolipina usada seg´ un la presente invenci´ on se puede obtener a partir de una fuente natural o sint´etica como ya es bien conocido para los expertos en la materia. Resumen de la invenci´ on

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De acuerdo con la presente invenci´ on, ser proporciona un liposoma que comprende un material formador de liposomas, cardiolipina y taxol. Con preferencia, dicho material formador de liposomas es al menos uno de los l´ıpidos seleccionados del grupo consistente en fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidilserina.

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La cardiolipina se elige preferentemente del grupo consistente en cardiolipina natural y cardiolipina sint´etica. Los liposomas pueden portar una carga negativa, una carga positiva o pueden ser neutros. Adem´ as, el liposoma puede comprender ves´ıculas unilaminares o multilaminares.

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La presente invenci´on proporciona igualmente una composici´ on farmac´eutica que comprende uno o m´as liposomas como los descritos anteriormente y un excipiente farmac´euticamente aceptable.

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De acuerdo con la presente invenci´ on se proporciona tambi´en el uso de la composici´on farmac´eutico descrita anteriormente en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo consistente en linfoma, c´ ancer de pulm´ on, c´ ancer de colon, c´ancer de ovarios y c´ancer de mama en un mam´ıfero. 4

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La presente invenci´on proporciona adem´ as el uso como anteriormente se ha descrito, en donde se induce hipotermia localizada en los tejidos cancerosos del mam´ıfero simult´ aneamente con la administraci´on del medicamento o bien despu´es de la administraci´on del medicamento. 5

De acuerdo con una modalidad m´ as de la presente invenci´ on, se proporciona el uso como anteriormente se ha descrito, en donde el mam´ıfero es un humano.

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Una vez descrita la presente invenci´on, se har´ a referencia ahora a ciertos ejemplos los cuales se proporcionan exclusivamente con fines ilustrativos y de ning´ un modo con fines limitativos. Ejemplo 1

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A 2,93 µM de taxol disuelto en cloroformo se a˜ nadieron 2,81 µM de cardiolipina en etanol. A esta mezcla, se a˜ nadieron 14,16 µM de fosfatidilcolina disuelta en hexano y 9,83 µM de colesterol en cloroformo. La mezcla se agit´ o suavemente y luego se evaporaron los disolventes bajo vac´ıo a una temperatura o una pel´ıcula seca y delgada de l´ıpido y f´ armaco. Los liposomas se formaron por debajo de 30◦ C. Se form´ cuando se a˜ nadieron 2,5 ml de soluci´ on de salina. Las escamas fueron sometidas a movimiento vorticial mediante media hora para proporcionar liposomas multilaminares. Estos liposomas fueron sonicados entonces durante media hora en un sonsacador de cuerno Heat System Cup, para proporcionar peque˜ nos liposomas unilaminares. Los liposomas fueron entonces dializados contra un litro de soluci´on de salina durante 24 horas. Una vez terminada la di´ alisis, se disolvi´ o un parte al´ıcuota de los liposomas en etanol y se analiz´ o mediante cromatograf´ıa en fase l´ıquida a elevada presi´ on (HPLC). La eficacia de encapsulaci´on del taxol en liposomas fue mayor del 95 % de la dosis de entrada inicial. La concentraci´ on de taxol en estos liposomas fue de 0,95 mg/ml. Ejemplo 2

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En este ejemplo de preparaci´ on, se emplearon las mismas condiciones experimentales excepto que se variaron las cantidades de f´ armaco y l´ıpidos. Para este ejemplo de preparaci´ on, se emplearon las siguientes concentraciones: Taxol 5,86 µM, cardiolipina 5,62 µM, fosfatidilcolina 28,18 µM y colesterol 19,38 µM. Los disolventes fueron evaporados entonces bajo vac´ıo y las capas secas de l´ıpidos y f´ armacos se dispersaron con 5 ml de soluci´ on de tetrahalosa-salina al 7 %, tras lo cual se procedi´ o a la hidrataci´ on, agitaci´ on vorticial y sonicaci´ on. Los liposomas fueron dializados entonces durante 24 hora y el porcentaje de encapsulaci´on de taxol en los liposomas fue mayor de 94 % tal y como se verific´o mediante HPLC. Estudios de estabilidad

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Los liposomas de taxol fueron preparados del modo usual utilizando cardiolipina, fosfatidilcolina y colesterol. Una parte al´ıcuota de estos liposomas de coloc´o a temperatura ambiente y a temperatura de refrigeraci´on (4◦ C). Como se muestra en la Figura 1, los liposomas de taxol a temperatura ambiente fueron estables durante 4 d´ıas. Por el contrario, el taxol libre de una concentraci´ on de 0,6 mg/ml en salinas se degrada en el espaci´o de 3 horas. El taxol lipos´ omico a la temperatura de refrigeraci´ on fue estable durante un mes.

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En otra serie de experimentos, se prepararon liposomas de taxol del modo usual pero en lugar de utilizar salina se emple´o tetrahalosa-salina al 7 % (un az´ ucar de diglucosa) para resuspender los liposomas. Se colocaron partes al´ıcuotas de estos liposomas a -20◦ C y a -80◦ C. A -20◦C, los liposomas de taxol fueron tambi´en estables durante un mes tal como se determin´o mediante HPLC. En este momento se dio por terminado el experimento. Los liposomas con 7 % de tetrahalosa se congelaron a -80◦ C durante 5 meses. De manera intermitente, los liposomas fueron descongelados y de nuevo congelados. Este proceso se repiti´o varias veces. Al t´ermino de 5 meses, los liposomas fueron dializados contra soluci´on de tetrahalosa al 7 % y el contenido en taxol en los liposomas dializados se midi´ o mediante HPLC, resultando ser de 93 % de la concentraci´on inicial de taxol en aquellos liposomas. Este experimento demuestra que los liposomas de taxol con tetrahalosa como excipiente pueden ser medios eficaces para almacenar los liposomas congelados y para su uso eficaz en aplicaciones cl´ınicas y terap´euticas despu´es de descongelar los liposomas. Evaluaci´ on de la toxicidad de los liposomas de Taxol

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En este estudio se emplearon ratones machos CD2 F1 con un peso de 22-25 g. El taxol libre, formulado en cremophor EL, fue diluido con salina para proporcionar una concentraci´ on de 1,25 mg/mol. Los 5

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liposomas de taxol se prepararon usando cardiolipina, fosfatidilcolina y colesterol. La concentraci´ on final de taxol en los liposomas fue de 1,25 mg/ml. Diez ratones de cada grupo fueron inyectados con taxol libre o con taxol encapsulado en liposomas a una dosis de 25 mg/Kg i.v. Esta es la dosis m´ as elevada de taxol libre que se puede inyectar en los ratones debido a las limitaciones de solubilidad y contenido en alcohol. Se repitieron las mismas dosis en los ratones en los d´ıas 5 y 9. No se pudieron suministrar m´ as inyecciones en los ratones que recibieron taxol libre debido a la esclerosis de la vena. Como se muestra en la Figura 2, en el d´ıa 12, tres ratones del grupo de taxol libre murieron debido a la toxicidad, mientras que no se observ´o toxicidad o mortalidad en los ratones que fueron inyectados con taxol encapsulado en liposomas.

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Evaluaci´ on terap´eutica del Taxol libre y del Taxol encapsulado en liposomas en ratones portadores de leucemia L1210

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Se propag´ o c´ancer de leucemia mur´ınica L1210 en ratones hembras DBA/2. Para los estudios terap´euticos, ratones CD2 F1 fueron implantados i.p. con 1x105 c´elulas de leucemia L1210 y, transcurridas 24 horas despu´es de la implantaci´on del tumor, se inyectaron con taxol libre o con taxol encapsulado en liposomas. Todos los ratones recibieron una dosis de 6 mg/Kg i.p. en los d´ıas 1 a 5. Ratones de control portadores de tumor fueron inyectados con salina normal en el mismo volumen que los ratones experimentales. Todas las inyecciones se realizaron sobre una base de 2 % de peso corporal. Los ratones fueron pesados en los d´ıas de la inyecci´on, se calcularon las dosis de f´armacos en base al peso corporal y se anot´o en d´ıas el tiempo de supervivencia. La Tabla 1 muestra la eficacia del taxol libre y del taxol encapsulado en liposomas sobre la supervivencia de ratones portadores del tumor L1210. Cuando los ratones fueron inyectados con taxol libre a una dosis de 6 mg/kg i..p. en los d´ıas 1-5, los mismos exhibieron una relaci´on T/C de 1,35 % (tratados versus control). Cuando se inyect´o la misma dosis de taxol que el f´ armaco encapsulado en liposomas, se obtuvo una relaci´on T/C de 178 %, demostrando ello que la supervivencia de los ratones portadores de tumor se mejora sustancialmente cuando se tratan con esta modalidad de tratamiento. Estos estudios demuestran que no solo se reducen las toxicidades del taxol cuando se encapsula en liposomas, sino que esta encapsulaci´ on proporciona tambi´en una mayor relaci´ on terap´eutica en los ratones portadores de tumor.

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Evaluaci´ on de la citotoxicidad del Taxol libre y del Taxol encapsulado en liposomas en c´ elulas de leucemia humana HL-60

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Se hicieron crecer c´elulas de leucemia promieloc´ıticas HL-60 en cultivo de tejido en medio PRM1-1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal. Todos los cultivos se mantuvieron en matraces de pl´astico para el cultivo de tejidos y se mantuvieron en la incubadora a 37◦C en aire humidificado conteniendo 5 % de CO2 .

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Se utiliz´ o el m´etodo de inhibici´ on del crecimiento para determinar la citotoxicidad del taxol libre y el taxol encapsulado en liposomas. Para estos experimentos, en matraces de 25 cm2 se depositaron en on se expusieron a concentraciones capas 1x105 c´elulas en la fase de crecimiento exponencial. A continuaci´ variables de taxol libre y de taxol lipos´ omico durante 72 horas a 37◦ C. Las c´elulas fueron contadas en un hemocit´ometro y se determin´ o la viabilidad mediante exclusi´on con azul tripano. La supervivencia de las c´elulas fue comparada con las c´elulas de control y se determinaron los valores IC50 (concentraci´on inhibidora para el 50 % de las c´elulas) para cada f´ armaco. Como se muestra en la Figura 3, los valores IC50 para el taxol libre fueron de 0,0025 µg/ml y se obtuvieron los mismos valores IC50 para el taxol encapsulado en liposomas. Estos experimentos demuestran que el taxol libre y el taxol lipos´ omico son as´ı equivalentes en su eficacia para producir citotoxicidad en las c´elulas de leucemia HL-60. Acumulaci´ on intracelular de Taxol libre y de Taxol encapsulado en liposomas

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Se determin´ o el contenido celular de taxol mediante cromatograf´ıa en fase l´ıquida a elevada presi´ on (HPLC). En concreto, se incubaron c´elulas de crecimiento exponencial en platos petri de 100 mm con medio conteniendo f´ armaco a 37◦ C. Las c´elulas fueron tratadas durante 1-4 horas con taxol libre o con taxol lipos´omico a una concentraci´ on de f´ armaco de 10 µg/ml y luego fueron centrifugadas y enjuagadas dos veces con PBS. Los botones celulares fueron suspendidos en 0,5 ml de soluci´ on de SDS al 2 % y luego sonicados durante 5 minutos en un sonicador de copa-cuerno. El homogenado celular fue extra´ıdo con 2 ml de metanol. Una parte al´ıcuota de esta soluci´on de inyect´ o en HPLC para la determinaci´on cuantitativa de taxol. Como se muestra en la Figura 4, la concentraci´ on celular de f´ armaco cuando se 6

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expuso con taxol libre, alcanz´ o un nivel m´ aximo en una hora, siendo el valor de 5,18 µg/107 c´elulas. Se observ´ o la misma concentraci´on de taxol a las 2 y 4 horas de exposici´ on del f´ armaco. Sin embargo, con el taxol lipos´ omico, la concentraci´on celular seca fue consistentemente m´as baja que la observada con el taxol libre. En una hora de exposici´ on, la concentraci´on celular de taxol fue de 2,5 µg/107 c´elulas y este valor fue m´ as o menos similar a las 2 y 4 horas de exposici´on con el taxol lipos´ omico. Este experimento demuestra que, incluso si la absorci´ on de f´ armaco encapsulado en liposomas es menor en las c´elulas HL60, la citotoxicidad es similar con cualquiera de las modalidades de tratamiento. Modulaci´ on de la resistencia a m´ ultiples f´ armacos en c´elulas cancerosas por Taxol lipos´ omico

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La resistencia de las c´elulas tumorales a la quimioterapia es uno de los motivos fundamentales de los fallos de tratamiento con pacientes con c´ ancer. Durante los u ´ltimos diez a˜ nos, una preocupaci´ on importante a consistido en definir el mecanismo de la resistencia de los tumores a la quimioterapia. Esta resistencia de los tumores ha demostrado ser el resultado de la expresi´on amplificada del gen de resistencia a m´ ultiples f´ armacos en c´elulas cancerosas. El producto de este gen de resistencia a m´ ultiples f´ armacos, p-glicoprote´ına de 170.000 daltons, funciona como una bomba de descarga y confiere resistencia a la acci´on citot´ oxica de f´ armacos quimioterap´euticos para el c´ ancer, estructuralmente no relacionados, al producir niveles de f´ armacos intracelulares m´as bajos. Los estudios realizados por esta entidad solicitante demuestran que el taxol encapsulado en liposomas tiene una capacidad importante para salvar la resistencia a m´ ultiples f´ armacos. Estos estudios fueron realizados en c´elulas HL 60/VCR que son c´elulas promieloc´ıticas de leucemia humana y se derivan de c´elulas HL-60 parentales y se hacen resistentes a vincristina, demostrando con ello un fenotipo de resistencia a m´ ultiples f´ armacos. Las c´elulas HL-60 VCR se hicieron crecer en medios a 37◦C con 5 % de CO2 .

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Se coloc´o un n´ umero de c´elulas, conocido con precisi´on, en matraces de cultivo de tejidos y se trataron con concentraciones variables de taxol libre, taxol encapsulado en liposomas y liposomas de control que representan la misma concentraci´on de l´ıpidos que la utilizada para el taxol. Despu´es de 72 horas de incubaci´ on, fueron contadas las c´elulas de cada matraz mediante un hemocit´ ometro y se determin´ o la viabilidad por exclusi´on con azul tripano. Se determin´ o el porcentaje de supervivencia de c´elulas tratadas con respecto a control sin tratar. La actividad citot´oxica fue expresada como el valor IC50 el cual fue definido como la concentraci´ on de f´ armaco resultante en un 50 % de supervivencia de las c´elulas en comparaci´on con el control. En la Figura 5 se presentan las curvas de supervivencia de c´elulas HL-60/VCR despu´es de la exposici´on a taxol libre y a taxol encapsulado en liposomas. El valor IC50 para taxol libre en HL-60/VCR es de 2,43 µg/ml, demostrando con ello que esta l´ınea de c´elulas es 1.280 veces m´as resistente que la l´ınea omico es de solo 0,37 µg/ml. de c´elulas parentales HL-60. Sin embargo, el valor IC50 para el taxol lipos´ Esto demuestra que el taxol lipos´ omico sensibiliza 7 veces a las c´elulas HL-60/VCR en comparaci´on con el taxol libre. Por tanto, es evidente que el taxol encapsulado en liposomas modula la resistencia a los f´ armacos en el fenotipo de resistencia a m´ ultiples f´ armacos, lo cual ser´ıa potencialmente una ventaja importante en una situaci´ on cl´ınica en donde una gran poblaci´ on de los pacientes fallaran en su respuesta a la quimioterapia como consecuencia de la resistencia a m´ ultiples f´ armacos. Acumulaci´ on intracelular de Taxol en c´elulas con resistencia a m´ ultiples f´ armacos El contenido celular de taxol fue determinado mediante cromatograf´ıa en fase l´ıquida a elevada presi´ on. En concreto, se incubaron c´elulas HL-60/VCR en la fase de crecimiento exponencial, con resistencia a m´ ultiples f´ armacos en platos petri de 100 mm con medio conteniendo f´ armaco a 37◦C, conteniendo bien taxol libre o bien taxol encapsulado en liposomas. Las c´elulas fueron tratadas durante 1-4 horas con cualquiera de los f´ armacos y luego fueron centrifugadas y enjuagadas dos veces con PBS. Las c´elulas se suspendieron en PBS fr´ıo y se contaron, para centrifugarse de nuevo entonces. Los botones celulares fueron suspendidos en 0,5 ml de soluci´ on de SDS al 2 % y luego fueron sonicados durante 5 minutos en un sonicador de copa-cuerno (Heat Systems, Farmingdate, N.Y.). El homogenado celular resultante fue extra´ıdo con 4 ml de metanol, sometido a movimiento vorticial durante 1 minuto y centrifugado durante 20 minutos a 3.000 rpm. las muestras fueron le´ıdas mediante el uso de HPLC. La concentraci´ on de f´ armaco en 10 c´elulas fue calculada utilizando una curva de calibraci´ on normalizada para c´elulas portadoras de f´ armaco y a continuaci´on se trataron de manera similar. La Figura 6 ilustra la acumulaci´ on de taxol en c´elulas HL-60/VCR con fenotipo de resistencia, despu´es del tratamiento con 10 µg/ml de f´armaco libre y taxol encapsulado en liposomas durante un periodo de 1 a 4 horas. Las c´elulas HL-60/VCR resistentes demostraron una absorci´ on m´ axima de taxol encapsulado 7

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en liposomas y, en el transcurso de la exposici´ on, la acumulaci´ on intracelular del f´ armaco aument´ o de manera correspondiente. A las 4 horas, la acumulaci´ on de f´ armaco fue de 10,54 µg/107 c´elulas con taxol lipos´omico, mientras que la acumulaci´on de taxol libre fue de solo 3,04 µg/107 c´elulas, mostrando una disminuci´on de tres veces en la absorci´on celular. Se observo la misma reacci´on en los primeros momentos de la exposici´on celular y fue evidente una diferencia de dos veces en la concentraci´on de f´ armaco entre el taxol libre y el taxol lipos´ omico. Estos datos sugieren que la modulaci´on de la resistencia al f´armaco en las c´elulas HL-60/VCR se puede explicar parcialmente por la mejorada absorci´ on celular del f´ armaco en el caso del taxol encapsulado en liposomas. La absorci´ on celular mejorada y la modulaci´ on eficaz de la resistencia a m´ ultiples f´ armacos en c´elulas HL-60/VCR por el taxol encapsulado en liposomas, demuestra que esta modalidad de tratamientos puede ser de alto valor cl´ınico para pacientes que han fallado previamente en la quimioterapia del c´ancer. En general, esta modalidad de tratamiento es m´ as eficaz que la del taxol libre y se puede aplicar con ´exito en pacientes con c´ancer. De acuerdo con la presente invenci´ on, el objeto de la misma se puede emplear para tratar cualquier mam´ıfero, tal como una vaca, caballo, cerdo, perro o gato. Sin embargo resulta particularmente preferida para utilizarse en el caso de que el mam´ıfero tratado sea un humano. Como se ha indicado anteriormente, se proporciona ahora la Tabla 1. TABLA

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Evaluaci´ on terap´eutica del taxol libre y del taxol encapsulado en liposomas Taxol contra leucemia L1210 25

Dosis 6 mg/Kg 6 mg/Kg

% T/C Taxol Libre Taxol encapsulado en liposomas

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En general, el taxol, por ejemplo, se puede obtener mediante aislamiento como un producto natural a partir de la corteza del a´rbol de tejo del Pac´ıfico. V´ease M.C. Wani et al, J. Amer, Chem. Soc., vol. 93, 2325 (1971). Sin embargo, el taxol o un derivado antineopl´ astico del mismo se puede sintetizar en el laboratorio. V´ease J.-N. Denis et al, J. Amer, Chem. Soc., vol. 110, pp. 5917-5919 (1988). Por otro lado, el taxol y sus derivados de acuerdo con la presente invenci´ on se pueden emplear para el tratamiento de cualquier forma de c´ ancer en mam´ıferos, particularmente aquellos compuestos que funcionan promoviendo la reuni´ on de microt´ ubulos y que prohiben el proceso de desagregaci´ on de tubulina. Sin embargo, los presentes compuestos resultan particularmente ventajosos en el tratamiento de linfoma, c´ancer de ovarios, c´ ancer de mama, c´ancer de pulm´ on y c´ ancer de colon en mam´ıferos, m´as particularmente en humanos. De acuerdo con la presente invenci´ on, el taxol o derivados antineopl´ asticos del mismo, encapsulados en liposomas, se administran normalmente al mam´ıfero por v´ıa intravenosa o intraperitoneal. Adem´ as, el presente o presentes compuestos se administran generalmente en la cantidad de alrededor de 50-250 on mam´ıfero. mg de compuesto activo por m2 de ´area de superficie del anfitri´ Para un humano, por ejemplo, con un peso corporal de alrededor de 70 Kg, se administran de 0,5 a 5 mg aproximadamente de compuesto activo por Kg de peso corporal. Con preferencia, se administran alrededor de 1-3 mg de compuesto activo por Kg de peso corporal. De este modo, la presente invenci´on proporciona tambi´en m´etodos para el tratamiento de diversos c´anceres en mam´ıferos, particularmente c´anceres en humanos.

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Adem´as, la presente invenci´on proporciona tambi´en un m´etodo para modular la resistencia a m´ ultiples f´ armacos en c´elulas cancerosas que son sometidas a quimioterapia. De acuerdo con este aspecto de la presente invenci´on, se ha descubierto que mediante el uso de las composiciones lipos´omicas de la presente invenci´on, es posible reducir la tendencia de las c´elulas cancerosas sometidas a quimioterapia al desarrollo de resistencia a los agentes quimioterap´euticos usados en la quimioterapia. En particular, las presentes composiciones lipos´ omicas no solo reducen la tendencia de las c´elulas cancerosas sometidas a quimioterapia con taxol y sus derivados a desarrollar resistencia a los mismos, 8

ES 2 148 223 T3 sino que las presentes composiciones reducen tambi´en la tendencia de las c´elulas cancerosas a desarrollar resistencia a otros agentes usados en quimioterapia, tal como glic´osidos de antraciclina, por ejemplo.

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Por otro lado, de acuerdo con la presente invenci´ on, se ha descubierto que las presentes composiciones lipos´omicas se pueden administrar intravenosa o intraperitonealmente a una parte aislada del cuerpo de un mam´ıfero, particularmente del cuerpo de un humano, tal como un brazo o una pierna, o en el caso de un humano, en una mano. A continuaci´ on, dicha porci´ on del cuerpo del mam´ıfero se puede someter a un tratamiento de hipertermia. Los tratamientos de hipertermia son bien conocidos para los expertos en la materia. De manera muy sorprendente, se ha descubierto que tras efectuar el tratamiento de hipertermia, los liposomas administrados se funden para proporcionar una dosis altamente localizada de taxol o derivado del mismo. Como es l´ogico, la dosis administrada depender´a del peso corporal del mam´ıfero que est´ a siendo tratado y de la evaluaci´on del m´edico que realiza el tratamiento. De acuerdo con este aspecto de la presente invenci´on, el tratamiento de hipertermia se puede administrar antes, simult´ aneamente o despu´es de la administraci´on de ingrediente o ingredientes activos, y los liposomas se pueden administrar localmente o generalmente por todo el cuerpo.

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ES 2 148 223 T3 REIVINDICACIONES 1. Un liposoma caracterizado porque comprende un material formador de liposomas, cardiolipina y taxol. 5

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2. Un liposoma seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque dicho material formador de liposomas es al menos uno de los l´ıpidos seleccionados del grupo consistente en fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidilserina. 3. Un liposoma seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque dicha cardiolipina se elige del grupo consistente en cardiolipina natural y cardiolipina sint´etica. 4. Un liposoma seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque dicho liposoma porta una carga negativa, una carga positiva o es neutro.

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5. Un liposoma seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque dicho liposoma comprende ves´ıculas unilaminares o multilaminares. 6. Una composici´on farmac´eutica caracterizada porque comprende uno o m´ as liposomas seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un excipiente farmac´euticamente aceptable. 7. Uso de la composici´on farmac´eutica de la reivindicaci´on 6 en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo consistente en linfoma, c´ ancer de pulm´ on, c´ancer de colon, c´ancer de ovarios y c´ ancer de mama en un mam´ıfero.

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8. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 7, caracterizado porque se induce hipertermia localizada en los tejidos cancerosos de dicho mam´ıfero simult´ aneamente con la administraci´on de dicho medicamento o despu´es de la administraci´on de dicho medicamento. 9. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 7 u 8, caracterizado porque dicho mam´ıfero es un humano.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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