k

19

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

k

21

6

51

˜ ESPANA

12

k ES 2 070 774 kN´umero de solicitud: 9301968 kInt. Cl. : A61K 9/127

11 N.◦ de publicaci´ on:

SOLICITUD DE PATENTE

k

71 Solicitante/es: Laboratorios Hipra, S.A.

k

72 Inventor/es: Nogareda Gifre, Juan

k

74 Agente: Isern Jara, Jorge

22 Fecha de presentaci´ on: 16.09.93

43 Fecha de publicaci´ on de la solicitud: 01.06.95

43 Fecha de publicaci´ on del folleto de la solicitud:

01.06.95

k

Avda. La Selva, s/n 17170 Amer, Gerona, ES

k k

k kResumen:

54 T´ıtulo: Preparaciones lipos´ omicas de f´ armacos o ant´ıgenos vacunales para medicina veterinaria. 57

Preparaciones lipos´omicas de f´armacos o ant´ıgenos vacunales para medicina veterinaria. Las preparaciones lipos´omicas contienen a los f´armacos utilizados, bien en el interior de los liposomas, como soluci´on acuosa, o bien en la bicapa fosfolip´ıdica que forma los liposomas. Cuando los liposomas contienen ant´ıgenos vacunales, ´estos se encuentran en el interior de los liposomas o en la bicapa. Los fosfol´ıpidos utilizados, de origen natural, semisint´etico o sint´etico, se acompa˜nan de antioxidantes y estabilizantes. Los liposomas tienen un di´ametro m´aximo de 0,2 micras, y han sido esterilizados y estabilizados para el mantenimiento de sus caracter´ısticas hasta el momento de su aplicaci´on. Las preparaciones lipos´omicas se utilizan para la aplicaci´on de f´armacos o ant´ıgenos vacunales por v´ıa parenteral, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, en cualquier especie animal, dejando menos residuos en los tejidos animales y ocasionando menores lesiones que las fomulaciones tradicionales.

Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

A1

ES 2 070 774 A1 DESCRIPCION Esta patente se refiere a “Preparaciones lipos´omicas de f´armacos o ant´ıgenos vacunales para medicina veterinaria”. 5

10

15

20

25

30

35

Introducci´ on En los a˜ nos 60 se acu˜ na el t´ermino liposoma para designar a las ves´ıculas que se forman espont´ aneamente al dispersar fosfol´ıpidos en agua (Bangham, A. D. Advan. Lipid. Res.1:1965). Estas ves´ıculas est´an formadas por una bioapa de fosfol´ıpidos estructuralmente semejante a las que forman las membranas biol´ ogicas. Los liposomas como entidades f´ısicas, empezaron a ser usados para el estudio de las propiedades de las membranas biol´ogicas (Bangham, A. D. et al. Methods. Membr. Biol. 1. 1974). Posteriormente, se postula la posibilidad de su uso para el transporte de mol´eculas en su interior, con lo que se conseguir´ıa una administraci´ on de dichas mol´eculas de una manera “natural” pues se usar´ıan en su vehiculaci´on solamente compuestos reconocibles por el organismo como propios (Ryman et al. assays in Biochemistry. 16, 1980). Desde los primeros intentos hasta nuestros d´ıas, muchas han sido las dificultades que han debido irse superando: estabilidad de los liposomas “in vitro” e “in vivo”, distribuci´ on regular de tama˜ no de los liposomas, eficacia de encapsulamiento, “leaking” o p´erdida de la sustancia encapsulada en el liposoma, etc... La presente invenci´on establece un m´etodo para la elaboraci´ on de los liposomas a peque˜ na o gran escala que resuelve en gran medida todos los problemas mencionados, y que permite su aplicaci´on en medicina veterinaria por v´ıa parenteral. Uno de los problemas m´ as acuciantes en el campo de la sanidad animal, son los residuos de f´armacos presentes en algunos tejidos y ´organos comestibles despu´es de la administraci´on de productos farmacol´ogicos a los animales de abasto. Con el fin de evitar problemas de toxicidad, las administraciones p´ ublicas establecen para cada f´ armaco un LMR o l´ımite m´ aximo de residuos a partir del cual debe determinarse un “tiempo de espera” o “plazo de supresi´ on”, per´ıodo que debe transcurrir desde que un animal recibe un tratamiento farmacol´ ogico hasta que es sacrificado para el consumo humano. Este plazo de espera, puede oscilar en Espa˜ na y en administraci´on parenteral desde los 7 d´ıas para la flumequina hasta los 40 o´ 60 d´ıas para la gentamicina, seg´ un especie. Como cabe suponer, unos tiempos de espera tan prolongados pueden acarrear a corto plazo el desuso de f´ armacos cuya efectividad est´a fuera de duda.

40

La presente invenci´on se refiere a unas preparaciones lipos´omicas que permiten la administraci´on de f´ armacos encapsulados en liposomas con lo que se consigue el poder administrar una menor dosis de f´ armaco, manteniendo la actividad antibacteriana, con lo cual el nivel de residuos de f´ armaco en tejidos se reduce autom´aticamente y, por consiguiente, se acorta el plazo de espera.

45

Otro problema que aparece en la aplicaci´on de determinados f´ armacos por v´ıa intramuscular, es la necrosis del m´ usculo anexo al punto de inoculaci´ on. Frecuentemente estas lesiones originan decomisos en matadero, lo que supone una merma de ganancias para el ganadero. Dichas necrosis, se han intentado paliar con el uso de diferentes disolventes o bien, en algunos casos, mediante la formaci´on de complejos con pol´ımero (polivinilpirrolidona, por ejemplo), (Davey, C.A. et al Vet. Rec. 117, 1985). Dichas estrategias, s´olo han conseguido enmascarar dichas lesiones sin llegar a poder evitarlas, con lo que el beneficio obtenido es simplemente relativo.

50

55

60

La presente inveni´on propone preparaciones lipos´ omicas farmacol´ ogicas que evitan la formaci´on de lesiones en el m´ usculo tras la administraci´ on, pues debido al encapsulamiento de la soluci´ on de f´ armaco dentro de una membrana de fosfol´ıpidos, el tejido est´ a aislado del f´ armaco y no se ve afectado por ´el. Se ejerce al mismo tiempo un efecto “depot” similar al de las preparaciones “long-acting” (L.A.) ya que los liposomas acceden de manera escalonada al torrente sangu´ıneo, con lo que se alcanza una vida media del f´ armaco m´as prolongada que con las preparaciones tradicionales. Las infecciones intracelulares causadas por microorganismos como por ejemplo los Mycoplasmas o Virus, presentan gran dificultad para su curaci´ on pues son pocos los f´ armacos capaces de atravesar la membrana celular para poder ejercer su efecto sobre estos agentes infecciosos a nivel citoplasm´atico. La 2

ES 2 070 774 A1 estrategia actual recurre a la terapia mediante dosis masivas.

5

10

15

20

25

30

35

40

La presente invenci´on define preparaciones lipos´ omicas que contienen f´armacos para ser usados en medicina veterinaria con lo que se consigue la entrada del f´armaco en el interior de las c´elulas infectadas mediante endocitosis. Una vez en el citoplasma, el endosoma (conjunto de liposomas + membrana citoplasm´atica) es internalizado y posteriormente degradado por los lisosomas, a lo cual sigue el vertido de la carga lipos´ omica al citoplasma. Con esto se consigue que el f´armaco tenga acceso a los organismos pat´ ogenos localizados en el citoplasma. Desde los trabajos realizados por Jules Freund en 1937, es ampliamente conocido el poder inmunoestimulante de las emulsiones oleosas (Freund, J. et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 37, 1937). Desde ese mismo momento empezaron a desarrollarse vacunas inactivadas cuya forma gal´enica era la de una emulsi´ on oleosa agua-en-aceite (W/O). Dichas emulsiones se conocen como Adyuvantes Incompletos de Freund. En su aplicaci´on veterinaria, este tipo de vacunas destacan por su potente poder estimulante de la inmunidad del animal, con lo que se consigue una elevada tasa de anticuerpos y, una protecci´ on eficaz y de larga duraci´ on. Por contra, este tipo de emulsiones puede presentar el grave inconveniente de dejar residuos en la zona de inoculaci´ on, lo que se traduce en decomisos en matadero y en una merma de beneficios para el ganadero (Straw et al. Can. J. Comp. Med. 49, 1985). Tambi´en se han venido utilizando emulsiones O/W con lo que se solventa parcialmente el problema de los residuos, aunque esto se consigue a expensas de una menor inmunogenicidad de la vacuna (Herbert, W. J. Inmunology. 14, 1968). La presente invenci´on propone tambi´en preparaciones lipos´omicas, para medicina veterinaria, que contiene ant´ıgenos v´ıricos, factores de adhesi´ on, toxinas y, en general, prote´ınas de naturaleza bacteriana, parasitaria o f´ ungica en liposomas. Con ello se consigue una inmunogenicidad potenciada, pues los liposomas circulantes son capturados directamente por los macr´ofagos, con lo que la respuesta inmunol´ ogica es mucho m´as r´apida. Por lo que respecta a los residuos, los fosfol´ıpidos que forman los liposomas, son totalmente metabolizables, lo que supone una total recuperaci´ on del punto de inoculaci´ on. Para la preparaci´ on de los liposomas, en un reactor de acero inoxidable, se procede a la preparaci´ on de una soluci´ on acuosa de f´ armaco a una concentraci´ on que puede oscilar entre el 30 y el 60%, o bien una suspensi´on de 1 o m´ as ant´ıgenos v´ıricos y/o de origen bacteriano como endotoxinas, exotoxinas factores de adhesi´ on, prote´ınas de membrana (OMP), o de prote´ınas de par´ asitos y/u hongos. Dicha soluci´ on o suspensi´ on, se somete a una agitaci´on constante y se a˜ nade una mezcla de fosfol´ıpidos de origen natural, semi sint´etico o sint´etico, junto con antioxidantes (butilhidroxitolueno, -tocoferol acetato o similares) y estabilizantes “colesterol o similares”. La incorporaci´on de dichos componentes puede realizarse en su forma s´olida o´ previamente disueltos en un disolvente org´ anico adecuado. En el caso de tratarse de un f´ armaco liposoluble, se procede a su disoluci´ on junto con los fosfol´ıpidos, antioxidantes y estabilizantes en un disolvente org´ anico.

45

Una vez completada la adici´on, se procede a la separaci´ on, mediante procesos separativos adecuados, de la preparaci´ on de liposomas de los restos de principio activo libre que no han sido encapsulados, entendi´endose por principio activo aquel f´ armaco o ant´ıgenos que son objetos del encapsulamiento. 50

55

En el caso de la adici´ on de fosfol´ıpidos disueltos en un disolvente org´ anico se procede, previamente, a su evaporaci´on y a su posterior recuperaci´ on por condensaci´ on. Seguidamente los liposomas son sometidos a un tratamiento mec´ anico adecuado para obtener homogeneidad en la distribuci´ on de tama˜ nos de los mismos. Los liposomas obtenidos deben tener un di´ametro inferior a 0,2 µ. A la salida del proceso de homogeneizaci´ on, la suspensi´ on lipos´omica es prefiltrada e inmediatamente esterilizada por filtraci´ on a trav´es de membranas de 0,22 µ de di´ ametro de poro. A dicha suspensi´on, se a˜ nade una soluci´ on est´eril de carbohidrato (sacarosa o similar) como agente crioprotector.

60

El producto est´eril es recogido en un tanque provisto de agitaci´on y acto seguido se envasa en viales de capacidad adecuada. 3

ES 2 070 774 A1

El producto envasado es liofilizado para asegurar as´ı su estabilidad f´ısico-qu´ımica durante toda su vida comercial. 5

A continuaci´ on, se describen diversas experiencias realizadas con la presente invenci´on en la que se ponen de manifiesto los puntos rese˜ nados en la introducci´ on. Experiencia 1

10

Esta experiencia se basa en la comparaci´on de la tasa de mortalidad in vitro experimentada por 2 cultivos bacterianos de Escherichia coli, a los que se inoculan respectivamente, gentamicina en soluci´on y gentamicina encapsulada en liposomas.

15

Para ello, un cultivo bacteriano en fase estacionaria de crecimiento se somete a agitaci´on moderada a una temperatura constante de 37◦ C.

20

A tiempo cero se calcula, mediante el m´etodo de Miles and Misra, la concentraci´on de organismos viables en cfu (unidades formadoras de colonias); el cultivo se divide en dos partes y se a˜ nade a la primera gentamicina sulfato en soluci´ on a una concentraci´ on final en el cultivo de 80 µg/ml y gentamicina sulfato encapsulada en liposomas a una concentraci´on final de f´ armaco de 8 µg/ml a la 2a¯ mitad. A intervalos regulares, se extrae muestra de cada cultivo y se calcula el n◦ de g´ermenes viables por el m´etodo experiencia.

25

En la siguiente tabla se expresan los valores obtenidos en porcentaje de superviviencia respecto al valor inicial.

30

(Ver Tabla en la p´ agina siguiente) 35

40

45

50

55

60

4

ES 2 070 774 A1

% de supervivencia

5

T (h)

Gentamicina en soluci´ on

Gentamicina encapsulada

0

100

100

1

51,7

53,2

2

44,5

45,8

3

37,8

40,9

4

25,2

30,6

5

19,7

26,3

6

18,1

19,9

7

15,0

18,7

8

13,1

16,1

10

12,7

14,5

12

11,5

10,8

14

9,6

8,7

16

7,5

6,5

24

3,8

2,7

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Con el f´ armaco encapsulado, a una concentraci´ on 10 veces inferior, se obtiene una mortalidad a lo largo de la experiencia muy similar a la alcanzada con el f´armaco en soluci´on. 60

Experiencia 2 Esta experiencia se basa en la comparaci´on del nivel de residuos hallado en tejidos comestibles de 5

ES 2 070 774 A1 cerdo tras la administraci´ on intravenosa de gentamicina sulfato en soluci´ on acuosa al 10%, a una dosis de 6 g/10 kg y el mismo antibi´ otico a concentraci´on de eficacia terap´eutica similar bajo la forma de la presente invenci´on. 5

A continuaci´ on se expresan las concentraciones (en µg/g) de antibi´ otico encontradas en ri˜ no´n, h´ıgado y pulm´ on, a diferentes d´ıas post-administraci´on. Ri˜ n´ on 4

8

12

15

20

25

30

35

40

45

Soluci´ on Acuosa

69,72

26,7

8,29

7,15

6,95

6,87

5,92

5,81

5,75

5,61

Liposomas

1,81

1,57

1,23

0,98

0,86

0,79

0,89

0,71

0,65

0,53

4

8

12

15

20

25

30

35

40

45

Soluci´ on Acuosa

7,25

6,72

4,31

3,19

2,81

2,29

2,01

1,73

0,95

0,92

Liposomas

1,69

1,21

1,18

0,96

0,63

0,31

0,25

0,21

0,17

0,18

4

8

12

15

20

25

30

35

40

45

Soluci´ on Acuosa

1,21

0,86

0,72

0,59

0,27

0,19

0,15

0,21

0,17

0,09

Liposomas

2,82

2,45

2,29

1,72

1,35

1,16

0,79

0,51

0,38

0,15

10

15

20

H´ıgado

25

30

Pulm´ on 35

40

45

50

En esta experiencia se observa como conforme a la bibliograf´ıa (Brow, S. A. et al. Am J. Vet. Res. 47, 1986) la gentamicina administrada bajo la forma de soluci´ on acuosa se acumula preferentemente en el tejido renal. El mismo antibi´ otico, administrado bajo la forma de la presente invenci´ on, alcanza niveles mucho menores en el ri˜ no´n. En el h´ıgado, la diferencia de concentraci´on es menor ya que es el tejido donde se acumulan preferentemente los liposomas (Poste, G. Biol. Cell. 47. 1983).

55

En el pulm´on, donde interesa alcanzar una alta concentraci´ on de antibi´ otico a fin de obtener una buena eficacia terap´eutica, la administraci´ on mediante liposomas se muestra superior a la soluci´on acuosa. Experiencia 3

60

Esta experiencia establece una comparaci´on de lesiones originadas al administrar doxiciclina por v´ıa intramuscular en cerdos, en soluci´on acuosa inyectable, o bien, encapsulada en liposomas por el m´etodo descrito en la presente invenci´on.

6

ES 2 070 774 A1 El an´ alisis de las lesiones se realiza mediante necropsia a los 5 d´ıas post-inoculaci´ on de los animales y an´ alisis visual del punto de inoculaci´ on y zonas anexas.

5

El test se realiza sobre 2 lotes de 20 lechones cada uno, el primero de los cuales, es tratado con una soluci´on acuosa de doxiciclina hiclato al 10% y el segundo con una formulaci´ on preparada de acuerdo con la siguiente invenci´on. Asimismo, se inocula un tercer lote de 5 lechones con P.B.S.E. (soluci´ on tamp´ on de fosfatos est´eril). La dosis inoculada para cada uno de los tres preparados inyectables es de 2 ml. Necrosis

Edema

Petequias

Granulosis

Lote 1

20/20

18/20

20/20

20/20

Lote 2

0/20

2/20

3/20

0/20

Lote 3

0/5

0/5

0/5

0/5

10

15

20

Experiencia 4 25

30

Esta experiencia, sirve para comparar la farmacocin´etica de la enrofloxacina administrada en cerdos por v´ıa intravenosa en forma de soluci´ on acuosa o bajo la forma establecido por la presente invenci´ on. La experiencia se realiza sobre 2 lotes de 5 animales de 2 meses de edad y peso similar (18 kg) cada uno. El primer lote, recibe un tratamiento de 100 mg de enrofloxacina por v´ıa intravenosa y el segundo lote, se trata con 100 mg de enrofloxacina encapsulada en liposomas seg´ un la presente invenci´ on. Tras la administraci´on del producto, se extraen muestras de sangre a int´ervalos regulares y se determina el contenido de enrofloxacina en suero mediante HPLC (Cromatograf´ıa l´ıquida de alta resoluci´ on).

35

Los valores expresados en la siguiente tabla son valores promedio de los 5 animales de cada lote.

40

(Ver Tabla en la p´ agina siguiente)

45

50

55

60

7

ES 2 070 774 A1

µg Enrofloxacina/ml Tiempo (min)

Lote 1

Lote 2

30

2,314

1,538

60

1,812

1,427

90

1,521

1,385

120

1,376

1,263

150

1,020

1,212

180

0,915

1,116

210

0,801

1,081

240

0,723

0,975

360

0,566

0,910

420

0,444

0,891

540

0,238

0,861

660

0,121

0,735

840

0,085

0,617

1080

0,47

0,573

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Llevando estos valores a unas curvas tiempo/concentraci´ on de enrofloxacina en suero, se pueden calcular los par´ametros farmacocin´eticos, que son: 60

Area bajo la curva (AUC) Vida media

Soluci´ on 484,63 199,16

Liposomas 1446.18 748,00 8

ES 2 070 774 A1 Experiencia 5

5

10

15

20

Con esta experiencia se pone de manifiesto la mayor eficacia antibacteriana de las formulaciones antibi´ oticas seg´ un la presente invenci´ on frente a las formulaciones cl´ asicas en el tratamiento de las infecciones intracelulares. Para ello disponemos de 30 microplacas con un cultivo en monocapa de c´elulas PK-15. Las placas se incuban a 37◦ C durante 2 d´ıas para obtener una monocapa perfectamente confluente. Posteriormente son infectadas con una concentraci´on 1,6 x 106 cfu (unidades formadoras de colonias) de Mycoplasma sp e incubadas otra vez. A las 8 horas post infecci´ on, se lavan las placas y 10 de ellas, son tratadas con enrofloxacina a una concentraci´ on de 1 µg/ml y un segundo grupo con enrofloxacina encapsulada en liposomas, de acuerdo con la presente invenci´on. El tercer grupo de 10 placas, se guarda como control. Seguidamente, las placas son incubadas otra vez a 37◦ C y cada 24 horas se toman 2 placas de cada grupo y se lisan con una soluci´ on al 20% de SDS (sodio dodecil sulfato) y se siembra el lisado (previa diluci´ on con Soluci´ on tamp´ on de fosfatos est´eril) en placas de agar para proceder al recuento de las cfu (unidades formadoras de colonias). Los resultados siguientes expresan el valor medio de las cfu para cada grupo de placas a los distintos tiempos: Tiempo

Enro. Soluci´ on

Enro. Liposomas

Control

1 d´ıa

1,75

1,68

2,9

2 d´ıas

1,82

1,60

3,4

3 d´ıas

2,03

1,41

3,7

4 d´ıas

2,15

1,22

4,1

5 d´ıas

2,13

1,07

4,8

25

30

35

40

Experiencia 6 45

50

Esta experiencia se basa en la comparaci´on de la tasa de anticuerpos, obtenida de sueros procedentes de cerdos inmunizados con una vacuna frente a Influenza porcina (virus H1N1 y H3N2), bajo la forma gal´enica de emulsi´on O/W y de la presente invenci´ on. Para la realizaci´on de dicha experiencia, se utilizan lechones libres de anticuerpos maternales. La tasa de anticuerpos es valorada por Inhibici´ on de la Hemoaglutinaci´ on (IHA). Los valores expresados, corresponden a la media de los resultados obtenidos en cuatro lotes de animales tratados.

55

60

9

ES 2 070 774 A1 Virus H1N1 No. de vacunaciones

No. animales inmunizados

T´ıtulo IHA a las 3 sem. Post-vacun.

T´ıtulo IHA a las 2 semanas Post-revacun.

Emulsi´ on O/W

1 2

9 18

1/46 1/43

No revacun. 1/103

Liposomas

1 2

21 22

1/68 1/58

No revacun. 1/256

No de vacunaciones

No. animales inmunizados

T´ıtulo IHA a las 3 sem. Post-vacun.

T´ıtulo IHA a las 2 semanas Post-revacun.

Emulsi´ on O/W

1 1/38

9 1/92

1/40 1/38

No Revacun. 1/92

Liposomas

1 2

21 22

1/62 1/55

No Revacun. 1/239

5

10

15

Virus H3N2 20

25

30

Los animales fueron vacunados el d´ıa 0 y revacunados tres semanas despu´es de la primera vacunaci´on. 35

Cabe citar que se consideran como efectivas las tasas de anticuerpos iguales o superiores a 1/64. Experiencia 7

40

En esta experiencia se procede a la administraci´ on de una vacuna inactivada contra la Enfermedad de Aujeszky, en forma de emulsi´on O/W y bajo la forma de la presente invenci´ on. La vacunaci´ on se realiz´ o en lechones libres de anticuerpos maternales, y se valoraron los anticuerpos humorales indicados contra la Enfermedad de Aujeszky.

45

El nivel de anticuerpos frente a la Enfermedad de Aujeszky, es valorado mediante Seroneutralizaci´ on. No. de vacunaci´ ones

No. de animales inmuniz.

T´ıtulo por SN 3 semanas Postvacunaci´ on

T´ıtulo por SN 2 semanas Postre-vacunaci´on

Emulsi´ on O/W

1 2

38 53

12,8 13,7

No revacunados 98,8

Liposomas

1 2

21 21

29,9 29,9

No revacunados 205,6

50

55

60

La revacunaci´on se realiz´ o 3 semanas despu´es de la primera vacunaci´on.

10

ES 2 070 774 A1 Ejemplo 8

5

Esta experiencia establece una comparaci´on en el nivel de anticuerpos, conseguido al vacunar cerdos con ant´ıgeno de DNT (dermonecrotoxoide) adyuvantado con una emulsi´ on oleosa tipo W/O, o bien encapsulado en liposomas como se propone en la presente invenci´ on. La tasa de anticuerpos se valora mediante Sueroneutralizaci´ on (SN) sobre monocapas de c´elulas VERO.

10

No. de vacunaciones

No. de animales inmuniz.

T´ıtulo SN a las 4 semanas Post-vacunac

T´ıtulo SN a las 2 semanas Post-revacunac.

15

Emulsi´ on W/O

1 2

11 28

1/4 1/8

No revacunadas 1/30

20

Liposomas

1 2

10 36

1/8 1/4

No revacunadas 1/66

25

Los animales fueron vacunados en d´ıa 0 y revacunados 4 semanas despu´es de la primera vacunaci´ on. Cabe se˜ nalar que se consideran como efectivas las tasas de anticuerpos iguales o superiores a 1/4. Experiencia 9

30

35

De manera similar a la experiencia anterior, se compara el nivel de anticuerpos al vacunar cerdos con ant´ıgeno compuesto por factores de adhesi´ on K88ab, K99 y 987P. El primer lote de animales es vacunado con una emulsi´ on W/O y el segundo lote con ant´ıgeno encapsulado en liposomas, de acuerdo con la presente invenci´on. La tasa de anticuerpos se valora mediante ensayos ELISA, espec´ıficos para cada factor de adhesi´ on.

No. de Vac.

40

No. animal ensaya

T´ıtulo a las 4 semanas Post-vac.

T´ıtulo a las 2 semanas Post-revacunaci´on

K88ab

k 99

987 P

K88ab

k 99

937 P

45

Emulsi´ on W/O

1 2

9 10

1/600 1/600

1/500 1/500

1/500 1/600

No rev 1/2000

No rev 1/1500

No rev 1/1000

Liposomas

1 2

15 15

1/600 1/600

1/600 1/500

1/500 1/500

No rev 1/3500

No rev 1/4000

No rev 1/2000

50

55

Los animales fueron vacunados el d´ıa 0 y revacunados 4 semanas despu´es de la primera vacunaci´on. Se aceptan como efectivos los niveles de anticuerpos superiores a 1/400.

60

11

ES 2 070 774 A1 REIVINDICACIONES

5

10

1. Preparaciones lipos´ omicas de f´armacos o ant´ıgenos vacunales para medicina veterinaria, caracterizadas porque los liposomas que contienen a los f´armacos o ant´ıgenos vacunales los pueden contener en el interior, en la bicapa o en la superficie de los liposomas, teniendo una concentraci´ on entre 0,5 y 150 mg/ml en el caso de los f´armacos que se aplican por v´ıa parenteral, y haciendo una suspensi´ on previa de los liposomas en un disolvente adecuado en el caso de los f´ armacos que se aplican por v´ıa intravenosa o intramuscular o de los liposomas que contienen ant´ıgenos vacunales y se aplican por v´ıa intramuscular o subcut´ anea, y caracterizadas tambi´en porque los liposomas contienen antioxidantes y estabilizantes, habiendo sido esterilizados tras una apropiada selecci´on de tama˜ nos, y estabilizados adecuadamente. 2. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque los liposomas tienen una concentraci´ on de f´ armacos entre 0,5 y 150 mg/ml, preferentemente entre 2 y 40 mg/ml.

15

20

25

30

35

3. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque los f´ armacos que contienen pueden estar bien el interior de los liposomas, bien en la bicapa de fosfol´ıpidos de origen natural, semisint´etico o sint´etico utilizados en la formaci´ on de los liposomas. 4. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque cuando contienen ant´ıgenos vacunales, estos se encuentran en el interior de los liposomas o en la bicapa de fosfol´ıpidos de origen natural, semisint´etico o sint´etico utilizados en la formaci´ on de los liposomas. 5. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque se prepara una supensi´ on previa de los liposomas en un disolvente adecuado cuando ´estos contienen f´armacos que pueden aplicarse por v´ıa parenteral, intravenosa o intramuscular, o cuando contienen ant´ıgenos vacunales para aplicaci´ on intramuscular, subcut´ anea o intraperitoneal. 6. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque los ant´ıgenos que pueden estar contenidos en el interior de los liposomas est´ an constituidos por uno o m´ as tipos de virus y/o proteinas de origen bacteriano, tales como factores de adhesi´ on, endotoxinas, exotoxinas, proteinas de membrana, y/o proteinas de origen parasitario y/o f´ ungico. 7. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque los liposomas usados contienen antioxidantes (butilhidroxitolueno, tocoferol, acetato o similares) y estabilizantes (colesterol o similares) de los fosfol´ıpidos, para conseguir una mayor resistencia a la peroxidaci´ on de los fosfol´ıpidos y una mayor estabilidad a la p´erdida de la carga de los liposomas. 8. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque los liposomas utilizados tienen un di´ametro m´ aximo de 0,2 micras.

40

45

50

9. Preparaciones lip´ osomicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque los liposomas usados son esterilizados mediante filtraci´on a trav´es de membranas de 0,22 micras de di´ ametro de poro. 10. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque a la suspensi´ on lipos´omica est´eril se le a˜ nade una soluci´ on de un carbohidrato, como sacarosa o producto similar, que act´ ua como agente crioprotector. 11. Preparaciones lipos´ omicas, de acuerdo con la reivindicaci´on 1, caracterizadas porque los liposomas usados han sido estabilizados in vitro mediante un proceso de liofilizaci´ on.

55

60

12

kES 2 070 774 kN. solicitud: 9301968 kFecha de presentaci´on de la solicitud: 16.09.93 kFecha de prioridad:

11

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

21

˜ ESPANA

◦

22 32

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

k

51 Int. Cl.6 :

A61K 9/127

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor´ıa

Documentos citados

Reivindicaciones afectadas

X

FR-A-2501060 (KUREHA KAGAKU KOGYO KABUSHIKI KAISHA) * Memoria; reivindicaci´on 1 *

10

X

US-A-4460722 (YURIKO IGARASHI et al.) * Columna 5, l´ıneas 27-34,56-60 *

10

X

WO-A-9304672 (PITMAN-MOORE, INC.) * Reivindicaciones 15,10,4 *

4,7,10

Categor´ıa de los documentos citados X: de particular relevancia

on no escrita O: referido a divulgaci´

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´

misma categor´ıa A: refleja el estado de la t´ecnica

de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu´ de presentaci´ on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci´ on del informe 28.02.95

para las reivindicaciones n◦ : Examinador M. Ybarra Fern´andez

P´ agina

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