Guía rápida de manejo LightCycler® 480 Instrument Software Version 1.5

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1) Arranque del instrumento y del Software

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1.1 Arranque del instrumento

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1.2 Carga de la placa

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1.3 Arranque del software

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2) Setup del Software para realizar el experimento

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2.1 Setup un Nuevo Experimento desde un Template

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2.2 Modificar el Template para ajustarlo a tu experimento

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2.3 Salvar el programa como un Template

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3) Introducción de los nombres de las muestras

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3.1 Trucos para introducir los nombres de las muestras

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3.2 División de Subsets

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3.3 Guardar como un Template

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3.4 Uso de la opción Toggle View Table

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4) Comenzar el experimento y verlo online

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4.1 Comenzar el Run

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4.2 Durante el Run

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5) Apéndice A: Información General

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5.1 Información de pedido

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5.2 Montaje de un ensayo con SYBR Green

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5.3 Volúmenes de reacción

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1.1 ARRANQUE DEL INSTRUMENTO 1. Encender el interruptor principal.

2. Los dos indicadores luminosos en el frente del equipo, hacen referencia al status del mismo. Cuando el color del LED de la izquierda cambia a verde y el de la derecha se mantiene en naranja, el equipo está listo para trabajar (tarda unos 3,5 minutos). En ese momento se puede arrancar el software o cargar la placa. Nota: para evitar que se evapore la muestra y contamine el equipo, asegurarse bien de que la placa está correctamente sellada con el adhesivo protector y retirar las solapas laterales pre-troqueladas. Color del LED izquierdo

Color del LED derecho

Estado del Instrumento

Naranja *parpadeando*

Naranja *parpadeando*

Instrumento inicializando

Verde

Naranja

Instrumento listo y encendido No hay placa cargada

Verde

Naranja *parpadeando*

La placa se está cargando

Verde

Verde

Instrumento listo y encendido La placa está cargada

Verde *parpadeando*

Verde *parpadeando*

Instrumento funcionando

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1.2 CARGA DE LA PLACA 1. Para cargar la placa, pulsar el botón que se encuentra al lado del LED naranja.

2. Se abrirá un cajón en la parte derecha del instrumento dejando acceso libre para posicionar la placa. Colocar la placa en la orientación correcta: esquina inferior derecha con un corte.

3. Pulsar nuevamente el botón frontal y el LED de la derecha cambiará a color verde indicando que la placa está correctamente introducida y listo para iniciar el experimento.

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1.3 ARRANQUE DEL SOFTWARE 1. Encienda el ordenador. 2. Login a Windows. a. User name: operator b. Password: LC480 3. Arranque el software del LightCycler a. Doble-click en el icono del LC 480 del escritorio b. Login al software.

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2) INICIO DEL SOFTWARE PARA CORRER UN NUEVO EXPERIMENTO 2.1 INICIO DE UN NUEVO EXPERIMENTO DESDE UN TEMPLATE 1. Cuando se arranca el software se ve la venta de OVERVIEW. Clickar en New Experiment from Template.

2. Seleccionar el Template adecuado.

3. …y pulsar OK.

2.2 MODIFICAR UN TEMPLATE PARA AJUSTARLO A OTRO EXPERIMENTO 1. En la ventana de New Experiment , el Detection Format debe indicar SYBR Green I (ejemplo) 2. Entrar el Reaction Volume. Los rangos posibles son 10-100µl para placas de 96 pocillos y 5-20µl para placas de 384 pocillos.

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3. Nota- el protocolo siguiente está optimizado para el kit LightCycler® 480 SYBR Green I de ROCHE. 4. Un experimento típico con SYBR Green tendrá 4 programas separados: Desnaturalización inicial (o activación), amplificación (donde se realizarán los ciclos de la PCR), melting (o programa de disociación) y enfriamiento. El Analysis Mode indica el análisis esperado para cada programa. Para añadir un nuevo programa, click en y para borrarlo, en .

5. Cada programa consiste en uno o más segmentos. Target indica la temperatura que queremos que alcance. Hold indica el tiempo que va a estar a esa temperatura. Ramp Rate es la velocidad a la que se alcanza esa temperatura. Acquisition Mode indica la frecuencia a la que se adquieren datos.

6. Durante la desnaturalización inicial o activación, la temperatura aumenta a una velocidad de 4.4°C/s hasta que llega a los 95°C, do nde se mantiene entre 5-10 minutos. Es un único ciclo. En este paso no se adquiere ninguna señal (Acquisition Mode = None). Este paso activa la Taq y desnaturaliza el dsDNA.

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7. Durante la Amplificación, la temperatura alcanza los 95°C a una velocidad de 4.4°C/s, donde se mantiene durante 10 segundos para permitir que el dsDNA se desnaturalice. Nota – La temperatura del siguiente paso es dependiente de las secuencia de los primers. En este ejemplo, la temperatura baja a 60°C a una velocidad de 2.2°C/s durante 10 segundos. En este paso se permite que se unan los primers al DNA. Para los experimentos iniciales, es una buena idea ajustar la temperatura a 5ºC menos de la Tm del primer. Entonces se incrementa la temperatura hasta los 72°C a una velocidad de 4.4°C durante 10 segundos. Durante este tiempo, el Nuevo dsDNA se ha sintetizado con la ayuda de la Taq DNA Polimerasa. Es en este tercer segmento donde indicaremos en el programa Adquisición SINGLE. Esto significa que la señal fluorescente se adquiere una sola vez al final del segmento de elongación. Todo este ciclo se repite 45 veces

8. Siguiendo a la amplificación, programaremos un Nuevo programa de MELTING o de CURVAS DE DISOCIACIÓN para asegurarnos la especificidad del product amplificado. El DNA se desnaturaliza a 95º C durante 5 segundos y nuevamente reanillado bajando la temperatura a 65º C durante 1 minuto. La señal de fluorescencia es monitorizada continuamente hasta que se desnaturaliza nuevamente a 95º C.

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9. El programa final de enfriamiento no es necesario para el experimento en sí, pero se incluye por motivos de seguridad

2.3 Salvar el programa como un Template 1. Para salvar el programa como un Template, clickar en Save As Template En la parte inferior izquierda de la ventana de programación.

3) Entrada de los Nombres de las Muestras 3.1 División en Subset Editor 1.- Clickamos en el icono de SubSet Editor

2.- Clickamos en

y aparecerá la siguiente pantalla:

Señalaremos los pocillos interesados y clickaremos en Apply.

3.2 Trucos para entrar los nombres de las muestras 1. Nota- La entrada de datos se puede realizar después del Run.

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2. Seleccionar el icono de Sample Editor en el lado izquierdo de la ventana de New Experiment. 3. Debajo de la pestaña General, introducir los nombres de las muestras en la columna Sample Name manualmente o copiando y pegando desde Excel.

4. Para introducir los nombres de las muestras más fácilmente, seleccionar los pocillos con el ratón e indicar si hubiera replicas en la columna Repl. Of

5.- Alternativamente, se puede clickar en el botón siguiente ventana:

apareciendo la

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Seleccionaremos el “Workflow”, el “Subset” de interés, los pocillos a rellenar y los datos adecuados a incluir. Podremos incluir también los replicados y volver de nuevo a la ventana anterior del “Sample Editor”.

3.3 Guardar como un Template 1. Para salvar el orden de las muestras clicker directamente en el icono que se encuetra en la parte inferior izquierda de la pantalla. Save As Template

4) Comenzar el Run y ver los datos OnLine 4.1 COMENZAR EL RUN 1. Ir de Nuevo a la venta de Experimento y clickar en Start Run en la esquina inferior derecha de la pantalla. Solo se podrá hacer cuando se haya metido la placa. Salvar el experimento en la carpeta adecuada. 2. Cuando el experimento comience, la ventana cambia automáticamente para poder ver los datos OnLine. El botón de ‘Start Run’ cambia a ‘Abort Run’. 3. Nota – Clicka en para acceder a diferentes opciones.

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4.2 DURANTE EL RUN 1. En el programa de amplificación se pueden añadir ciclos de 10 en 10, clicka en +10 Cycles.

2. End Program: Para finalizar el programa sin perder ningún dato, clickar en el botón de End Program. El programa en curso finalizará y los datos obtenidos serán salvados. 3. Abort the Run: Para parar el Run, clicka en el botón Abort Run. Nota –Esto implica la pérdida de todos los datos. 4. La opción de Color compensation puede ser activada durante todo el Run. Nota- color compensation es importante cuando se realiza experimentos múltiples , pero es innecesaria con SYBR Green I.

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5) Apéndice A: Información General 5.1 INFORMACION DE PEDIDO Product Sybr Green Master mix (kit pequeño)

Catalog name LightCycler® 480 SYBR Green I Master

Catalog number 04707516001

Description 5 x 1 ml (2x conc.) (approx. 500 reactions of 20 µl final reaction volume)

Taqman Master mix (kit pequeño)

LightCycler® 480 Probes Master

04707494001

5 x 1 ml (2x conc.) (approx. 500 reactions of 20 µl final reaction volume)

Sybr Green Master mix (kit grande)

LightCycler® 480 SYBR Green I Master

Taqman Master mix (kit grande)

LightCycler® 480 Probes Master

04887301001

10 x 5 ml (2x conc.) (approx. 10 x 500 reactions of 20 µl final reaction volume)

HRM Master Mix

LightCycler® 480 High Resolution Melting Master

04909631001

5 x 1 ml (500 reactions, 20 µl each)

Placas 96 blancas

LightCycler® 480 Multiwell Plate 96, white

04729692001

5 x 10 plates (includes sealing foils)

Placas 384 blancas

LightCycler® 480 Multiwell Plate 384, white

04729749001

5 x 10 plates (includes sealing foils)

Placas 96 transparentes

LightCycler® 480 Multiwell Plate 96, clear

5102413001

5 x 10 plates (includes sealing foils)

Placas 384 transparentes

LightCycler® 480 Multiwell Plate 384, clear

05102430001

5 x 10 plates (includes sealing foils)

04887352001

10 x 5 ml (2x conc.) (approx. 10 x 500 reactions of 20 µl final reaction volume)

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5.2 MONTAJE DE REACCION Reacción de 20 µl

Preparación de la reacción para SYBR Green

Reactivo

Concentración Final

Volumen por reacción

Agua

0,5 µM

1 µl

Primer Forward (stock 5 µM)

0,5 µM

2 µl

Primer Reverse (stock 5 µM)

0,5 µM

2 µl

LightCycler® 480 SYBR Green I Master

1x

10 µl

Total

15 µl

Añadir 5 µl cDNA para un volumen total de reacción de 20 µl

5.3 VOLUMENES DE REACCION 10-100µl para placas de 96 pocillos 5-20µl para placas 384 pocillos

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