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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93905917.6 kFecha de presentaci´on : 16.02.93 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 626 859 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 07.12.94

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54 T´ıtulo: Inhibici´ on de la hipotensi´ on y del shock s´ eptico, causados por ´ oxido n´ıtrico, mediante el

uso de hemoprote´ına conteniendo hierro.

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73 Titular/es: Board of Regents,

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72 Inventor/es: Kilbourn, Robert G.;

30 Prioridad: 19.02.92 US 838603

The University of Texas System Office of General Council, 201 West 7th Street Austin, Texas 78701, US Duke University y Apex Bioscience, Inc.

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.06.98

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

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16.06.98

Aviso:

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De Angelo, Joseph y Bonaventura, Joseph

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74 Agente: D´ avila Baz, Angel

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION Inhibici´ on de la hipotensi´ on y del shock s´eptico, causados por o´xido n´ıtrico, mediante el uso de hemoprote´ına conteniendo hierro. Campo de la invenci´ on La invenci´on est´ a dirigida al uso de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de un efecto fisiol´ ogico perjudicial en un animal causado por niveles en exceso de s´ıntesis de ´oxido n´ıtrico. El medicamento puede ser preparado para el tratamiento de estados tales como hipotensi´on o shock s´eptico. Fundamento de la invenci´ on Factor de Relajaci´ on Derivado del Endotelio Se ha demostrado que las c´elulas endoteliales producen un potente vasodilatador conocido como Factor de Relajaci´on Derivado del Endotelio (EDRF). Muchas sustancias de origen natural que act´ uan como vasodilatadores fisiol´ogicos mediatizan la totalidad o parte de su acci´on mediante la estimulaci´ on de la liberaci´on de EDRF. Ejemplos de tales sustancias incluyen acetilcolina, histamina, bradiquinina, leucotrienos, ADP y ATP. Estudios recientes han identificado al EDRF como ´oxido n´ıtrico, un compuesto inestable de corta vida (Ignarro et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:9265-9269 y Palmer et al., 1987, Nature 327:524-526). La L-arginina es el precursor metab´olico de EDRF (Schmidt et al., 1988, Eur. J. Pharmacol. 154:213-216). La NG -metil-L-arginina es un inhibidor competitivo de la v´ıa de bios´ıntesis de EDRF (Palmer et al., 1988, Nature 333:664-666). Ha quedado demostrado que la administraci´ on de NG -metil-L-arginina a cobayos y conejos aumenta la presi´ on sangu´ınea (Aisaka et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:881-886). Parece ser que el ´oxido n´ıtrico (NO) es sintetizado a partir de L-arginina por la enzima NO sintasa; el coproducto es L-citrulina (Moncada et al., 1991, J. Cardiovascular Pharmacol. 17 (Supl. 3):S1-S9). El NO es un estimulante end´ogeno para guanilato ciclasa soluble. Se ha comprobado que el ´oxido n´ıtrico es producido por macrofagos, c´elulas endoteliales, neutr´ofilos, c´elulas y heptatocitos de Kupffer, fibroblastos mur´ınicos estimulados con citicinas, y c´elulas EMT-6, una l´ınea de c´elulas de adenocarcinoma de mama mur´ınico espont´aneo cuando se tratan con citocina (revisado en Moncada et al., 1991, Pharmacol. Reviews 43:109-142). Concretamente, las c´elulas de macrofagos llegan a activarse mediante tratamientos durante 12-36 horas con gamma-interferon, endotoxina bacteriana y diversas citocinas (revisado en Collier y Vallance, 1989, Trends in Pharmacol. Sci. 10:427-431). Se ha comprobado que las c´elulas endoteliales, en presencia de gamma-interferon, segregan grandes cantidades de o´xidos de nitr´ ogeno derivados de arginina despu´es de la activaci´on por el factor de necrosis tumoral (TNF) o endotoxina (Kilbourn y Belloni, 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:772-776). El TNF causa una hipotensi´ on notable en mam´ıferos (Tracey et al., 1986, Gynecol. Obstet, 164:415-422; Old, 1985, Science 230:630-632). Adem´ as, se cree que el TNF mediatiza el colapso vascular resultante de la endo2

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toxina bacteriana (Beutler et al., 1985, Science 229:869-871). Recientemente se ha comprobado que los derivados de arginina inhiben la hipotensi´on sist´emica asociada con la producci´on de ´oxido n´ıtrico, concretamente el tratamiento con TNF, gamma-interferon, interleucina-2 y endotoxina bacteriana (Kilbourn et al., Patente US No. 5.028.627, concedida el 2 Julio 1991; Solicitud PCT No. WO 91/04023, publicada el 4 Abril 1991; y Kilbourn et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 87:3629-3632). Tambi´en se cree que la sobreproducci´ on de o´xido n´ıtrico est´ a implicada en numerosos otros s´ındromes patog´enicos o potencialmente patog´enicos. Por ejemplo, se cree que algunos de estos s´ındromes est´an asociados con malaria, senescencia y diabetes. Los procedimientos de la presente invenci´on se pueden emplear tambi´en para prevenir, inhibir y/o aliviar dichos s´ındromes relacionados con NO. Interacci´ on de Hemoglobina con Factor de Relajaci´ on Derivado del Endotelio El o´xido n´ıtrico reacciona con hemoglobina para formar nitrosil-hemoglobina (Kosaka et al., 1989, Free Radical Biology 7:653-658). La nitrosil-hemoglobina reacciona con ox´ıgeno para proporcionar nitrato y methemoglobina, la cual se reduce r´apidamente por methemoglobina reductasa. Al menos parte del o´xido n´ıtrico se oxida por ox´ıgeno a NO2 , el cual a su vez se convierte a nitrito y nitrato. La formaci´ on de nitrosil-hemoglobina se ha empleado para cuantificar el o´xido n´ıtrico presente en ratones suministrados con endotoxina bacteriana, concretamente mediante el uso de espectroscop´ıa de resonancia paramagn´etica electr´onica (EPR), para detectar el NO que ha formado un ligando con hemoglobina (Wang et al., 1991, Life Sciences 49:55-60). Aunque la endotoxina bacteriana induce el shock s´eptico, en el estudio de Wang et al. no se observ´ o hipotensi´ on. Los expertos en la materia reconocer´ an que tales estudios por EPR pueden ser usados para cuantificar tambi´en la uni´ on de NO a otras hemoprote´ınas. Se ha comprobado igualmente que la hemoglobina inhibe las respuestas de relajaci´on no vascular a EDRF (Buga et al., 1989, Eur. J. Pharmacol. 161:61-72). Adem´ as, la hemoglobina a 1 µM redujo, y a 10 µM, aboli´ o la relajaci´ on dependiente del endotelio inducida por acetilcolina o por A23187 en anillos a´orticos de conejo (Martin et al., 1985, J. Pharmacol. Exp. Ther. 232:708716). Martin et al. plantearon la hip´ otesis de que la hemoglobina inhibe la relajaci´ on inducida dependiente del endotelio por la uni´ on de o´xido n´ıtrico. Shock S´eptico El shock s´eptico se caracteriza por una perfusi´on tisular inadecuada y es causado normalmente por bacilos ent´ericos gram-negativos tales como Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Serratia y Bacteroides (v´ease Harrison’s INTERNAL MEDICINE, 10a ¯ Ed., vol. 1, Petersdorf et al., eds., McGraw Hill, N.Y. 1983). Los bacilos gram-negativos poseen endotoxina, conocida tambi´en como lipopolisac´arido (LPS), la cual es un componente de la pared de la c´elula que puede activar leucocitos en cantidades diminutas en la sangre.

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El shock s´eptico se caracteriza por escalofr´ıos, fiebre, n´ ausea, v´ omitos, diarrea y abatimiento. El posterior desarrollo del shock s´eptico se caracteriza por taquicardia, taquipnea, hipotensi´on, cianosis perif´erica, embotamiento mental y oliguria. A medida que progresa el shock, la oliguria persiste y sobrevienen fallo card´ıaco, insuficiencia respiratoria y coma. La muerte se produce normalmente como consecuencia de edema pulmonar, anoxemia generalizada secundaria a insuficiencia respiratoria, arritmia card´ıaca, coagulaci´ on intravascular diseminada con hemorragia, anoxia cerebral, o una combinaci´ on de tales acontecimientos. Se cree que la mayor parte de los da˜ nos causados por el shock s´eptico son provocados por endotoxina. Igualmente, se ha llegado a la hip´ otesis de que el o´xido n´ıtrico juega un papel principal en la producci´ on de hipotensi´on en sujetos expuestos a endotoxina (Kilbourn et al. Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1991, vol. 172:11321138). Estudios realizados han demostrado que la hipotensi´ on y la p´erdida de capacidad de respuesta vascular resultantes de la administraci´ on de endotoxina se invierten por la administraci´ on de an´ alogos de L-arginina los cuales inhiben la producci´ on de o´xido n´ıtrico (Parratt y Stoclet, 1991, Applied Cardiopulmonary Pathophysiology 4:143-149; y Kilbourn et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3629-3632). En ciertos casos, una p´erdida aguda de sangre puede causar hipotensi´ on. Despu´es de la recuperaci´ on inicial debido a un tratamiento convencional de la hipotensi´ on, una rotura de la integridad intestinal puede causar posteriormente hipotensi´ on s´eptica. Dicho s´ındrome puede ser tratado f´ acilmente de acuerdo con la presente invenci´on. Tratamientos del Shock S´eptico En la actualidad existe un n´ umero de procedimientos cl´ınicos disponibles para el tratamiento del shock s´eptico (revisado en Harrison’s INTERNAL MEDICINE, 10a ¯ Ed., vol. 1, Petersdorf et al., eds. McGraw Hill, N.Y. 1983). Sin embargo, cada uno de ellos tiene sus propios inconvenientes. Uno de los tratamientos implica la sustituci´ on de un volumen de sangre con sangre, plasma u otros fluidos, tal como alb´ umina de suero humano, en soluciones de electrolitos adecuados, tales como dextrosa salina y bicarbonato. Sin embargo, se requieren grandes cantidades de estas sustancias, las cuales pueden ascender a 8-12 litros en solo unas pocas horas, conduciendo ello a cambios masivos en los balances de fluido y electrolito. Tambi´en se pueden usar antibi´ oticos para el tratamiento del shock s´eptico. Sin embargo, para determinar los antibi´ oticos adecuados a utilizar, deben realizarse y evaluarse cultivos en sangre. Dichos cultivos requieren tiempo. Por otro lado, los antibi´ oticos pueden empeorar inicialmente el shock causado por las bacterias puesto que los mismos destruir´ an las bacterias y los organismos moribundos pueden liberar incluso m´ as lipopolisac´arido en el cuerpo. Se han utilizado tambi´en terap´euticamente f´ armacos vasoactivos tales como estimulantes de beta-receptores (por ejemplo, isoproterenol y dopamina) y agentes bloqueadores de alfa-receptores

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(fenoxibenzamina y fentolamina) dado que el shock s´eptico viene acompa˜ nado por una m´ axima estimulaci´on de receptores alfa-adren´ergicos. Sin embargo, todos esos f´ armacos pueden tener serios efectos secundarios. En adici´on, los estudios realizados por Stoclet et al. (Amer. J. Physiol. 259:H1038-1043) sugieren que el shock endot´oxico y la producci´on de NO pueden causar una menor sensibilidad a estos agentes, disminuyendo su eficacia. Para invertir esta p´erdida de sensibilidad se puede emplear la terapia con hemoprote´ına de hierro seg´ un la presente invenci´ on. Otra t´ecnica de tratamiento implica el uso de antisuero humano a E. Coli J5, una cepa mutante que produce endotoxina sin las cadenas laterales oligosac´aridas variables. Sin embargo, dado que dicho antisuero procede de muchos donantes humanos diferentes con inmunorrespuestas variables al ant´ıgeno, no puede obtenerse una norma r´ıgida en cuanto a su eficacia. Dicho antisuero puede transmitir tambi´en agentes infecciosos. Para evitar estos problemas, actualmente se est´an ensayando anticuerpos monoclonales que se unen a endotoxina en pacientes que padecen de shock s´eptico (revisado en Johnston, 1991, J. NIH Res. 3:61-65). Un inconveniente de esta t´ecnica es que el tratamiento de pacientes s´epticos con anticuerpos antiendotoxina no tiene un efecto inmediato sobre la presi´on sangu´ınea y puede que no funcione en absoluto en el caso de que los pacientes no sean tratados en una fase inicial. Otra t´ecnica usada para tratar el shock s´eptico implica la administraci´on de prote´ına que incrementa la permeabilidad bactericida (BPI), una proteina humana derivada de gr´ anulos de neutr´ ofilos. Esta prote´ına se une a LPS. En la actualidad se est´ an desarrollando versiones de la mol´ecula (revisado en Johnston, 1991, J. NIH Res. 3:61-65). Tambi´en se est´an desarrollando t´ecnicas para el tratamiento del shock s´eptico destinadas a evitar que la endotoxina active los leucocitos que inician la respuesta inflamatoria (revisado en Johnston, 1991, J. NIH Res. 3:61-65). Ejemplos de tales t´ecnicas incluyen la administraci´on de un receptor de interleucina-1 (IL-1) soluble, un antagonista de receptor de IL-1, un anticuerpo monoclonal a TNF-α, un receptor de TNF soluble y un anticuerpo monoclonal a receptor de TNF-α. Todas estas t´ecnicas padecen del hecho de que el bloqueo de la interacci´on del receptor de citocina no tiene un efecto inmediato sobre la producci´ on de ´oxido n´ıtrico por NO sintasa (es decir, una vez inducida por citocinas, la NO sintasa contin´ ua produciendo NO incluso despu´es de la supresi´ on del est´ımulo). La presente invenci´on implica el uso de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´on de un medicamento para el tratamiento de un efecto fisiol´ogico perjudicial en un animal causado por niveles excesivos de s´ıntesis de ´oxido n´ıtrico. Una hemoprote´ına de hierro tiene una afinidad sustancial para el o´xido n´ıtrico y/o cataliza la oxidaci´on de o´xido n´ıtrico a nitratos o nitritos. La hemoprote´ına de hierro m´ as preferida es hemoglobina, en particular la hemoglobina recombinante. Igualmente, se puede utilizar mioglobina, que como ya es conocido se une a ´oxido n´ıtrico. 3

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Se conocen otras hemoprote´ınas de hierro, incluyendo ciertos citocromos, por ejemplo, y las mismas se pueden emplear cuando se demuestren los efectos relacionados con ´oxido n´ıtrico antes mencionados. Hemoglobinas particularmente preferidas son aquellas que tienen un largo per´ıodo de vida en circulaci´on, por ejemplo, aquellas que tienen una pobre afinidad por haptoglobina. Los expertos en la materia podr´an reconocer que en la preparaci´ on de los medicamentos seg´ un la invenci´on se puede utilizar cualesquiera prote´ınas o p´eptidos conteniendo hemoglobinas de hierro que unan o liguen NO. A pesar de los resultados previos que demuestran la interacci´on de las hemoprote´ınas de hierro, tal como hemoglobina, con o´xido n´ıtrico, los resultados terap´euticamente eficaces del uso de la presente invenci´on resultan muy sorprendentes e inesperados. No cabr´ıa esperar dichos resultado a la vista del hecho de que el fluido sangu´ıneo normal de un mam´ıfero est´ a repleto de hemoglobina contenida en gl´ obulos rojos de la sangre que contienen aproximadamente 34 % de hemoglobina. Dichas c´elulas constituyen normalmente m´as del 43 % de la sangre. Por tanto, la sangre est´a constituida por 15 % de hemoglobina aproximadamente. Adem´ as, el ´oxido n´ıtrico es muy lip´ ofilo y penetra f´ acilmente en los gl´obulos rojos de la sangre. Los expertos en la materia hubieran esperado que cualquier efecto de una hemoprote´ına de hierro libre, tal como hemoglobina, en la sangre, para eliminar el ´oxido n´ıtrico perjudicial habr´ıa sido insignificante en comparaci´ on con los efectos de la hemoglobina contenida en los gl´ obulos rojos de la sangre ya presentes. La base de los resultados sorprendente e inesperadamente eficaces de la presente invenci´on no se entiende completamente en la actualidad pero, a medida que se describa la presente invenci´on, ser´ a evidente para los expertos en la materia que las hemoprote´ınas de hierro libres de la presente invenci´on, tal como hemoglobina, resultan fenomenalmente eficaces para fines terap´euticos relacionados con la inversi´ on de los efectos fisiol´ogicos perjudiciales inducidos por o´xido n´ıtrico in vivo. Resumen de la invenci´ on La invenci´on est´a dirigida al uso de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de un efecto fisiol´ogico perjudicial en un animal causado por niveles excesivos de s´ıntesis de ´oxido n´ıtrico. En particular, la invenci´ on est´a dirigida al uso de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para ligar u oxidar o´xido n´ıtrico para reducir los niveles de o´xido n´ıtrico inducidos en un animal por una citocina o una endotoxina, o bien en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de hipotensi´ on sist´emica o shock s´eptico. Dicha hipotensi´ on puede ser inducida por ciertas citocinas o por una toxina microbiana tal como endotoxina bacteriana. El uso de acuerdo con la invenci´on implica una cantidad terap´euticamente eficaz de una hemoprote´ına de hierro, tal como hemoglobina y similares. El medicamento est´a adaptado preferentemente para su administraci´on intravascular, la cual incluye administraci´ on intraarterial e intravenosa. Se pueden usar otras v´ıas de administraci´ on parenteral, 4

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por ejemplo peritoneal o intralinf´ atica, por nombrar unas pocas, para la eliminaci´on de la producci´ on indeseada de NO en puntos relacionados. Puede ser factible la administraci´ on enteral en el caso de que la hemoprote´ına o un derivado de la misma sea resistente a la digesti´on y pase a la circulaci´on. El animal puede ser, por ejemplo, un animal dom´estico o un paciente humano. La hipotensi´ on sist´emica se deriva de forma m´as caracter´ıstica de la producci´ on anormal de o´xido n´ıtrico inducida por una citocina o por una toxina microbiana. Una cantidad terap´euticamente eficaz de hemoprote´ına de hierro es una cantidad suficiente para ligar y/u oxidar pr´ acticamente la totalidad del o´xido n´ıtrico libre y para eliminarlo as´ı de la circulaci´ on. En una modalidad preferida, la hemoprote´ına de hierro es hemoglobina o mioglobina y se administra intravascularmente. La endotoxina bacteriana es el principal agente causante del shock s´eptico. Se han encontrado niveles elevados de ´oxido n´ıtrico en animales con shock s´eptico (Wang et al., 1991, Life Sciences 49:55-60). Por tanto, la invenci´ on est´a dirigida tambi´en al uso de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de shock s´eptico en un paciente. Breve descripci´ on del dibujo La Figura 1 muestra el efecto de la hemoglobina sobre la hipotensi´ on inducida por endotoxina en un perro. La disminuci´ on de la presi´ on arterial media, inducida por endotoxina, queda interrumpida por la administraci´ on de hemoglobina. Descripci´ on detallada de la invenci´ on En su principal modalidad, la presente invenci´on est´a dirigida al uso de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de hipotensi´ on sist´emica inducida por un modificador de la respuesta biol´ ogica causante de forma directa o indirecta de una sobreproducci´on de o´xido n´ıtrico. Ejemplos de tales modificadores de la respuesta biol´ ogica incluyen, pero no de forma limitativa, las citocinas. La invenci´on est´a dirigida tambi´en a un m´etodo de preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de shock s´eptico y de la hipotensi´on asociada. Preparaci´ on de Hemoglobina El material de partida, hemoglobina sin modificar, se puede obtener usando procedimientos conocidos en la t´ecnica (v´ease, por ejemplo, Solicitud PCT No. de Publicaci´ on WO 88/ 03408, publicada el 19 Mayo 1988; Patente US No. 4.001.401; Feola et al., 1983, Surgery Gynecology and Obstetrics 157:399-408; De Venuto et al., 1979, Surgery Gynecology and Obstetrics 149:417-436). Por ejemplo, se puede obtener hemoglobina sin modificar libre de estroma como sigue: (a) obtenci´on de sangre entera; (b) separaci´on de los gl´ obulos rojos de los otros componentes de la sangre entera; (c) aislamiento de la hemoglobina de los eritrocitos; y (d) separaci´on de la hemoglobina del estroma y de otras impurezas. La hemoglobina libre de estroma se puede preparar partiendo de eritrocitos en c´ elulas recientemente aspiradas, anticuadas o congeladas o de eritrocitos de sangre entera. La sangre deber´ a ser pasada de forma est´eril al interior de recipientes

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con una actividad anticoagulante suficiente para evitar la formaci´ on de co´ agulos. Seg´ un una modalidad, las c´elulas sangu´ıneas se lavan en una soluci´on de salina y se centrifugan para separar los gl´ obulos rojos de los gl´ obulos blancos as´ı como para separar adicionalmente proteinas libres (Feola et al., 1983, Surgery Gynecology and Obstetrics 157:399-408). En otra modalidad, los gl´ obulos rojos pueden ser separados de otras c´elulas sangu´ıneas mediante el paso a trav´es de una centr´ıfuga de tipo semicontinuo tal como se describe en la Solicitud PCT No. de publicaci´ on No. WO 88/03408, publicada el 19 Mayo 1988. La hemoglobina se puede aislar, seg´ un una modalidad, diluyendo la soluci´ on de gl´obulos rojos en agua o en un disolvente org´ anico a 2-10◦C, para separar la hemoglobina de los gl´ obulos rojos de todos los restos celulares (Solicitud PCT No. de publicaci´ on WO 88/03408, publicada el 19 Mayo 1988; Patente No. 4.001.401; Feola et al., 1983; Surgery Gynecology and Obstetrics 157: 399-408). En otra modalidad, la hemoglobina se precipita como un complejo de zinc mediante la adici´on de una sal de zinc a una soluci´ on de hemoglobina (De Venuto et al., 1979, Surgery Gynecology and Obstetrics 149:417-436). La hemoglobina aislada, seg´ un otra modalidad, puede ser purificada por ultrafiltraci´on a trav´es, por ejemplo, de un filtro de 0,5 micras el cual retiene los componentes celulares y deja pasar la hemoglobina. La hemoglobina puede obtenerse tambi´en a trav´es de otros procedimientos conocidos en la t´ecnica. Por ejemplo, mediante t´ecnicas de ADN recombinante se pueden adaptar cepas bacterianas (v´ease, por ejemplo, Nagai y Hoffman, Patente US No. 5.028.588, concedida el 2 Julio 1991) o levadura (v´ease, por ejemplo, Solicitud PCT No. de publicaci´ on WO 90/13645, publicada el 15 Noviembre 1990) u otros organismos eucari´ oticos, para producir hemoglobina. Se cree que la hemoglobina recombinante es particularmente conveniente debido a que se puede producir f´ acilmente en grandes cantidades y debido a que el uso de dicha hemoglobina recombinante evita la posibilidad de que se produzca una infecci´on portada por la sangre tal como aquella que puede ser producida por diversos virus o retrovirus. La hemoglobina puede ser, por ejemplo, cualquier hemoglobina humana, incluyendo, pero no de forma limitativa, HbA (alfa2beta2 ), HbA2 (alfa2delta2 ), HbF (alfa2 gamma2), Hb Barts (gamma4), HbH (beta4 ) y Hb Portland I (zeta2 gamma2), Hb Portland II (zeta2 beta2 ), Hb Portland III (zeta2 delta2 ) Hb Gower I (zeta2 epsilon2 ) y Hb Gower II (alfa2epsilon2 ); as´ı como cualquier otra hemoglobina animal, por ejemplo, hemoglobina bovina o porcina. La hemoglobina usada seg´ un la presente invenci´on puede ser modificada qu´ımicamente usando procedimientos conocidos en la t´ecnica, para aumentar la estabilidad del tetr´ amero y/o disminuir la afinidad por ox´ıgeno. Ejemplos de modificaciones qu´ımicas para aumentar la estabilidad del tetr´ amero incluyen, pero no de forma limitativa, la reticulaci´on con polialquilenglicol (Iwashita, Patentes US Nos. 4.412.989 y

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4.301.144); con o´xido de polialquileno (Iwasake, Patente US No. 4.670.417); con un polisac´arido (Nicolau, Patente US Nos. 4.321.259 y 4.473.563); con fosfato de inositol (Wong, Patentes US Nos. 4.710.488 y 4.650.786); con un agente reticulante bifuncional (Morris et al., Patente US No. 4.061.736); con insulina (Ajisaka, Patente US No. 4.377.512); y con un agente reticulante tal que la composici´on de hemoglobina sea reticulada intromolecularmente entre lys 99 alfa1 y lys 99 alfa2 (Walder, Patente No. 4.598.064). Ejemplos de modificaciones qu´ımicas para disminuir la afinidad por ox´ıgeno de la hemoglobina aislada incluyen, pero no de forma limitativa, la polimerizaci´on con fosfato de piridoxal (Sehgal et al., 1984, Surgery, 95:433-438) y el uso de reactivos que imitan a 2,3-DPG (Bucci et al., Patente US No. 4.584.130). En otra modalidad, la hemoglobina usada seg´ un la presente invenci´ on puede ser una variante de hemoglobina, una hemoglobina que comprende una cadena de globina de una secuencia de nucle´otidos que ha sido alterada de tal manera que se produce la alteraci´ on de la estructura o funci´ on de la hemoglobina, pero de tal modo que la hemoglobina sigue siendo funcionalmente activa, tal como se define por la capacidad para unirse reversiblemente a ox´ıgeno (u o´xido n´ıtrico, como es l´ogico). Categor´ıas de variantes de hemoglobina incluyen, pero no de forma limitativa, variantes que autopolimerizan; variantes en donde el tetr´amero no se disocia bajo condiciones fisiol´ogicas in vivo (por ejemplo, Hb Rainier, beta145 tirosina es reemplazada por cisteina); variantes con menor afinidad intr´ınseca por ox´ıgeno, es decir, una hemoglobina que tiene una P50 de por lo menos 10 mm de Hg aproximadamente bajo condiciones fisiol´ ogicas (por ejemplo, Hb Chico, beta-66 lisina es reemplazada por treonina; Hb Raleigh, beta-I valina es reemplazada por alanina; Hb Titusville, alfa-94 aspartato a asparagina; Hb Beth Israel (beta-102 asparagina es reemplazada por serina; y Hb Kansas, beta-102 asparagina a treonina; variantes que son estables en ´alcalis (por ejemplo, Motown/Hacettepe, beta-127 o glutamina es reemplazada por ´acido glut´ amico; variantes que son estables en ´acidos; variantes que tienen una menor afinidad de uni´ on a haptoglobina; variantes con una mayor afinidad intr´ınseca por ox´ıgeno, es decir, una hemoglobina que tiene una P50 de como m´ aximo 1 mm de Hg aproximadamente bajo condiciones fisiol´ ogicas (por ejemplo, HbA Deer Lodge, beta-2 histidina es reemplazada por arginina, Labossiere et al., 1972, Clin. Biochem. 5:46-50; HbA Abruzzo, beta-143 histidina es reemplazada por arginina, Tentori et al., 1972, Clin. Chim. Acta 38:258-262; y HbA MacKees Rocks, beta-145 tirosina es reemplazada por una secuencia de terminaci´ on, Winslow et al., 1976, J. Clin. Invest. 57:772-781). Las variantes de hemoglobina estables en a´cidos pueden incluir aquellas que reemplazan la histidina en la posici´on alfa-103 por un amino´acido que no se ioniza en a´cido (Perutz, 1974, Nature 247:341). Ejemplos de tales amino´ acidos incluyen serina, treonina, leucina y alanina. Variantes de hemoglobina que no se unen a haptoglobina son aquellas con variaci´ on en la se5

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cuencia alfa-121-127. Se ha comprobado que esta secuencia est´a implicada en la uni´ on de haptoglobina que al parecer incide en una mayor eliminaci´ on circulatoria (McCormick and Atorssi, 1990, J. Prot. Chem. 9:735). Las variantes de globina pueden producirse por diversos m´etodos conocidos en la t´ecnica. La manipulaci´ on que se traduce en su producci´on puede ocurrir a nivel gen´etico o a nivel prote´ınico. La globina puede ser alterada a nivel gen´etico mediante mutag´enesis espec´ıfica por puntos usando procedimientos bien conocidos. Una t´ecnica que puede ser empleada implica el uso de oligonucle´otidos sint´eticos para construir globinas variantes con sustituciones de bases. Seg´ un una modalidad, un oligonucle´ otido corto que contiene la mutaci´on se sintetiza y se recuece para construir la forma de una sola hebra del gen de globina de tipo salvaje (Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479488). El heteroduplex corto resultante puede servir como cebador para la s´ıntesis de la segunda hebra mediante ADN polimerasa. En el extremo 5’, se forma una muesca de una sola hebra la cual es cerrada por ADN ligasa. En otra modalidad, se sintetizan dos oligonucle´otidos complementarios, conteniendo cada uno de ellos la secuencia mutante. El duplex que se forma despu´es del recocido de estos oligonucle´otidos complementarios, puede ser unido a una mol´ecula de ADN m´as grande mediante ADN ligasa, con la condici´on de que los extremos de ambas mol´eculas tengan extremos “adherentes” de una sola hebra complementarios. Otra t´ecnica que puede ser usada implica la introducci´ on de un peque˜ no espacio de una sola hebra en la mol´ecula de ADN seguido por s´ıntesis de ADN de reparaci´ on defectuosa, es decir, la incorporaci´ on defectuosa de un nucle´otido no complementario en el espacio (Botstein y Shortle, 1985, Science 229:1193). La incorporaci´ on de un tiol nucle´ otido en dicho espacio puede reducir al m´ınimo la escisi´on del nucle´otido no complementario. Alternativamente, se puede preparar una variante de globina sintetizando qu´ımicamente el ADN que codifica la variante de globina usando procedimientos conocidos en la t´ecnica (v´ease, por ejemplo, Froehler, 1986, Nucl. Acids Res. 14:5399-5407 y Caruthers et al., 1982 GENETIC ENGINEERING, J.K. Setlow y A. Hollaender eds., Plenum Press, New York, vol. 4, pp. 1-17). En una modalidad preferida, se sintetizan qu´ımicamente fragmentos las hebras resultantes codificadoras de globina variante pueden ser ampliadas usando procedimientos conocidos en la t´ecnica, por ejemplo, la tecnolog´ıa PCR, y posteriormente insertadas en un vector de clonaci´on como se describe, por ejemplo, en la Solicitud PCT No de publicaci´ on WO 90/13645, publicada el 15 Noviembre 1990. En modalidades espec´ıficas, se pueden crear mutantes espec´ıficos en puntos mediante la introducci´ on de desajustes en los oligonucle´otidos usados para cebar la ampliaci´ on PCR (Jones y Howard, 1990, Biotechniques 8:178-180). Las manipulaciones de la secuencia de globina pueden ser realizadas a nivel prote´ınico. Se pueden efectuar cualquiera de numerosas modificaciones qu´ımicas mediante t´ecnicas conocidas que incluyen, pero no de forma limitativa, la disocia6

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ci´on qu´ımica espec´ıfica por bromuro de cian´ ogeno, tripsina, quimotripsina, papaina o proteasa V8, acetilaci´on con NaBH4 , formilaci´on, oxidaci´on, reducci´on; etc. Alternativamente, la prote´ına de globina variante puede ser sintetizada qu´ımicamente usando procedimientos conocidos en la t´ecnica, tal como sintetizadores de p´eptidos comercialmente disponibles y similares. Tales t´ecnicas standard de s´ıntesis de polip´eptidos pueden encontrarse en publicaciones tales como Merrifield, 1963, J. Chem. Soc. 85:2149-2154 y Hunkapillar et al., 1984, Nature (London) 310:105-111). Tratamiento de Hipotensi´ on y Shock S´eptico con Hemoglobina La hemoglobina preparada seg´ un los procedimientos anteriormente descritos se puede usar para la profilaxis o tratamiento de hipotensi´on sist´emica o shock s´eptico, estados ambos inducidos por la producci´ on interna de o´xido n´ıtrico. Dicha producci´ on interna de o´xido n´ıtrico puede derivarse del tratamiento de un animal con una citocina la cual incluye, pero no de forma limitativa, factor de necrosis tumoral, interleucina-1 e interleucina-2, en el caso de hipotensi´on sist´emica. En una modalidad espec´ıfica, la hemoglobina se puede usar para la profilaxis o tratamiento de hipotensi´ on sist´emica en un paciente inducida por tratamiento quimioterap´eutico con dichas citocinas. En el shock s´eptico, la producci´ on de o´xido n´ıtrico se deriva de la exposici´on de un animal a una endotoxina bacteriana. Las bacterias productoras de virus, hongos o enterotoxinas pueden inducir tambi´en directa o indirectamente la sobreproducci´ on de NO, la cual puede ser mitigada por la administraci´ on de las hemoprote´ınas de la presente invenci´on. La hemoprote´ına de hierro preferida, hemoglobina, usada en la presente invenci´ on se mezcla con un veh´ıculo farmac´euticamente aceptable. Los veh´ıculos farmac´euticos son tampones fisiol´ ogicamente compatibles tal como soluci´on de Hank o Ringer, salina fisiol´ ogica, una mezcla consistente en salina y glucosa, soluci´ on heparinicida de citrato s´ odico-´ acido c´ıtrico-dextrosa y similares. La hemoglobina para usarse en los m´etodos de la presente invenci´on se puede mezclar con sustitutos de plasma y expansores de plasma de tipo coloidal, tal como polisac´aridos lineales (por ejemplo, dextrano), hidroxietilalmid´ on, gelatina fluida equilibrada y otras proteinas de plasma. Adem´ as, la hemoglobina se puede mezclar con sustitutos de plasma polim´ericos solubles en agua y fisiol´ ogicamente aceptables, por ejemplo, alcohol polivin´ılico, poli(´ oxido de etileno), polivinilpirrolidona y condensados de o´xido de etileno-polipropilenglicol y similares. T´ecnicas y formulaciones para administrar las composiciones que comprenden hemoprote´ına de hierro pueden encontrarse en general en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Col., Easton, PA, u ´ltima edici´ on. En una modalidad preferida, la hemoglobina se administra intravascularmente. La cantidad de hemoprote´ına de hierro administrada, la cantidad eficaz, es una cantidad suficiente para unirse a pr´ acticamente la totalidad del o´xido n´ıtrico presente, eliminando as´ı o´xido n´ıtrico libre de la circulaci´on. Dicha cantidad eficaz es generalmente del orden de 0,1

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a 10 g/kg de peso corporal aproximadamente. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar el mejor modo y modalidades preferidas de la presente invenci´on sin que ello suponga una limitaci´ on de la invenci´ on reivindicada, salvo que se especifique lo contrario. Ejemplo 1 Abrogaci´ on de la Disminuci´ on de la Presi´ on Sangu´ınea Se llevaron a cabo experimentos en perros cruzados acondicionados de 23-28 kg de peso. La atenci´on prestada a los animales estuvo de acuerdo con la recomendaciones de la American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care y satisfac´ıan todas las normas prescritas por la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Committee on Care and Use of Laboratory Animals (1978) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Natl. Inst. Health, Bethesda, MD) DHEW Publi. No. (NIH) 78-83. El perro permaneci´o sin recibir alimento alguno durante la noche antes del d´ıa del experimento y fu´e anestesiado con pentobarbital (25 mg/kg, i.v.), intubado orotraquealmente y ventilado con una bomba de Harvard a una velocidad nominal de 12 respiraciones por minuto y un volumen total de la respiraci´ on de 15 ml/kg. El perro fu´e instrumentado con un cordis para la introducci´ on de un cat´eter Swan-ganz para medir las presiones arteriales venosa central y pulmonar, as´ı como una l´ınea arterial para controlar continuamente la presi´on sangu´ınea por v´ıa de un procesador anal´ ogico-digital asistido por ordenador. Una vez que la presi´on sangu´ınea y el ritmo card´ıaco se estabilizaron, se administr´o endotoxina al perro como una inyecci´ on de bolo (50 µg/kg, i.v. en 10 ml DPBS). Despu´es del inicio de la hipotensi´ on, se administr´ o, mediante un cat´eter venoso central, una infusi´ on r´ apida de 50 ml de hemoglobina (5 g de hemoglobina bovina comercialmente disponible/100 ml) durante 20 segundos. Los cambios cardiovasculares fueron controlados durante 12 horas m´ as despu´es de la administraci´on de hemoglobina. En la Figura 1 se muestra un gr´ afico que ilustra la hipotensi´ on inducida por endotoxina, su inhibici´ on por hemoglobina y la posterior administraci´on de alb´ umina de suero bovino (5 g). La presi´on sangu´ınea arterial media disminuy´o desde 160 mm de Hg a 70 mm Hg 2 horas despu´es de la administraci´on de endotoxina. Posteriormente se

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administr´o la hemoglobina (HgB) como un bolo intravenoso. La ca´ıda de la presi´ on sangu´ınea fu´e abrogada mediante esta administraci´ on y se invirti´ o parcialmente la hipotensi´on. Este efecto dur´ o aproximadamente 45 minutos antes a posterior disminuci´on solo fu´e ligeramente influenciada por la administraci´ on de 5 g de alb´ umina de suero bovino (BSA). Tras la repetici´on de este experimento, se obtuvieron pr´ acticamente los mismos resultados. Ejemplo 2 Ligaci´ on de NO por Mioglobina La formaci´ on de o´xido n´ıtrico por citosol de c´elulas endoteliales fu´e medida mediante un nuevo ensayo cin´etico en microplaca de 96 pocillos. En ensayo est´ a basado en la captura de NO por Fe2+ -mioglobina (Mb) la cual se oxida posteriormente a Fe3+ -mioglobina. el proceso de hemooxidaci´on fu´e medido continuamente con un lector cin´etico de microplacas (Molecular Devices, Menlo Park CA) como la velocidad de cambio en OD405-OD650 . Se recogieron puntos de datos de la totalidad de los 96 pocillos cada 16 segundos, durante 30 minutos a 25◦C, sacudiendo antes de realizar cada medici´on OD. Se utiliz´o la pendiente de la l´ınea de regresi´on de ajuste o´ptima (OD/min) para calcular la velocidad de s´ıntesis de NO. Las mediciones de OD/min se convirtieron a pmoles NO/min dividiendo por el incremento on comen OD405 -OD650 medido tras la oxidaci´ pleta de 1 pmole de Mb reducida con un exceso de 10 veces molar de ferricianuro pot´asico. Bajo las condiciones usadas, la eficacia de captura de NO por Mb se aproxim´ o al 100 %; el hecho de doblar o dividir a la mitad la concentraci´ on de Mb no tuvo influencia sobre la velocidad de oxidaci´ on de Mb. Todas las muestras conten´ıan 5-30 µl de citosol de c´elulas endoteliales (1-6 mg proteina/ml) y concentraciones finales de 5 µM Mb, 500 µM L-arginina, 500 µM NADPH y 80 Mm TRIS, pH 7,6. Preparaci´on de Fe2+ -Mioglobina: Se redujeron 2 mM de mioglobina (procedente de m´ usculo esquel´etico de caballo, Sigma con ditionito s´ odico y se aplic´o inmediatamente a una columna Sephadex G-25, seguido por eluci´ on con tampon 50 Mm TRIS, pH 7,6. La Mb fu´e prorrateada y guardada a -70◦C durante un tiempo de hasta 2 meses antes de su uso. De este modo, queda demostrado claramente la utilidad de esta hemoprote´ına de hierro para la eliminaci´on de a´cido n´ıtrico.

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REIVINDICACIONES 1. Uso de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de un efecto fisiol´ogico perjudicial en un animal causado por niveles excesivos de s´ıntesis de ´oxido n´ıtrico. 2. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 1 de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para ligar u oxidar o´xido n´ıtrico para reducir los niveles de o´xido n´ıtrico para reducir los niveles de o´xido n´ıtrico inducidos en un animal por una citocina o una endotoxina.

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3. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 1 de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento de la hipotensi´ on sist´emica. 4. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 1 de una hemoprote´ına de hierro en la preparaci´ on de un medicamento para el tratamiento del shock s´eptico. 5. Uso seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la hemoprote´ına de hierro es hemoglobina o mioglobina. 6. Uso seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el medicamento est´a adaptado para su administraci´ on intravascular.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.

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Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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