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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA

C07K 14/315 A61K 39/09 C12N 5/10

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 90900035.8 kFecha de presentaci´on: 15.12.1989 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 449 856 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 09.10.1991

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54 T´ıtulo: Mutantes de neumolisina y vacunas de neumococos fabricadas a partir de los mismos.

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73 Titular/es:

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72 Inventor/es: Paton, James Cleland;

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74 Agente: Garc´ıa-Cabrerizo y del Santo, Pedro

30 Prioridad: 16.12.1988 AU 198988

DE STAAT DER NEDERLANDEN VERTEGENWOORDIGD DOOR DE MINISTER VAN WELZIJN, VOLKSGEZONDHEID EN CULTUUR P.O. Box 5406 NL-2280 HK Rijswijk, NL

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.11.2001

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 160 570 T3

16.11.2001

Aviso:

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Boulnois, Graham John; Andrew, Peter William; Mitchell, Timothy John y Walker, John Arthur

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 160 570 T3 DESCRIPCION Mutantes de neumolisina y vacunas de neumococos fabricadas a partir de los mismos. 5

Esta invenci´on se refiere a mutantes de la toxina neumolisina y a vacunas de neumococos basadas en estos mutantes. Antecedentes

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Streptococcus pneumoniae (un neumococo) es un pat´ ogeno importante que produce enfermedades invasivas tales como neumon´ıa, meningitis y bacteriemia. Incluso en regiones en las que se dispone de una terapia eficaz de antibi´ oticos, la tasa de mortalidad por neumon´ıa producida por neumococos puede ser de hasta el 19 % en pacientes hospitalizados y aumenta hasta el 30-40 % en pacientes con bacteriemia. Estas altas tasas de mortalidad se han notificado en los Estados Unidos, donde la neumon´ıa, de la que S. pneumoniae es la causa m´as com´ un, ocupa el quinto lugar entre las causas de muerte. De hecho, la neumon´ıa es la u ´ nica enfermedad infecciosa entre las diez causas principales de muerte en ese pa´ıs. En los Estados Unidos, las tasas de mortalidad por meningitis neumoc´ ocica var´ıan del 13 al 45 %. En los pa´ıses en desarrollo, m´as de 3 millones de ni˜ nos menores de 5 a˜ nos mueren cada a˜ no por neumon´ıa, y de nuevo, S. pneumoniae es el agente causante m´as com´ un. S. pneumoniae tambi´en causa infecciones menos graves pero muy prevalentes, tales como otitis media y sinusitis, que tienen un impacto significativo sobre los costes sanitarios en los pa´ıses en desarrollo. La otitis media es especialmente importante en ni˜ nos peque˜ nos; la sinusitis afecta tanto a los ni˜ nos como a los adultos. A finales de los a˜ nos 70 se autoriz´o una vacuna para prevenir infecciones graves, especialmente neumon´ıas bacterianas, y para proteger a ciertos grupos, tales como individuos esplenectomizados y ni˜ nos peque˜ nos, que son particularmente susceptibles a la enfermedad neumoc´ ocica fulminante. La vacuna se compone de polisac´aridos capsulares purificados, que son los ant´ıgenos superficiales predominantes de los neumococos. Sin embargo, cada serotipo de S. pneumoniae (de los que hay 83) tiene un polisac´ arido capsular estructuralmente distinto, y la inmunizaci´ on con un serotipo no confiere protecci´on contra la inmensa mayor´ıa de los dem´ as. La vacuna autorizada actualmente en Australia contiene polisac´aridos purificados a partir de los 23 serotipos m´ as comunes, que son los responsables de aproximadamente el 90 % de las infecciones producidas por neumococos en este pa´ıs. La protecci´on contra los serotipos contenidos en la vacuna no es completa de ning´ un modo, y ha habido varios informes de infecciones graves, incluso fatales, que se han producido en individuos de alto riesgo vacunados. En los ni˜ nos peque˜ nos es donde la vacuna tiene la peor eficacia, y varios estudios, incluyendo uno realizado en Adelaide, han demostrado que la formulaci´ on existente tiene un efecto beneficioso cl´ınico demostrable peque˜ no o nulo en este grupo. Este fallo aparente de la vacuna parece estar relacionado con la deficiente inmunogenicidad de ciertos polisac´aridos de neumococos en ni˜ nos con menos de 5 a˜ nos. Los presentes solicitantes han demostrado que la respuesta de anticuerpos es particularmente deficiente para los cinco serotipos responsables con m´as frecuencia de la enfermedad en ni˜ nos (tipos 6, 14, 18, 19 y 23). De hecho, la respuesta de anticuerpos contra esos polisac´aridos de neumococos s´ olo se aproxima a los niveles encontrados en adultos en ni˜ nos de m´ as de 8 a˜ nos en el momento de la vacunaci´ on. (Vaccines, agina Ed. S.A. Plotkin y E.A. Mortimer, 2a ¯ Ed. 1994, W.B. Saunders Company, ISBN 0-1726-6584-5, p´ 535 columna izquierda, u ´ltimo p´ arrafo - columna derecha, primer p´ arrafo). En vista de esto, parece ser necesaria una vacuna que incluya ant´ıgenos distintos de los polisac´aridos capsulares para proteger a los ni˜ nos peque˜ nos de la infecci´on neumoc´ ocica. Uno de tales ant´ıgenos podr´ıa ser una neumolisina, una toxina proteica producida por todos los aislados virulentos de S. pneumoniae. Se ha descubierto que la inmunizaci´ on de ratones con esta prote´ına confiere un grado de protecci´ on contra la infecci´on neumoc´ ocica (Vaccines, loc. cit., p´agina 550, columna derecha, primer p´ arrafo). Sin embargo, existe la dificultad de que la neumolisina es t´ oxica para los seres humanos. De esta forma, la neumolisina incluida en una vacuna debe ser sustancialmente no t´ oxica. Sin embargo, para hacer que una neumolisina sea no t´ oxica, la mayor´ıa de las veces se emplean procedimientos que probablemente alteran la configuraci´on b´ asica de la prote´ına y hacen que sea inmunog´enicamente distinta de la neumolisina nativa o de tipo silvestre. Una respuesta inmune inducida por una prote´ına alterada que es inmunog´enicamente distinta de la neumolisina nativa tendr´ a una capacidad de protecci´ on menor o no tendr´ a dicha capacidad de protecci´ on. Este aspecto se se˜ nala en Infection and Immunity, vol. 54, no. 1, 1986, p´ aginas 50-55, Paton J.C. y col., que describe los mutantes de neumolisina pJCP21 y pJCP22. Sin embargo, dichos mutantes no proporcionan una respuesta inmune protectora. De esta forma, la dificultad radica en producir una neumolisina alterada que sea no t´ oxica y que al 2

ES 2 160 570 T3 mismo tiempo sea suficientemente similar desde el punto de vista inmunog´enico a la forma t´oxica como para inducir una respuesta inmune protectora.

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Entonces, una neumolisina alterada con las caracter´ısticas anteriores puede usarse de varias formas en una vacuna. De esta manera, la neumolisina alterada puede usarse por s´ı misma para inmunizar, o de forma alternativa, la neumolisina alterada puede conjugarse con polisac´aridos de neumococo, o de forma alternativa, puede incluirse en una vacuna en la que los polisac´ aridos de neumococo pueden estar conjugados con otra prote´ına y la neumolisina alterada s´ olo est´a presente en una forma no conjugada. Como alternativa, tanto el polisac´ arido de neumococo como la neumolisina pueden usarse en forma no conjugada. Descripci´ on de la invenci´ on

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Por lo tanto, en sentido amplio, puede decirse que la invenci´on reside en una neumolisina mutante que es sustancialmente no t´oxica y que es capaz de inducir una respuesta inmune protectora en un animal que es reactivo a la neumolisina de tipo silvestre, caracterizada porque la neumolisina mutante tiene la secuencia de amino´acidos ilustrada en la Figura 3, secuencia que se ha alterado por al menos una sustituci´ on, deleci´on o bloqueo de amino´acidos en las posiciones 257 a 297 y/o en las posiciones 367 a 397 y/o en las posiciones 424-437.

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Preferiblemente, la neumolisina mutante se ha alterado en las posiciones 367-397 y ha reducido la actividad de uni´ on al complemento en comparaci´ on con la neumolisina de tipo silvestre. La reducci´ on de la actividad de uni´ on al complemento produce menos inflamaci´on en el sitio de administraci´ on de la vacuna. 25

Preferiblemente, la neumolisina mutante se ha alterado en las posiciones 257-297 y ha reducido la actividad de uni´ on a Fc en comparaci´on con la neumolisina de tipo silvestre. La reducci´ on de la actividad de uni´ on a Fc produce menos inflamaci´ on en el sitio de administraci´ on de la vacuna. 30

Preferiblemente, la neumolisina mutante se altera a causa de una o m´ as sustituciones de amino´ acidos con respecto a la neumolisina de tipo silvestre. La neumolisina puede alterarse reemplazando, retirando o bloqueando el amino´acido presente en uno o m´as de los sitios 367, 384, 385, 428, 433 o 435 de la neumolisina de tipo silvestre.

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En otra forma, puede decirse que la invenci´ on reside en una vacuna que incluye una neumolisina alterada, siendo dicha neumolisina alterada no t´ oxica y capaz de inducir una respuesta inmune en un animal reactivo a la neumolisina de tipo silvestre. 40

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Preferiblemente, la vacuna comprende material de polisac´ arido capsular conjugado con la neumolisina alterada o mutante. El material capsular puede proceder de uno cualquiera o m´as de los serotipos de Streptococcus pneumoniae 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F Y 33F. En esta realizaci´on, la vacuna puede dirigirse espec´ıficamente a los serotipos que est´ an asociados com´ unmente con la enfermedad en ni˜ nos y ante los que los ni˜ nos generalmente tienen una respuesta inmune deficiente (es decir, los serotipos daneses 6A, 68, 14, 18C, 19A, 19F y 23F). Sin embargo, tambi´en pueden usarse otros serotipos comunes contenidos en la presente vacuna 23-valente de Merck Sharp y Dohme (Pneumovax 23) para sintetizar conjugados (es decir, los tipos 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F y 33F) o, en efecto, cualquier otro serotipo. La conjugaci´on de cualquier polisac´arido de neumococo con el soporte proteico asegura una buena inmunogenicidad dependiente de c´elulas T en ni˜ nos, de tal forma que se producen niveles protectores de anticuerpos anti-polisac´ arido.

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La combinaci´on de la neumolisina alterada junto con el material capsular asegurar´ a un grado extra de protecci´on, particularmente contra serotipos de S. pneumoniae cuyos polisac´ aridos no se han incorporado en las formulaciones de vacuna existentes. 60

La vacuna preferiblemente se administra por inyecci´ on subcut´ anea, con o sin un adyuvante aprobado, tal como gel de al´ umina.

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ES 2 160 570 T3 En otra forma, puede decirse que la invenci´ on reside en un clon recombinante que incluye un replic´on y una secuencia de ADN que codifica una neumolisina alterada, siendo dicha neumolisina alterada no t´ oxica y siendo capaz de inducir una respuesta inmune en un animal que reacciona ante la neumolisina de tipo silvestre. 5

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En otra forma, puede decirse que la invenci´ on reside en un procedimiento para producir una neumolisina alterada, que incluye las etapas de purificar dicha neumolisina alterada a partir de un sistema de expresi´on que incluye un clon recombinante con un ADN que codifica una neumolisina alterada, siendo dicha neumolisina sustancialmente no t´ oxica y siendo capaz de inducir una respuesta inmune en un animal que reacciona ante la neumolisina de tipo silvestre. Preferiblemente, el sistema de expresi´on es un cultivo de una c´elula hospedante que incluye un clon recombinante con ADN que codifica la neumolisina alterada.

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En otra forma, puede decirse que la invenci´ on reside en un procedimiento para producir una vacuna, que incluye la etapa de amplificar un clon recombinante que codifica una neumolisina alterada, induciendo la transcripci´on y la traducci´ on de dicho material clonado y purificando la neumolisina alterada, y la etapa de conjugar la neumolisina alterada con un polisac´ arido capsular, teniendo la neumolisina alterada una actividad t´ oxica sustancialmente menor que la neumolisina de tipo silvestre.

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Para comprender mejor la invenci´ on, a continuaci´ on se describir´ an realizaciones espec´ıficas de la invenci´on haciendo referencia a los diagramas, en los que:La Fig. 1 es la secuencia de ADN del gen que codifica la neumolisina de tipo silvestre, 25

La Fig. 2 es la secuencia de ADN de un gen alterado que codifica la neumolisina de tipo silvestre usada para clonar el gen de la neumolisina en un vector de expresi´ on, La Fig. 3 es la secuencia de amino´acidos de la neumolisina de tipo silvestre obtenida a partir de la secuencia de ADN del gen que codifica la neumolisina de tipo silvestre, y

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La Fig. 4 muestra la secuencia de amino´acidos de la neumolisina, mostrando las sustituciones de amino´ acidos inducidas por mutag´enesis de localizaci´on dirigida. Se han usado t´ecnicas de ADN recombinante para construir derivados de neumolisina no t´ oxicos adecuados para la administraci´on a los seres humanos. Para conseguir esto, el gen de S. pneumoniae que codifica la neumolisina se clon´ o en Escherichia coli y se determin´o su secuencia de ADN completa. La secuencia de ADN se muestra en la Figura 1 y la secuencia de amino´acidos derivada se muestra en la Figura 3. Tres regiones del gen de la neumolisina se sometieron a mutag´enesis dirigida a oligonucle´otidos. La primera regi´on codifica los amino´acidos 427-437 de la secuencia de la prote´ına, y se presenta subrayada en la Figura 3. Esta secuencia de 11 amino´acidos muestra una homolog´ıa absoluta con regiones similares presentes en otras toxinas activadas con tiol relacionadas, por lo que se considera responsable de la actividad hemol´ıtica y, por lo tanto, de la actividad t´ oxica de la toxina. Las otras dos regiones codifican los amino´ acidos 257-297 y los amino´ acidos 368-397 y tambi´en se presentan subrayadas en la Figura 3. Estas dos regiones de la toxina tienen una homolog´ıa sustancial en las secuencias de amino´ acidos con la prote´ına reactiva con C (CRP) humana y, por lo tanto, por deducci´ on, se consideran responsables de la capacidad de la neumolisina de unirse a la regi´ on Fc de las inmunoglobulinas y de activar el complemento. Como se muestra en la Figura 4, se construyeron quince mutaciones distintas en el gen de la neumolisina, que ocasionaban la sustituci´ on de un solo amino´acido. Con la intenci´ on de mantener la estructura de la neumolisina alterada, se realizaron sustituciones conservativas, de forma que los amino´ acidos se sustituyeron por amino´ acidos de naturaleza similar. Para la regi´ on implicada en la actividad hemol´ıtica, cada uno de los siguientes cambios: Cys428 → Gly, Cys428 → Ser, Trp433 → Phe, Glu434 → Asp y Trp435 → Phe, redujo la actividad hemol´ıtica en un 97 %, 90 %, 99 %, 75 % y 90 %, respectivamente. Las otras mutaciones en esa regi´ on (Cys428 → Ala, Glu434 → Gln y Trp436 → Phe) no tuvieron ninguna influencia sobre la actividad hemol´ıtica. La mutaci´on de una regi´ on distinta de la toxina considerada responsable de la uni´ on a las membranas de las c´elulas diana tambi´en afecta a la actividad hemol´ıtica de la prote´ına. Esta sustituci´ on, His367 → Arg, inhibe ´ completamente la actividad hemol´ıtica. Este es un hallazgo bastante impredecible, ya que His367 → Arg, por lo tanto, muestra una mayor inhibici´ on de esta propiedad que las sustituciones realizadas dentro de la regi´ on de 11 amino´acidos considerada responsable de la actividad hemol´ıtica.

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Las mutaciones en los dominios de tipo CRP se ensayaron con respecto a la capacidad de activar el on del complemento. Para Trp379 → Phe, Tyr384 → Phe, Asp385 → Asn y Trp397 → Phe, la activaci´ complemento se redujo en un 20 %, 70 %, 100 % y 15 %, respectivamente. Las otras mutaciones en los dominios de tipo CRP mostradas en la Figura 4 no reducen la activaci´on del complemento. De forma importante, las mutaciones anteriores que afectan a la actividad hemol´ıtica o a la activaci´on del complemento no perjudica a la inmunogenicidad de las prote´ınas en comparaci´on con la neumolisina nativa o de tipo silvestre. on preferida para reducir la actividad hemol´ıtica, De esta forma, aunque His367 → Arg es la mutaci´ una combinaci´ on de dos o m´ as mutantes que reduzcan la actividad hemol´ıtica tambi´en puede conseguir un nivel de reducci´ on muy alto de la actividad hemol´ıtica. De forma similar, Asp385 → Asn es la mutaci´on preferida para conseguir una reducci´on de la activaci´ on del complemento, sin embargo, tambi´en puede usarse una combinaci´ on de dos o m´ as mutantes distintos que reduzcan la actividad en un menor grado. En una realizaci´ on preferida, el derivado de neumolisina para uso en la vacuna contendr´ıa una combinaci´on de ciertas de las mutaciones anteriores, de forma que la prote´ına no pueda activar el complemento adem´as de tener una actividad hemol´ıtica cero. Son ejemplos de tal combinaci´ on:1) His367 → Arg + Asp385 → Asn,

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2) His367 → Arg + Asp385 → Asn + Cys428 → Gly o Trp433 → Phe 3) Asp385 → Asn + Cys428 → Gly + Trp433 → Phe

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Estas son algunas de las combinaciones preferidas, sin embargo, debe entenderse que pueden usarse otras combinaciones de mutaciones para obtener la neumolisina alterada de utilidad en una vacuna. Adem´as, la neumolisina alterada puede comprender una cualquiera de las mutaciones individuales con una actividad suficientemente reducida. El alto nivel de expresi´ on de la neumolisina alterada a partir del ADN que codifica la neumolisina alterada puede conseguirse usando una cualquiera de varias t´ecnicas convencionales, incluyendo la expresi´on en un hospedante procariota con el ADN clonado de forma apropiada dentro de uno cualquiera de los muchos vectores de expresi´on disponibles actualmente, o clonado de forma apropiada dentro del cromosoma del hospedante; la expresi´on en un hospedante eucariota con el ADN clonado de forma apropiada dentro de un vector de expresi´ on o clonado dentro del cromosoma del hospedante; o dentro de un sistema de expresi´on in vitro tal como el que puede comprender componentes purificados necesarios para la expresi´on de la neumolisina alterada. Para conseguir un alto nivel de expresi´ on del gen de la neumolisina mutada, se ha clonado en el vector pKK233-2 para la expresi´ on dentro de Escherichia coli u otro procariota similar. Este vector inclu´ıa genes de resistencia a ampicilina y a tetraciclina, el promotor trc (que puede regularse por IPTG [isopropil-β-Dtiogalactopiran´ osido] y un sitio de uni´ on a ribosomas lac Z adyacente a un cod´ on de iniciaci´on ATG que incorpora un sitio de restricci´ on NcoI. Inmediatamente cadena abajo del cod´ on de iniciaci´ on hay sitios de restricci´ on para PstI y HindIII, seguidos de un fuerte terminador de la transcripci´ on T1 T2 . Antes de la inserci´on en pKK233-2, se construy´ o un sitio de restricci´on NcoI en el extremo 5’ de la secuencia codificante de la neumolisina (en el cod´ on de iniciaci´on) por mutag´enesis dirigida a oligonucle´ otidos, como se muestra en la Figura 2. Esto permiti´ o que el extremo proximal del gen de la neumolisina alterado se clonara dentro del sitio NcoI de pKK233-2; se us´ o un sitio HindIII aproximadamente 80 bases cadena abajo del cod´ on de terminaci´ on de la neumolisina para unir el extremo distal del gen alterado en el sitio compatible en pKK233-2. Sin embargo, el derivado de neumolisina mutante podr´ıa clonarse en uno cualquiera de varios sistemas de vectores de expresi´on. La neumolisina mutante se prepara como se indica a continuaci´ on: primero se cultivan c´elulas E. coli que llevan el pl´asmido recombinante anterior en cultivos de 9 litros en medio Luria Bertani (o en cualquier otro medio apropiado), suplementado con el antibi´ otico apropiado, a 37◦C, con aireaci´on. Cuando el cultivo alcanza la u ´ ltima parte de la fase logar´ıtmica de crecimiento, se a˜ nade IPTG a una concentraci´ on final de 20 µM (para inducir la expresi´on del gen de la neumolisina alterado) y se contin´ ua la incubaci´ on durante 2 a 3 horas m´ as. Despu´es, las c´elulas se recogen por centrifugaci´on o ultrafiltraci´ on y se lisan por tratamiento con EDTA y lisozima, seguido de sonicaci´on, o por rotura en una celda de presi´ on French. Los desechos celulares se retiran por centrifugaci´on y el extracto despu´es se dializa extensivamente frente a fosfato s´odico 10 mM (pH 7,0). El material despu´es se introduce en una columna de DEAE-celulosa y se eluye con un 5

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gradiente lineal de fosfato s´ odico de 10 a 250 mM (pH 7,0). Se re´ unen las fracciones que contienen niveles m´aximos del derivado de neumolisina, se concentran por ultrafiltraci´ on y se introducen en una columna de Sephacryl S-200. Esta columna se revela en fosfato s´ odico 50 mM (pH 7,0) y de nuevo se re´ unen las fracciones con altos niveles de derivado de neumolisina, se concentran por ultrafiltraci´ on y se almacenan en glicerol al 50 % a -15◦C. El producto final tiene una pureza mayor del 95 %, a juzgar por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. La cromatograf´ıa de interacci´on hidr´ ofoba en Fenil-Sepharose es una purificaci´on alternativa que tambi´en podr´ıa usarse. Debe entenderse que ´este es s´olo un procedimiento de purificaci´ on de la neumolisina alterada y que pueden emplearse otros procedimientos alternativos (incluyendo Cromatograf´ıa L´ıquida de Alta Presi´ on).

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Esta neumolisina alterada purificada despu´es puede administrarse como una vacuna a los niveles apropiados, por s´ı misma o en combinaci´on con otros ant´ıgenos. En una formulaci´ on, la neumolisina puede conjugarse con un polisac´ arido procedente de uno cualquiera o m´as de la diversidad de cepas de neumococos descritas anteriormente. 15

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La neumolisina mutante puede conjugarse con los diversos serotipos de polisac´ arido por una diversidad de procedimientos. El primero implica la preparaci´ on de un polisac´ arido activado por tratamiento del polisac´ arido puro (disponible en el mercado) con bromuro de cian´ ogeno y dihidrazida de a´cido ad´ıpico (ADH). El ADH-polisac´arido despu´es se combina con la neumolisina mutante en presencia de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida - HCl. El material conjugado se separa de los reactivos por cromatograf´ıa a trav´es de Sepharose CL-4B. Como alternativa, los conjugados de polisac´ arido-neumolisina mutante pueden prepararse usando reactivos bifuncionales tales como hexanoato de N-succinimidil-6(4’-azido-2’-nitrofenilamino) (SANPAH). El polisac´arido puro disuelto en soluci´ on salina tamponada con fosfato se hace reaccionar con SANPAH en presencia de una fuente de luz blanca intensa. El SANPAH sin reaccionar despu´es se separa del polisac´arido activado por cromatograf´ıa en Sephadex G-50. El polisac´arido activado despu´es se conjuga con la neumolisina mutante en tamp´ on borato 0,2 M (pH 8,5). Despu´es, cualquier exceso de grupos reactivos se bloquea con lisina y el conjugado de polisac´ arido-prote´ına se separa de los dem´as reactivos por cromatograf´ıa en Sepharose CL-4B. Los conjugados tambi´en pueden prepararse por aminaci´ on reductora con cianoborohidruro. Como alternativa, otra prote´ına, tal como la toxina tet´ anica inactivada, puede conjugarse con los polisac´aridos deseados y a la vacuna puede a˜ nad´ırsele neumolisina alterada en una forma no conjugada.

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ES 2 160 570 T3 REIVINDICACIONES

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1. Una neumolisina mutante que es sustancialmente no t´ oxica y que es capaz de inducir una respuesta inmune protectora en un animal que es reactivo a la neumolisina de tipo silvestre, caracterizada porque la neumolisina mutante tiene la secuencia de amino´ acidos ilustrada en la Figura 3, secuencia que se ha alterado en al menos una sustituci´ on, deleci´ on o bloqueo de amino´acidos en las posiciones 257 a 297 y/o en las posiciones 367 a 397 y/o en las posiciones 424-437. 2. Una neumolisina mutante de acuerdo con la reivindicaci´ on 1, que se ha alterado en las posiciones 367-397 y que tiene una actividad de uni´ on al complemento menor que la neumolisina de tipo silvestre. 3. Una neumolisina mutante de acuerdo con las reivindicaciones 1 o´ 2, que se ha alterado en las posiciones 257-297 y que tiene una actividad de uni´ on a Fc menor que la neumolisina de tipo silvestre.

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4. Una neumolisina alterada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene la siguiente secuencia de amino´acidos:

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en la que R1 es His o Arg, R2 es Trp o Phe, R3 es Tyr o Phe, R4 es Asp o Asn, R5 es Trp o Phe, R6 es Cys, Gly o Ser, R7 es Trp o Phe, R8 es Glu o Asp, R9 es Trp o Phe, y en la que al menos uno de los restos R1 , R6 , R7 , R8 o R9 es distinto del tipo silvestre. 55

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5. Una neumolisina alterada de acuerdo con la reivindicaci´ on 4, en la que R1 es Arg, R2 es Trp, T3 es Tyr, R4 es Asn, R5 es Trp, R6 es Cys, R7 es Trp, R8 es Glu y R9 es Trp. 6. Una vacuna que comprende una neumolisina alterada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 7. Una vacuna de acuerdo con la reivindicaci´ on 6, que comprende un material de polisac´ arido capsular conjugado con un soporte proteico y un material proteico no conjugado, procediendo el material de 8

ES 2 160 570 T3 polisac´arido capsular de uno cualquiera o m´ as de los serotipos de Streptococcus pneumoniae, y siendo el material proteico no conjugado una neumolisina alterada.

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8. Una vacuna de acuerdo con la reivindicaci´ on 7, en la que el material capsular procede de uno cualquiera o m´as de los serotipos de Streptococcus pneumoniae 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F y 33F. 9. Una vacuna de acuerdo con la reivindicaci´ on 6, que comprende un material de polisac´arido capsular conjugado con un soporte proteico, procediendo el material de polisac´ arido capsular de uno cualquiera o m´as de los serotipos de Streptococcus pneumoniae, y siendo el soporte proteico una neumolisina alterada. 10. Una vacuna de acuerdo con la reivindicaci´ on 9, en la que el material capsular procede de uno cualquiera o m´as de los serotipos de Streptococcus pneumoniae 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F y 33F.

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11. Un pl´ asmido recombinante que incluye una secuencia de ADN que codifica una neumolisina alterada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

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12. Una c´elula hospedante h´ıbrida que incluye un pl´asmido recombinante de acuerdo con la reivindicaci´on 11, incluyendo dicho pl´ asmido recombinante un control de la expresi´on inducible operable por la expresi´on de dicho ADN que codifica la neumolisina alterada dentro de una c´elula hospedante. 13. Un procedimiento para producir una neumolisina alterada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que incluye las etapas de purificar dicha neumolisina alterada a partir de un sistema de expresi´ on que incluye un pl´ asmido recombinante de acuerdo con la reivindicaci´on 11. 14. Un procedimiento para producir una neumolisina alterada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que incluye las etapas de purificar dicha neumolisina alterada a partir de un cultivo de una c´elula hospedante de acuerdo con la reivindicaci´on 12.

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15. Un procedimiento para producir una vacuna que incluye la etapa de amplificar un clon recombinante que codifica una neumolisina alterada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, induciendo la transcripci´on y la traducci´ on de dicho material clonado y la purificaci´ on de la neumolisina alterada, y la etapa de conjugar la neumolisina alterada con un polisac´arido capsular. 35

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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