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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on:

2 192 041

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 99915161.6 kFecha de presentaci´on: 31.03.1999 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 1 071 340 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 31.01.2001

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54 T´ıtulo: Huevos enriquecidos en ´ acido linoleico conjugado y m´ etodo para fabricarlos.

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73 Titular/es: WISCONSIN ALUMNI

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72 Inventor/es: Cook, Mark E.;

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74 Agente: D´ıez de Rivera de Elzaburu, Alfonso

30 Prioridad: 15.04.1998 US 60588

RESEARCH FOUNDATION 614 North Walnut Street Post Office Box 7365 Madison, Wisconsin 53707-7365, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.09.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 192 041 T3

16.09.2003

Aviso:

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Aydin, Rahim y Pariza, Michael W.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 192 041 T3 DESCRIPCION Huevos enriquecidos en ´acido linoleico conjugado y m´etodo para fabricarlos. 5

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Antecedentes de la invenci´ on Los a´cidos linoleicos conjugados (en adelante, colectivamente, “CLA” [Conjugated Linoleic Acids]) un conjunto de ocho is´ omeros geom´etricos y posicionales de ´acido 9-cis, 12-cis-octadecadienoico (“´acido linoleico”) no conjugados, muestran efectos beneficiosos para la salud cuando un animal los consume en su dieta. Los is´omeros 9-cis, 11-trans y, en menor grado, el 10- trans y el 12-cis, al igual que otros is´ omeros conjugados, se presentan naturalmente en los alimentos. El CLA se aisl´o y se identific´o por primera vez a partir de extractos de carne vacuna picada y asada que denotaban actividad anticarcinog´enica (Ha y colaboradores, Carcinogenesis 8: 1881-1887). El CLA tambi´en se encuentra en algunos productos de quesos procesados. Y. L. Ha, N. K. Grimm y M. W. Pariza, en J. Agric. Food Chem., Vol. 37, N◦ 1, pp. 75-81 (1987). El CLA preparado sint´eticamente inhibe la carcinog´enesis inducida qu´ımicamente en diversos sistemas de modelos animales (Ha y colaboradores, 1996 supra; Ha y colaboradores, Cancer Res. 50: 1097-1101, 1990; Ip y colaboradores, Cancer Res. 51: 6118-6124, 1991; Ip y colaboradores, Cancer Res. 54: 12121215, 1994). Otras actividades biol´ ogicas que se observaron en los sistemas de modelos animales incluyen la reducci´on de los efectos catab´ olicos adversos que induce la estimulaci´on inmune (Miller y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm. 198(3): 1107-1112, 1994) y el mayor rendimiento en cuanto al crecimiento en ratas (Chin y colaboradores, J. Nutr. 124: 2344-2349, 1994). El CLA tambi´en reduce el desarrollo de la aterosclerosis en los conejos (Lee y colaboradores, Atherosclerosis, 108:19-25, 1994) y en los h´ amsteres (Nicolosi y colaboradores,Circulation 88 Suppl: 2458, 1993) a los que se suministra una dieta aterog´enica altamente graso que contiene colesterol. Tambi´en reduce el contenido de la grasa corporal e incrementa la masa corporal magra (Park y colaboradores, Abstract for 1995 Annual Meeting of the Institute of Food Technologists [Resumen para la Reuni´ on Anual de 1995 del Instituto de Tecn´ ologos en Alimentos], 64-10: 183, 1995, y Park y colaboradores, Lipids 32: 853-5 (1977)). Estos efectos del CLA parecen ser, en parte, una consecuencia de los efectos sobre el metabolismo de los l´ıpidos. Al aumentar la cantidad del CLA dietario, podr´ıan obtenerse efectos similares sobre la salud en los seres humanos. Uno de los medios por el cual se podr´ıa aumentar el CLA dietario, consiste en incrementar la cantidad del CLA que se encuentra en los alimentos, tales como los huevos. El documento de patente de Estados Unidos N◦ 5.504.114, describe que pueden obtenerse huevos muy ricos en CLA, administrando CLA a las gallinas ponedoras. Sin embargo, el documento de patente de Estados Unidos as, que cuando se administra a las aves una dieta enriquecida con CLA, sus N◦ 5.504.114 describe, adem´ huevos fecundados no pueden sacar cr´ıa y muestran una dr´ astica alteraci´on en el perfil de l´ıpidos. El nivel de CLA hallado en la yema de los huevos producidos por gallinas ponedoras alimentadas con una dieta suplementada con CLA, aument´ o m´as de 20 veces; hubo un incremento del estearato (18:0) y del palmitato (16:0) de los ´acidos grasos saturados y una reducci´ on del oleato (18:1) y del palmitoleato (16:1) de los ´acidos grasos monoinsaturados. El porcentaje relativo de C16:0 y C18:0 aument´ o alrededor de 37 % y 87 % respectivamente. El porcentaje relativo de C16:1 y C18:1 se redujo en porcentajes aproximados de 48 % y 41 % respectivamente. Las relaciones de C16:0/C16:1 y C18:0/C18:1 aumentaron aproximadamente 2,4 y 3,2 veces, respectivamente. En los huevos que presentan estos cambios en la composici´on de a´cidos grasos, la yema del huevo se endurece cuando se enfr´ıa a una temperatura inferior a la temperatura ambiente de 21◦ C (70◦ F), preferiblemente a una temperatura comprendida entre 0◦ C (32◦F) y as preferiblemente, a una temperatura que oscile entre 0◦ C (32◦ F) y 16◦ C (60◦ F) y los 21◦C (70◦ C), m´ huevos fecundados no sacan cr´ıa cuando se incuban. En los mam´ıferos, los ´acidos grasos monoinsaturados se forman desaturando directamente y por oxidaci´on a´cidos grasos saturados preformados de cadena larga (C> 16). La estearoil-CoA desaturasa (“SCD” [Stearoyl-CoA Desaturase], tambi´en conocida como “9 desaturasa”) cataliza la desaturaci´on ?9 de los a´cidos palm´ıtico (C16:0) y este´ arico (C18:0), que forman los a´cidos palmitoleico (C16:1, n-7) y oleico (C18:1, n-9). La enzima desaturasa est´a asociada con el ret´ıculo endopl´ asmico (microsomas) y puede aislarse como microsomas del h´ıgado, la gl´andula mamaria, el cerebro, los test´ıculos y los tejidos adiposos. Son muchos los mecanismos que pueden estar implicados en el proceso de regulaci´ on de la actividad la SCD, incluso la alteraci´ on y privaci´ on dietaria (Cook y Spence, J. Biol. Chem. 248: 1793-1796, 1973), hormonas (Brenner, Biochem. Soc. Trans., 18: 773-775, 1990) y la composici´on de la grasa dietaria 2

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(Christiansen y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 1082: 57-62, 1991; Ntambi, J.M., J. Biol Chem. 267 (15): 10925-10930, 1992). Las dietas ricas en a´cidos grasos poliinsaturados por lo general disminuyen la actividad de la SCD (Christiansen y colaboradores, 1991 supra; de Antueno y colaboradores Mol. Cell. Biochem. 118: 153-161, 1992; de Schrijver y Privett; J. Nutr., 112: 619-626, 1982; Garg y colaboradores, Biochem. Biophys. Acta 962: 330-336, 1988). La evidencia m´ as convincente, indica que las disminuciones en la actividad de la SCD representan una s´ıntesis enzim´atica reducida, que surge de una reducci´on en la abundancia del mARN de la SCD1 (Ntambi, 1992 supra). Una dieta con alto contenido de carbohidratos, sin grasas, puede aumentar la s´ıntesis enzim´atica de la SCD y el nivel de mARN de la SCD1 en el h´ıgado (Landschulz y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm., 200 (2): 763:768, 1994; Ntambi, 1992 supra; Thiede y Strittmantter, J. Biol. Chem., 260: 14459-14463, 1985). Estudios recientes indicaron que el ´acido araquid´ onico (C20:4) regula la s´ıntesis del ´acido graso monoinsaturado inhibiendo la expresi´ on gen´etica de la estearoil-CoA desaturasa en los linfocitos. (Tebbey y Buttke, Biochim. Biophys. Acta., 1171: 27-34, 1992) y en el h´ıgado del rat´ on (Landschulz y colaboradores, 1994 supra). En t´erminos comerciales no es aceptable aumentar simplemente la cantidad de CLA en la dieta de las gallinas ponedoras para aumentar el CLA dietario en los huevos, debido a los efectos adversos que los mayores niveles de CLA tienen tanto sobre la capacidad reproductiva de las aves, como sobre la aceptaci´on de quien consume los huevos. Lo que la t´ecnica precisa es un m´etodo para aumentar la cantidad de CLA en los huevos, que no produzca consecuencias reproductivas indeseables para las poblaciones av´ıcolas, y que al mismo tiempo mantenga un producto aceptable para el uso y consumo de los seres humanos. Breve sumario de la invenci´ on

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Un objeto de la presente invenci´ on consiste en proporcionar un m´etodo para aumentar el contenido de CLA en los huevos, sin provocar un efecto perjudicial en los huevos. Consecuentemente, en un aspecto, la presente invenci´on consiste en un m´etodo para enriquecer el contenido de CLA en los huevos, sin causar efectos no deseados en los mismos. El m´etodo incluye las etapas de: administrar una cantidad eficaz de CLA a un ave para enriquecer el nivel de CLA en un huevo puesto por el ave, a un nivel superior al nivel encontrado en un huevo que pone un ave a la que no se suministr´ o una dieta enriquecida con CLA; administrar al ave una cantidad de uno o m´ as ´acidos grasos insaturados, no conjugados, que resulte eficaz para superar los efectos adversos del a´cido linoleico conjugado en el aspecto de un huevo que pone un ave a la que se suministra una dieta enriquecida con CLA; y permitir que la gallina ponedora ponga un huevo que tenga mayor nivel de a´cido linoleico conjugado con relaci´on a un huevo no tratado, y una yema que permanezca l´ıquida cuando se enfr´ıa por encima de 0◦C (32◦ F) y por debajo de la temperatura ambiente de 21◦ C (70◦ F). En un segundo aspecto, la presente invenci´on consiste tambi´en en un huevo que tiene mayores niveles de CLA con relaci´on a los huevos que no fueron mejorados, en los que al menos el 1 % de los a´cidos grasos totales del huevo es ´acido linoleico conjugado y en el que el huevo tiene una yema que permanece l´ıquida cuando se la enfr´ıa por encima de 0◦ C (32◦ F) y por debajo de la temperatura ambiente de 21◦C (70◦ F). En otro aspecto, esta invenci´ on es un pienso para aves de corral que comprende a´cido linoleico conjugado y un a´cido graso insaturado no conjugado, que supera los efectos adversos del a´cido linoleico conjugado en un huevo. Otros objetos, ventajas y caracter´ısticas resultar´ an evidentes al revisar la memoria descriptiva, los dibujos y las reivindicaciones.

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Breve descripci´ on de las diversas vistas de los dibujos La Figura 1 ilustra el efecto de la dieta de las gallinas ponedoras sobre la capacidad de sacar cr´ıa de los huevos puestos por las gallinas.

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Descripci´ on detallada de la invenci´ on Cuando se suministra CLA a las especies av´ıcolas en las dietas convencionales, la composici´on del a´cido graso de los huevos que producen estas aves se altera significativamente. El documento de patente de Estados Unidos N◦ 5.504.114 describe un cambio en las relaciones de 16:0/16:1 y 18:0 y 18:1 de los ´acidos grasos despu´es de la suplementaci´on con CLA. Estos cambios se asocian con una reducci´on en la actividad de la ?9 desaturasa (estearoil-CoA desaturasa, SCD). En este sentido, la suplementaci´on con CLA se correlacion´o con niveles m´as bajos de mARN de la SCD1 en el h´ıgado del rat´ on in vivo y en una 3

ES 2 192 041 T3 l´ınea de c´elulas hep´ aticas de rat´ on in vitro. El documento de patente de Estados Unidos N◦ 5.504.114 no describe ninguna vinculaci´ on entre la suplementaci´on con CLA y los niveles de mARN de la SCD1, ni describe la forma de superar tanto el cambio en las relaciones como los efectos sobre el huevo luego de la suplementaci´on con CLA. 5

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La presente invenci´on proporciona un huevo que tiene mayores niveles de a´cido linoleico conjugado en comparaci´on con un huevo no mejorado, donde el huevo mejorado con CLA no muestra los efectos adversos que se observaron anteriormente en las yemas de los huevos que pon´ıan las gallinas a las que se suministraba una dieta enriquecida con CLA del documento de patente de Estados Unidos N◦ 5.504.114. Un huevo que tiene un mayor nivel de CLA es aqu´el para el cual al menos alrededor del 1 %, preferiblemente al menos alrededor del 1,5 % del total de los a´cidos grados, es CLA. M´ as preferiblemente, tanto como aproximadamente el 2 % —o un porcentaje mayor a´ un— de los a´cidos grasos totales es CLA. Los huevos de la presente invenci´on que tienen un aspecto normal se caracterizan por tener una yema amarilla que permanece l´ıquida cuando se almacenan a una temperatura superior a los 0◦ C (32◦F) e inferior a as, las relaciones de ´acidos grasos 16:0/16:1 y 18:0/18:1 la temperatura ambiente de 21◦ C (70◦ F). Adem´ vuelven a las relaciones que se observan en los huevos que no tienen mayores niveles de CLA. Las relaciones 16:0/16:1 y 18:0/18:1 se alteran en los huevos que tienen mayores niveles de CLA, de acuerdo con el documento de patente de los Estados Unidos N◦ 5.504.114. Los huevos de la presente invenci´on tambi´en on con los huevos mejorados tienen una viscosidad a 4◦ C (40◦F) de alrededor de 780 cps en contraposici´ con CLA del documento de patente de Estados Unidos N◦ 5.504.114, que poseen una viscosidad elevada de 1300 cps aproximadamente. El valor del pH del albumen de los huevos de la presente invenci´ on almacenados durante 2 semanas a 16◦ C (60◦F) tambi´en est´a comprendido entre alrededor de 8,9 y 9,0. Por el contrario, los huevos mejorados con CLA del documento de patente de los Estados Unidos N◦ 5.504.114, tienen un pH de albumen reducido, de aproximadamente 8,55. Del mismo modo, el pH de la yema de los huevos de la presente invenci´on es, como en los huevos “normales”, de aproximadamente 6,0. Los huevos mejorados con CLA del documento de patente de Estados Unidos N◦ 5.504.114 tienen un pH de la yema elevado, de 7,34 aproximadamente. La distribuci´on (en peso) de la yema y del albumen en los huevos de la presente invenci´ on tambi´en es t´ıpica de huevos “normales”, no mejorados con CLA. El porcentaje en peso del albumen en los huevos de la presente invenci´ on est´a comprendido entre alrededor del 60 y 62 %, mientras que los huevos del documento de patente de los Estados Unidos N◦ 5.504.114 tienen solamente cerca del 52 % de albumen (despu´es de estar almacenados a 10◦C (50◦ F) durante 3 meses). El contenido porcentual de la yema de los huevos de la presente invenci´on es de aproximadamente 25-28 %, mientras que un porcentaje elevado (cerca del 35 %) de los huevos mejorados con CLA de la patente anterior, es atribuible a la yema. La invenci´on tambi´en consiste en un m´etodo para producir el huevo, en el que el m´etodo comprende las etapas de: (1) administrar CLA a una gallina ponedora, en una cantidad eficaz para aumentar el porcentaje de CLA en los huevos que pone la gallina ponedora (como un porcentaje de los a´cidos grasos totales); y (2) administrar a la gallina ponedora una cantidad de al menos un a´cido graso insaturado, no conjugado, eficaz para contrarrestar los efectos adversos que se observaron en los huevos enriquecidos con CLA. Por la expresi´on “gallina ponedora” debe entenderse una gallina capaz de producir y poner huevos. Las gallinas ponedoras que se utilizaron en los ejemplos fueron pollas. Sin embargo, es razonable esperar que la presente invenci´on pueda ponerse en pr´ actica empleando cualquiera de las especies av´ıcolas cuyos huevos son aptos para consumo de los seres humanos, incluso los pavos, gansos, codornices, patos, avestruces y otros. El CLA puede administrarse oralmente en cantidades superiores a 0,05 % en peso aproximadamente de la dieta. En estas cantidades, los huevos que pone el ave est´an enriquecidos con CLA (hasta un nivel tan alto como de 90 mg de CLA/huevo aproximadamente). Estas cantidades tambi´en hacen que los huevos puestos por la hembra no saquen cr´ıa. No obstante, dado que los a´cidos linoleicos conjugados son ingredientes alimenticios naturales y relativamente no t´ oxicos, la cantidad administrable no es cr´ıtica, siempre y cuando sea suficiente para que sea eficaz. Una cantidad preferida de CLA es de 0,5 % en peso de la dieta aproximadamente. A pesar de que el CLA en un porcentaje aproximado del 15 % en peso de la dieta es un l´ımite superior pr´ actico, es posible a˜ nadir el CLA en una cantidad superior al 15 %, sin que se produzca un efecto adverso evidente en el ave o el huevo. El a´cido graso insaturado, no conjugado, es un a´cido graso que tiene una o m´as enlaces dobles. Los a´cidos grasos preferidos son los ´acidos grasos poliinsaturados y monoinsaturados, m´as preferiblemente, el ´acido palmitoleico (16:1), el a´cido oleico (18:1), el a´cido linoleico (9 cis-, 12 cis, 18:2) y el a´cido linol´enico 4

ES 2 192 041 T3 {18:3 (n=3 o n=6)}. Una cantidad eficaz de a´cido graso insaturado, no conjugado, en la dieta del presente m´etodo fluct´ ua entre 0,05 y 15 % en peso de la dieta, preferiblemente, se aproxima al 5 % en peso de la dieta. El a´cido graso puede comprender un solo ´acido graso o mezclas de dos o m´ as ´acidos grasos y puede derivar de fuentes animales o vegetales. 5

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El o los ´acidos grasos insaturados, no conjugados se pueden administrar v´ıa oral, en forma de uno o m´as aceites que tengan alto contenido de a´cidos grasos insaturados, no conjugados. La adici´ on de aceite de oliva, aceite de canola o aceite de ma´ız a la dieta, supera el efecto del CLA sobre la capacidad de sacar cr´ıa y el aspecto de la yema del huevo. Como estos aceites son ricos en los ´acidos grasos preferidos, se anticipa que podr´ıa utilizarse cualquier aceite o grasa rico en ´acidos grasos C16:1, C18:1 o ´acidos grasos C18:2 o C18:3 no conjugados en la pr´ actica de la presente invenci´on. La tabla 9-9 de los Requerimientos de nutrientes de las aves de corral, Novena Edici´ on Revisada, National Academy Press (1994) detalla el porcentaje de ´acidos grasos seleccionados en diversos aceites y grasas vegetales y animales que pueden emplearse para un pienso de las aves de corral. Cualquiera de las grasas o aceites que all´ı se detallan, puede usarse como una fuente de a´cido graso insaturado, no conjugado deseable cuando se formula un pienso animal adecuado, de acuerdo con la presente invenci´ on. Los aceites preferidos incluyen el aceite de ma´ız, aceite de Canoga y aceite de oliva y las mezclas de los mismos. La invenci´on tambi´en consiste en un pienso que resulta de utilidad en el m´etodo. El pienso de la presente invenci´on comprende CLA en una cantidad eficaz para aumentar el porcentaje de CLA en los huevos de una gallina ponedora (como un porcentaje de los a´cidos grasos totales) y una cantidad de al menos un a´cido graso no conjugado, insaturado, eficaz para contrarrestar los efectos adversos que se observaron en los huevos enriquecidos con CLA. El pienso puede tener las propiedades de la “cebo” que describe el documento de patente de los Estados Unidos N◦ 5.504.114. El pienso puede ser cualquier pienso convencional para aves de corral suplementado con suficiente CLA y ´acido graso eficaz para lograr la composici´on de a´cido graso deseada. Los aceites y grasas vegetales y animales indicados con anterioridad en la Tabla 9-9 de Requerimientos de nutrientes de las aves de corral incluso, aunque sin limitarse a ellos, el aceite de oliva, aceite de ma´ız y aceite de Canoga, son fuentes adecuadas de a´cidos grasos. En los ejemplos, el pienso comprende alrededor del 0,5 % de CLA y entre 1 y 10 % aproximadamente de aceite de oliva o entre 1 y el 10 % aproximadamente de aceite de ma´ız. Esto equivale a suplementar el pienso con, aproximadamente, 0,1 a 7 % de a´cido oleico, aproximadamente 0,1 % de palmitoleato y aproximadamente 0,1 a 1 % de linoleato. Los ejemplos demuestran asimismo que los huevos que producen las gallinas ponedoras alimentadas con una dieta suplementada con CLA y aceite de ma´ız, no mostraron endurecimiento de la yema del huevo ni un menoscabo en la capacidad de producir cr´ıas. Las formas de a´cidos libres del CLA pueden prepararse por isomerizaci´ on del a´cido linoleico. El CLA se puede sintetizar tal como lo describe el Ejemplo 1 del documento de patente de Estados Unidos N◦ 5.504.114. El CLA tambi´en puede prepararse a partir del a´cido linoleico, por la acci´ on de una isomerasa del a´cido linoleico de un microorganismo inofensivo, tal como la bacteria del rumen butyrivibrio fibrisolvens. Los microorganismos inofensivos presentes en los tractos intestinales de las ratas y otros animales monog´ astricos tambi´en pueden convertir al a´cido linoleico en CLA. S. F. Chin, J. M. Storkson, W. Liu, K. Albright y M. W. Pariza, 1994, J. Nutr. 128:694-7∼1. El CLA que se obtiene mediante la implementaci´on de los m´etodos de preparaci´ on descritos, contiene uno o m´ as de los ´acidos 9,11-octadecadienoicos y/o ´acidos 10,12-octadecadienoicos e is´ omeros activos de los mismos. Puede estar libre o qu´ımicamente unido por medio de enlaces de ´ester. El CLA es termoestable y se puede emplear tal como est´a o se puede desecar y pulverizar. El CLA se convierte f´ acilmente en una sal no t´ oxica, tal como la sal de potasio o sodio, haciendo reaccionar cantidades qu´ımicamente equivalentes del ´acido libre con un hidr´ oxido alcalino, a un pH de entre 8 y 9 aproximadamente. Las formas activas del CLA incluyen, adem´as de los ´acidos libres: los is´omeros conjugados de CLA; sales no t´oxicas de los mismos; ´esteres activos y otros derivados qu´ımicos activos de los mismos; y las mezclas de los mismos.

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Los is´omeros posicionales conjugados del CLA son a´cidos 9,11- y 10,12-octadecadienoicos. Te´oricamente, se formar´ıan 8 is´ omeros geom´etricos de los dos is´ omeros posicionales (c9, c11; c9, t11; t9, c11; t9, t11; c10, c12; c10, t12; t10, c12 y t10, t12). Como resultado de la isomerizaci´ on, s´ olo cuatro is´omeros ser´ıan de esperar, a saber c9, c11; c9, t11; t10, c12; y c10, c12). No obstante, como resultado de las caracter´ısticas coplanares de los 5 ´atomos de carbono alrededor de un doble enlace conjugado y el conflicto espacial del radical de resonancia, el a´cido linoleico produce predominantemente dos is´ omeros el acido c9,t11 y t10,c12-octadecadienoico, cuando se autooxida o se somete a isomerizaci´on alcalina. Los ´ 5

ES 2 192 041 T3 dos is´omeros c,c restantes son contribuyentes menores.

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La distribuci´on relativamente alta de los is´ omeros t,t del ´acido 9,11 o´ 10,12-octadecadienoico aparentemente resulta de la estabilizaci´on adicional de los is´omeros geom´etricos c9,t11 o´ t10,c12-, la cual se prefiere termodin´ amicamente, durante un tiempo de procesamiento m´ as prolongado. Asimismo, el is´ omero t,t del a´cido 9,11 o 10,12-octadecadienoico que se form´o predominantemente durante la isomerizaci´on de los is´omeros geom´etricos del ´acido linoleico (´acido t9,t12-, c9,t12- y ´acido 9,c12-octadecadienoico) puede influir en la relaci´ on final de los is´ omeros o el contenido de CLA final en las muestras.

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Los is´omeros geom´etricos del ´acido linoleico tambi´en influyen en la distribuci´ on de los contribuyentes menores (is´ omeros c,c de los ´acidos 9,11- y 10,12-, t9,c11- y c11,t12-octadecadienoicos). El is´omero 11,13puede producirse como un producto secundario, a partir del a´cido c9,c12-octadecadienoico o a partir de sus formas isom´ericas durante el procesamiento.

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Los t´erminos “´acidos linoleicos conjugados” y “CLA”, tal como se los emplea en la presente, incluyen al a´cido 9,11-octadecadienoico, al a´cido 10,12-octadecadienoico, las mezclas de los mismos y las sales no t´ oxicas de los ´acidos. Las sales no t´oxicas de los ´acidos de CLA libres pueden prepararse haciendo reaccionar los ´acidos libres con una base no t´ oxica.

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Aquella persona que desee producir un huevo que comprenda un mayor nivel de CLA, puede comenzar por alimentar a las gallinas ponedoras con una dieta suplementada con CLA y ´acido graso C18:1 o C16:1, entre aproximadamente 1 y 7 d´ıas antes de la recolecci´on de huevos. Preferiblemente la dieta suplementada con CLA y ´acido graso insaturado se administra a las gallinas ponedoras al menos unos 7 d´ıas antes aproximadamente de la recolecci´on de huevos.

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Los siguientes ejemplos no restrictivos cumplen prop´ositos puramente ilustrativos. Ejemplos 30

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Efecto de la dieta sobre los huevos Cuatro grupos de 15 gallinas ponedoras recibieron dietas suplementadas con 0,5 % de aceite de ma´ız, 0,5 % de CLA; 0,5 % de aceite de ma´ız y 10 % de aceite de oliva; o´ 0,5 % de CLA y 10 % de aceite de oliva. Si bien los huevos producidos por las gallinas que recibieron dietas suplementadas con CLA se caracterizan por yemas duras y un color rojo, estos efectos adversos en los huevos se contrarrestan cuando las gallinas alimentadas con CLA tambi´en reciben ´acidos grasos mono- o poliinsaturados suplementarios en la dieta. Adem´as de las caracter´ısticas mejoradas de la yema, la adici´on de las grasas mono- o poliinsaturadas en la dieta tambi´en contrarresta la menor capacidad de sacar cr´ıa de los huevos fecundados producidos por las gallinas que reciben una dieta suplementada con CLA. Si bien la capacidad de sacar cr´ıa que denotan los huevos producidos por las gallinas alimentadas con las dietas suplementadas con CLA se reduce dr´ asticamente, la suplementaci´on de la dieta de las gallinas alimentadas con CLA con 10 % de aceite de oliva, ma´ız o Canoga, contrarresta el efecto del CLA sobre la capacidad de sacar cr´ıa (Tabla 1 y Figura 1). Comenzando el primer d´ıa de la iniciaci´ on de la suplementaci´on dietaria, se recolectaron los huevos fecundados y se incubaron en condiciones de incubaci´ on adecuadas. Se determinaron los porcentajes de huevos que finalmente sacaron cr´ıa para cada grupo y para cada d´ıa de la recolecci´on.

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ES 2 192 041 T3 TABLA 1 Porcentaje total de la capacidad de producir cr´ıa 5

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D´ıa de alimentaci´on

Grupo con aceite de ma´ız

Grupo con CLA

Grupo con aceite de ma´ız + aceite de oliva

Grupo con CLA + aceite de oliva

1

71,43

87,5

100,0

100,0

2

100,0

90,9

90,0

77,7

3

71,43

60,0

91,67

80,0

4

90,91

53,85

100,0

100,0

5

83,33

25,0

86,67

90,91

6

72,73

00,0

88,89

57,14

7

85,71

00,0

100,0

77,78

8

87,5

00,0

91,67

100,0

9

92,31

00,0

92,31

91,67

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25

30

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ES 2 192 041 T3 REIVINDICACIONES

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1. Un m´etodo para producir un huevo de ave que tiene un mayor nivel de a´cido linoleico conjugado (CLA) con respecto a un huevo no tratado y que por lo dem´ as, tiene un aspecto normal, comprendiendo el citado m´etodo las siguientes etapas: administrar CLA a una gallina ponedora en una cantidad eficaz para aumentar el porcentaje de CLA en los huevos puestos por la gallina ponedora, como un porcentaje de a´cidos grasos totales;

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administrar a la gallina ponedora una cantidad de al menos un a´cido graso no conjugado, insaturado, eficaz para producir un huevo que tenga una yema que permanezca l´ıquida cuando se enfr´ıa a una temperatura superior a 0◦ C (32◦ F) e inferior a la temperatura ambiente de 21◦ C (70◦ F); y permitir que la gallina ponedora ponga un huevo que tiene un mayor nivel de a´cido linoleico conjugado con relaci´on a un huevo no tratado y una yema que permanezca l´ıquida cuando se enfr´ıa a una temperatura superior a 0◦ C (32◦F) e inferior a la temperatura ambiente de 21◦C (70◦ F). 2. El m´etodo de acuerdo con la reivindicaci´on 1, en el que el a´cido graso no conjugado, insaturado, se administra en una cantidad eficaz para producir un huevo que tiene una yema que permanece l´ıquida cuando se enfr´ıa a 16◦ C (60◦ F). 3. El m´etodo de acuerdo con la reivindicaci´on 1 o´ 2, en el que la gallina ponedora se alimenta con el a´cido linoleico conjugado y el a´cido graso no conjugado, insaturado, durante al menos aproximadamente un d´ıa antes de poner el huevo.

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4. El m´etodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el a´cido linoleico conjugado se provee en un pienso que comprende al menos 0,05 % aproximadamente de CLA como un porcentaje de la dieta en peso. 5. El m´etodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el alimento de a´cido graso insaturado se provee en un pienso que comprende al menos alrededor de 0,05 % de un ´acido graso no conjugado, insaturado, como un porcentaje de la dieta en peso. 6. El m´etodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el a´cido graso no conjugado, insaturado, se selecciona de un grupo que consiste en un a´cido graso poliinsaturado y uno monoinsaturado. 7. El m´etodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el a´cido graso no conjugado, insaturado, se selecciona de un grupo que consiste en un a´cido graso 16:1, un a´cido graso 18:1, un a´cido graso 18:2 no conjugado y un a´cido graso 18:3 no conjugado. 8. El m´etodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el CLA administrado se selecciona de un grupo que consiste en un a´cido libre, una sal no t´ oxica del mismo, un ´ester del mismo, un derivado qu´ımico del mismo y sus mezclas.

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9. Un huevo en el que al menos el 1 % de los ´acidos grasos totales es ´acido linoleico conjugado y que tiene una yema que permanece l´ıquida cuando se enfr´ıa a m´as de 0◦ C (32◦ F) y a menos de la temperatura ambiente de 21◦C (70◦ F). 10. Un huevo de acuerdo con la reivindicaci´on 9, produci´endose el huevo mediante el m´etodo de acuerdo con la reivindicaci´ on 1. 11. Un huevo de acuerdo con las reivindicaciones 9 o´ 10, que tiene una yema l´ıquida cuando se enfr´ıa a una temperatura comprendida entre 0◦ C (32◦ F) y 16◦ C (60◦ F).

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12. Un huevo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que tiene una yema que permanece l´ıquida cuando se enfr´ıa a 16◦ C (60◦F). 13. Un huevo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que al menos el 1,5 % de los ´acidos grasos totales es ´acido linoleico conjugado. 14. Un huevo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que la yema es amarilla. 8

ES 2 192 041 T3

15. Un huevo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, que tiene una relaci´ on de acido graso de 16:0/16:1 de un huevo que no posee el nivel de CLA mejorado. ´ 5

16. Un huevo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, que tiene una relaci´ on de acido graso de 18:0/18:1 de un huevo que no posee el nivel de CLA mejorado. ´

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17. Un pienso para aves de corral que comprende una cantidad de a´cido linoleico conjugado (CLA) eficaz para aumentar el porcentaje de CLA en los huevos que pone una gallina ponedora, como un porcentaje de a´cidos grasos totales, y un ´acido graso no conjugado, insaturado, eficaz para permitir que un ave alimentada con el ´acido graso produzca un huevo que tenga una yema que permanezca l´ıquida cuando se enfr´ıa a 16◦ C (60◦ F).

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18. El pienso para aves de corral de acuerdo con la reivindicaci´ on 17, en el que el pienso comprende por lo menos 0,5 % aproximadamente de CLA y por lo menos 0,5 % aproximadamente de un a´cido graso no conjugado, insaturado.

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19. El pienso para aves de corral de acuerdo con las reivindicaciones 17 o´ 18, en el que el ´acido graso no conjugado, insaturado se selecciona de un grupo que consiste en un a´cido graso 16:1, un a´cido graso 18:1, un a´cido graso 18:2 no conjugado y un a´cido graso 18:3 no conjugado. 20. El pienso para aves de corral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el CLA se selecciona de un grupo que consiste en un ´acido libre, una sal no t´ oxica del mismo, un ´ester del mismo, un derivado qu´ımico del mismo y sus mezclas.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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