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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 080 939 kInt. Cl. : A61K 9/50

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˜ ESPANA

C12N 11/04 B01J 13/04

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 91903047.8 kFecha de presentaci´on : 08.01.91 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 462 269 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 27.12.91

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54 T´ıtulo: M´ etodo para encapsular c´ elulas y aparato.

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73 Titular/es:

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72 Inventor/es: Aebischer, Patrick y

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Fernando

30 Prioridad: 08.01.90 US 461999

Brown University Research Foundation 42 Charlesfield Street, P.O. Box 1949 Providence, RI 02912, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.02.96

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

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16.02.96

Aviso:

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Wahlberg, Lars

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION Antecedentes de la invenci´ on El campo t´ecnico de esta invenci´on se refiere a la encapsulaci´on de c´elulas vivas para la producci´ on de factores biol´ogicamente activos. Existe en la actualidad considerable inter´es en los productos biol´ ogicamente activos de c´elulas vivas, que incluyen, por ejemplo, neurotransmisores, hormonas, citokinas, factores de crecimiento nervioso, factores de angiog´enesis, factores de coagulaci´on sangu´ınea, linfokinas, enzimas y otros agentes terap´euticos. Existe tambi´en un inter´es sustancial en desarrollar nuevos m´etodos y sistemas para producir tales factores biol´ ogicos, as´ı como en suministrar estos factores a sujetos, con fines terap´euticos. Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson est´ a caracterizada por la degeneraci´on del sistema nigroestriatal dopamin´ergico. Se ha informado de que la implantaci´ on estriatal de varillas de pol´ımero que liberan cantidades sostenidas de un neurotransmisor, dopamina, alivia el parkinsonismo experimental en roedores, indicando que la liberaci´on de s´ olo dopamina en la estructura diana adecuada puede ser capaz de corregir esta deficiencia funcional. En contraste con la capacidad limitada de un sistema de liberaci´on de f´ armaco a base de una matriz pol´ımera, se han propuesto c´elulas liberadoras de dopamina, encapsuladas, como un medio de proporcionar un suministro continuo de neurotransmisores. La encapsulaci´ on de c´elulas secretoras de neurotransmisores mediante una membrana permeoselectiva que permita la difusi´ on del factor biol´ ogico puede no s´ olo impedir el escape de c´elulas mit´oticamente activas, sino tambi´en evitar el rechazo por el hu´esped en el caso de trasplante entre especies. Algunos investigadores han propuesto el empleo de microc´apsulas – peque˜ nas esferas que encapsulan una gotita microsc´ opica de una soluci´on con c´elulas – tanto con fines de implante terap´eutico como para la producci´ on a gran escala de productos biol´ ogicos. Sin embargo, existen varios inconvenientes para esta aproximaci´on de microencapsulaci´on: las microc´apsulas pueden ser extremadamente dif´ıciles de manejar (y de recuperar despu´es de implantadas); su volumen es limitado; y los tipos de materiales encapsulantes que pueden utilizarse est´an restringidos (a causa del procedimiento de formaci´on) a pol´ımeros que puedan disolverse en disolventes biocompatibles. Una aproximaci´on alternativa ha sido la macroencapsulaci´on, que implica t´ıpicamente cargar c´elulas en fibras huecas y despu´es cerrar las aberturas de ambos extremos con una cola pol´ımera. En contraste con las microc´apsulas, las macroc´apsulas ofrecen la ventaja de una f´ acil recuperabilidad, lo cual constituye una caracter´ıstica importante en implantes terap´euticos (especialmente neurales). Sin embargo, la construcci´ on de macroc´apsulas ha sido a menudo tediosa en el pasado, y ha requerido gran cantidad de mano de obra. Adem´ as, a causa de la falta de fiabilidad del cierre, los m´etodos convencionales de macroencapsulaci´on han proporcionado resultados inconsistentes. 2

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Las perlas que contienen c´elulas divulgadas en el documento GB-A-2 192 171 se producen utilizando una soluci´ on de alginato para encapsular una suspensi´on de c´elulas en un medio de cultivo acuoso. La soluci´ on de alginato es aportada a trav´es de una corona circular formada por dos orificios conc´entricos, siendo aportada la suspensi´ on de c´elulas a trav´es del orificio interior. La suspensi´ on de c´elulas y la soluci´ on de alginato son coextruidas para formar gotitas que son expulsadas por soplado del extremo de la aguja mediante un sistema coaxial de aire. Cada gotita cae en un olo enba˜ no de curado (por ejemplo CaCl2 ), y s´ tonces gelifica o coagula el alginato para formar una envoltura exterior firme. A continuaci´ on se cambia el ba˜ no de curado a un tamp´ on que contiene glioxal, el cual atraviesa la envoltura de alginato y reticula un pre-pol´ımero (por ejemplo PAAH) presente en la suspensi´ on de c´elulas. La morfolog´ıa del encapsulado producido mediante esta tecnolog´ıa es una perla que tiene una esfera interior constituida por una suspensi´ on celular reticulada, conc´entrica a una esfera exterior de alginato. Los sistemas de reactivos se eligen de manera tal que tanto los componentes de alginato como los de pol´ımero precipiten cada uno lentamente, sirviendo el ba˜ no de curado para asegurar que la formaci´on de la envoltura de alginato se produce en el ba˜ no. La necesidad de facilitar la precipitaci´ on de la envoltura de alginato en el ba˜ no de curado en lugar de en el orificio de extrusi´ on surge del deseo de conseguir que la soluci´on de alginato rodee por completo a la suspensi´ on de c´elulas (por ejemplo gracias a la tensi´on superficial) antes de que se endurezca, y producir de este modo una perla esf´erica cerrada por completo. En consecuencia, el m´etodo de la t´ecnica anterior est´a espec´ıficamente dise˜ nado para dar tiempo a que la soluci´on de alginato rodee el material del n´ ucleo antes de la solidificaci´ on, se establezca la morfolog´ıa de la perla durante la ca´ıda de la gotita desde la aguja, y se estabilice en el ba˜ no de curado. Patent Abstracts of Japan, volumen 11, n´ umero 315 (C-451) (2762), de 14 de octubre de 1987, divulga que desde una boquilla se pulverizan en una soluci´ on de agente gelificante gotas de una suspensi´on de c´elulas y agente formador de pel´ıcula. El documento GB-A-1 538 510 ense˜ na que primeramente se dejan conformar en esferas gotas de encapsulado, antes de que se endurezca el material de pel´ıcula que rodea la c´apsula. Por ejemplo, se indica que a medida que la corriente de chorro se mueve hacia abajo, es estrangulada o estrechada, y es cortada gota a gota de manera tal que forma c´ apsulas esf´ericas de di´ametro uniforme. Existe una necesidad de mejores t´ecnicas para la macroencapsulaci´on de c´elulas, tanto con fines de implante terap´eutico como de producci´ on industrial. T´ecnicas de encapsulaci´on que puedan ser practicadas de una manera automatizada, y que permitan el empleo de un abanico m´ as amplio de materiales y/o proporcionen un cierre m´ as fiable, satisfar´ıan una necesidad que se percibe desde hace tiempo en la t´ecnica.

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Sumario de la invenci´ on Se divulgan m´etodos y sistemas para encapsular c´elulas viables que producen factores biol´ ogicamente activos. Las c´elulas son encapsuladas dentro de una membrana pol´ımera semipermeable coextruyendo una suspensi´ on acuosa de c´elulas y una soluci´ on pol´ımera a trav´es de una abertura com´ un para formar un extrusionado tubular que tiene un revestimiento externo pol´ımero que encapsula la suspensi´ on de c´elulas. En un aspecto de la invenci´ on se divulgan m´etodos en los cuales la suspensi´on de c´elulas y la soluci´on pol´ımera son extruidas a trav´es de una abertura de extrusi´ on com´ un que tiene al menos dos orificios conc´entricos, de manera tal que la suspensi´on de c´elulas es extruida a trav´es del orificio interior y la soluci´ on pol´ımera es extruida a trav´es del orificio exterior. La soluci´on pol´ımera coagula para formar un revestimiento externo. As´ı, m´ as espec´ıficamente, la invenci´ on proporciona un m´etodo para encapsular c´elulas viables, comprendiendo el m´etodo coextruir una suspensi´ on acuosa de c´elulas y una soluci´ on pol´ımera a trav´es de una abertura de extrusi´ on com´ un que tiene orificios interior y exterior de los cuales salen respectivamente la suspensi´on y la soluci´ on pol´ımera, coagul´ andose dicha soluci´ on, al ser coextruida a trav´es de la abertura, para formar un extrusionado tubular que tiene un revestimiento externo pol´ımero semipermeable que encapsula dicha suspensi´ on de c´elulas. A medida que se forma el revestimiento externo, los extremos del extrusionado tubular pueden ser cerrados para formar una c´ apsula de c´elulas. En una realizaci´ on ilustrada, el extrusionado tubular es cerrado a intervalos para definir compartimientos de c´elulas separados, conectados por uniones pol´ımeras. Las cadenas de c´ apsulas de c´elulas formadas de este modo tienen varias ventajas sobre los productos encapsuladores de c´elulas convencionales. La forma multicompartimentada asegura que las roturas de la membrana tubular pueden ser contenidas a c´apsulas individuales de c´elulas. Adem´ as, el dise˜ no es particularmente ventajoso para preparar cultivos celulares implantables, para suministrar factores biol´ ogicamente activos a un sujeto, con fines terap´euticos. La cadena de c´ apsulas de c´elulas puede ser arrollada, retorcida o configurada de otro modo de diversas formas a fin de proporcionar una estructura densa y compacta para el implante. Puesto que las c´apsulas de c´elulas est´an unidas entre s´ı, pueden ser recuperadas f´ acilmente, en caso necesario, tras el implante. La naturaleza en forma de cadena de estos productos es particularmente preferible a las microc´apsulas esf´ericas individuales que t´ıpicamente son recuperadas mediante aspiraci´on (lo que a menudo da como resultado un elevado porcentaje de c´apsulas irrecuperables y, en consecuencia, inflamaci´on en el sujeto). Las cadenas de c´apsulas de c´elulas multicompartimentadas pueden formarse a partir del extrusionado tubular de la presente invenci´ on cerrando el extrusionado a intervalos, mediante el empleo de diversas t´ecnicas. Por ejemplo, el extrusionado puede ser cerrado comprimi´endolo a intervalos por medio de fuerza mec´anica o neu-

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m´atica. De manera alternativa, puede modificarse la presi´on a la cual son extruidas la suspensi´ on de c´elulas o la soluci´ on pol´ımera, para colapsar el extrusionado tubular a intervalos y definir compartimientos de c´elulas separados. En otra t´ecnica adicional, puede interrumpirse o impedirse de otro modo a intervalos el flujo de la suspensi´on de c´elulas para colapsar de manera similar el extrusionado tubular y definir compartimientos de c´elulas. Los productos de la presente invenci´on son particularmente id´ oneos para ser empleados en dispositivos de implante terap´euticos tales como los divulgados en la patente de EE.UU. 4.892.538, “In vivo Delivery of Neurotransmitters By Implanted, Encapsulated Cells” de Aebischer y otros, expedida el 9 de enero de 1990, incorporada en la presente por referencia. En la patente de EE.UU. 4.892.538 se divulgan t´ecnicas para implantar c´elulas secretoras de neurotransmisores, encapsuladas, en una regi´ on diana dentro del cerebro de un sujeto, de manera tal que las c´elulas encapsuladas segregan un neurotransmisor y de este modo permiten el suministro constitutivo de un agente terap´eutico a fin de tratar una deficiencia neurol´ogica, tal como la enfermedad de Parkinson. De manera alternativa, tambi´en pueden construirse o´rganos artificiales capaces de segregar otros factores biol´ogicos, tales como hormonas (por ejemplo insulina, factores t´ımicos y similares) empleando los extrusionados tubulares y cadenas de c´ apsulas de c´elulas multicompartimentadas de la presente invenci´ on. Las c´apsulas de c´elulas son id´ oneas tambi´en para el empleo en biorreactores y otros sisteon de mas de cultivo in vitro, para la producci´ f´ armacos y otros materiales biol´ogicos u ´ tiles. En tales aplicaciones, se encapsulan c´elulas que producen tales materiales, sea naturalmente, por mutaci´on o por dise˜ no recombinante, y se deja que sinteticen los materiales, que pueden ser recogidos despu´es de la secreci´on a un medio de cultivo circulante. De manera alternativa pueden acumularse los materiales biol´ogicos dentro de las c´apsulas de c´elulas (por ejemplo mediante el adecuado control de la porosidad) y despu´es son cosechados extrayendo del medio de cultivo las cadenas, lisando las membranas pol´ımeras y recuperando en forma concentrada los materiales sintetizados. El revestimiento pol´ımero es preferentemente una membrana semipermeable, es decir, una estructura porosa capaz de proteger las c´elulas trasplantadas de un asalto autoinmune o v´ırico, as´ı como de otros agentes nocivos del ambiente externo, mientras que permiten que se difundan a trav´es de la misma los nutrientes esenciales, los productos de desecho celulares, y las secreciones celulares. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresi´ on “selectivamente permeable” o “semipermeable” se emplea para describir membranas biocompatibles que permiten la difusi´ on a trav´es de las mismas de solutos que tienen un peso molecular de hasta aproximadamente 150.000. La permeabilidad del revestimiento pol´ımero puede hacerse variar controlando la viscosidad de la soluci´on pol´ımera, de manera tal que, al producirse la coagulaci´ on, se forme el revestimiento con una red de microcanales que proporcionen ca3

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minos de difusi´ on. En una realizaci´ on, esto puede conseguirse empleando un disolvente miscible con agua como uno de los componentes de la soluci´ on pol´ımera, y manteniendo una diferencia de presiones entre la suspensi´on acuosa de c´elulas y la soluci´on pol´ımera durante la extrusi´ on. A medida que se forma el extrusionado tubular, el agua procedente de la suspensi´on acuosa de c´elulas se infiltra en el pol´ımero que se est´a coagulando para reemplazar al disolvente a medida que el disolvente est´a siendo impelido hacia afuera por la diferencia de presiones. Al producirse la coagulaci´ on, el agua que se ha infiltrado en el revestimiento pol´ımero proporciona una red de poros. La presi´ on y viscosidad o´ptimas variar´an, naturalmente, con el disolvente y pol´ımero empleados, pero pueden ser determinadas f´acilmente para cualquier combinaci´ on particular de pol´ımero y disolvente por aquellas personas experimentadas en la t´ecnica sin una experimentaci´on excesiva. En otro aspecto de la invenci´ on se divulgan sistemas para encapsular c´elulas a fin de producir el extrusionado tubular y los productos de c´apsulas de c´elulas multicompartimentadas descritos anteriormente. Este sistema puede incluir un conjunto de cabezal de extrusi´ on (por ejemplo una hilera o similar) que tenga un primer orificio interior y un segundo orificio exterior, conc´entrico, as´ı como un medio de aportaci´ on de suspensi´on de c´elulas para aportar la suspensi´ on acuosa de c´elulas al orificio interior del conjunto de cabezal de extrusi´ on, y un medio de aportaci´ on de soluci´on pol´ımera para aportar la soluci´ on pol´ımera al orificio exterior del conjunto de cabezal de extrusi´ on. A medida que se coextruyen la suspensi´on de c´elulas y la soluci´ on pol´ımera, forman un extrusionado tubular que tiene un revestimiento externo pol´ımero que encapsula la suspensi´ on de c´elulas. Tales sistemas pueden ser realizados de acuerdo con un aspecto adicional de la invenci´ on en un aparato para encapsular c´elulas viables, que comprende: un conjunto de cabezal de extrusi´on que tiene al menos un primer orificio interior y un segundo orificio exterior, conc´entrico; medios de aportaci´ on de suspensi´on de c´elulas para aportar una suspensi´ on acuosa de c´elulas al orificio interior de dicho conjunto de cabezal de extrusi´ on; medios de aportaci´ on de soluci´ on pol´ımera para aportar una soluci´ on pol´ımera al orificio exterior del conjunto de cabezal de extrusi´ on, y medios de diferencia de presiones para proporcionar una diferencia positiva de presiones entre la suspensi´ on de c´elulas y la soluci´ on pol´ımera durante el curso de la extrusi´on, de manera tal que dicha suspensi´ on de c´elulas y dicha soluci´ on pol´ımera, al ser coextruidas desde dicho conjunto de cabezal, forman un extrusionado tubular que tiene un revestimiento exterior pol´ımero coagulado que encapsula dicha suspensi´ on de c´elulas, impeliendo durante el funcionamiento dicha diferencia positiva de presiones disolvente de pol´ımero hacia afuera, 4

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alej´ andole de la suspensi´ on de c´elulas durante la coagulaci´ on. 5

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El extrusionado tubular puede ser cerrado a intervalos por cualquiera de una serie de diversos mecanismos. En una realizaci´on ilustrada, dos ruedas con elementos oclusores en su periferia cooperan en rotaci´ on para estrangular peri´ odicamente el extrusionado tubular y cerrarlo de este modo. Este sistema de compresi´on mec´anica puede ser sustituido por una diversidad de otros sistemas de compresi´on mec´anicos o neum´aticos para cerrar a intervalos el extrusionado tubular. De manera alternativa, el sistema puede incluir un medio de control del flujo para hacer variar la diferencia de presiones entre la suspensi´ on acuosa de c´elulas y la soluci´ on pol´ımera durante la coextrusi´on. Por ejemplo, cada uno de los medios de aportaci´ on de componentes puede incluir una bomba de infusi´ on que est´e gobernada mediante un ordenador u otro elemento de control. En el funcionamiento normal, las bombas de infusi´ on est´an controladas para mantener una diferencia de presiones entre la suspensi´ on acuosa de c´elulas y la soluci´on pol´ımera, de manera tal que el disolvente del pol´ımero es impelido hacia afuera durante la coagulaci´ on. Haciendo variar peri´ odicamente la presi´on, puede hacerse colapsar a intervalos el extrusionado tubular para definir compartimientos individuales de c´elulas. Esto puede conseguirse, por ejemplo, reduciendo la presi´ on de la soluci´ on acuosa. En algunos casos puede ser preferible interrumpir por completo el flujo de la soluci´on acuosa y crear un vac´ıo para asegurar un cierre completo entre compartimientos. Pueden emplearse de manera similar otras diversas t´ecnicas para interrumpir el flujo de la soluci´on acuosa a intervalos y provocar de este modo que el extrusionado tubular se colapse y forme compartimientos m´ ultiples. Por ejemplo, puede incorporarse un mecanismo de retracci´ on en el conjunto de cabezal de extrusi´ on para mover el orificio interno con respecto al orificio externo, de manera tal que se interrumpe a intervalos el flujo de la soluci´on acuosa para definir compartimientos de c´elulas separados. Los sistemas descritos en la presente invenci´on pueden incluir adem´ as un ba˜ no de agente de extinci´on para coagular la soluci´ on pol´ımera despu´es de la extrusi´ on, y diversos mecanismos para secar el extrusionado tubular a medida que emerge del cabezal de extrusi´ on, incluyendo soplantes, o c´amaras de evacuaci´ on. El conjunto de cabezal de extrusi´ on puede incorporar orificios adicionales para proporcionar m´ ultiples revestimientos o para aportar un fluido de extinci´on en torno al extrusionado tubular. El sistema puede incluir tambi´en una c´ amara de sedimentaci´on para la suspensi´ on de c´elulas, o un mecanismo equivalente de empaquetado de c´elulas, a fin de incrementar la densidad de c´elulas dentro de la suspensi´on acuosa de c´elulas. A continuaci´ on se describir´ a la invenci´ on en relaci´on con algunas realizaciones ilustradas; no obstante, debe estar claro que personas especializadas en la t´ecnica pueden hacer diversas adiciones, sustracciones o modificaciones, sin apartarse del esp´ıritu o alcance de la invenci´ on.

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Breve descripci´ on de los dibujos La figura 1 es un diagrama esquem´ atico general de un sistema para encapsular c´elulas viables de acuerdo con la invenci´on;

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la figura 2 es un diagrama esquem´ atico m´ as detallado de un conjunto de cabezal de extrusi´ on para ser empleado en el sistema de la figura 1;

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la figura 3 es un diagrama esquem´ atico de un conjunto alternativo de cabezal de extrusi´ on para ser empleado en el sistema de la figura 1; la figura 4 es un diagrama esquem´ atico de un mecanismo para cerrar peri´ odicamente un extrusionado tubular de acuerdo con la invenci´on, a fin de formar un veh´ıculo de cultivo celular multicompartimentado;

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la figura 5 es un diagrama esquem´ atico de un mecanismo para formar c´ apsulas de c´elulas “atadas”; la figura 6 es un gr´ afico que muestra la liberaci´on de dopamina en funci´ on del tiempo para c´apsulas que contienen c´elulas secretoras de dopamina producidas de acuerdo con la presente invenci´on con tres sistemas distintos de disolvente; la figura 7 es un gr´ afico que muestra la liberaci´on de dopamina por c´elulas PC12 en condiciones normales y bajo estimulaci´on con potasio a distintos tiempos despu´es de la encapsulaci´on de acuerdo con la invenci´ on; la figura 8A es un gr´ afico que muestra la liberaci´on de catecolaminas desde c´elulas PC12 encapsuladas; y

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la figura 8B es un gr´ afico que muestra la liberaci´on de catecolaminas desde c´elulas cromafines encapsuladas. 45

Descripci´ on detallada En la figura 1 se muestra un sistema 10 para producir un extrusionado tubular 12 de acuerdo con la presente invenci´on, que incluye un cabezal de extrusi´ on 14 que tiene un primer orificio (el m´as interno) 16, un segundo orificio exterior 18 y, opcionalmente, un tercer orificio (el m´as externo) 20. El sistema 10 incluye adem´as una aportaci´ on 22 de suspensi´on de c´elulas y una bomba asociada 24, una aportaci´ on 26 de soluci´ on de pol´ımero y una bomba asociada 28 y, opcionalmente, una aportaci´ on 30 de soluci´ on de enjuague con una bomba 32. Adem´ as, el sistema puede incluir tambi´en, opcionalmente, una aportaci´ on 34 de agente de extinci´on que fluye externamente, con una bomba asociada 36. Todos los elementos de bombeo pueden ser controlados manualmente o, con preferencia, mediante un controlador automatizado (por ejemplo un microprocesador) 38. El sistema 10 puede incluir tambi´en un ba˜ no de agente de extinci´on 40, que normalmente estar´ıa dispuesto directamente debajo del cabezal de extrusi´ on 14 durante el funcionamiento. De manera

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alternativa, el sistema puede incluir un soplante 41, o bien puede emplearse el sistema dentro de una c´ amara en la que se ha hecho el vac´ıo u otra c´amara a presi´on reducida, a fin de ayudar a la eliminaci´on del disolvente. Cuando se emplea el sistema 10 para conformar el extrusionado tubular en una cadena de c´apsulas de c´elulas multicompartimentadas, puede emplearse un medio de cierre. En la figura 1 se muestra uno de tales elementos de cierre 42, que incluye dos ruedas motorizadas 44A y 44B que tienen una serie de protuberancias 46 que cooperan durante la rotaci´ on para estrangular y cerrar peri´ odicamente el extrusionado tubular a medida que pasa entre las ruedas 44A y 44B. De manera alternativa, puede emplearse un medio de retracci´on 48 para retraer peri´ odicamente el orificio interior a fin de interrumpir el flujo de la suspensi´ on de c´elulas. El efecto de estas retracciones es cerrar peri´ odicamente el extrusionado y formar nuevamente compartimientos m´ ultiples. En otra aproximaci´ on alternativa adicional, el controlador 38 puede hacer variar la presi´on aplicada mediante la bomba 24 (y/o la bomba 28) para crear interrupciones peri´ odicas en el flujo de la suspensi´ on de c´elulas. En la figura 2 se muestra con mayor detalle el cabezal de extrusi´on 14, que incluye un orificio interior 16 para suministrar una suspensi´ on de c´elulas y un orificio exterior 18 para suministrar una soluci´on pol´ımera. A medida que son extruidas la suspensi´ on de c´elulas y la soluci´ on pol´ımera a trav´es del orificio de extrusi´ on com´ un 19, la soluci´ on pol´ımera coagula para formar un revestimiento externo en torno a la suspensi´ on de c´elulas. En la figura 3 se muestra con mayor detalle un cabezal de extrusi´ on alternativo 14A que comprende un orificio interior 16 para suministrar la suspensi´on de c´elulas, un segundo orificio 18 (que rodea al orificio interior) para suministrar la soluci´on pol´ımera, y un orificio m´as externo 20 para suministrar un fluido de extinci´ on fluyente, tal como soluci´on salina. En esta realizaci´ on puede obtenerse un revestimiento liso extruyendo simult´ aneamente la suspensi´ on de c´elulas y la soluci´ on pol´ımera a trav´es del orificio com´ un 19, aplicando al mismo tiempo durante la extrusi´on un fluido de extinci´on fluyente (por ejemplo desde el orificio m´as externo 20 del conjunto de cabezal de extrusi´ on 14A). En la figura 4 se muestra con mayor detalle el elemento de cierre 42 de la figura 1. Est´an montadas ruedas motorizadas 44A y 44B en lados opuestos del extrusionado tubular 12, de manera tal que, al rotar, las protuberancias 46 de las ruedas entran en contacto peri´ odicamente con el extrusionado 12 para estrangular y cerrar el extrusionado 12 a medida que sale del cabezal de extrusi´ on 14. Las ruedas 44A y 44B pueden estar enlazadas mec´anicamente y ser accionadas mediante un motor convencional bajo el control de un controlador, tal como se muestra en la figura 1. El resultado del cierre peri´odico del extrusionado 12 es una cadena multicompartimentada 50 de macroc´apsulas que tienen una membrana pol´ımera 52 que rodea a una soluci´ on de c´elulas encapsulada 54 con c´elulas individuales 56 dispues5

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tas en la misma. Las c´apsulas de c´elulas individuales est´an unidas una con otra por filamentos de conexi´on 58 en aquellos lugares en donde las protuberancias 46 de los medios de cierre 42 han estrangulado el extrusionado 12. Para formar los revestimientos de membrana de la presente invenci´ on pueden emplearse diversos pol´ımeros, incluyendo pol´ımeros derivados de soluciones que ser´ıan en otro caso incompatibles con la propagaci´ on de c´elulas vivas. A causa del procedimiento de extrusi´ on exclusivo divulgado en la presente invenci´on, disolventes que ser´ıan de otro modo t´ oxicos son r´ apidamente impulsados lejos de la suspensi´on acuosa de c´elulas durante el proceso de formaci´on de la membrana, permitiendo de este modo el empleo de muchos materiales pol´ımeros nuevos y potencialmente u ´ tiles. Por ejemplo, pueden formarse membranas pol´ımeras a partir de poliacrilatos (incluyendo copol´ımeros acr´ılicos), polivinilidenos, poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, polisulfonas, poliacrilonitrilos, as´ı como derivados, copol´ımeros y mezclas de los mismos. El disolvente para la soluci´ on de pol´ımero depender´ a del pol´ımero particular elegido para el material de membrana. Los disolventes apropiados incluyen una amplia variedad de disolventes org´ anicos, tales como alcoholes y cetonas, en general, as´ı como dimetilsulf´ oxido (DMSO), dimetilacetamida (DMA) y dimetilformamida (DMF), en particular. En general se prefieren disolventes org´ anicos miscibles con agua. La soluci´on pol´ımera o “barniz” puede incluir tambi´en diversos aditivos, que incluyen tensioactivos para favorecer la formaci´ on de canales porosos, as´ı como antioxidantes para secuestrar ´oxidos que se forman durante el proceso de coagulaci´on. Adem´as, cuando las c´apsulas de c´elulas de la presente invenci´on est´an dise˜ nadas para ser implantadas, pueden incorporarse tambi´en en la membrana pol´ımera materiales, tales como agentes antiinflamatorios y factores de crecimiento celular, a fin de reducir la respuesta inmune o estimular el cultivo celular, respectivamente. De manera alternativa, pueden a˜ nadirse estos materiales a las cadenas de c´apsulas de c´elulas multicompartimentadas despu´es de que se hayan formado, mediante un procedimiento de pos-revestimiento o de rociado. Por ejemplo, pueden sumergirse las cadenas en una soluci´ on que contiene un agente antiinflamatorio, tal como un corticoide, un factor angiog´enico, o un factor de crecimiento, despu´es de la extrusi´ on, para pos-revestir las c´ apsulas de c´elulas. Tambi´en pueden emplearse procedimientos de pos-revestimiento para proporcionar una barrera protectora contra inmun´ ogenos y similares. Por ejemplo, pueden revestirse (por ejemplo mediante inmersi´on, rociado o aplicaci´ on de un fluido fluyente durante la extrusi´ on) las cadenas de c´ apsulas de c´elulas, despu´es de su formaci´on, con un material protector superficial, tal como poli(´ oxido de etileno) o poli(´ oxido de propileno) (que tenga por ejemplo un peso molecular de aproximadamente 10.000 Dalton o superior), a fin de inhibir interacciones de prote´ınas con las c´apsulas. 6

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Tambi´en pueden emplearse diversas t´ecnicas para controlar la lisura o rugosidad de la superficie externa del revestimiento pol´ımero. En algunos casos puede ser preferible un revestimiento exterior muy liso a fin de reducir la fijaci´ on de tejido cicatricial y otras reacciones inmunes durante el implante. Un revestimiento liso semejante puede obtenerse sumergiendo simult´ aneamente el extrusionado tubular en un agente de extinci´on, tal como un ba˜ no de soluci´ on salina fisiol´ ogica, o aplicando un fluido de extinci´ on fluyente durante la extrusi´ on (por ejemplo desde un tercer orificio m´as externo, conc´entrico, de un conjunto de cabezal de extrusi´ on). De manera alternativa, en algunas aplicaciones puede desearse una superficie externa rugosa con porors de mayor tama˜ no, por ejemplo en casos en los cuales se desee el crecimiento de capilares hacia el interior durante el implante, pudiendo conseguirse una superficie externa rugosa semejante mediante coagulaci´on en aire. De acuerdo con la invenci´ on pueden encapsularse diversas l´ıneas celulares. Tal como se ha se˜ nalado anteriormente, las cadenas de cultivo de c´elulas multicompartimentadas son particularmente u ´tiles para el suministro constitutivo de neurotransmisores, tales como dopamina, que es segregada por c´elulas de la m´edula adrenal, tejido mesencef´alico ventral embri´ onico y l´ıneas celulares neurobl´ asticas. En algunas aplicaciones se prefieren particularmente c´elulas PC12 (una l´ınea celular inmortalizada derivada de un feocromocitoma de rata) a causa de su capacidad para segregar grandes cantidades de dopamina a lo largo de prolongados per´ıodos de tiempo. Otros neurotransmisores incluyen el a´cido gamma-aminobut´ırico (GABA), serotonina, acetilcolina, noradrenalina y otros compuestos necesarios para funciones nerviosas normales. Se conocen o pueden aislarse diversas l´ıneas celulares que segregan estos neurotransmisores. Pueden emplearse tambi´en c´elulas que sintetizan y segregan agonistas, an´ alogos, derivados o fragmentos de neurotransmisores que son activos, incluyendo, por ejemplo, c´elulas que segregan bromocriptina, un agonista de la dopamina, y c´elulas que segregan L-dopa, un precursor de la dopamina. En otras realizaciones de la invenci´on pueden elegirse las c´elulas encapsuladas por su secreci´on de hormonas, citokinas, factores de crecimiento nervioso, factores de angiog´enesis, anticuerpos, factores de coagulaci´ on sangu´ınea, linfokinas, enzimas y otros agentes terap´euticos. Las suspensiones acuosas de c´elulas pueden incluir adem´ as diversos aditivos para proteger a las c´elulas durante el procedimiento de extrusi´ on o para estimular subsiguientemente su crecimiento. Tales aditivos pueden incluir, por ejemplo, un medio nutriente o factores de crecimiento que est´an incorporados en la suspensi´ on acuosa, as´ı como un material de sustrato de anclaje para favorecer la fijaci´on de las c´elulas. El material de sustrato de anclaje puede ser un material protein´ aceo, tal como col´ageno, laminina, o poliamino´ acidos. De manera alternativa, la suspensi´ on celular o la soluci´on pol´ımera (o ambas) pueden incluir un agente espumante o un agente gasificante que pueden distorsionar la superficie in-

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terna del revestimiento pol´ımero a fin de incrementar el ´area de la superficie de anclaje del interior tubular. Los productos de la presente invenci´ on pueden adoptar diversas formas, incluyendo extrusionados tubulares simples as´ı como cadenas de c´apsulas de c´elulas multicompartimentadas. La forma de las cadenas multicompartimentadas puede ser tubular, semejante a salchichas, o casi esf´erica, semejante a sartas de perlas. El di´ ametro exterior m´aximo de la cadena variar´a t´ıpicamente desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1,0 mil´ımetros. El espesor de pared de la membrana variar´ a t´ıpicamente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 micr´ometros. La longitud de las cadenas variar´a en funci´ on de la aplicaci´on particular. Los productos pueden adoptar tambi´en la forma de c´ apsulas de c´elulas “atadas con cuerdas”, es decir, uno o m´as compartimientos de c´elulas individuales est´ an conectados a un largo tubo o “cuerda” de pol´ımero. En la figura 5 se muestra una de tales c´ apsulas de c´elulas “atadas” 51, con una membrana pol´ımera 52 que rodea una soluci´ on de c´elulas encapsulada 54 con c´elulas individuales 56 dispuestas en el interior de la misma. La c´apsula de c´elulas 51 incluye adem´as un largo filamento pol´ımero 59 que se puede formar mediante el mismo aparato que se ha descrito anteriormente en relaci´on con la figura 4, interrumpiendo el flujo de la soluci´ on de c´elulas y estrangulando la soluci´ on pol´ımera para formar una “cuerda” s´ olida. Tambi´en puede pos-revestirse la “cuerda” con un material (por ejemplo un poliuretano o similar) que comunique una resistencia adicional al filamento. Tales c´ apsulas de c´elulas “atadas” pueden hallar diversas aplicaciones, en particular cuando se implantan en un sujeto para el suministro constitutivo de factores activos. Durante el uso, la c´ apsula de c´elulas puede situarse tan cerca como se desee de la regi´on diana (por ejemplo, en el cerebro, la cavidad peritoneal o cualquier otro sitio), mientras que el otro extremo de la “cuerda” puede fijarse en un punto de anclaje conveniente o disponerse en un lugar f´ acilmente accesible para su recuperaci´ on. La invenci´on se describir´ a a continuaci´ on en relaci´on con diversos ejemplos ilustrativos y no limitantes: Ejemplos Se emple´o un sistema de extrusi´ on similar al ilustrado en la figura 1, consistente en tres bombas de infusi´ on programables controladas electr´ onicamente, una hilera de chorro, dos sistemas de ruedas coaxiales controladas por motor en cuyo per´ımetro estaban montados tubos oclusores de politetrafluoroetileno, y un sistema de absorci´on. Las macroc´ apsulas se formaron mediante la inyecci´on de una soluci´ on pol´ımera en el tubo externo de la hilera. Simult´ aneamente se inyect´o en el tubo interno de la hilera un coagulante, t´ıpicamente las c´elulas encapsuladas en su medio de cultivo. La membrana encapsulante se form´ o mediante un procedimiento de chorro seco e hilado en h´ umedo, es decir, estabilizaci´on r´ apida de la soluci´on de pol´ımero que emerge de la boquilla de la hilera mediante el medio de extinci´on interno, acoplada con estabilizaci´on adicional en

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un ba˜ no de agente de extinci´on. El cierre de la fibra se realiz´o estrangulando mec´anicamente la fibra hueca que se estaba formando, con el sistema coaxial de ruedas antes de la inmersi´ on en el ba˜ no de extinci´on. Cerca del cabezal de la hilera, la concentraci´ on de disolvente era suficientemente elevada para permitir la adecuada fusi´ on de las paredes de la fibra. Despu´es de cada tanda de encapsulaci´on, se hizo pasar autom´ aticamente un enjuague con disolvente puro a trav´es de la luz de la hilera, a fin de evitar la obstrucci´on de la boquilla. Se cultivaron c´elulas PC12, una l´ınea celular inmortalizada derivada de un feocromocitoma de rata, que segrega grandes cantidades de dopamina, en placas de cultivo para tejidos revestidas con col´ageno, en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de caballo inactivado por calor y 5% de suero fetal de bovino. Se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 5% de suero fetal de bovino c´elulas de m´edula adrenal disociadas de bovino, un tipo de c´elulas que no se dividen y que segregan dopamina. Antes de la encapsulaci´on se recolectaron las c´elulas y se cargaron en una concentraci´ on de 1 x 105 c´elulas/ml en una jeringa de 3 ml. En una jeringa de vidrio de 5 ml se carg´o una soluci´ on de copol´ımero de cloruro de vinilo y acrilonitrilo al 15 por ciento, o bien en dimetilsulf´ oxido (DMSO), en dimetilformamida (DMF), o en dimetilacetamida (DMA). A continuaci´ on se coextruyeron ambas soluciones a trav´es de la hilera, y las c´apsulas se recogieron en una soluci´ on salina fisiol´ ogica. Se enjuagaron las c´apsulas y se colocaron en pocillos individuales que conten´ıan los medios de cultivo apropiados. La liberaci´ on basal de catecolaminas y la provocada por potasio se cuantificaron a las 2 y a las 4 semanas en condiciones de incubaci´on est´ aticas mediante cromatograf´ıa l´ıquida de altas prestaciones (HPLC) de par i´ onico en fase invertida, equipada con detecci´on electroqu´ımica. Para cada per´ıodo de tiempo se realizaron sobre muestras representativas an´alisis morfol´ogicos, incluyendo microscop´ıa ´optica, microscop´ıa electr´onica de barrido y microscop´ıa electr´onica de transmisi´on. Todas las c´apsulas cargadas con c´elulas liberaron dopamina en el medio en condiciones basales en todos los per´ıodos de tiempo. Un elevado tratamiento con potasio increment´o la liberaci´ on de dopamina tanto desde c´elulas PC12 como desde c´elulas de la m´edula adrenal. La producci´on de dopamina por las c´elulas PC12 aument´ o con el tiempo, pero no la de las c´elulas de la m´edula adrenal. Se cree que el incremento a lo largo del tiempo de la liberaci´on de dopamina por parte de las c´apsulas cargadas con c´elulas PC12 est´a relacionado con la proliferaci´on celular dentro de la c´apsula de pol´ımero. No se pudo observar una diferencia significativa en la liberaci´on de dopamina desde c´apsulas cargadas con c´elulas PC12 extruidas con los tres sistemas distintos de disolvente (DMSO, DMF, DMA), lo cual sugiere que la t´ecnica de encapsulaci´ on de la presente invenci´on puede evitar el da˜ no infligido a las c´elulas por disolventes (figura 6). Debido a la mayor presi´ on del sistema del orificio interior, el disolvente fue impelido r´ apidamente hacia afuera, en direcci´ on 7

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al exterior de la c´ apsula de pol´ımero, lo cual evit´o el contacto prolongado de c´elula y disolvente. El an´ alisis morfol´ogico revel´ o la presencia de peque˜ nos c´ umulos de c´elulas PC12 dispersados al azar en la luz de la c´ apsula. Al nivel del microscopio electr´onico pod´ıan observarse c´elulas PC12 bien conservadas, con sus t´ıpicos gr´ anulos secretorios densos a los electrones. La presencia de numerosas figuras mit´ oticas suger´ıa divisi´ on celular dentro del espacio de la c´apsula. Aunque se hab´ıan coextruido inicialmente como una suspensi´ on de c´elulas, las c´elulas cromafines adrenales formaron agregados empaquetados una semana despu´es de la encapsulaci´on. La figura 7 muestra los resultados de una determinaci´on in vitro en la cual se encapsularon c´elulas PC12 de acuerdo con la presente invenci´ on y fueron monitorizadas en cuanto a la liberaci´ on de dopamina a las dos y a las cuatro semanas desde la encapsulaci´on. Los niveles de dopamina se midieron en condiciones normales (controladas) y tambi´en bajo una intensa estimulaci´ on con potasio, del que se sabe induce la despolarizaci´ on de las c´elulas y, en consecuencia, incrementa la secreci´on de dopamina en c´elulas viables. Como puede observarse en los gr´ aficos, exist´ıa poca actividad a las dos semanas; sin embargo, a las cuatro semanas las c´elulas encapsuladas mostraron secreci´on de dopamina no s´ olo en condiciones normales, sino que tambi´en exhibieron una intensa

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respuesta a la estimulaci´ on con potasio, indicando que las c´elulas eran efectivamente viables en su estado encapsulado. Las figuras 8A y 8B muestran los resultados de determinaciones in vitro adicionales en las cuales se monitorizaron las secreciones de c´elulas PC12 y c´elulas cromafines, respectivamente, cuatro semanas despu´es de la encapsulaci´on de acuerdo con la presente invenci´on. Una vez m´ as se estimularon las c´elulas mediante elevadas concentraciones de potasio en el medio, y mientras que las c´elulas PC12 liberaron s´ olo dopamina, las c´elulas cromafines liberaron varias catecolaminas. El gr´afico muestra los niveles de noradrenalina (NE), epinefrina (EPI) y dopamina (DA). A causa de su din´ amica de fluidos, las macroc´apsulas extruidas de acuerdo con la presente invenci´on permitir´ an el empleo de un abanico m´ as amplio de sistemas pol´ımero/disolvente, y pueden constituir una t´ecnica de encapsulaci´ on m´ as eficiente. Los resultados demuestran que c´elulas secretoras de dopamina, inmortalizadas y diferenciadas, sobrevivir´ an en la macroencapsulaci´on. La capacidad de estas c´apsulas para liberar espont´ aneamente dopamina a lo largo del tiempo sugiere que la encapsulaci´on en pol´ımeros puede proporcionar una alternativa al trasplante de c´elulas secretoras de dopamina no encapsuladas o microencapsuladas, en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

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REIVINDICACIONES 1. Un m´etodo para encapsular c´elulas viables, el cual m´etodo comprende coextruir una suspensi´ on acuosa de c´elulas y una soluci´ on pol´ımera a trav´es de una abertura de extrusi´ on com´ un que tiene orificios interior y exterior de los cuales salen respectivamente la suspensi´on y la soluci´ on pol´ımera, coagul´ andose dicha soluci´ on, al ser coextruida a trav´es de la abertura, para formar un extrusionado tubular que tiene un revestimiento externo pol´ımero semipermeable que encapsula dicha suspensi´ on de c´elulas. 2. El m´etodo de la reivindicaci´on 1, que incluye adicionalmente cerrar el extrusionado tubular a intervalos para definir compartimientos de c´elulas separados conectados por uniones pol´ımeras. 3. El m´etodo de la reivindicaci´ on 2, en el cual la operaci´ on de cerrar el extrusionado comprende comprimir el extrusionado a intervalos para definir los compartimientos de c´elulas separados. 4. El m´etodo de la reivindicaci´ on 2, en el cual la operaci´ on de cerrar el extrusionado comprende modificar la presi´ on bajo la cual es extruida la suspensi´on de c´elulas o la soluci´on pol´ımera, colapsando de este modo el extrusioando tubular a intervalos para definir los compartimientos de c´elulas separados. 5. El m´etodo de la reivindicaci´ on 2, en el cual la operaci´ on de cerrar el extrusionado comprende impedir el flujo de la suspensi´ on de c´elulas a intervalos para colapsar el extrusioando tubular y de este modo definir compartimientos de c´elulas separados. 6. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual el revestimiento pol´ımero se coagula en aire. 7. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual el revestimiento pol´ımero se coagula en una c´amara de presi´on reducida. 8. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual el revestimiento pol´ımero se coagula en un ba˜ no de agente de extinci´on. 9. El m´etodo de la reivindicaci´on 1, que comprende extruir una suspensi´ on acuosa que contiene c´elulas que segregan un factor biol´ogicamente activo tal como un neurotransmisor. 10. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual la suspensi´on acuosa de c´elulas extruida contiene un medio nutriente. 11. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual la suspensi´on acuosa de c´elulas extruida contiene un sustrato de anclaje. 12. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual la soluci´on pol´ımera comprende un componente de disolvente miscible con agua. 13. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el cual la soluci´on pol´ımera comprende adicionalmente un tensioactivo y/o un agente antiinflamatorio y/o un antioxidante. 14. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, que comprende adicionalmente controlar la viscosidad de dicha soluci´ on de pol´ımero. 15. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, que comprende adicionalmente mantener una diferencia de presiones entre la suspensi´ on acuosa de c´elulas y la soluci´on pol´ımera durante la coextrusi´ on para impedir la difusi´ on de disolvente desde di-

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cha soluci´on pol´ımera hacia dicha suspensi´on de c´elulas. 16. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, que comprende adicionalmente aplicar un material de barrera protector al exterior del revestimiento pol´ımero. 17. Un veh´ıculo de cultivo de c´elulas (50, 51) que comprende una membrana pol´ımera semipermeable tubular (52) que encierra un cultivo (54) de c´elulas, habiendo sido formado dicho veh´ıculo mediante coextrusi´on del cultivo de c´elulas y una soluci´on pol´ımera a trav´es de una abertura de extrusi´ on com´ un que tiene orificios interior y exterior a los cuales se aportan respectivamente el cultivo y la soluci´on pol´ımera, habiendo sido seleccioandos dicho cultivo y soluci´on pol´ımera de manera tal que la soluci´on coagula, formando dicha membrana, al ser coextruida junto con el cultivo a trav´es de la abertura com´ un. 18. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 17, en el cual la membrana (52) es permeable a mol´eculas que tienen un peso molecular de aproximadamente 150.000 o inferior. 19. El veh´ıculo de la reivindicaci´ on 17, en el cual el di´ ametro exterior m´aximo del veh´ıculo de cultivo de c´elulas var´ıa desde 0,1 hasta 1,0 mil´ımetros. 20. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 17, en el cual la membrana (52) tiene un espesor de pared que var´ıa desde 10 hasta 100 micr´ometros. 21. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 17, en el cual la membrana pol´ımera (52) comprende un material de poliacrilato. 22. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 17, en el cual la membrana pol´ımera (52) comprende un tensioactivo y/o un agente antiinflamatorio y/o un antioxidante. 23. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 17, en el cual se cierra a intervalos (en 58) la membrana pol´ımera (52) para definir compartimientos de c´elulas separados (56) conectados por uniones pol´ımeras (58). 24. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 17, en el cual se cierra la membrana tubular para definir al menos un compartimiento (56) de c´elulas conectado a un filamento (59) de atadura. 25. El veh´ıculo de la reivindicaci´ on 17, en el cual el cultivo de c´elulas comprende adicionalmente una suspensi´on acuosa de c´elulas que contiene c´elulas que segregan un factor biol´ogicamente activo, por ejemplo un factor terap´eutico. 26. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 17, en el cual la suspensi´on acuosa de c´elulas comprende adicionalmente un medio nutriente. 27. El veh´ıculo de la reivindicaci´ on 17, en el cual el cultivo de c´elulas comprende adicionalmente un material de sustrato de anclaje. 28. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 17, en el cual el material de sustrato est´ a seleccionado de un material de col´ageno, un material de laminina y un poliamino´ acido. 29. El veh´ıculo de la reivindicaci´ on 17, que comprende adicionalmente un material de barrera protector que reviste al menos una porci´on de la superficie externa de la membrana pol´ımera (52). 30. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 29, en el cual el material de barrera protector es un inhibidor de interacciones con prote´ınas. 9

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31. El veh´ıculo de la reivindicaci´on 29, en el cual el material de barrera protector est´ a seleccionado de poli(´ oxidos de etileno), poli(´oxidos de propileno), derivados y mezclas de los mismos. 32. Aparato para encapsular c´elulas viables, que comprende: un conjunto de cabezal de extrusi´ on (14) que tiene al menos un primer orificio interior (16) y un segundo orificio exterior, conc´entrico (18); medios de aportaci´ on (22) de suspensi´ on de c´elulas para aportar una suspensi´ on acuosa de c´elulas al orificio interior (16) de dicho conjunto de cabezal de extrusi´ on (14); medios de aportaci´ on (26) de soluci´on pol´ımera para aportar una soluci´ on pol´ımera al orificio exterior (18) del conjunto de cabezal de extrusi´ on, y medios de diferencia de presiones para proporcionar una diferencia positiva de presiones entre la suspensi´ on de c´elulas y la soluci´ on pol´ımera durante el curso de la extrusi´ on, de manera tal que dicha suspensi´ on de c´elulas y dicha soluci´on pol´ımera, al ser coextruidas desde dicho conjunto de cabezal (14), forman un extrusionado tubular que tiene un revestimiento exterior pol´ımero coagulado que encapsula dicha suspensi´ on de c´elulas, impeliendo durante el funcionamiento dicha diferencia positiva de presiones disolvente de pol´ımero hacia afuera, alej´ andole de la suspensi´ on de c´elulas durante la coagulaci´on. 33. El aparato de la reivindicaci´ on 32, en el cual los medios de diferencia de presiones comprenden medios de control del flujo para mantener la diferencia de presiones entre la suspensi´on acuosa de c´elulas y la soluci´ on pol´ımera durante la coextrusi´on. 34. El aparato de la reivindicaci´ on 33, en el cual los medios de control de flujo comprenden un ordenador (38) adaptado para controlar una pri-

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mera bomba de infusi´ on (24) en dichos medios de aportaci´ on (22) de suspensi´on de c´elulas y una segunda bomba de infusi´ on (28) en dichos medios de aportaci´ on (26) de soluci´on pol´ımera. 35. El aparato de la reivindicaci´ on 32, que comprende adicionalmente un ba˜ no de agente de extinci´on (40) para coagular dicha soluci´ on pol´ımera despu´es de la extrusi´on. 36. El aparato de la reivindicaci´ on 32, que comprende medios de cierre para cerrar a intervalos el extrusionado tubular para definir compartimientos de c´elulas separados (54) conectados por uniones pol´ımeras (58). 37. El aparato de la reivindicaci´ on 36, en el cual los medios de cierre (42) comprenden medios (44a, 44b, 46) para comprimir a intervalos el extrusionado durante la extrusi´ on, para definir los compartimientos de c´elulas separados. 38. El aparato de la reivindicaci´ on 36, en el cual los medios de cierre se pueden hacer funcionar para modificar la presi´ on bajo la cual es extruida la suspensi´ on de c´elulas o la soluci´on pol´ımera, colapsando de este modo el extrusionado tubular a intervalos para definir los compartimientos de c´elulas separados. 39. El aparato de la reivindicaci´ on 36, en el cual los medios de cierre comprenden medios (48) para impedir a intervalos el flujo de la suspensi´ on de c´elulas a fin de colapsar el extrusionado tubular y definir los compartimientos de c´elulas separados. 40. El aparato de la reivindicaci´ on 36, en el cual los medios de cierre comprenden un medio de retracci´on (48) para mover el orificio interior (16) de dicho conjunto de cabezal de extrusi´ on (14) en relaci´on con el orificio exterior (18), a fin de interrumpir a intervalos el flujo del extrusionado tubular para definir los compartimientos de c´elulas separados. 41. El aparato de la reivindicaci´ on 32, en el cual el conjunto de cabezal de extrusi´ on (14) incluye un tercer orificio conc´entrico, el m´as externo (20), para suministrar un fluido de extinci´ on a fin de coagular dicha soluci´ on pol´ımera.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales.

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Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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