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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 233 970

51 Int. Cl. : C12N 1/20, C12N 5/08

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A61K 39/02, C07K 14/29 C12N 15/32, C12Q 1/68 C07K 16/12, C12P 21/08 G01N 33/577, G01N 33/569 C12N 5/20 // (C12N 1/20, C12R 1:01) (C12P 21/08, C12R 1:91)

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 96922446 .8

86 Fecha de presentación: 06.06.1996

87 Número de publicación de la solicitud: 0832185

87 Fecha de publicación de la solicitud: 01.04.1998

54 Título: Líneas celulares infectadas con Ehrlichia granulocítica, vacunas, diagnósticos y métodos.

30 Prioridad: 06.06.1995 US 470358

11.03.1996 US 613415

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.06.2005

73 Titular/es: Antigenics Inc.

34-A Commerce Way Woburn, Massachusetts 01801, US

72 Inventor/es: Coughlin, Richard, T. y

Gingrich-Baker, Cindy

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel

ES 2 233 970 T3

16.06.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 233 970 T3 DESCRIPCIÓN Líneas celulares infectadas con Ehrlichia granulocítica, vacunas, diagnóstico y métodos. 5

Antecedentes de la invención Campo de la invención

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La presente invención se refiere, en general, a Ehrlichia granulocítica. En particular, la presente invención se refiere a una línea celular seleccionada entre el grupo compuesto por una línea celular de leucemia promielocítica, una línea celular de leucemia mielógena aguda, una línea celular de linfoma histiocítico, una línea celular de tipo monocito-macrófago, una línea celular de leucemia monocítica aguda, y una línea de células pulmonares embrionarias, estando infectada la línea celular con Ehrlichia granulocítica, a un método para cultivar de forma continua Ehrlichia granulocítica, a vacunas que comprenden Ehrlichia granulocítica o antígenos de Ehrlichia granulocítica, a métodos para prevenir la ehrlichiosis en un animal, a anticuerpos contra Ehrlichia granulocítica, y a métodos para detectar Ehrlichia granulocítica o anticuerpos contra Ehrlichia granulocítica en un animal. Técnica relacionada

20

A los animales se les transmite una amplia serie de virus, bacterias y parásitos a través de las garrapatas. En los Estados Unidos, la enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por garrapatas notificada más frecuentemente. El agente etiológico de la enfermedad de Lyme, B. burgdorferi, se transmite por garrapatas del género Ixodes (Mather et al., JAVMA 205:186-188 (1994)).

25

Otra enfermedad transmitida por garrapatas, la ehrlichiosis, se produce por el género de bacterias conocido como Ehrlichia (como revisión de Ehrlichia y enfermedades producidas por Ehrlichia véase, Rikihisa, Clin. Microbiol. Reviews 4(3):286-308 (1991)). Las diversas especies de Ehrlichia son miembros de la familia Rickettsiaceae. A diferencia de B. burgdorferi, Ehrlichia no requiere un hospedador mamífero para mantenerse en estado silvestre. Sin embargo, si está implicado un hospedador mamífero, la mayoría de las especies de Ehrlichia infectan a los monocitos de la sangre y en varios casos se han aislado en cultivos de monocitos (véase, por ejemplo, Dawson et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.192.679 expedida el 9 de marzo de 1993, que reivindica una línea celular de monocitosmacrófagos caninos DH82 infectada con E. canis).

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Ehrlichia equi es el agente causante de la ehrlichiosis equina (Rikihisa, Clin. Microbiol. Reviews 4(3):286-308 (1991)). Aunque no se ha definido el mecanismo de transmisión, parece ser que es poco habitual que infecte a los granulocitos y no a los monocitos. E. equi tiene una amplia serie de hospedadores. Se ha notificado la infección experimental de caballos, burros, ovejas, cabras, perros, gatos, monos y babuinos (Lewis, Vet. Parasitol. 2:61-74 (1976)). En Europa, otra Ehrlichia granulocítica, E. phagocytophila, produce la fiebre transmitida por garrapatas en ovejas, vacas y bisontes, y utiliza como vector a I. ricinis (Ristic, M. et al., en Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology, Kreig, N. et al., eds. Williams y Wilkins, Baltimore (1984), páginas 704-709). Aunque estos organismos se transportan por diferentes garrapatas y están presentes en diferentes continentes, son indistinguibles entre sí por métodos serológicos o de PCR (Chen et al., J. Clin. Microbiol. 32:589-595 (1994)). Recientemente se han notificado varios casos fatales de ehrlichiosis granulocítica humana en Wisconsin, Minnesota y Connecticut, así como un caso humano no fatal en Florida (Chen et al., J. Clin. Microbiol. 32:589-595 (1994)). Estos casos de ehrlichiosis se produjeron por una Ehrlichia que era indistinguible de E. equi y E. phagocytophila por métodos de PCR (Bakken, J.S. et al., JAMA 272:212218 (1994); Rynkiewicz y Liu, New Engl. J. Med. 330:292-293 (1994)). Sumario de la invención

50

A diferencia de E. canis, no hay ningún informe de condiciones de cultivo celular para el aislamiento de E. equi, E. phagocytophila o Ehrlichia granulocítica humana, ni hay un modelo animal para la transmisión. Tanto el cultivo de células como el modelo de transmisión son esenciales en el desarrollo de una terapia apropiada con antibióticos y en el desarrollo de vacunas, así como en el desarrollo de productos de diagnóstico fiables.

55

La invención también proporciona un método para desarrollar de forma continua Ehrlichia granulocítica que comprende infectar una línea celular seleccionada entre el grupo compuesto por una línea celular de leucemia promielocítica, una línea celular de leucemia mielógena aguda, una línea celular de linfoma histiocítico, una línea celular de tipo monocito-macrófago, una línea celular de leucemia monocítica aguda, y una línea de células pulmonares embrionarias con Ehrlichia granulocítica y cultivar la línea celular infectada en un medio de cultivo adecuado.

60

De esta manera, la presente invención proporciona una línea celular seleccionada entre el grupo compuesto por una línea celular de leucemia promielocítica, una línea celular de leucemia mielógena aguda, una línea celular de linfoma histiocítico, una línea celular de tipo monocito-macrófago, una línea celular de leucemia monocítica aguda y una línea de células pulmonares embrionarias donde la línea celular está infectada con Ehrlichia granulocítica. 65

La invención también proporciona una vacuna que comprende Ehrlichia granulocítica junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, donde la Ehrlichia granulocítica está presente en una cantidad eficaz para inducir respuestas inmunes protectoras en un animal contra Ehrlichia granulocítica. 2

ES 2 233 970 T3 La invención también proporciona una vacuna que comprende uno o más antígenos de Ehrlichia granulocítica junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, donde el antígeno está presente en un cantidad eficaz para inducir anticuerpos protectores en un animal contra Ehrlichia granulocítica. 5

10

La invención también proporciona un método para prevenir la ehrlichiosis en un animal que comprende administrar al animal la vacuna descrita anteriormente. La invención también proporciona un método para identificar Ehrlichia granulocítica en un animal que comprende analizar en el tejido o fluido corporal del animal un ácido nucleico, proteína, polisacárido o anticuerpo específico contra el Ehrlichia granulocítica. La invención también proporciona un antígeno de Ehrlichia granulocítica substancialmente puro que tiene un peso molecular aproximado seleccionado entre el grupo compuesto por 21 kDa, 23 kDa, 40 kDa, 47 kDa, 85 kDa, 130 kDa y 145 kDa.

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La invención también proporciona un polipéptido substancialmente puro que comprende el antígeno descrito anteriormente. 20

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que comprende el antígeno descrito anteriormente. La invención también proporciona un anticuerpo que tiene afinidad de unión por el antígeno descrito anteriormente.

25

La invención también proporciona un anticuerpo que tiene afinidad de unión por el antígeno y/o polipéptido descrito anteriormente.

30

La invención también proporciona una sonda de ácido nucleico para la detección de la presencia de ácido nucleico de Ehrlichia granulocítica en una muestra de un individuo, que comprende una molécula de ácido nucleico suficiente para detectar específicamente en condiciones de hibridación rigurosas la presencia de la molécula descrita anteriormente en la muestra. La invención también proporciona un método para detectar un ácido nucleico de Ehrlichia granulocítica en una muestra, que comprende:

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a) poner en contacto la muestra con la sonda de ácido nucleico descrita anteriormente, en condiciones tales que se produzca la hibridación y, b) detectar la presencia de la sonda unida al ácido nucleico de Ehrlichia granulocítica.

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La invención también proporciona un kit para detectar la presencia de un ácido nucleico de Ehrlichia granulocítica en una muestra, que comprende al menos un recipiente que tiene dispuesto en su interior la sonda de ácido nucleico descrita anteriormente. La invención también proporciona un kit de diagnóstico para detectar la presencia de Ehrlichia granulocítica en una muestra que comprende al menos un recipiente que tiene dispuesto en su interior el anticuerpo descrito anteriormente. La invención también proporciona un kit de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos contra Ehrlichia en una muestra que comprende al menos un recipiente que tiene dispuesto en su interior el o los antígenos descritos anteriormente.

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Otros objetos y ventajas de la presente invención serán evidentes tras la siguiente descripción. Breve descripción de los dibujos 55

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Figura 1. Titulaciones de anticuerpos específicos contra Ehrlichia granulocítica de perros infectados. Figura 2. Análisis de PCR de líneas celulares infectadas por Ehrlichia granulocítica (XTG, VXG3, USG, XGG y VBH) y no infectadas (HL60). PCR de células HL60 infectadas con HGE usando sondas de ARNr 16S específicas de Ehrlichia (Anderson et al., J. Clin. Micro. 29:2838-42). Calle 1, marcadores de peso molecular; calle 2, células USG3 (pase 40); calle 3, células XGG3 (pase 37); calle 4, células VXG3 (pase 39); calle 5, VBH3 (pase 39); calle 6, células XTG3 (pase 36); y calle 7, células HL60 no infectadas. Figura 3. Transferencia de Western usando sueros de perros infectados por Ehrlichia granulocítica (A) o no infectados (B). Los antígenos usados en cada calle son las células lisadas de HL60, USG, VBH, VOG, VUH, VXG, XGG, XQH, XTG y XUG.

3

ES 2 233 970 T3 Descripción detallada de las realizaciones preferidas La presente invención se refiere a Ehrlichia granulocítica. 5

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En una realización preferida, la presente invención se refiere a Ehrlichia granulocítica aislada de un hospedador donde dicho hospedador es un mamífero (preferiblemente un ser humano, perro, ratón o caballo). En una realización preferida, Ehrlichia granulocítica se aísla a partir de un hospedador humano. En una realización, la presente invención se refiere a una línea celular de leucemia promielocítica infectada con Ehrlichia granulocítica. En una realización preferida, la línea celular de leucemia promielocítica es una línea celular humana. En una realización preferida, la línea celular de leucemia promielocítica humana es HL60 (ATCC CCL 240) o mutantes o variantes de la misma. En otra realización preferida, la línea celular de leucemia promielocítica humana infectada con Ehrlichia granulocítica tiene las características de identificación de ATCC CRL-11864 (línea celular XQH), ATCC CRL-11865 (línea celular VXG3) o mutantes o variantes de las mismas. ATCC CRL-11864 (línea celular XQH) y ATCC CRL-11865 (línea celular VXG3) se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 Estados Unidos el 29 de marzo de 1995.

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Las características de identificación de ATCC CRL-11864, ATCC CRL-11865 o mutantes o variantes de las mismas se definen en este documento para incluir características que se comparten comúnmente entre las cepas de Ehrlichia granulocítica, incluyendo características fisiológicas, morfológicas y basadas químicamente. Además de las dos líneas de células depositadas infectadas, la tabla 3 muestra siete líneas celulares HL60 más que se infectaron por sangre entera o glóbulos blancos aislados de perros individuales infectados por Ehrlichia granulocítica.

25

En otra realización, la presente invención se refiere a una línea celular de leucemia mielógena aguda (preferiblemente una línea celular humana) infectada con Ehrlichia granulocítica. En una realización preferida, la línea celular de leucemia mielógena aguda humana es KG-1 (ATCC CCL-246) o mutantes o variantes de la misma.

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En otra realización, la presente invención se refiere a una línea celular de linfoma histiocítico (preferiblemente, una línea celular humana) infectada con Ehrlichia granulocítica. En una realización preferida, la línea celular de linfoma histiocítico humano es U937 (ATCC CRL-1593.2) o mutantes o variantes de la misma. En otra realización, la presente invención se refiere a una línea celular de tipo monocito-macrófago (preferiblemente, una línea celular humana) infectada con Ehrlichia granulocítica. En una realización preferida, la línea celular de tipo monocito-macrófago humano es THP-1 (ATCC TIB-202) o mutantes o variantes de la misma.

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En otra realización, la presente invención se refiere a una línea celular de leucemia monocítica aguda (preferiblemente, una línea celular humana) infectada con Ehrlichia granulocítica. En una realización preferida, la línea celular de leucemia monocítica aguda humana es AML-193 (ATCC CRL-9589) o mutantes o variantes de la misma. 40

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En otra realización, la presente invención se refiere a una línea de células pulmonares embrionarias (preferiblemente, una línea celular humana) infectada con Ehrlichia granulocítica. En una realización preferida, la línea de células pulmonares embrionarias humanas es HEL299 (ATCC CCL-137) o mutantes o variantes de la misma. Los mutantes y variantes de las líneas celulares que contienen Ehrlichia granulocítica o del organismo Ehrlichia granulocítica contenido, incluyen cualquier cambio detectable en el material genético que puede transmitirse a las células hijas y posiblemente incluso a generaciones posteriores dando lugar a células mutantes o individuos mutantes. Una mutación puede ser cualquier cambio (o una combinación de cambios) detectable no natural que afecte a la constitución química o física, mutabilidad, replicación, función fenotípica o recombinación de uno o más desoxirribonucleótidos; pueden añadirse, delecionarse, substituirse, invertirse o transponerse nucleótidos a nuevas posiciones con y sin inversión. Pueden aparecer mutaciones espontáneamente y pueden inducirse experimentalmente por aplicación de mutágenos. Las mutaciones pueden inducirse por agentes químicos tales como agentes alquilantes, ácido nitroso, tintes de acridina, por métodos de ADN recombinante usando análogos de base de ácido nucleico, etc., o por medio de cambios ambientales como radiación, cambios de substratos metabólicos, etc. (Principles of Genetics, 8ª Edición, Gardner, E.J. et al., eds., John Wiley & Sons, Nueva York 1991, pág. 288-319). Como es un organismo intracelular, Ehrlichia granulocítica puede alterarse por reaislamiento en otra línea de células hospedadoras con un fenotipo diferente. Las mutaciones también pueden producirse espontáneamente. En dos de las líneas celulares, se observó que el efecto citopático normal de Ehrlichia granulocítica se perdía a lo largo de varios pases en serie. Tales mutantes fenotípicos son valiosos ya que son más fáciles de mantener en cultivo celular. En otra realización, la presente invención se refiere a un método para cultivar de forma continua Ehrlichia granulocítica que comprende infectar una línea celular seleccionada entre el grupo compuesto por una línea celular de leucemia promielocítica, una línea celular de leucemia mielógena aguda, una línea celular de linfoma histiocítico, una línea celular de tipo monocito-macrófago, una línea celular de leucemia monocítica aguda, y una línea de células pulmonares embrionarias con Ehrlichia granulocítica, y cultivar la línea celular infectada en un medio de cultivo adecuado. Véase, por ejemplo, Collins et al., Nature 270:347-349 (1977)). 4

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En otra realización, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende Ehrlichia granulocítica junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, donde Ehrlichia granulocítica está presente en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune protectora en un animal contra Ehrlichia granulocítica. Ehrlichia granulocítica puede purificarse a partir de las líneas de células infectadas descritas anteriormente usando técnicas bien conocidas en la técnica. El aislamiento de Ehrlichia sin células de mamífero se realizó como se describe en el ejemplo 2. También son apropiados métodos para obtener Ehrlichia chaffeensis sin células de mamífero para el aislamiento de Ehrlichia granulocítica sin células de mamífero (Brouqui, P. et al., Infect. Immun. 62:405-11 (1994)).

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La bacteria Ehrlichia granulocítica presente en la vacuna puede no ser viable (por ejemplo, puede destruirse por calor) o puede estar atenuada. Pueden prepararse vacunas de Ehrlichia granulocítica destruidas por calor como se ha descrito previamente para otras vacunas destruidas por calor (véase, por ejemplo, Palmer, Cornell Vet. 79:201-205 (1989) que describe una vacuna preparada a partir de un cultivo celular inactivado de Ehrlichia risticii). De forma similar, pueden prepararse vacunas de Ehrlichia granulocítica atenuada como se ha descrito previamente para otras vacunas vivas atenuadas (véase, por ejemplo, Jongejan, Infect. Immun. 59:729-731 (1991), que describe inmunidad protectora contra C. ruminantium después de la vacunación con rickettsias atenuadas in vitro).

20

En otra realización, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende uno o más antígenos de Ehrlichia granulocítica junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, donde el antígeno está presente en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune protectora en un animal contra Ehrlichia granulocítica. Pueden obtenerse antígenos de Ehrlichia granulocítica usando métodos bien conocidos en la técnica.

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Pueden prepararse antígenos brutos a partir de células hospedadoras infectadas por fijación química, inactivación térmica, irradiación, sonicación, congelación-descongelación u otros medios. Pueden obtenerse antígenos menos brutos a partir de bacterias liberadas en el medio de cultivo procedentes de células lisadas y después inactivarse de forma similar. Pueden obtenerse antígenos de Ehrlichia granulocítica parcialmente purificados y purificados por métodos bien conocidos incluyendo centrifugación, reparto de fases y cromatografía en columna (Brouqui, P. et al., Infect. Immun. 62:405-11 (1994). En una realización preferida, los antígenos son proteínas, polisacáridos o lípidos. En otra realización preferida, la proteína, polisacárido o lípido está presente en la superficie de Ehrlichia granulocítica. En otra realización preferida, la proteína-antígeno de Ehrlichia granulocítica se conjuga con polisacárido capsular (CP) de Ehrlichia para producir una vacuna doble. Los CP, en general, pueden prepararse o sintetizarse como se describe en Schneerson et al., J. Exp. Med. 152:361-376 (1980); Marburg et al., J. Am. Chem. Soc. 108:5282 (1986); Jennings et al., J. Immunol. 127:10111018 (1981); y Beuvery et al., Infect. Immunol. 40:39-45 (1983). En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método para preparar un conjugado de polisacárido que comprende: obtener el antígeno de Ehrlichia descrito anteriormente; obtener un CP o fragmento de Ehrlichia; y conjugar el antígeno con el CP o el fragmento de CP. En una realización preferida, la presente invención se refiere a un antígeno de Ehrlichia granulocítica substancialmente puro que tiene un peso molecular aproximado seleccionado entre el grupo compuesto por 21 kDa, 23 kDa, 40 kDa, 47 kDa, 85 kDa, 130 kDa y 145 kDa. Estos antígenos pueden purificarse a partir de cultivos de Ehrlichia o producirse con métodos de ácido nucleico recombinante. La presente invención pretende incluir fragmentos y péptidos sintéticos de estos antígenos. En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un polipéptido substancialmente puro que comprende el antígeno descrito anteriormente. En otra realización preferida, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que comprende el antígeno o antígenos descritos anteriormente.

50

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión por el antígeno o antígenos descritos anteriormente. 55

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión por el polipéptido descrito anteriormente.

60

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a una sonda de ácido nucleico para la detección de la presencia de un ácido nucleico de Ehrlichia granulocítica en una muestra de un individuo, que comprende una molécula de ácido nucleico suficiente para detectar específicamente en condiciones de hibridación rigurosa la presencia de la molécula descrita anteriormente en la muestra. En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método para detectar un ácido nucleico de Ehrlichia granulocítica en una muestra, que comprende:

65

a) poner en contacto la muestra con la sonda de ácido nucleico descrita anteriormente, en tales condiciones que se produzca la hibridación, y b) detectar la presencia de la sonda unida al ácido nucleico de Ehrlichia granulocítica. 5

ES 2 233 970 T3 En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico para detectar la presencia de un ácido nucleico de Ehrlichia granulocítica en una muestra, que comprende al menos un recipiente que tiene dispuesto en su interior la sonda de ácido nucleico descrita anteriormente. 5

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En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico para detectar la presencia de antígenos de Ehrlichia granulocítica en una muestra, que comprende al menos un recipiente que tiene dispuesto en su interior los anticuerpos descritos anteriormente. En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos contra antígenos de Ehrlichia granulocítica en una muestra, que comprende al menos un recipiente que tiene dispuesto en su interior los antígenos descritos anteriormente. En una realización preferida, el animal a proteger se selecciona entre el grupo compuesto por seres humanos, caballos, ciervos, vacas, cerdos, ovejas, perros y pollos. En una realización más preferida, el animal es un ser humano o un perro. En otra realización, la presente invención se refiere a un método para prevenir la ehrlichiosis en un animal, que comprende administrar al animal la vacuna descrita anteriormente, administrándose la vacuna en una cantidad eficaz para prevenir la ehrlichiosis. La vacuna de la invención se usa en una cantidad eficaz que depende de la vía de administración. Aunque se prefieren las vías de administración intranasal, subcutánea o intramuscular, la vacuna de la presente invención también puede administrarse por vía oral, intraperitoneal o intravenosa. Un especialista en la técnica apreciará que las cantidades a administrar para cualquier protocolo de tratamiento particular pueden determinarse fácilmente sin experimentación indebida. Las cantidades adecuadas están dentro del intervalo de 2 microgramos de la proteína por kg de peso corporal a 100 microgramos por kg de peso corporal.

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Además, pueden usarse cepas atenuadas vivas de Ehrlichia granulocítica como vacunas, como se hace con Brucella abortus (Brucellosis vaccine, Coopers, U.S. Vet. Lic. No: 107). Las líneas celulares no citopáticas, VOG y XUG, pueden ser adecuadas como vacunas atenuadas. 30

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La vacuna puede suministrarse a través de un vector tal como BCG. La vacuna también puede suministrarse como ADN desnudo que codifica antígenos diana. La vacuna de la presente invención puede emplearse en formas tales como cápsulas, soluciones líquidas, suspensiones o elixires para administración oral, o en formas líquidas estériles tales como soluciones o suspensiones. Preferiblemente se usa cualquier vehículo inerte, tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato o cualquier vehículo en el que la vacuna tenga propiedades de solubilidad adecuadas. Las vacunas pueden estar en forma de preparaciones de una sola dosis o en matraces de múltiples dosis que pueden usarse para programas de vacunación en masa. Se hace referencia a Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol (ed.) (1980); y New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al., (eds.); University Park Press, Baltimore, MD (1978), en relación con los métodos de preparación y uso de vacunas. Las vacunas de la presente invención también pueden comprender adyuvantes que mejoran la producción de anticuerpos y de células inmunes. Tales adyuvantes incluyen, pero sin limitación, diversas formulaciones oleosas tales como adyuvante completo de Freund (CFA), el dipéptido conocido como MDP, saponinas (por ejemplo, QA-21, USPN 5.047.540), hidróxido de aluminio o citoquinas linfáticas. El adyuvante de Freund es una emulsión de aceite mineral y agua que se mezcla con la substancia inmunogénica. Aunque el adyuvante de Freund es potente, normalmente no se administra a seres humanos. En su lugar, puede usarse alumbre (hidróxido de aluminio) como adyuvante para administración a un ser humano. La vacuna puede absorberse sobre el hidróxido de aluminio desde el que se libera lentamente después de la inyección. La vacuna también puede encapsularse dentro de liposomas de acuerdo con Fullerton, Patente de Estados Unidos Nº 4.235.877. En otra realización, la presente invención se refiere a un método para identificar Ehrlichia granulocítica en un animal que comprende analizar en el tejido o el fluido corporal del animal la presencia de un ácido nucleico, proteína, polisacárido, lípido o anticuerpo específico contra Ehrlichia granulocítica. El análisis de un ácido nucleico específico para Ehrlichia granulocítica puede realizarse por técnicas de PCR o por técnicas de hibridación (véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, editada por Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Eremeeva et al., Clin. Microbiol. 32:803-810 (1994) que describe la diferenciación entre especies del género Rickettsia del grupo de fiebre manchada por análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción de ADN amplificado por PCR). En Chen et al., J. Clin. Microbiol 32:589-595 (1994) se han descrito sondas de ácido nucleico usadas para analizar ADN genómico de Ehrlichia granulocítica por medio de análisis de PCR. Pueden identificarse proteínas, polisacáridos o anticuerpos específicos contra Ehrlichia granulocítica como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Más específicamente, pueden inducirse anticuerpos contra proteínas específicas contra Ehrlichia granulocítica como se describe en general en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). También pueden obtenerse anticuerpos específicos contra Ehrlichia granulocítica a partir de animales infectados (Mather, T. et al., JAMA 205:186-188 (1994)). 6

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En otra realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión específicamente contra un antígeno de Ehrlichia granulocítica como se ha descrito anteriormente. El antígeno de Ehrlichia granulocítica de la presente invención puede usarse para producir anticuerpos o hibridomas. Un especialista en la técnica reconocerá que si se desea un anticuerpo, puede generarse un péptido como se describe en este documento y usarse como un inmunógeno. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos de estos anticuerpos. La invención también incluye anticuerpos monocatenarios. Pueden generarse fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula por técnicas conocidas, por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin limitación: el fragmento F(ab’)2 ; fragmentos Fab’, fragmentos Fab y fragmentos Fv. Tienen un interés especial para la presente invención anticuerpos contra antígenos de Ehrlichia granulocítica que se producen en seres humanos o están “humanizados” (es decir, que son no inmunogénicos en un ser humano) por tecnología recombinante u otra tecnología. Pueden producirse anticuerpos humanizados, por ejemplo, reemplazando una porción inmunogénica de un anticuerpo con una porción correspondiente pero no inmunogénica (es decir, anticuerpos quiméricos) (Robinson, R.R. et al., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, K, et al., Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison, S.L. et al., Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger, M.S. et al., Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly, S. et al., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better, M. et al., Science 240:1041-1043 (1988); Liu, A.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84:3439-3443 (1987); Liu, A.Y., et al., J. Immunol. 139:3521-3526 (1987); Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84:214-218 (1987); Nishimura, Y. et al., Canc. Res. 47:999-105 (1987); Wood, C.R et al., Nature 314:446-449 (1985)); Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988). Morrison, S.L: (Science, 229:1202-1207 (1985)) y Oi, V.T. et al., (BioTechniques 4:214 (1986)) proporcionan revisiones generales de anticuerpos quiméricos “humanizados”. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos “humanizados” adecuados por CDR o substitución CEA (Jones, P.T. et al., Nature 321:552-525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239:1534 (1988); Beidler, C.B. et al., J. Immunol. 141:4053-4060 (1988)).

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En otra realización, la presente invención se refiere a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal descrito anteriormente. Un hibridoma es una línea celular inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo monoclonal específico. 30

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En general, en la técnica se conocen bien las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales e hibridomas (Campbell, “Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1984); St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:1-21 (1980)). Cualquier animal (ratón, conejo y similares) que se sepa que produce anticuerpos puede inmunizarse con el polipéptido seleccionado. En la técnica son bien conocidos los métodos para inmunización. Tales métodos incluyen inyección subcutánea o intraperitoneal del polipéptido. Un especialista en la técnica reconocerá que la cantidad de antígeno usada para la inmunización variará basándose en el animal que se inmuniza, la antigenicidad del antígeno y el sitio de inyección.

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El antígeno puede modificarse o administrarse en un adyuvante para aumentar la antigenicidad del péptido. En la técnica son bien conocidos los métodos para aumentar la antigenicidad de un antígeno. Tales procedimientos incluyen el acoplamiento del antígeno con una proteína heteróloga (tal como globulina o β-galactosidasa) o por medio de la inclusión de un adyuvante durante la inmunización.

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En el caso de los anticuerpos monoclonales, se retiran células de bazo de los animales inmunizados, se fusionan con células de mieloma y se cultivan para producir células de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales.

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Para identificar la célula de hibridoma que produce un anticuerpo con las características deseadas puede usarse uno cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Éstos incluyen la selección de los hibridomas con un ensayo ELISA, análisis de transferencia de Western o radioinmunoensayo (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175:109124 (1988)). Los hibridomas que secretan los anticuerpos deseados se clonan y se determina la clase y subclase usando procedimientos conocidos en la técnica (Campbell, Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, supra (1984)). En el caso de los anticuerpos policlonales, se aísla antisuero que contiene anticuerpos a partir del animal inmunizado y se investiga la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada usando uno de los procedimientos descritos anteriormente. En otra realización de la presente invención, se marcan de manera detectable los anticuerpos descritos anteriormente. Los anticuerpos pueden marcarse de manera detectable por medio del uso de radioisótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina, avidina y similares), marcadores enzimáticos (tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y similares), marcadores fluorescentes (tales como FITC o rodamina, y similares), átomos paramagnéticos, y similares. En la técnica son bien conocidos procedimientos para realizar tal marcaje, por ejemplo, véase Sternberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval et al., Immunol. 109:129 (1972); y Goding, J. Immunol. Meth. 13:215 (1976). Los anticuerpos marcados de la presente invención pueden usarse para ensayos in vitro, in vivo e in situ para identificar células o tejidos que expresan un péptido específico. 7

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En otra realización de la presente invención, los anticuerpos descritos anteriormente se inmovilizan en un soporte sólido. Los ejemplos de tales soportes sólidos incluyen plásticos tales como policarbonato, carbohidratos complejos tales como agarosa y sepharose, resinas acrílicas tales como poliacrilamida y perlas de látex. En la técnica son bien conocidas las técnicas para acoplar anticuerpos a tales soportes sólidos (Weir et al., “Handbook of Experimental Immunology” 4ª Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Capítulo 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Ezym. 34 Academic Press, N.Y. (1974)). Los anticuerpos inmovilizados de la presente invención pueden usarse para ensayos in vitro, in vivo e in situ así como en inmunocromatografía. Además, un especialista en la técnica puede adaptar fácilmente procedimientos disponibles actualmente, así como las técnicas, métodos y kits descritos anteriormente en relación con los anticuerpos, para generar péptidos capaces de unirse a una secuencia peptídica específica para generar péptidos antipéptidos diseñados de manera racional, por ejemplo, véase Hurby et al., “Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides”, En Synthetic Peptides, A User’s Guide, W.H. Freeman, NY, pág. 289-307 (1992), Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds. Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Kaspczak et al., Biochemistry 28:9230-8 (1989).

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En otra realización, la presente invención se refiere a un método para detectar un antígeno de Ehrlichia granulocítica en una muestra, que comprende a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito anteriormente, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos, y b) detectar la presencia de dicho anticuerpo unido al antígeno. En detalle, los métodos comprenden incubar una muestra de ensayo con uno o más de los anticuerpos de la presente invención y ensayar si el anticuerpo se une a la muestra de ensayo. Las condiciones para incubar un anticuerpo con una muestra de ensayo varían. Las condiciones de incubación dependen del formato empleado en el ensayo, los métodos de detección empleados y el tipo y naturaleza del anticuerpo usado en el ensayo. Un especialista en la técnica reconocerá que cualquiera de los formatos de ensayo inmunológico disponibles comúnmente (tales como radioinmunoensayos, ensayos con inmunoabsorbente unido a enzima, técnica de Ouchterlony basada en difusión, o ensayos inmunofluorescentes de tipo Rocket) puede adaptarse fácilmente para emplear los anticuerpos de la presente invención. Pueden encontrarse ejemplos de tales ensayos en Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985); y Antibodies: a Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Las muestras de ensayo inmunológico de la presente invención incluyen células, proteínas o extractos de membrana de células, o fluidos biológicos tales como sangre, suero, plasma u orina. La muestra de ensayo usada en el método descrito anteriormente variará basándose en el formato de ensayo, la naturaleza del método de detección y los tejidos, células o extractos usados como muestra a ensayar. Los métodos para preparar extractos de proteínas o extractos de membrana de células son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse fácilmente para obtener una muestra que sea capaz con el sistema utilizado.

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En otra realización, la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de anticuerpos contra Ehrlichia granulocítica en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un antígeno descrito anteriormente, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos, y b) detectar la presencia de dicho antígeno unido al anticuerpo. Con detalle, los métodos comprenden incubar una muestra de ensayo con uno o más de los antígenos de la presente invención y ensayar si el antígeno se une a la muestra de ensayo. Se entiende que los métodos de detección de anticuerpos incluyen células enteras o inmunofluorescencia de células fijas (IFA), análisis de transferencia de Western, EIA y RIA. En otra realización de la presente invención, se proporciona un kit que contiene todos los reactivos necesarios para realizar los métodos de detección descritos previamente. El kit puede comprender: i) un primer recipiente que contiene el anticuerpo descrito anteriormente, y ii) un segundo recipiente que contiene un conjugado que comprende una molécula de unión del anticuerpo y un marcador. En otra realización preferida, el kit comprende además uno o más recipientes distintos que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de anticuerpos unidos. Los ejemplos de los reactivos de detección incluyen, pero sin limitación, anticuerpos secundarios marcados o, como alternativa, si el anticuerpo primario está marcado, los reactivos de unión cromofóricos, enzimáticos o de anticuerpo que son capaces de reaccionar con el anticuerpo marcado. El kit compartimentalizado puede ser como se ha descrito anteriormente para los kits de sondas de ácido nucleico. Un especialista en la técnica reconocerá fácilmente que los anticuerpos descritos en la presente invención pueden incorporarse fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en la técnica. Los métodos de diagnóstico y selección de la invención son especialmente útiles para un paciente del que se sospecha que tiene riesgo de desarrollar o de tener ehrlichiosis. De acuerdo con la invención, ahora es posible la investigación presintomática de un individuo en necesidad de tal investigación usando ADN que codifica un antígeno de la invención. El método de investigación de la invención permite un diagnóstico presintomático de la presencia del ADN en un individuo, y de esta manera una opinión con respecto a la probabilidad de que tal individuo desarrolle o haya desarrollado ehrlichiosis. Se desea un diagnóstico precoz para maximizar la intervención oportuna apropiada. 8

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En una realización preferida del método de investigación, se tomaría una muestra de tejido a partir de tal individuo, y en esta muestra se analizaría (1) la presencia de un gen específico de Ehrlichia granulocítica; (2) la presencia de ARNm específico de Ehrlichia granulocítica y/o (3) la presencia de un antígeno específico de Ehrlichia granulocítica (por ejemplo, proteína). El gen específico de Ehrlichia granulocítica puede caracterizarse basándose en, por ejemplo, la detección de modelos de digestión de restricción en ADN “normal” frente al ADN del paciente, incluyendo análisis RFLP, usando sondas de ADN preparadas contra las secuencias de los genes (un fragmento funcional de las mismas) enseñadas en la invención. De manera similar, el ARNm específico de Ehrlichia granulocítica puede caracterizarse y compararse con un ARNm en una muestra. Puede usarse la técnica de PCR para realizar los análisis descritos anteriormente. También pueden detectarse antígenos/proteínas específicas de Ehrlichia granulocítica usando un ensayo biológico para la actividad del antígeno o usando un ensayo inmunológico y anticuerpos. Cuando se ensayan antígenos/proteínas específicas de Ehrlichia granulocítica, se prefiere el ensayo inmunológico por su velocidad. Véase Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). La presente invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplo I Transmisión de Ehrlichia granulocítica 20

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Se recogieron garrapatas I. scapularis adultas de áreas de la Costa Este de los Estados Unidos que tienen alta incidencia de enfermedad de Lyme humana, Condado de Westchester, NY y Condado de Montgomery, PA. La prevalencia de infección por B. burgdorferi sensu stricto en las garrapatas se determinó por medio de un inmunoensayo de fluorescencia directa (Mather, T. et al., Exp. Parasitol. 70:55-61 (1990)) del intestino medio de las garrapatas, y fue de 11/30 (35%) y 16/30 (55%), respectivamente. De cuatro a cinco hembras adultas y un número igual de garrapatas macho de cada sitio de recogida se aplicaron a los perros como se ha descrito previamente (Mather et al., JAVMA 205(2):186188 (1994)). En el momento en el que se realizó el estudio, no fue posible determinar la prevalencia de infección por Ehrlichia en las garrapatas. Se realizaron análisis de química y hematología sanguínea antes y después de la exposición. La infección por borrelia de los perros se confirmó por el desarrollo progresivo de reactividad de transferencia de Western (Cambridge Biotech Corp.). La infección por Babesia, Fiebre Manchada de la Montañas Rocosas (RMSF), y la infección por Ehrlichia se determinaron por IFA usando suero de perros antes y después de la exposición. La tabla 1 demuestra que ninguno de los perros ensayados demostró una evidencia serológica de infección con B. microti, B. gibsonii o Rickettsiella rickettsii antes o después de la exposición. Un perro (EIP) fue débilmente positivo para los anticuerpos contra E. canis, pero fue seronegativo cuando se examinó después de la exposición. Se concluyó que el perro no se había infectado con E. canis. Un perro (DXP) se volvió débilmente seropositivo para anticuerpos contra Babesia canis después de la exposición. Siete de los once perros fueron seropositivos para anticuerpos contra E. equi después de la exposición. Ninguno de estos perros fue seropositivo para anticuerpos contra E. equi antes de la exposición. En los sueros también se ensayó la reacción cruzada con otras especies de Ehrlichia. Los sueros reactivos con E. equi (Ehrlichia granulocítica) no fueron reactivos con E. sennetsu, E. risticci o E. platys. Con pocas excepciones, los sueros reactivos con E. equi tampoco fueron reactivos con E. canis. La reacción cruzada con E. canis fue muy débil (≤1:80) y sólo se observó con sueros que habían tenido la máxima reactividad con E. equi (≥1:1280). Se compararon los parámetros hematológicos de después de la exposición de los perros que se habían infectado con Ehrlichia granulocítica que presentaban reacción cruzada serológica con E. equi, con los de los perros que no se habían infectado. Los resultados mostrados en la tabla 2 indican que antes de la exposición no había diferencias significativas en los recuentos de células sanguíneas entre los perros que finalmente se habían infectado con Ehrlichia granulocítica y los que no se habían infectado. Después de la exposición, los perros infectados con Ehrlichia granulocítica tenían niveles reducidos de neutrófilos y niveles elevados de linfocitos, resultados coherentes con la ehrlichiosis.

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La figura 1 demuestra que las titulaciones de anticuerpos específicos contra Ehrlichia granulocítica de los perros infectados permanecían elevadas durante mucho tiempo después de la exposición. Esto indica que los perros se habían infectado persistentemente. 55

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Ejemplo 2 Condiciones de cultivo para aislamiento de Ehrlichia granulocítica 50

Para intentar aislar Ehrlichia a partir de sangre de perros expuestos a garrapatas Ixodes scapularis recogidas del campo se usaron la línea celular de leucemia promielocítica humana HL-60 (ATCC CCL 240) y la línea de monocitomacrófago murino P388D1 (ATCC TIB 63). 55

Las condiciones de cultivo celular y los medios fueron: RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal inactivado térmicamente al 20%, 1-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM o medios adecuados similares requeridos para mantener la línea de células hospedadoras. No se usaron antibióticos. Las células se mantuvieron en un incubador a 37ºC con un 5% de CO2 (Collins, et al., Nature 270:347-349 (1977)).

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Las células de mamífero se cocultivaron con células sanguíneas de perros por cualquiera de dos métodos. Por medio del método 1, se añadieron 100 µl o 200 µl de sangre entera a cultivos de células HL60 o P388D1, respectivamente. Por medio del método 2, se añadieron 100 µl de granulocitos/monocitos aislados de sangre de perro a un inserto de filtro de cultivo de tejidos suspendido sobre células HL60. El filtro impedía el contacto directo de las células caninas con HL60, pero permitía que las bacterias o virus pasaran a su través. No se obtuvo un aislado de Ehrlichia a partir de la línea de monocitos-macrófagos P388D1, sino que se obtuvo en varios intentos con la línea celular de leucemia promielocítica HL60. Como se muestra en la tabla 3, los dos métodos se usaron satisfactoriamente para obtener aislado de Ehrlichia. La morfología degenerativa de las células se hizo notable muchos pasos después del cocultivo. Como se indica en la

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tabla 3, no fue evidente hasta al menos el día 26 en el que las células se infectaron. En todos los casos excepto dos (VOG y XUG), fue necesario pasar las células infectadas sobre células HL60 no infectadas recientes para mantener el cultivo. Las líneas celulares de Ehrlichia granulocítica que producían un efecto citopático significativo sobre la línea de células hospedadoras de mamífero tuvieron que dividirse sobre células nuevas de dos a tres veces por semana. Es adecuada una relación de división de 1:2 o 1:3 de las líneas de células citopáticas sobre células HL60 nuevas. Las líneas de células no líticas (VOG y XUG) crecen ligeramente más lento que las células HL60 no infectadas, pero son indistinguibles de HL60 por microscopía óptica. Para confirmar que los cultivos estaban degenerando debido al contaminante bacteriano y no a un virus, se realizó el siguiente experimento. Se cultivaron cinco de las líneas celulares infectadas y, en cada caso, se pasaron células (como es habitual), sobrenadantes centrifugados a baja velocidad (sin células de mamífero) o sobrenadantes centrifugados a baja velocidad y filtrados a través de un filtro de 0,2 µm, sobre células HL60 sanas. Los resultados se muestran en la tabla 4. En los cinco casos, la infección se transmitió a las células no infectadas por contacto de célula a célula o por los sobrenadantes sin células de mamífero, pero no por los sobrenadantes sin células de mamífero filtrados. De esta manera, el agente infeccioso era una bacteria con un tamaño mayor de 0,2 µm y no un virus. Se usó PCR para confirmar la presencia de Ehrlichia en las líneas celulares infectadas (XTG, VXG3, XGG y VBH) y la ausencia de Ehrlichia en las líneas celulares no infectadas (HL60) (figura 2). Se usaron cebadores que se sabe que son específicos para el gen de ARN16r de ≥ 90 especies de Ehrlichia (Anderson et al., J. Clin. Microbiol. 29: 28382842 (1991)). Para un análisis posterior por SDS-PAGE y transferencia de Western, se recogieron aproximadamente 1x106 células de mamífero infectadas de las líneas celulares indicadas, se lavaron y se lisaron. Los resultados mostrados en la figura 3 demuestran que al menos 3 antígenos eran detectables en los lisados de células infectadas pero no en las células no infectadas. La detección se realizó usando suero canino de un perro infectado con Ehrlichia granulocítica (UKG) de la exposición experimental que no se encontraba entre los usados para obtener las líneas celulares. También puede aplicarse un análisis de SDS-PAGE y transferencia de Western a antígenos de Ehrlichia granulocítica presentes en sobrenadantes sin células de mamífero de la línea celular VXGE (tabla 5). Se aplicaron antígenos recogidos por centrifugación de alta velocidad de aproximadamente 100 ml de sobrenadantes sin células de mamífero VXG3 a un gel de SDS-PAGE al 10% y después se realizó una transferencia de Western con suero de perro. Se observaron siete antígenos, con pesos moleculares aparentes de 21 kDa, 23 kDa, 47 kDa, 85 kDa, 130 kDa y 145 kDa. Aunque se observó una reactividad débil con algunos sueros no inmunes, estos antígenos solos o en combinación tuvieron buenos valores predictivos positivos y negativos y pueden servir como proteínas de diagnóstico para la infección granulocítica. Cualquiera de estas proteínas, péptidos sintéticos, fragmentos o antígenos recombinantes equivalentes a los mismos puede usarse como vacuna para la prevención de la ehrlichiosis granulocítica. Una línea celular granulocítica humana se ha infectado con una Ehrlichia encontrada en la sangre de perros expuestos a I. scapularis. Los antígenos de esta Ehrlichia cultivada presentan reacción cruzada serológica con E. equi. No hay ningún informe de condiciones de cultivo adecuadas para E. equi. Se han usado antígenos de extractos de células infectadas o sobrenadantes de cultivo para detectar anticuerpos de perros infectados con esta Ehrlichia granulocítica.

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Ejemplo 3 35

Líneas de células hospedadoras alternativas para el mantenimiento de Ehrlichia granulocítica El intervalo de infectabilidad de células hospedadoras se analizó creando un panel de líneas de células humanas, de mono, caninas y murinas procedentes de diversos tejidos y que representaban diversas fases de diferenciación.

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Materiales y métodos Se obtuvieron varias líneas celulares no infectadas a partir de la ATCC y se mantuvieron en cultivo de tejido como se describe en el ejemplo 2. Cada línea celular se ensayó con respecto a la capacidad de actuar como un hospedador para Ehrlichia granulocítica por cocultivo con 5 x 105 células de USG y, por separado, por cocultivo con 5 x 105 células VXG. En estas condiciones, las células USG y VXG se lisarían completamente en algunos días. Todas las divisiones de cultivo posteriores se realizaron en medios limpios. Las células se mantuvieron en cocultivo durante 4 semanas y se observó la morfología. La línea de células no infectadas se mantuvo en cultivo de una forma paralela como control. Se analizaron muestras de cada línea de células de ensayo por PCR usando el método descrito en el ejemplo 2. Resultados Los resultados del experimento de transmisión granulocítica se muestran en la tabla 6. Pudieron infectarse seis de las once líneas celulares. La infección se demostró en cinco de las seis líneas celulares (HL-60, KG1, U937, THP-1 y HEL299) por cambios en la morfología celular así como por análisis de PCR. Una línea celular adicional, AML193, mostró una fuerte citopatología dentro del periodo de observación de cuatro semanas y con mucha probabilidad se había infectado, pero no se realizó PCR. Cuatro de las líneas celulares (DH82, Vero, P388D1 e IC-21) no dieron ninguna indicación de infección por cambios en la morfología celular o por PCR. Una línea celular, JM1, desarrolló una morfología celular poco habitual poco después del cocultivo, pero después volvió a su forma de macrófago normal y el resultado de la PCR fue negativo.

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Discusión

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La capacidad de Ehrlichia granulocítica de infectar a la línea de células de leucemia promielocítica humana HL-60 es coherente con el tropismo celular conocido de las bacterias en pacientes humanos infectados. Se analizó la capacidad de Ehrlichia granulocítica, que se había aislado originalmente en la línea celular de leucemia promielocítica HL-60, para transmitir la infección a otras líneas celulares con diferentes fenotipos. La capacidad de Ehrlichia granulocítica derivada de HL-60 de infectar la línea celular de leucemia mielógena aguda humana, KG-1, es coherente con la 15

ES 2 233 970 T3 tendencia del organismo a infectar células granulocíticas o células que pueden diferenciarse adicionalmente en células granulocíticas. 5

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Ehrlichia granulocítica derivada de HL-60 también es capaz de infectar líneas de células humanas que están más diferenciadas hacia un fenotipo monocítico, tales como U937, THP-1 o AML-193. U937 se ha usado previamente como línea de células hospedadoras para E. risticii. Ehrlichia granulocítica derivada de HL-60 también pudo infectar la línea de células pulmonares embrionarias humanas, HEL299. La infectabilidad de esta línea celular es fortuita, ya que HEL299 es una línea de células de tipo fibroblasto unido que puede usarse en ensayos de placas para ensayos de infectividad. La incapacidad de infectar una línea celular monocítica canina, DH-82, con Ehrlichia granulocítica derivada de HL-60 es interesante, ya que esta línea celular puede actuar como hospedador para varias Ehrlichia monocíticas incluyendo E. canis, E. chaffeensis y E. muris. De manera similar, la incapacidad de infectar la línea celular de tipo monocito-linfoblasto, P388D1, con Ehrlichia granulocítica derivada de HL-60 es interesante, ya que esta línea celular se ha usado como hospedador para E. risticii, una Ehrlichia monocítica. Podría llegarse a una conclusión similar en relación con la línea celular de macrófagos murinos IC-21. La incapacidad de infectar la línea celular pre-B humana, JM-1, con Ehrlichia granulocítica derivada de HL-60 no es sorprendente, ya que este fenotipo celular no se ha identificado como una diana para la infección por ninguna Ehrlichia conocida. La línea celular de riñón de mono verde africano, Vero, también sería un hospedador poco probable para la infección con Ehrlichia granulocítica derivada de HL-60.

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ES 2 233 970 T3 Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle para aclarar y facilitar la comprensión, un especialista en la técnica apreciará tras la lectura de esta descripción que pueden realizarse diversos cambios en la forma y en los detalles sin apartarse de las reivindicaciones adjuntas. 5

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ES 2 233 970 T3 REIVINDICACIONES

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1. Una línea celular seleccionada entre el grupo compuesto por una línea celular de leucemia promielocítica, una línea celular de leucemia mielógena aguda, una línea celular de linfoma histiocítico, una línea celular de tipo monocitomacrófago humano, una línea celular de leucemia monocítica aguda, y una línea de células pulmonares embrionarias, donde dicha línea celular está infectada con E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana. 2. La línea celular de la reivindicación 1, donde la línea celular es una línea celular humana.

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3. La línea celular de la reivindicación 2, donde la línea celular humana es la línea celular de leucemia promielocítica humana. 4. La línea celular de la reivindicación 2, donde la línea celular humana es una línea celular de leucemia mielógena aguda humana. 5. La línea celular de la reivindicación 2, donde la línea celular humana es una línea celular de linfoma histiocítico humano.

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6. La línea celular de la reivindicación 2, donde la línea celular humana es una línea celular de tipo monocitomacrófago humano. 7. La línea celular de la reivindicación 2, donde la línea celular humana es una línea celular de leucemia monocítica aguda humana.

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8. La línea celular de la reivindicación 2, donde la línea celular humana es una línea de células pulmonares embrionarias humanas. 9. La línea celular de la reivindicación 3, donde la línea celular de leucemia promielocítica humana es HL-60 (ATCC CCL-240). 10. La línea celular de la reivindicación 9, donde la línea celular HL-60 infectada es XQH (ATCC CRL-11864). 11. La línea celular de la reivindicación 9, donde la línea celular HL-60 infectada es VXG3 (ATCC CRL-11865).

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12. La línea celular de la reivindicación 4, donde la línea celular de leucemia mielógena aguda humana es KG-1 (ATCC CRL-246). 13. La línea celular de la reivindicación 5, donde la línea celular de linfoma histiocítico humano es U937 (ATCC CRL-1593.2). 14. La línea celular de la reivindicación 6, donde la línea celular de tipo monocito- macrófago humano es THP-1 (ATCC TIB-202).

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15. La línea celular de la reivindicación 7, donde la línea celular de leucemia monocítica aguda humana es AML193 (ATCC CRL-9589). 16. La línea celular de la reivindicación 8, donde la línea celular de pulmón embrionario humano es HEL299 (ATCC CCL-137).

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17. Un método para cultivar de forma continua E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana que comprende infectar una línea celular, donde la línea celular se selecciona entre el grupo compuesto por una línea celular de leucemia promielocítica, una línea celular de leucemia mielógena aguda, una línea celular de linfoma histiocítico, una línea celular de tipo monocito-macrófago humano, una línea celular de leucemia monocítica aguda, y una línea de células pulmonares embrionarias, con E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana, y cultivar la línea celular infectada en un medio de cultivo adecuado. 18. El método de la reivindicación 17, donde la línea celular se infecta por cocultivo de dicha línea celular con células sanguíneas infectadas con E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana dentro de un medio de cultivo adecuado. 19. El método de la reivindicación 18, que comprende además las etapas de: (a) cultivar la línea celular infectada con células cultivadas no infectadas nuevas;

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(b) dividir la línea celular infectada en una relación de división de aproximadamente 1:2 o 1:3 entre las células infectadas y células cultivadas no infectadas nuevas; y

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ES 2 233 970 T3 (c) identificar un efecto citopático sobre la línea celular infectada. 20. Un método para purificar E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana, que comprende: 5

(a) cultivar una línea celular, donde la línea celular se selecciona entre el grupo compuesto por una línea celular de leucemia promielocítica, una línea celular de leucemia mielógena aguda, una línea celular de linfoma histiocítico, una línea celular de tipo monocito-macrófago humano, una línea celular de leucemia monocítica aguda, y una línea de células pulmonares embrionarias, donde dicha línea celular está infectada con E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana; y

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(b) purificar dicha E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana a partir de dicha línea celular infectada. 21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, donde la línea celular es una línea celular humana. 15

22. El método de la reivindicación 21, donde la línea celular humana es una línea celular de leucemia promielocítica humana. 20

23. El método de la reivindicación 22, donde la línea celular de leucemia promielocítica humana es HL-60 (ATCC CCL-240). 24. El método de la reivindicación 23, donde la línea celular HL-60 infectada es XQH (ATCC CRL-11864). 25. El método de la reivindicación 23, donde la línea celular HL-60 infectada es VXG3 (ATCC CRL-11865).

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26. El método de la reivindicación 21, donde la línea celular de leucemia mielógena aguda humana es KG-1 (ATCC CRL-246). 30

27. El método de la reivindicación 21, donde la línea celular de linfoma histiocítico humano es U937 (ATCC CRL1593.2). 28. El método de la reivindicación 21, donde la línea celular de tipo monocito-macrófago humano es THP-1 (ATCC TIB-202).

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29. El método de la reivindicación 21, donde la línea celular de leucemia monocítica aguda humana es AML-193 (ATCC CRL-9589). 30. El método de la reivindicación 21, donde la línea de células pulmonares embrionarias humanas es HEL299 (ATCC CCL-137).

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31. Una vacuna que comprende E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, donde dicha E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana está presente en una cantidad eficaz para inducir anticuerpos protectores en un animal contra E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana. 45

32. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 31, donde dicha E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana no es viable. 50

33. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 31, donde dicha E. equi, E. phagocytophilia o Ehrlichia granulocítica humana está atenuada. 34. El uso de una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33 en la fabricación de un medicamento para prevenir la ehrlichiosis en un animal.

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