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ACIDOS NUCLEICOS Y . SUS COMPONENTES
acidos nucleicos desempeiian varias funciones en los orde bajo peso molecular de
Story Transcript
CUARTA PARTE
ANALISIS DE COMUNIDAD: EXTRACCION Y DERIVATIZACION DE ACIDOS GRASOS TOTALES PERFILES DE ACIDOS GRASOS derivados de los fosfolípidos de membranas celulares de microorganismos pueden ser utilizados para estimar biomasa microbiana (Figura 1). Además, estos perfiles proveen información sobre la estructura taxonómica, diversidad funcional y estatus nutricional de comunidades microbianas. Por ejemplo, perfiles de ácidos grasos han sido usados para distinguir entre comunidades microbianas de suelos sujetos a diferentes tratamientos agrícolas. Finalmente, extracción y análisis de ácidos grasos de organismos puros cultivados bajo condiciones estándares proveen información suficiente para el reconocimiento e identificación a nivel de especies o subespecies (Figura 2). Materiales & Equipos: • • • • • • • •
Tubos de ensayo Pipetas Pasteur y de 1 ml Viales para GC Baños de agua a 80 y 100 oC Bloque térmico Vortex Cromatógrafo de gas Centrífuga
ACIDOS GRASOS TOTALES
Reactivo 1.
45 g NaOH 150 ml metanol 150 ml agua destilada
Reactivo 2.
325 ml 6N HCl 275 ml alcohol metílico
Reactivo 3.
200 ml hexano 200 ml metil ter-butil eter
Reactivo 4.
10.8 g NaOH 900 ml agua destilada
Ejemplo de ácidos grasos típicos membranas de microorganismos.
encontrados
=
O
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
-
OH
Acido Graso 18:0
=
O C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
-
OH-CH3
18:0 metil éster
=
O
C-C-C-C-C-C-C-C-C=C-C-C-C-C-C-C-C-C
-
OH
18:1 cis 9 (ó trans 9)
=
O C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C C OH 19:0 ciclopropano O C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C C-C-C OH 19:0 anteiso O C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C C-C-C OH OH 19:0 iso 3OH OH C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C H 16:0 aldehído O-CH3 C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C O-CH3 16:0 dimetil acetal
-
=
-
-
=
-
-
=
-
-
-
-
-
Figura 1:
2
en
las
-
ACIDOS GRASOS TOTALES
3
METODOLOGIA 1. Colecte asépticamente muestras de suelo de varios lugares. Tambien, podría utilizar muestras de suelo provenientes de su experimento de mineralización de hidrocarburos. Añade 2.0 g de suelo (5.0 g de suelo bajo en materia orgánica) o biomasa bacteriana (de una placa de cultivo) a un tubo con tapa revestida de teflón. 2. Añade 2.0 ml de reactivo de saponificación (Reactivo 1). 3. Vortex brevemente y saponifica a 100 oC por 30 minutos. Permite que los tubos se enfrien a temperatura ambiente. 4. Metila ácidos grasos añadiendo 4.0 ml de Reactivo 2. 5. Vortex brevemente e incuba a 80oC por 10 minutos en baño de agua. Inmediatamente enfría los tubos a temperatura ambiente después de incubación. 6. Los ácidos grasos se extraen añadiendo 1.25 ml de 1:1 hexano:metil-ter butil eter (Reactivo 3). Mezcla invirtiendo los tubos por 10 minutos. La fase orgánica (sobrenadante) es removida con una pipeta Pasteur a un tubo limpio (13 X 100 mm). 7. Repite la extracción (paso #6) y combina fases orgánicas en el mismo tubo. 8. Lava extracto orgánico añadiendo 3.0 ml de Reactivo 4. Mezcla gentilmente por 5 minutos. Centrifuga a 4,000 rpm por 5 minutos para obtener una buena interfase. Transfiere la fase orgánica a un nuevo tubo. 9. Repite el lavado (paso #8). Transfiere la fase orgánica al vial de cromatografía. 10. Análisis de ácidos grasos metilados por cromatografía de gas. Figura 2:
Perfil típico de ácidos grasos observados por cromatografía de gas Staphylococcus aureus
Representación esquemática de los pasos envueltos en la extracción y derivatización de ácidos grasos.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA COSECHA
Cultivo Fresco (Transfiere del tercer cuadrante)
Cuatro Transferencias a Tubo de Ensayo
SAPONIFICACION
Vortex 5-10 seg
Añade 1.0 ml Reactivo #1
Vortex 5-10 seg
100o C 5 min
100o C 20 min
METILACION
Añade 2.0 ml Reactivo #2
Vortex 5-10 seg
80o C 10 min
EXTRACCION
Añade 1.25 ml Reactivo #3
Retenga Fase de Arriba
10 min
LAVADO
Transfiera a Vial de Cromatografía de Gas
10 min
Añade 3.0 ml Reactivo #4
Remueva Fase Inferior
Remueve 2/3 Partes de la Fase Superior
Selle
ACIDOS GRASOS TOTALES
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Datos & Análisis: Hábitat: Fecha colección de muestras: Observaciones (tipo y abundancia relativa de los ácidos grasos presentes en la muestra):
PREGUNTAS... 1. ¿Por qué es importante crecer los cultivos puros bajo condiciones estándares para propósitos de identificación? 2. ¿Por qué se metilan los ácidos grasos antes de su análisis por cromatografía de gas?