UNIVERSIDAD NACIONAL SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO ESCUELA DE POST GRADO

MAESTRIA EN CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ANALISIS SENSORIAL E INSTRUMENTAL EPA 01ACT

06 –ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA Fundamentos Especies absorbentes. Análisis cuali y cuantitativo.

Req: 80 pwr

Dra. Celina Luízar Obregón

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Fundamentos • La espectroscopia infrarroja trata de la interacción de la luz infrarroja (IR) con la materia. • El espectro de las ondas electromagnéticas que se muestran a continuación muestra la ubicación de la banda de IR.

λ = 2.5 to 17 μm ó

n = 4000 to 600 cm-1

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA IR Lejano

(15 – 200 mm ó 667 – 50 cm-1)

o La región por debajo de 400 cm-1, ahora se clasifica como

el infrarrojo lejano o Se caracteriza por vibraciones de baja frecuencia típicamente asignadas a bajas vibraciones de la energía de deformación y los modos fundamentales de estiramiento de átomos pesados​​. o Sólo hay un IR-activo de vibración fundamental que se extiende más allá de 4000 cm-1, que es el modo de estiramiento de HF fluoruro de hidrógeno.

J. Coates, “Vibrational Spectroscopy: Instrumentation for Infrared and Raman Spectroscopy”, Applied Spectroscopy Reviews, 1998, 33(4), 267 – 425.

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA IR Medio

(2.5 – 15 mm ó 4000 – 667 cm-1)

o Se define normalmente como la gama de frecuencias de 4000

cm-1 a 400 cm-1. o El límite superior es más o menos arbitraria, y se eligió originalmente como un límite práctico sobre la base de las características de rendimiento de los instrumentos antiguos. o El límite inferior, en muchos casos, está definida por un componente óptico específico, tal como, un divisor de haz con un bromuro de potasio (KBr) de sustrato, que tiene una transmisión natural de corte justo por debajo de 400 cm-1.

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA IR Cercano

(0.5 – 2.5 mm ó 12500 – 4000 cm-1)

o Los trabajos iniciales de NIR se realizaron con espectrómetros

UV-Vis extendidos. o MIR y NIR se debe considerar en el mismo campo. o Los armónicos NIR se derivan de las bandas fundamentales observadas en el infrarrojo medio.

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Criterio para que un compuesto absorba en el IR: o Cambio en el momento dipolar o Radiación con la correcta longitud de onda

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Fundamentos: Modos normales de vibración

Tipo

Ejemplo

cm-1

IR

RAMAN

estiramiento (sim)

O

C

O

1340

-

+

estiramiento (asim)

O

C

O

2349

+

-

deformación

O

C

O

667

+

-

deformación

O

C

O

667

+

-

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Fundamentos: Vibraciones fundamentales • Los enlaces pueden vibrar seis modos: estiramiento (estiramiento) de estiramiento simétrico y asimétrico, cizalla (tijera), swing (rock), sacudidos (moviendo) y torsión (torcedura), que se representan de la siguiente manera:

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA • Modos normales de vibracion del grupo amida

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA • Uso de isótopos Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1

1 = 27 min 2 = 63 min 3 = 180 min 4 = 21 h

Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974)

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA • Modos normales de vibracion del grupo amida

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA

FTIR MEDIO - MIR

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA INSTRUMENTACIÓN o Según la forma cómo son obtenidas las frecuencias de IR, los espectrofómetros de infrarrojo se pueden clasificar en dos tipos:  Dispersivo  Interferométrico o Dispersivo: la luz es separada en frecuencias individuales por dispersión, usando un monocromador. o Interferométrico: las frecuencias de IR pueden interactuar, este perfil es evaluado para determinar las frecuencias individuales y sus intensidades

INSTRUMENTACIÓN Componentes de los Espectrómetros de IR

IR Source

Sample compartment

Detector

INSTRUMENTACIÓN Componentes de los Espectrómetros de IR

INSTRUMENTACIÓN Espectrómetros Las partes principales de un espectómetro de IR son: o Fuente de radiación IR o Monocromadores o Porta muestra o Detector

Referencia Fuente

Detector

Monocromador

Muestra

Dispositivo de lectura

INSTRUMENTACIÓN Espectrómetros

Diagrama simplificado de un espectrómetro por transformada de Fourier

INSTRUMENTACIÓN Espectrómetros

Diagrama interior de un espectrómetro por transformada de Fourier

INSTRUMENTACIÓN Espectrómetros

Diagrama interior de un espectrómetro por transformada de Fourier

INSTRUMENTACIÓN Espectrómetros o Todos los instrumentos modernos son instrumentos con

transformación de Fourier. o En todos los experimentos de transmisión de radiación de una fuente se dirige a través de la muestra a un detector. o La medida del tipo y la cantidad de luz transmitida por la muestra proporciona información sobre la estructura de las moléculas que comprende la muestra.

INSTRUMENTACIÓN Espectrómetros

INSTRUMENTACIÓN Monocromadores o Convierten la luz policromática en monocromática o Deben ser construidos de materiales que transmiten en IR:  Prismas de haluro de metales  Prismas de NaCl  Rejillas

INSTRUMENTACIÓN Celdas de muestras o El porta muestra debe ser da un álcali como NaCl o KBr. o No se debe usar solventes acuosos, pues estos disuelven

las sales. o Se usan solo solventes orgánicos como cloroformo. o Pueden ser para muestras:  sólidad  líquidas  gases

INSTRUMENTACIÓN Detectores o o o o o

Detectores de termocupla Detectores Thermister Detectores piroelectricos Detectores Golay Detectores Fotoconductivos

INSTRUMENTACIÓN Espectrofotómetro con transformada de Fourier Presenta las siguientes ventajas:

o Aumenta la resolución de las frecuencias. o Aumenta la reproducibilidad de las frecuencias. (equipos antiguos debían ser calibrados antes de cada uso). o Operación rápida o Basado en uso de computador. o Facilmente adaptado para uso remoto (Ej: GC – FTIR)

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras o o o o o

Líquido puro Solución Nujol – Método Mull Pastilla de KBr, NaCl ATR

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras Líquido puro o Pueden obtenerse a partir del propio líquido o a partir de una solución del líquido en un solvente apropiado o Interferencias por la absorción del solvente pueden ser descartadas. o Se coloca una gota de la muestra en un plato (sal de NaCl, KBr, o AgCl), se coloca un segundo plato encima, para proteger.

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras Nujol o El nujol es un aceite mineral que es transparente en el IR, excepto a 2900, 1450, 1375 cm-1. o Tambien puede usarse perfluorokerosene (Fluorolube)

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras KBr o La muestra debe ser pulverizada con KBr (grado IR) seco. o La mezcla se prensa y se obtiene una pastilla que es sometida a analisis.

INSTRUMENTACIÓN Espectrómetros o Para obtener un espectro de IR, la muestra debe ser colocado en un

"recipiente" o célula que es transparente en la región IR del espectro. o El cloruro de sodio o placas de sal son un medio común de colocación de la muestra en el haz de luz del instrumento.

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras

IR transparent Salt Plates

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras

o Estas placas están

hechas de sal y se deben almacenar en un ambiente libre de agua, tales como el desecador que se muestra aquí.

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras

o Las placas también se

deben manejar con guantes para evitar el contacto de la placa con la humedad de las manos.

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras o Para ejecutar un espectro IR

de una muestra de líquido, una o dos gotas de la muestra líquida se aplica a una placa de sal. o Una placa de sal segunda se coloca en la parte superior de la primera de tal manera que el líquido forma una película delgada "sandwich" entre las dos placas.

INSTRUMENTACIÓN Preparación de muestras o El soporte de la celda se coloca

entonces en el haz del instrumento. o La muestra se escanea a continuación por el instrumento utilizando parámetros predestinados. o Un espectro satisfactorio da picos bien definidos, pero no tan intensos como para causar aplastamiento en la parte inferior de los picos.

INSTRUMENTACIÓN Fuentes de energía

Fuente globar: SiC

Filamento de W

Fuente hilo de nicrom incandescente

Laser

Lámpara de mercurio

INSTRUMENTACIÓN Técnica de reflectancia total atenuada o Para obtener un espectro de IR, la muestra debe ser colocado en un

"recipiente" o célula que es transparente en la región IR del espectro. o El cloruro de sodio o placas de sal son un medio común de colocación de la muestra en el haz de luz del instrumento.

INSTRUMENTACIÓN

Técnica de reflectancia total atenuada o Para obtener un espectro de IR, la muestra debe ser colocado en un

"recipiente" o célula que es transparente en la región IR del espectro. o El cloruro de sodio o placas de sal son un medio común de colocación de la muestra en el haz de luz del instrumento.

INSTRUMENTACIÓN Técnica de reflectancia total atenuada o Reflectancia total atenuada o Los medios más densos a menos medios densos o reflectancia completa o Evanescent onda o Penetra varios micrómetros

Diamond tip sample

IR beam

INSTRUMENTACIÓN Técnica de reflectancia total atenuada (ATR) o Para películas delgadas o materiales polvorosos con superficie

suave. o Para materiales que son muy delgados o que absorben fuertemente al ser analizadas por espectroscopía de transmitancia. o Muestras líquidas o No requiere preparación para análisis con ATR.

A cada reflexión, el haz de luz penetra la muestra a una distancia de micrones y es absorbida a frecuencias características. El accesorio más usado es el de selenuro de zinc

INSTRUMENTACIÓN Técnica de reflectancia total atenuada o Cuando el haz de IR penetra la muestra, esta puede ser reflejada fuera de la superficia de una partícula o puede ser transmitida a otra partícula. o La energía reflejada de la superficie, es perdida. o El haz de IR que pasa através de la partícula puede reflejarse a la siguiente partícula o ser transmitida a través de la siguiente partícula. Este evento

reflexión-transmisión puede ocurrir varias veces en la muestra, que incrementa el camino óptico. o Finalmente, esta luz IR dispersa es colectada por un espejo esférico que es orientado hacia el detector. o La luz IR detectada es absorbida parcialmente por las partículas de lamuestra, con la información de la muestra.

INSTRUMENTACIÓN Técnica de FTIR de imagen o Provee un espectro de muestras de 10 mm. o Presenta dos modos: reflectancia y transmitancia. o Usa un modo ATR.

INSTRUMENTACIÓN Técnica de FTIR de imagen

ESPECIES ABSORBENTES

ESPECIES ABSORBENTES

ESPECIES ABSORBENTES

ESPECIES ABSORBENTES

ANALISIS CUALITATIVO 1-deceno

unsat’d C-H

3020-3080 cm-1 C=C 1640-1680

910-920 & 990-1000 RCH=CH2

ANALISIS CUALITATIVO

4-metil-1-penteno

910-920 & 990-1000 RCH=CH2

ANALISIS CUALITATIVO

2-metil-1-buteno

880-900 R2C=CH2

ANALISIS CUALITATIVO 2,3-dimetil-1-buteno

880-900 R2C=CH2

ANALISIS CUALITATIVO BENCENO

=C—H bond, ―Insaturado‖ ―arilo‖ (sp2)

3000-3100 cm-1 + 690-840

mono-sustituido

+ 690-710, 730-770

Orto-disustituido + 735-770 meta-disustituido + 690-710, 750-810(m)

para-disustituido + 810-840(m)

C=C bond

1500, 1600 cm-1

ANALISIS CUALITATIVO

etilbenceno

3000-3100 cm-1 Insat C-H

1500 & 1600 Anillo de Benceno

690-710, 730-770 mono-

ANALISIS CUALITATIVO

o-xilene

735-770 ortho

ANALISIS CUALITATIVO

p-xileno

810-840(m) para

ANALISIS CUALI Y CUANTITATIVO m-xileno

meta 690-710, 750-810(m)

ANALISIS CUALITATIVO Estireno

no sat’d C-H

1640 C=C

910-920 & 990-1000 RCH=CH2

mono

ANALISIS CUALITATIVO

2-fenilpropeno

Sat’d C-H

880-900 R2C=CH2

mono

ANALISIS CUALI Y CUANTITATIVO

Análisis cualitativo

ANALISIS CUALI Y CUANTITATIVO Análisis cuantitativo FTIR cumple la Ley de Beer. o Aplicaciones: o Analizadores de leche: proteinas, grasa y lactosa o Grupos carbonilo del éster de lípidos absorben a 5.73 m (1742 cm-1), o grupos amida de proteína en 6.47 m (1348 cm-1), o Grupos hidroxilo de lactosa a 9.61 micras (1046 cm-1).

ANALISIS CUANTITATIVO Autenticación de refrescos conteniendo sacarosa, glucosa y fructosa Muestas • 28 jugos comerciales • 5 jugos auténticos: manzana, pera, naranja, piña, y pera

puros y con diluciones: 4 -100 %, según su etiqueta de empaque).

• 13 soluciones estándar g/100 L : glucosa (0.5 – 4.0), fructosa (0.5 – 14), sacarosa (0.5 – 8.0)

Leopold, L.F. et al. Quantification of carbohydrates in fruit juices. Spectroscopy 26 (2011) 93–104

ANALISIS CUANTITATIVO Identificación - Cuantificación

Fig. (a) Primera derivada de los espectros de glucosa , fructosa y sucrosa (b) Espectro FTIR glucose (4 g/100 mL), fructosea (14 g/100 mL) y sucrosa (8 g/100 mL ) estándares en paralelo con jugos comerciales de manzana, naranja y durazno.

ANALISIS CUANTITATIVO Identificación Clasificación - PCA

Fig. Diagrama de scores para las dos componentes principales, PC1 y PC2, obtenidos de las muestras genuionas y comerciales de jugos de manzana, naranja y pera

ANALISIS CUANTITATIVO Calibración –Modelo PLS o Las mismas muestras son usadas en el modelo y en la evaluación de calibración. o Se deja una muestra para tratamiento como desconocida. o El sub set del modelo se calibra con las muestras consideradas. Después, se predice el valor de la desconocida. o El proceso se repite con otro subset, hasta que todas las muestras hayan sido dejadas de lado. o Se calcula la varianza residual de validación RMSEP o El modelo de calibración se obtiene usando la 1ª derivada de FTIR de las soluciones estándar de glucosa, fructosa y sucrosa. o Región espectral usada 900 – 1400 cm-1 (calibración y predicción)