APLICACION DE LA CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION AL ANALISIS DE ACIDOS ORGANICOS EN ZUMOS, NECTARES Y BEBIDAS REFRESCANTES HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC APLICATION BY ANALYSIS OF ORGANIC ACIDS IN JUICES, NECTARS AND COOLING DRINKS

Por M.a

J.

1ÓPEZ HERNÁNDEZ,

J.

SIMAL LOZANO y

M.a A.

ROMERO RODRÍGUEZ

Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología. Laboratorio de Bromatología. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago de Compostela. E-15706 Santiago de Compostela RESUMEN Se ha desarrollado un método para la determinación y separac10n por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa de ácidos orgánicos en zumos, néctares y bebidas refrescantes, usando un detector UV. Los ácidos orgánicos principales (tartárico, málico y cítrico) requieren una purificación previa por resinas de intercambio iónico Dowex l. La recuperación encontrada es de 89,6% para el ácido tartárico, 9,4 % para el ácido málico y 98,6% para el ácido cítrico, siendo los coeficientes de variación de 2,4; 2,8 y 3,3 respectivamente. Los ácidos ascórbico, sórbico y benzoico se analizan tras una dilución previa 20/100 y filtrado a través de una membrana de 0,22 JLm. PALABRAS CLAVE : Acidos or gánicos, zumos, néctares, bebidas refrescantes, HPLC .

SUMMARY A reverse phase high performance liquid chromatographic method using a UV detector has been developed for the separation and determination of the organic acids in juices, nectars and cooling drinks, using a cation exchange column Dowex 1 without sample preparation of the major organic acids (tartaric, malic and citric acids). Mean percent recoveries of each acid were tartaric 89,6%, malic 94,4% and citric 98,6%. The coefficients of variation are 2,4; 2,8 and 3,3 respectively. Ascorbic, sorbic and benzoics acids have been analiced after 20/100 dilution and filtration throung 0,22 JLm membrane. KEv WORDS: Organic acids, juices, nectars, cooling drinks, HPLC.

INTRODUCCION Los zumos de frutas, néctares y bebidas refrescantes presentan en su compostewn diferentes ácidos orgánicos constituyentes de las frutas de las que se obtienen (ácidos tartárico, málico, cítrico y ascórbico) o incorporados como aditivos acidulantes (ácidos Anal. Bromatol. XLI-1 (1989), 65-71

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tartánco, málico y cítrico) antioxidantes (ácido ascórbico) o conservadores (ácidos sórbico y benzoico). La aplicación de la cromatografía líquida de alta resolución al análisis cuali y cuantitativo de estos compuestos, es recogida por diferentes autores, como CoPPOLA et al. (1978), GOIFFON et al. (1985), YASEK (1985), PICHA (1985), BADUD y FRATZ (1986), FRAYNE (1986) y los Métodos Oficiales de Análisis de Zumos de frutas y sus derivados, B. O. del E. (1988). El objeto de este trabajo es efectuar el análisis de ácidos orgánicos presentes en las muestras anteriormente citadas mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa, utilizando un detector UV /viS en el que se selecciona la longitud de onda de acuerdo con el tipo de ácido. Así, los ácidos orgánicos mayoritarios (tartárico, málico y cítrico) se leerán a 214 nm, el ácido ascórbico a 254 nm, mientras que para los ácidos sórbico y benzoico, la longitud de onda utilizada es 230 nm.

MATERIAL Y METODOS

Muestras Se han analizado un total de 31 muestras, nueve de zumos, siete de néctares y quince de bebidas refrescantes, todas ellas adquiridas en el mercado.

Preparación de la muestra Para el análisis de los ácidos mayoritarios (tartárico, cítrico y málico) se efectúa una previa neutralización de la muestra con NaOH 1 N hasta pH = 10 que asegure la formación de las sales correspondientes. Una vez neutralizada, se filtra a través de membranas Millipore de 0,22 ¡;..m (Millipore Corporation, Bedford) pasando 20 ml del filtrado a la resina de intercambio iónico básica a la forma de CI-, Dowex 1 {Fluka). La elución de los ácidos se efectúa con 50 ml de Cl Na al 5% (P jv). Para efectuar la separación y determinación de los ácidos ascórbico, sórbico y benzoico, se diluye la muestra 20/100 con agua de grado HPLC filtrándose a continuación por membrana Millipore de 0,22 ¡;..m.

Preparación de patrones Los patrones de los ácidos analizados (tartárico, málico, cítrico, ascórbico, sórbico y benzoico) son de grado analítico (Merck). La dilución de los mismos se ha realizado con Cl Na al 5% (ácidos mayoritarios) y agua de grado HPLC (ácidos ascórbico, sórbico y benzoico), a niveles similares al valor promedio de cada uno de ellos encontrados en las muestras.

Análisis por cromatografía líquida de alta resolución El cromatógrafo utilizado en este trabajo, ha sido un Spectra-Physics equipado con una bomba SP8700XR, inyector 10 ¡;..1, Rheodyne, detector UV /VIs SP8440XR e integrador SP4290.

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DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN ...

La columna empleada en la separación de los ácidos ha sido Spheri 5 RP 18 (Brownlee Labs, USA) con un tamaño de partícula de 5 ¡.tm y dimensiones 220 X 4,6 mm. Como fase móvil se emplea agua de grado HPLC tras ajustar el pH de la misma a 2,2 con ácido sulfúrico (Merck), YASEK (1985) a un flujo de 0,4 ml/min. Las longitudes de onda seleccionadas han sido: ·-

214 nm para los ácidos tartárico, málico y cítrico. 254 nm para el ácido ascórbico. 230 nm para los conservadores (sórbico y benzoico).

Cálculos Se establece el factor de respuesta de cada uno de los ácidos inyectando patrones de concentración conocida: F

=

Factor de respuesta del patrón de ácido, expresada en mg/100 ml A 1 = Area del patrón de ácido C = Concentración de ácido en la muestra expresada en mg/100 ml A 2 = Area del ácido en la muestra 2,5 = Factor de dilución

el = Concentración

C = 2,5 X F X A2

Estudio de la recuperación de la resina de intercambio iónico Se ha efectuado el estudio de la recuperación tras pasar un patrón de concentración conocida de los ácidos tartárico, málico y cítrico, previamente neutralizado con Na OH a través de la columna Dowex 1, de la que se eluye con 50 ml de Cl Na al 5%. Los resultados obtenidos aparecen recogidos en la tabla l.

1

1

Tabla 1 Estudio de la recuperación en las resinas de intercambio catiónico Número de determinación

Acido tartárico

Acido málico

Acido cítrico

1 2 3 4 5 6 7 8 9

92,6 89,0 86,4 89,7 88,3 87,6 89,7 92,5 88,6

94,2 93,8 92,3 91,8 96,7 92,8 96,7 100,1 94,4

92,1 98,6 93,6 93,9 98,5 99,7 100,6 99,3 98,6

Valor promedio ... ......... CV% ... ........ .... ......

89,6 2,36

94,4 2,79

98,6 3,34

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J. SIMAL

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RESULTADOS Y DISCUSION La identificación de cada ácido orgánico se realiza por el tiempo de retención correspondiente a la longitud de onda seleccionada. La figura 1 recoge los registros gráficos de los ácidos tartárico, málico y cítrico en el que los tiempos de retención respectivos son 5,96; 6,76 y 10,37 minutos. La longitud de onda empleada ha sido de 214 nm. El cromatograma correspondiente al ácido ascórbico, a 254 nm, aparece registrado en la figura 2. El tiempo de retención obtenido en las condiciones de trabajo descritas es de 7,13 min. La figura 3 muestra el cromatograma obtenido a 230 nm de los ácidos benzoico y sórbico, que presentan un tiempo de retención de 6,43 min en el caso del ácido benzoico y de 7,29 m in para el ácido sórbico. Los valores encontrados en el análisis de 31 muestras : 9 de zumos, 7 de néctares y 15 de refrescos, aparecen recogidos en la tabla Il. Los resultados se han obtenido de tres inyecciones sucesivas en análisis efectuados dentro de los treinta minutos. En las muestras zumos analizadas, se han encontrado ácido tartárico, en una de ellas 79,3 mg/100 ml. )1 contenido de ácido málico varían entre 38,1 mg/100 y 751,1 mg/100 ml. Se ha encontrado ácido ascórbico en cinco de los nueve zumos analizados, oscilando su valor entre 0,5 y 19,6 mg/100 ml. Los valores de ácido cítrico están entre 29 y 1182 mg/100 mi. Ni en las muestras de zumos ni en las de néctares se han encontrado conservadores. Los niveles de ácido tartárico encontrados en los néctares, oscilan entre 6,0 y 76,2 en siete de las nueve muestras analizadas. En cuanto al ácido málico en los néctares, se ha encontrado en todas las muestras analizadas entre 2,8 y 380 mg/100 ml. El contenido de ácido cítrico en estas muestras está comprendido entre 116,1 y 477 ,0 mg/100 ml. El ácido ascórbico ha podido ser determinado en tres néctares, oscilando sus valores entre 0,1 y 2,2 mg/100 ml. En el análisis de las 15 muestras de bebidas refrescantes, se ha encontrado ácido tartárico en dos de ellas (10,6 y 1,8 mg/100 ml). El ácido málico ha dado resultados positivos en seis de ellas con valores comprendidos entre 16,9 y 659,7 mg/100 ml. El ácido cítrico se ha encontrado en todas las muestras de bebidas refrescantes, oscilando entre 34,0 y 958,1 mg/100 ml, lo cual corrobora la leyenda de su etiqueta, en la que se indica la presencia de acidulantes. De igual manera, en siete muestras en las que se encontró ácido ascórbico entre 1,5 y 19,5 mg/100 ml, aparecía indicado en su etiqueta de composición. En el análisis de conservadores, nueve muestras presentan ácido benzoico entre 4,0 y 35,1 mg/100 ml, mientras que en tres muestras se han encontrado ácido sórbico y benzoico conjuntamente, siendo los niveles encontrados para el ácido benzoico entre 24,1 y 26,1, y para el ácido sórbico entre 3,3 y 17,7 mg/100 ml.

CONCLUSIONES -

Se sugiere un procedimiento de HPLC que permite el análisis de ácidos naturales y /o incorporados como acidulantes (tartárico, málico y cítrico), ácido ascórbico natural o incorporado como antioxidante y de conservadores autorizados en este tipo de muestras (ácidos benzoico y sórbico).

APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN ••.

Fig. 1

Fig. 2

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Fig. 3

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Fig. 1.-Cromatograma de una solución patrón de ácido tartárico, málico y cítrico (200 mg / 100 mi de Cl Na al 5% de cada uno de ellos). 1.• pico = Acido tartárico; 2.• pico = ácido málico; 3.• pico = Acido cítrico; Longitud de onda = 214 nm.; Atenuación = 128; Velocidad del papel = 0,25 cm/min. Fig. 2.-Cromatograma de una solución patrón de ácido ascórbico de 10,0 mg/ 100 ml. Longitud de onda = 254 nm.; Atenuación= 128; Velocidad del papel= 0,25 cm/min. Fig. 3.-Cromatograma de una solución patrón de ácido benzoico y ácido sórbico (3,0 mg / roo mi de cada uno de ellos). Longitud de onda = 230 nm.; 1.• pico = Acido benzoico ; 2.• pico = Acido sórbico ; Atenuación = 128; Velocidad del papel = 0,25 cm/min .

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Tabla 11 Determinación de ácidos orgánicos en muestras de zumos, néctares y bebidas refrescantes Tipo de muestra

Zumo Zumo Zumo Zumo Zumo Zumo Zumo Zumo Zumo

melocotón meloc. y uva. manzana 1 .. . manzana 2 .. . naranja 1 naranja 2 naranja 3 piña 1 piña 2 ...

Néctar Néctar Néctar Néctar Néctar Néctar Néctar

melocotón .. albaric. 1 albaric. 2 .. . naranja 1 .. . naranja 2 .. . naranja 3 .. . piña .. . .. . .. .

B. R.* cola ........ . B. R. naranja 1 ..... . B. R. naranja 2 ..... . B. R. naranja 3 .. . .. . B. R. naranja 4 .. . B. R. naranja S .. . B.R. limon 1 B. R. limón 2 B. R. limón 3 B. R. limón 4 B. R. manzana 1 . .. . B. R. manzana 2 ... . B. R. tónica 1 .. . B. R. tónica 2 .. . B . R. piña . ..... .

á. tartárico á. málico á. cítrico á. ascórbico á. benzóico á. sórbico mg/ 100 ml mg/ 100 ml mg/ 100 ml mg/ 100 ml mg/ 100 ml mg/ 100 ml

79,3 79,2 23,9

65,3 66,8 6,0

10,6 1,8

178,8 79,8 450,0 757,1 109,0 38,1 150,1 308,7 207,0

139,5 220,0 29,0 73,5 695,0 525,0 1.182 438,9 600,6

101,2 51,7 379,8 32,1 2,8 10,6 12,9

119,3 151,5 185,1 395,7 274,5 477,0 116,1

16,9 49,8

51,7

659,7 170,9

18,4

34,0 389,6 331,9 511,0 680,4 412,6 330,2 950,0 633,2 155,5 958,1 189,0 417,5 214,3 536,8

0,5 46,3

19,6 2,8 7,2

2,2 0,1

1,8

1,5 4,4 5,7

4,0 24,1 26,1 35,0 20,7

3,3

19,5 1,7 15,2 2,3

35,1 24,4 9,1 30,4 25,5

14,8

26,1

17,7

• B. R. = Bebida refrescante.

-

Se justifica la utilización de diferentes longitudes de onda para efectuar .la carac~ terización de cada uno de estos compuestos, ya que a 214 nm los ácidos mayoritarios presentan una alta absorbancia a las concentraciones encontradas en las muestras. Debido a la neutralización previa con NaOH el ácido ascórbico se degrada rápidamente, y los ácidos sórbico y benzoico presentan una absorbancia baja, A 254 nm el ácido ascórbico presenta en solución acuosa una alta absorción que permite su identificación y cuantificación.

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Para los conservadores (sórbico y benzoico) se ha empleado la longirud de onda recogida por los Métodos Oficiales de Análisis de Zumos de frutas y derivados (1988), 230 nm. La recuperación encontrada en el análisis de los ácidos mayoritarios (tartárico, málico y cítrico), tras pasar la muestra neutralizada por la resina Dowex 1 oscila entre 89,6 y 98,6 %. Finalmente, del análisis de las muestras efectuado es de destacar la ausencia de ácido tartárico en la muestra de zumo de melocotón y uva, siendo los restantes resultados obtenidos previsibles según la composición de las muestras y los aditivos indicados en su composición.

BIBLIOGRAFIA BADOUDZ, R. y PRATZ, G. (1986): «lmproved High-performance liquid chromatographic analysis of sorne carboxilic acids in food and beberages as their p-nitrobencyl esters». Journal of Chromatography, 360, 119-136. OFICIAL DEL EsTADO (B.O.E): 5 de febrero de 1988, págs 3891-3901. O . M . de 29 de enero de 1988. «Métodos oficiales de análisis de zumos de frutas y otros vegetales y sus derivados.

BoLETÍN

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