TEMA-22.

ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENZIMOLOGÍA

1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico Mejor conocimiento molecular metabolismo Desarrollo de métodos de análisis enzimáticas

2. Herramientas analíticas Purificación de enzimas

3. Terapia enzimática Industria Biotecnológica

8. Inhibidores enzimáticos (Fármacos) Conocimiento estructural y funcional

1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico a) La enzima debe estar presente en fluido biológico b) La enzima debe ser fácil de ensayar y automatizar la medida c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos deben ser significativos y debe haber buena correlación con los valores patológicos. d) La enzima debe ser estable

Tipos de fluidos:

Suero (Más común) y Orina

LCF, Pleura, Sinovial, etc

SUERO 1. Enzimas específicas Enzimas su función radica en el plasma Ej Enzimas de la coagulación, activación del complemento, metabolismo de lipoproteínas, etc

2. Enzimas no específicas Enzimas que son secretadas por los tejidos. Ej. Amilasas, lipasas, fosfatasas, etc. Enzimas intracelulares. Daño Tisular Creatin quinasa 50.000 veces daño en el musculo. Proliferación Celular (Neoplasia) Aclaramiento renal deficiente

DIAGNOSTICO

Enzima específica de tejidos (Raro) -Abundancia relativa Fosfatasa ácida (prostata), Acetilcolinesterasa (eritrocitos)

- Patrón de enzimas característico - Isoenzimas (LDH, Creatin quinasa..

Ciencia forense:, Adenosina deaminasa, adenilato ciclasa, aminopeptidasa, fosfatasa ácida, etc.

ENZIMOLOGIA CLÍNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO Pruebas enzimáticas : Evidencia de la producción de un infarto Seguimiento del progreso y la recuperación tras cirugía

Creatina Quinasa Aspartato aminotransferasa Lactato deshidrogenasa Valor en plasma

Concentración en tejido Velocidad del vertido Grado de degradación

Vida media 10 –130 horas

Creatina Quinasa mas específica

Test depende del tiempo del infarto

LDH se puede diferenciar por electroforesis

Creatina quinasa

Músculo esquelético Músculo cardiaco (Mayor concentración) Cerebro No en el hígado Proteína dimérica: Hay dos tipos de monómeros M y B Músculo M-M (99%) y M-B (1%) Corazón MM (80-70%) y M-B (20-30%) Cerebro B-B (100%)

Pequeño Infarto

M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B)

Lactato deshidrogenasa Hígado, Corazón Inmunoblotting LDH-1 Uso de sustratos específicos

LDH1/LDH2 = 0.85 Normal >1 Enfermo

Transaminasas (ALT y AST) Se utilizan poco actualmente Hígado AST/ALT (3-5) Corazón AST/ALT (20-25)

ENZIMOLOGIA CLÍNICA DE ENFERMEDADES HEPÁTICAS Aspartato aminotransferasa (AST ó GOT) Alanina aminotransferasa (AST ó GPT) Fosfatasa alcalina γ-Glutamil transferasa Otras: Lactato deshidrogenasa, glutation transferasa, etc Transaminasas

Fosfatasa alcalina 4-nitrofenil fosfato

Visible

Enfermedades hepáticas Crónicas Agúdas Intermitentes

γ-Glutamil transferasa

Hepatitis Cirrosis Tumores Obstrucción del conducto biliar

USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLÓGICAS -Diagnóstico de enfermedades -Seguimiento de tratamientos con fármacos (Higado metaboliza drogas) -Seguimiento de operaciones hepáticas TRANSAMINASAS No específicas del plasma Células parenquimales Hepatitis, cirrosis

Necroticas (Hepatitis, cirrosis)

Vertido al plasma

Progreso de la enfermedad

FOSFATASA ALCALINA No específicas del plasma Superficie sinusoidal del células hepáticas y del conducto biliar, Osteoblastos ISOENZIMAS Daños en las células del conducto biliar Ratio Fosf.Alc/Transaminasas Hepatitis 0,2-0,6 Obstrucción del 10-20 conducto biliar

γ-GLUTAMIL TRANSFERASA Alcoholismo crónico

Cirrosis

Incremento síntesis y en la secreción GLUTATION TRANSFERASA Cataliza reacciones de destoxificación utilizando glutation

Carcinogénicos Agentes de quimioterapia Paracetamol Xenobióticos

Contenido alto 5% Vida media corta 90 min Marcador muy rápido y sensible de daño hepático

Tiempo de la Protrombina Función hepática Tiempo requerido para la activación de la protrombina en Trombina Indica grado de funcionamiento hepático Factores de la coagulación están producidos en el hígado y secretados a la sangre Trombina

Cataliza el proceso de coagulación

OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO α-AMILASA

Páncreas Glándulas salivares

Suero normal Baja actividad Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30) Diagnóstico es complicado sin la medida de la amilasa Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30) Amilasa detección en orina debido a bajo Peso Molecular CREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASA Indicadores de desordenes en la musculatura esquelética Creatina quinasa

Músculo esquelético, cardiaco, Cerebro

Distrofia muscular, Daños en el músculo, ejercicio intenso, infarto de miocardio, daño cerebral, etc ISOENZIMAS Fructosa bifosfato aldolasa

Músculo esquelético (otros tejidos) Significado clínico menor Precaución (contaminación Glb rojos)

FOSFATASA ALCALINA Diagnóstico de obstrucción del conducto biliar Enfermedades de huesos Incremento actividad en células formadoras de huesos (Osteoblastos) Osteomalacia Raquitismo Hiperparatiroidismo Enfermedad denominada hipofosfatasia

Actividad Crecimiento cristales de hidroxiapatito Osteoblastos, Hígado, Intestino,

Pirofosfatos inorgánico (substrato) No estrictamente Isoenzimas Placenta Modificaciones Postraduccionales Diferenciación Electroforesis muy complicado Uso de inhibidores, Calor FOSFATASA ACIDA Localización Hígado, eritrocitos, PROSTATA, etc Diagnostico de carcinoma de Próstata Precaución en el muestreo - Lábil - Contaminación con FA de eritrocitos Diferenciación isoformas

- Sensibilidad sustratos - Uso de inhibidores específicos: Formaldehido

2. HERRAMIENTAS ANALÍTICAS: USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE METABOLITOS Uso de la enzima para transformar un metabolito en un producto el cual se pude determinar analíticamente

Ventajas La enzima es muy específica

Metabolito determinado en presencia de otras sustancias Evita la purificación necesaria en un análisis químico Sustancias lábiles

Inconvenientes El costo de la enzimas

Inmovilización Ureasa, Tripsina, Hexoquinasa Inmoviliza en las paredes del tubo Análisis en continuo Inactivación de las enzimas. Presencia de inhibidores, etc

1.

Puntos importantes para utilizar una enzima La posición del equilibrio de la reacción. Deber ser unidirecional y rápido Equilibrio no favorable a) Acoplando la reacción a otra reacción enzimática

b) Trampas químicas. Ej. Glutamato deshidrogenasa

2. Utilizar gran cantidad de enzima Depende de la Vmax y de la Km. 3. La especificidad de la enzima debe ser conocida 4. Pureza enzimática (reacciones colaterales)

Determinación de glucosa Test tolerancia a la glucosa

Metabolismo de la glucosa

Métodos enzimáticos 1. Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa

3. Glucosa deshidrogenasa

NADPH Cambio 340 nm Especificidad segundo paso Visible (Más utilizado) Más interferencias productos sangre

Determinación de ácido úrico Diagnóstico de la gota Método químico y enzimático

Actualmente sólo se utiliza el enzimático Absorbancia (293 nm) Alantoina; Consumo de O2 Acoplado a peroxidasa (H2O2)

Falta especificidad

Determinación de urea Test de la función renal: Suero y orina UREA

Ureasa

Colesterol

Capacidad de filtración glomerular

Carbonato amónico. NH4 Acoplado con glutamato DH

Determinación de colesterol y trigliceridos

Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardio Método químico (colorimétrico) No específico, contaminante

Esteresa Colesterol oxidasa Peroxidasa Absorción a 500 nm Trigliceridos Seguimiento: Diabetes Mellitus, Nefrosis, obstrucción biliar, etc

NADH

Otros metabolitos Creatina Creatina quinasa, Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa

Amonio

Glutamato deshidrogenasa

Tiamina difosfato en eritrocitos Ensayo enzimático usado para detectar una deficiencia en vitaminas Ensayo diagnostica deficiencia en vitaminas Malnutrición Encefalopatía de Wernicke´s Transquetolasa Sujetos normales: Actividad no cambia al añadir Tiamina Enfermos : Actividad al añadir Tiamina

ENZIMA INMUNOENSAYO Método indirecto para determinación de metabolitos, enzimas usadas para amplificar la señal Hormonas, drogas,proteínas, etc Anticuerpos son unidos a una enzima:

Identifican con un anticuerpo. Fácilmente cuantificables Peroxidasas Fosfatasas. etc

Virus, cocaína, anfetaminas opiáceos, anfígenos frente a microorganismos patógenos, etc,

3. Terapia enzimática Principales áreas de trabajo

- Eliminación de sustancias tóxicas de la sangre - Enfermedades genéticas - Cáncer

Degradación de tejidos necróticos usando enzimas proteolíticas (Tripsina, quimiotripsina, Bromelaina, Hialuronidasa). Eliminación de coágulos usando Estreptoquinasa, Uroquinasa, etc. Tratamiento de insuficiencia pancreática (Fibrosis cística) utilizando proteasas inmovilizadas Forma de administración Eliminación de metabolitos (sangre) Endógena: Estreptoquinasa Exógena: Ureasa Bilirrubina oxidasa Posibilidad de usar enzimas inmovilizadas

Tratamiento de Enfermedades genéticas Enfermedades metabólicas. Deficiencias enzimáticas Enfermedad de Gauchers Glucosilceramidasa Acumula un glucocerebrosido en los macrófagos Macrofagos no funcionales Anormalidades hepáticas, óseas, y hematológicas. Tratamiento enzima de placentas humanas Alto coste Enzimas recombinantes Pancreatitis Extros pancreáticos (lipasas, proteasas, amilasas, etc) Microencapsulados pH 6 liberan Fibrosis cística Defecto genético proteína transmembrana (1/2000). Mucosidad espesa , pulmones, estómago, etc Conducto pancreáticos bloqueado Igual que pancreatitis Tubos bronquiales Desosiribonucleasa (Mucosidad ADN y mucopolisacaridos). Xeroderma pigmentoso Defecto genético Individuos muy sensibles a la radiación UV Defecto mecanismo reparador del ADN Tratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicación tópica con liposomas

Cáncer Asparraginasa hidroliza la asparragina

Leucemia aguda limfoblástica Leucemia aguda granulocítica

Tumores Necesitan asparragina Enzima en plantas, animales y bacterias Ausente del suero de los mamiferos Tratamiento en combinación con quimioterapia Fuente es humana, microbiológica genera problemas de rechazo.

Glutaminasa Serina hidratasa Fenilalanino amonio liasa

Experimentación posibles agentes anticancerígenos

Leucina dehidrogenasa

Ciertos tipos de cáncer no tienen la capacidad de sintetizar aminoácidos y los obtienen del suero

Activación de prodrogas Prodrogas son drogas químicamente modificadas y permanecen inactivas hasta que son específicamente activadas. Drogas anticancerosas inhiben etapas específicas de vías metabólicas Metrotrexato análogo estructural del ácido fólico dihidrofolato reductasa No se produce tetrahidrofolato Síntesis ADN EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS Terapia enzimática prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT

Terapia enzimática prodroga genética dirigida GDEPT La enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor en la forma de un gen unido a un vector

4. DETECCIÓN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMÁTICAS Deficiencias enzimáticas debido a problemas genéticos Más de 400 deficiencias

Identificación de un metabolito Ej. Fenilcetonuria Fenilpiruvato Biopsia del tejido y medida de la actividad Pruebas en el ADN

FENILCETONURIA Déficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa

Retraso mental

Prevención dieta

Detección precoz es muy importante

INHIBIDORES ENZIMÁTICOS (FÁRMACOS) Inhibición de la hidroximetilglutaril CoA reductasa Hipercolesterolemia familiar

Niveles de colesterol en sangre

Inhibición de la xantina oxidasa Gota Xantina

Niveles de ácido úrico

Metabolismo de las Purinas

Ácido úrico

Alopurinol Aloxantina SUSTRATO SUICIDA Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa

Inhibidores antiretrovirales nhibidores de la proteasa.

Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA. Enzima proteasa cataliza la ruptura de la poliproteína que encápsula el virus. Necesarios para completar su proceso de replicación dando lugar a nuevos virus

Dimero de 99 aminoacidos

Hidrólisis ácido-base: Aspartico proteasa

Centro activo en el centro de la molécula

Inhibidores análogos del substrato Cambio en el enlace peptídico por un isoester

Conclusiones Medida de actividades enzimática en diagnóstico clínico Enzimas estimación de metabolitos Equipamiento más sofisticado gran automatización Variedad de enzimas puras: Tecnología de ADN Procesos tecnológicos: Inmovilización, Radioinmunoensayo, Inmunoensayo, etc Terapia enzimática

Estudios estructurales

Tecnología de ADN

Diseño de inhibidores