CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO CON LOS SÍNTOMAS DE MOTEADO AMARILLO DE LA OKRA (Abelmoschus esculentus) EN MÉXICO CHARACTERIZATION OF A NEW GEMINIVIRUS ASSOCIATED WITH OKRA (Abelmoschus esculentus ) YELLOW MOTTLE SYMPTOMS IN MÉXICO Rodolfo De La Torre-Almaráz1, Alejandro C. Monsalvo-Reyes1, Jesús Méndez-Lozano2 y Rafael F. Rivera-Bustamente3 1 Unidad de Biotecnología y Prototipos. ENEP-Iztacala.UNAM. México, D. F. Apartado Postal 54090. ([email protected]). 2CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa. Apartado Postal 280, Guasave, Sinaloa. 3 CINVESTAV-IPN-IRAPUATO. Km 9.5 Carr. Irapuato-León. Guanajuato.

RESUMEN

ABSTRACT

En 2000 y 2001, en campos de producción de okra (Abelmoschus esculentus (L.) Moench) en los Estados de Guerrero y Morelos, se observó una enfermedad que causa un rayado amarillo y distorsión severa del fruto, moteado y mosaico amarillo brillante, distorsión y reducción del tamaño de hojas. En algunas ocasiones y en pocas plantas de okra con síntomas, se logró identificar variantes de los virus AMV, TBSV, INSV y a un potyvirus desconocido, por transmisión mecánica en plantas indicadoras y diferenciales, así como por ensayos serológicos ELISA. Sin embargo, ninguno de ellos causó síntomas visibles en plantas de okra sanas en pruebas de transmisión mecánica, sugiriendo que estos virus de ARN no son responsables de la sintomatología observada en campo. El injerto de plantas de okra enfermas a plantas sanas, causó síntomas de rayado en fruto y moteado foliar, confirmando la presencia de un agente patogénico no transmisible de manera mecánica pero sí por injerto. El injerto de segmentos de plantas de Datura stramonium y Capsicum annuum previamente inoculadas por biobalística, utilizando ADN total procedente de plantas de okra enfermas, causó rayado y moteado amarillo en plantas de okra sanas sugiriendo la presencia de un virus de ADN. El análisis de hibridación tipo Dot blot, usando una sonda general (gen de la proteína de la cápside del Pepper huasteco virus) y el ensayo de PCR (utilizando oligonucleótidos degenerados para amplificar el gen de la proteína de la cápside), confirmaron la presencia de un geminivirus en todas las plantas de okra con los síntomas de moteado amarillo procedentes de campo y de las injertadas en el invernadero. Un fragmento de ADN viral de 632 bp, obtenido de los ensayos de la PCR, fue clonado y secuenciado (Número de acceso AF349113). El análisis de la secuencia sugiere que este virus es un nuevo begomovirus que muestra relaciones filogenéticas con el Squash leaf curl virus y el Sida golden mosaic virus. Se sugiere el nombre de Okra yellow mottle virus (OYMV) para este patógeno.

During 2000 and 2001, in okra (Abelmoschus esculentus L. Moench) production units in the States of Guerrero and Morelos, México, a disease was detected which causes yellow streaking and severe distortion of the fruit, bright yellow mottle and mosaic, distortion and reduction of leaf size. On certain occasions, in a few symptomatic okra plants, it was possible to identify variants of the viruses AMV, TBSV, INSV and an unknown potyvirus, by means of mechanical transmission to indicator and differential plants, as well as through ELISA serological assays. However, none of the above caused visible symptoms in healthy okra plants in mechanical transmission tests, which suggests that these RNA viruses are not responsible for the symptoms observed in the field. When healthy okra plants were graft-inoculated with scions from symptomatic okra plants, symptoms of streaking in the fruit and foliar mottling were observed, which confirms the presence of a pathogenic agent that is not transmissible by mechanical means, but which is transmitted by grafting. The grafting of Datura stramonium and Capsicum annum plant segments, which had been previously inoculated by means of biobalistics with DNA from diseased okra plants, caused yellow streak and mottling in healthy okra plants, suggesting the presence of a DNA virus. Results from a Dot blot hybridization analysis using a general probe (protein gene of the Pepper huasteco virus capsid), and the PCR-based assay (using degenerated oligonucleotides to amplify the protein gene of the capsid) confirmed the presence of a geminivirus in all of the okra plants presenting symptoms of yellow mottle from the field and those which had been grafted in the greenhouse. A fragment of 632bp viral DNA, obtained from the PCR assays, was cloned and sequenced (Access No. AF349113). The sequence analysis suggests that this virus is a new begomovirus showing phylogenetic relationship to the Squash leaf curl virus and Sida golden mosaic virus. The name Okra yellow mottle virus (OYMV)

Palabras clave: Angú, virus ADN.

is proposed for this pathogen.

Recibido: Diciembre, 2002. Aprobado: Diciembre, 2003. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 38: 227-238. 2004.

Key words: Angú, DNA virus.

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INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

a okra, angú o gombo (Abelmeschus esculentus. Malvaceae), es un cultivo de origen africano, introducido en México probablemente a mediados de la década de 1970 desde los Estados Unidos. Su cultivo se inició en Iguala, Guerrero, y después se extendió a Baja California Sur, Jalisco, Michoacán, Morelos Tamaulipas y Yucatán. La superficie total cultivada es cercana a 15 000 ha, de temporal y riego, con un rendimiento promedio de fruto de 6.0 t ha−1. Los principales Estados productores por superficie y por producción son Tamaulipas, Guerrero y Morelos. El fruto de okra se exporta a los Estados Unidos y Francia. La superficie total sembrada y el rendimiento promedio es 216 ha y 6.0 t ha−1 en Guerrero, y 252 ha con 12.4 ton ha−1 en Morelos. En ambas entidades la superficie cosechada de okra se duplica o triplica, por las siembras de temporal y riego (DGEA. SARH, 1990). La producción y superficie cultivada de okra ha disminuido en Guerrero, al extremo de que varias empacadoras han cerrado por falta de producción, y en Morelos hay una tendencia similar. La disminución del rendimiento de la okra puede ser causada por enfermedades, entre las que destaca una que causa moteado y mosaico foliar de color amarillo intenso (Figura 1A), que luego causa deformación y reducción severa de la lámina foliar (Figura 1B). Los frutos de las plantas enfermas presentan rayas o bandas alargadas de color amarillo, deformación y enrollamiento, así como pequeñas protuberancias o granos en la epidermis (Figura 1C). Esta enfermedad además de afectar el rendimiento, reduce la calidad de frutos, que son desechados si presentan un exceso de cualquiera de los síntomas descritos, particularmente del rayado amarillo, aún teniendo el tamaño comercial apropiado. Por el tipo de síntomas observados en las plantas de okra, cultivadas en Morelos y Guerrero, a esta enfermedad se le denomina moteado amarillo de la okra. Es probable que los síntomas observados en okra, en el campo, sean de naturaleza viral por agentes aún no caracterizados en México. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue determinar la etiología de la enfermedad del moteado amarillo de la okra que se cultiva en los Estados de Guerrero y Morelos.

kra, angú, or gumbo (Abelmeschus esculentus. Malvaceae), is a crop of African origin, probably introduced into México in the mid 1970s from the United States. It was first cultivated in Iguala, Guerrero, and later in Baja California Sur, Jalisco, Michoacán Morelos, Tamaulipas and Yucatán. The total cultivated area is nearly 15 000 ha of both rainfed and irrigated land, with an average fruit yield of 6.0 t ha−1. The main producer States, in both area and production, are Tamaulipas, Guerrero, and Morelos. The produce is exported to the United States and France. The total cultivated area and average yield in Guerrero is 261 ha and 6.0 t ha−1, and in Morelos, 252 ha with 12.4 t ha−1. In both States, the harvested area is doubled or tripled, because of rainfed and irrigated production (DGEA, SARH, 1990). In Guerrero, okra production and cultivated area have decreased to the point that several packing plants have closed due to lack of production, and in Morelos there is a similar tendency. The decrease in okra yield may be due to diseases, an outstanding example of which causes an intense yellow mottle and mosaic on leaves (Figure 1A), and later causes deformation and severe reduction of the leaf lamina (Figure 1B). The fruit of the diseased plants present yellow streaks or long yellow bands, deformation and curling, in addition to small protuberances or granulation in the epidermis (Figure 1C). Besides affecting yield, this disease reduces the quality of the fruit, which is rejected when it presents an excess of any of the described symptoms, especially the yellow streak, even when it has reached the appropriate commercial size. Because of the type of symptoms observed on okra plants cultivated in the States of Morelos and Guerrero, the disease was named okra yellow mottle virus. It is likely that the symptoms observed on okra in the field are of a viral nature caused by agents that have not yet been characterized in México. Therefore, the objective of this study was to determine the etiology of the yellow mottle disease in okra cultivated in the States of Guerrero and Morelos.

L

O

MATERIALS AND METHODS Separation of the virus

MATERIALES Y MÉTODOS Mechanical transmission Separación de virus Transmisión mecánica Porciones de hojas, tallos, raíces y flores de plantas de okra con síntomas del moteado amarillo, fueron maceradas en solución

Portions of leaves, stems, roots and flowers of okra plants with yellow mottle symptoms were macerated in a buffer solution of phosphates 0.02 M pH 7.0-DIECA (1g 10−1 mL). The macerate of each portion of affected plant was used independently to rub onto leaves of seedlings (three to four true leaves) of the following

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Figura 1. Síntomas virales en plantas de okra en parcelas comerciales de los Estados de Guerrero y Morelos. A) Síntomas de moteado amarillo en plántulas; B) síntomas de moteado amarillo, reducción y deformación de hojas de plantas maduras; C) rayado amarillo y deformación de frutos. Figure 1. Viral symptoms in okra plants at commercial plots of the States of Guerrero and Morelos. A) Symptoms of yellow mottle in seedlings; B) symptoms of yellow mottle, reduction and deformation of leaves of mature plants; C) yellow streaking and deformation of fruits.

amortiguadora de fosfatos 0.02 M pH 7.0-DIECA (1g 10 mL−1). El macerado de cada porción de planta afectada fue utilizado en forma independiente para frotar hojas de plántulas (tres a cuatro hojas verdaderas) de las siguientes especies indicadoras: Gomphrena globosa, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Beta vulgaris, Cucumis sativus, C. melo, Cucurbita pepo var. Gray Zucchini, Pisum sativum var. Sta Elena, Vigna unguiculata var. Blackeye, V. unguiculata subsp. sisquepedalis, Phaseolus vulgaris var. Madero, Datura stramonium, Nicotiana glutinosa, N. rustica, N. tabacum var. xanthi, N. benthaminana, Lycopersicon esculentum var. Royal Ace, Capsicum annuum var. Ancho y Abelmoschus esculentus. Las plantas se mantuvieron en invernadero (25 a 30 oC) hasta la aparición de síntomas (Dijkstra y De Jager, 1998). Transmisión por injerto Plantas de tomate, chile, D. stramonium y okra con cinco a seis hojas verdaderas y 20 cm de altura (cinco plantas por especie, todas producidas por semilla en invernadero), fueron injertadas lateralmente con púas procedentes de plantas de okra, recolectadas en campo, y con síntomas del moteado amarillo. El injerto se fijó al portainjerto con cinta parafilm, las plantas se cubrieron con bolsas de plástico por 10 d y se mantuvieron en invernadero (25 a 30 oC) hasta la aparición de síntomas. Las plantas injertadas con síntomas de origen viral fueron utilizadas para injertar posteriormente plantas de okra sanas producidas en invernadero (Dijkstra y De Jager, 1998). Ensayo serológico ELISA Hojas y flores de okra recolectadas en campo con los síntomas de moteado amarillo fueron analizadas con el ensayo serológico ligado a enzimas en doble sandwich (DAS-ELISA) en dos días, para la detección de diferentes tipos de virus de ARN. Las plantas indicadoras y diferenciales utilizadas en la separación de virus en invernadero, que manifestaron algún síntoma de probable origen viral también fueron

indicator species: Gomphrena globosa, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Beta vulgaris, Cucumis sativus, C. melo, Cucurbita pepo var. Gray Zucchini, Pisum sativum var. Sta Elena, Vigna unguiculata var. Blackeye, V. unguiculata subsp. sisquepedalis, Phaseolus vulgaris var. Madero, Datura stramonium, Nicotiana glutinosa, N. rustica, N. tabacum var. xanthi, N. benthaminana, Lycopersicon esculentum var. Royal Ace, Capsicum annuum var. Ancho, and Abelmoschus esculentus. The plants were kept in a greenhouse (25 to 30 oC) until symptoms appeared (Dijkstra and De Jager, 1998). Transmission by grafting Tomato, chili, D. stramonium and okra plants 20 cm tall with five to six true leaves (five plants per species, all produced from seed in a greenhouse) were grafted laterally with scions from okra plants with yellow mottle symptoms collected in the field. The graft was attached to the rootstock with parafilm tape, the plants were covered with plastic bags for 10 d and kept under greenhouse conditions (25 to 30 oC) until symptoms appeared. The grafted plants with viral symptoms were later used to graft onto healthy okra plants produced in a greenhouse (Dijkstra and De Jager, 1998). ELISA serological assay Okra leaves and flowers with yellow mottle symptoms collected in the field were analyzed with the double sandwich enzyme-linked serological assay (DAS-ELISA) on two days for the detection of different types of RNA virus. The indicator and differential plants used in the separation of the virus in a greenhouse that exhibited some symptom of likely viral origin, were also analyzed by ELISA. Commercial polyclonal antiserums were used to detect the Tomato spotted wilt virus (TSWV), Impatiens necrotic spotted virus (INSV), Alfalfa mosaic virus (AMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV), Tobacco ringspot virus (TRSV), Tobacco streak

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analizadas por ELISA. Se utilizaron antisueros policlonales comerciales para la detección de los virus de la marchitez manchada del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV), de la mancha necrótica del Impatiens (Impatiens necrotic spotted virus, INSV), del mosaico de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus, AMV), del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV), del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic virus, TMV), de la mancha anular del tabaco (Tobacco ringspot virus, TRSV), del estriado del tabaco (Tobacco streak virus, TSV), del enanismo arbustivo del tomate (Tomato bushy stunt virus, TBSV) y del jaspeado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV). Los antisueros y procedimientos de uso fueron adquiridos en Agdia Co. (EE.UU.) La absorbencia de las posibles reacciones antígeno anticuerpo fueron registradas en un Microlector con filtro de 492 nm, 20 y 60 min después de la adición del sustrato. La reacción fue considerada positiva si la absorbencia era igual ó superior a la lectura de los testigos positivos para cada virus, incluidos en el equipo de detección serológica (Clark y Adams, 1977). Extracción y análisis de ADN viral Dado que los síntomas de origen viral pueden ser causados por geminivirus, virus cuyo genoma está constituido de ADN, se realizó la extracción de ADN total de 1g de hojas de las muestras de okra recolectadas en campo, así como de plantas sanas de okra cultivadas a partir de semilla en invernadero y que se utilizaron como testigos negativos (Dellaporta et al., 1983). Veinte microlitros del extracto de ADN fueron fraccionados por electroforesis en geles de agarosa (1.0 %), conducida en solución amortiguadora TBE 1x (0.089 M Tris-base, 0.082 M ácido bórico, 0.002 M EDTA pH 8.0), a 100 V, por 1 h. En la electroforesis, además del ADN extraído de plantas de okra enfermas, se incluyó ADN total de plantas infectadas con el virus huasteco del chile PHV (Pepper huasteco virus. Familia Geminiviridae, Género Begomoviridae) como testigo positivo, ADN A del PHV (monómero), linearizado con la enzima Hind III, y como referencia ADN total de plantas sanas y el marcador de peso molecular 1 kb (Sambrook et al., 1989; Torres-Pacheco et al., 1996). Transmisión por biobalística Plántulas con dos a cuatro hojas verdaderas de chile, tomate, N. rustica, N. tabacum var. xanthi, N. glutinosa y N. benthamiana, así como C. quinoa, C. amaranticolor fueron inoculadas por biobalística usando micropartículas de tungsteno (50 µL), mezcladas con 5 µL de ADN viral (1 µL L−1) que se obtuvo de las plantas indicadoras inoculadas por transmisión mecánica y por injerto en el invernadero, pero sólo de las que se confirmó por hibridación tipo Dot-blot (descrita más adelante) que estaban infectadas con geminivirus. Las partículas de tungsteno impregnadas con ADN viral fueron proyectadas hacia la parte superior de las plántulas con presión de helio a 800 o 1200 psi usando un acelerador Du Pont (PDS-1000). Las hojas de las plantas bombardeadas fueron lavadas brevemente con agua destilada para retirar el exceso de desechos del bombardeo. El ensayo de transmisión por biobalística se realizó por triplicado. Las plantas bombardeadas fueron mantenidas en laboratorio por 12 h, después transferidas a una cámara bioclimática

virus (TSV), Tomato bushy stunt virus (TBSV), and Tobacco etch virus (TEV). The antiserums and procedures were acquired from Agdia Co. (USA). Absorbance of the possible antigen antibody reactions were recorded in a Microlector with a 492 nm filter, at 20 and 60 min after the addition of the substrate. The reaction was considered positive if absorbance was equal to or above the reading of the positive controls for each virus included in the serological detection equipment (Clark and Adams, 1977). Viral DNA extraction and analysis Given that symptoms of viral origin can be caused by geminivirus, whose genome is constituted of DNA, total DNA was extracted from 1 g of leaves of okra samples collected in the field, as well as from healthy okra plants grown from seed in the greenhouse, which were used as negative controls (Dellaporta et al., 1983). Twenty microliters of the DNA extract were fractioned by electrophoresis in agar gels (1.0%), conducted in a TBE buffer solution 1x (0.089 M Tris-base, 0.082 M boric acid, 0.002 M EDTA pH 8.0), at 100 V for 1 h. In the electrophoresis, in addition to the DNA extracted from diseased okra plants, total DNA of plants infected by the Pepper huasteco virus, family Geminiviridae, genus Begomoviridae (PHV), was included as a positive control, DNA A from PHV (monomer), linealized with the enzyme Hind III, and as a reference total DNA from healthy plants and the molecular weight marker 1 kb (Sambrook et al., 1989; TorresPacheco et al., 1996). Transmission by biobalistics Chili, tomato, N. rustica, N. tabacum var. xanthi, N. glutinosa and N. benthamiana, as well as C. quinoa, C. amaranticolor seedlings, with two to four true leaves, were inoculated by biobalistics using microparticles of tungsten (50 µL), mixed with 5 µL of viral DNA (1 µL L−1) obtained from the indicator plants inoculated by mechanical transmission and by grafting in the greenhouse, but only from those that were confirmed to be infected by geminivirus by Dot-blot type hybridization (described below). The tungsten particles impregnated with viral DNA were projected onto the upper part of the seedlings with helium pressure at 800 or 1200 psi using a Du Pont accelerator (PDS-1000). The leaves of the bombarded plants were washed briefly with distilled water to remove the excess of residues from the bombardment. The assay of transmission by biobalistics was performed in triplicate. The bombarded plants were kept in laboratory conditions for 12 h and later transferred to a bioclimatic chamber with white light and a uniform temperature of 25 oC until symptoms appeared. The plants were transferred to the greenhouse (25 to 30 oC) where they were kept for the mechanical transmissions and grafting tests (Garzon et al., 1993). Leaves of chili plants bombarded with DNA obtained from okra plants with yellow mottle symptoms and exhibiting some symptom of probable viral origin were used for mechanical transmission in okra seedlings with two to four true leaves and transmission by grafting on 20-cm tall okra plants, as described above, until symptoms appeared.

DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE OKRA con luz blanca y temperatura de 25 oC continua, hasta la aparición de síntomas. Las plantas se transfirieron al invernadero (25 a 30 oC), donde se conservaron para realizar ensayos de transmisión mecánica y por injerto (Garzón et al., 1993). Hojas de plantas de chile bombardeadas con el ADN obtenido de plantas de okra con síntomas de moteado amarillo, y que manifestaron algún síntoma de probable origen viral, fueron utilizadas para la transmisión mecánica en plántulas de okra con dos a cuatro hojas verdaderas, y transmisión por injerto en plantas de okra de 20 cm de alto, como se describió previamente, hasta la aparición de síntomas. Hibridación molecular Para detectar la presencia de geminivirus en las muestras recolectadas en campo, así como en el material vegetativo inoculado mecánicamente, por injerto o por biobalística, se realizó una hibridación molecular tipo Dot-blot y después una del tipo Southern para precisar el tamaño molecular del virus involucrado. Como sonda se utilizó el fragmento del gen clonado de la proteína de la cápside del virus huasteco del chile (PHV). La sonda fue marcada con el kit “Genes Images random prime labelling” (Amersham Life Science). Para el ensayo Dot-blot, el ADN de las muestras fue transferido directamente a membranas de Nylon Hybond (+), aunque también fue fraccionado por electroforesis en geles de agarosa y posteriormente transferido por capilaridad a una membrana de Nylon Hybond (+). Las membranas fueron prehibridadas e hibridadas a 65 oC, en condiciones de alta astringencia, usando en su oportunidad la sonda respectiva. Las autoradiografias fueron preparadas colocando las membranas hibridadas en casetes para exposición utilizando película Kodak X-Omat. Durante la exposición la película y membrana fueron almacenadas a temperatura ambiente por 2 h (Surzycki, 1999; Sambrook et al., 1989). Amplificación de ADN viral por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La prueba de la PCR se realizó únicamente con el ADN de las muestras de okra que mostraron síntomas del moteado amarillo y que estaban infectadas por geminivirus según los ensayos de hibridación tipo Dot-blot. La amplificación del ADN viral por la PCR se hizo con los oligonucleótidos MOT/CP, que amplifican un segmento de 650 pb del componente A de geminivirus y que incluye la región común (RC) y parte del gen de la proteína de la cápside (CP) (Ascencio-Ibañez et al., 2002). La mezcla final de reacción de la PCR (50 µL volumen total) tenía 2.5 mM MgCl2, buffer de reacción 1x, 200 µM mezcla de dNTP’s, 0.2 µM de cada oligonucleótido, 2.5 unidades de Taq ADN polimerasa (Amplitaq ADN polimerasa Perkin-Elmer), y 1 µL (100 ng) de las muestras de okra sospechosas de estar infectadas con geminivirus, de muestras de malezas que crecen junto a la okra y de aquellas que se utilizaron como testigos negativos y positivos. La mezcla de reacción fue incubada en un termociclador Perkin Elmer para 35 ciclos de reacción. Cada ciclo consistió en la incubación por 1 min a 94 oC, 1 min a

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Molecular hybridization To detect the presence of geminivirus in the samples collected in the field, as well as in plant material mechanically inoculated with biobalistics or grafting, initially a Dot-blot type molecular hybridization was performed, and later one of the Southern type, to precisely determine the molecular size of the virus involved. As a primer, a fragment of the cloned gene of the protein capsid of the PHV was used. The primer was marked with the “Genes images random primer labeling” kit (Amersham Life Science). For the Dot-blot assay, DNA from the samples was directly transferred to Nylon Hybond (+) membranes, although it was also fractionated by electrophoresis in agarosa gel and later transferred by capilarity to Nylon Hybond (+) membrane. The membranes were prehybridized and hybridized at 65 oC, under conditions of high astringency, with the timely use of the respective primer. The autoradiographs were prepared by placing the hybridized membranes in cassettes for exposure, using Kodak X-Omat film. During exposure, the film and membrane were stored at room temperature for 2 h (Surzycki, 1999; Sambrook et al., 1989). Amplificiation of viral DNA by polymerase (PCR) chain reaction The PCR test was performed only with DNA from the okra samples that exhibited symptoms of yellow mottle and, in the dot-blot hybridization tests, were shown to be infected by geminivirus. For amplification of the viral DNA by PCR, MOT/CP oligonucleotides were used. These amplify a 650 pb segment of the A component of geminivirus and include a common region (CR) and part of the capsid protein gene (CP) (Ascencio-Ibañez et al., 2002). The final PCR reaction mixture (50 µL total volume) consisted of 2.5 mM MgCl2, 1x reaction buffer, 200 µM mixture of dNTP’s, 0.2 µM of each oligonucleotide, 2.5 units of Taq DNA polymerase (Amplitaq DNA polymerase Perkin-Elmer), and 1 µL (100 ng) of the okra samples suspected of being infected by geminivirus, of samples of weeds that grow near the okra, and of those that were used as negative and positive controls. The reaction mixture was incubated in a Perkin Elmer thermocycler for 35 cycles of reaction. Each cycle comprised incubation for 1 min at 94 oC, 1 min at 56 oC and 1 min at 72 oC for 35 cycles. The amplified products were analyzed directly by electrophoresis in 1.4% agar gels (Mehta et al., 1994). Cloning and sequencing The product of amplification was separated from the agar matrix (GenClean) and cloned in E. coli strain DH5a, using the vector pCR TOPOII (Invitrogen) (Sambrook et al., 1989). The cloned products were analyzed in a sequencer, Applied Biosystem Genetic Analyzer 377. The nucleotide sequence was compared for identification with sequences available in the GenBank database using the Clustal method (MegAlign, DNA Star software, Madison, WI) (Sanger et al., 1977).

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56 oC y 1 min a 72 oC por 35 ciclos. Los productos amplificados fue-

RESULTS AND DISCUSSION

ron analizados directamente por electroforesis en geles de agarosa a 1.4% (Mehta et al., 1994).

Separation of the virus

Clonación y secuenciación El producto de amplificación fue separado de la matriz de agarosa (GenClean) y clonado en E. coli cepa DH5a utilizando el vector pCR TOPOII (Invitrogen) (Sambrook et al., 1989). Los productos clonados fueron analizados en un secuenciador Applied Biosystem Genetic Analizer 377. La secuencia nucleotídica fue comparada para su identificación con secuencias disponibles en la base de datos del GenBank, utilizando el método Clustal (MegAlign, DNA Star software, Madison, WI) (Sanger et al., 1977).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Separación de virus Transmisión mecánica Los casos donde se separó algún virus por transmisión mecánica, se caracterizaron considerando los síntomas obtenidos por inoculación mecánica en plantas indicadoras y después en plantas diferenciales (algunas se incluyen en las figuras respectivas). Además, se confirmó su identidad mediante ensayos serológicos tipo ELISA. Se separó e identificó al virus mosaico de la alfalfa (AMV), que causó lesiones locales necróticas y mosaico en Gomphrena globosa y C. amaranticolor con mosaico sistémico; además de lesiones locales cloróticas en Vigna sinnensis (Figura 2A). En plantas de okra no se observó ningún tipo aparente de síntomas. Este virus se separó fácilmente de los pétalos frescos de la okra, pero no se logró separar de hojas, tallos o raíz, recolectadas en campo (Van Vloten, 1981). Otro virus que se separó de flor y follaje fue el virus de la mancha necrótica del Impatiens (INSV), cuyos daños más significativos fueron la aparición de un mosaico y moteado suave, después patrones perineales, primero cloróticos y al final necróticos, en las hojas inoculadas de D. stramonium, C. annuum y N. rustica (Figura 2B). La necrosis de las hojas pronto se generalizó hasta causar la muerte de la planta. El INSV tampoco indujo síntomas por transmisión mecánica en plantas de okra en el invernadero (Brunt, 1995). Un tercer virus detectado fue el del enanismo arbustivo del tomate (TBSV), el cual fue propagado a partir de hojas y raíces de plantas de okra. TBSV causó lesiones locales necróticas, manchas irregulares de color blanquecino y deformación severa de hojas en Datura stramonium; lesiones locales necróticas y deformación de hojas en chile; y pequeñas lesiones locales necróticas en forma de anillo, hiponastia y deformación en hojas

Mechanical transmission The cases in which a virus was separated by mechanical transmission were characterized considering the symptoms obtained by mechanical inoculation in indicator plants and later in differential plants (some are included in the respective Figures). Also, their identity was confirmed with ELISA-type serological assays. The alfalfa mosaic virus (AMV) was separated and identified; this virus caused localized necrotic lesions and mosaic in Gomphrena globosa and C. amaranticolor, with systemic mosaic as well as local chlorotic lesions in Vigna sinensis (Figure 2A). In okra plants, no apparent type of symptoms was observed. This virus was easily separated from fresh okra petals, but it could not be separated from leaves, stems or roots collected in the field (Van Vloten, 1981). Another virus that was separated from flower and foliage was the Impatiens necrotic spot virus (INSV). The most significant damage this virus caused was the appearance of a soft mosaic and mottle; later oak-leaf patterns appeared, first chlorotic and finally necrotic, on inoculated D. stramonium, C. annuum and N. rustica leaves (Figure 2B). The leaves necrosis soon generalized until causing death of the plant. However, INSV transmitted mechanically did not induce symptoms in okra plants in the greenhouse (Brunt, 1995). A third virus detected was the Tomato bushy stunt virus (TBSV), which was propagated from leaves and roots of okra plants. TBSV caused localized necrotic lesions, irregular whitish spots and severe deformation in Datura stramonium leaves, localized necrotic lesions and deformation of leaves in chili, and small localized necrotic ring-shaped lesions, hyponasty, and deformation of leaves in tomato (Figure 2C). This virus did not cause any type of symptom in okra plants inoculated in the greenhouse (Martelli, 1990). Finally, a fourth virus was separated by mechanical transmission. This virus caused small necrotic semicircular spots, mosaic, and leaf deformation in N. tabacum var. Xanthi. In D. stramonium, it caused severe deformation of leaves, yellow chlorotic mottle, and multiple small pale yellow spots (Figure 3A). In N. benthamiana plants, the virus caused a light yellow mosaic, severe deformation and reduction in size of the rest of the inoculated leaves (Figure 3B). The characteristics of the induced symptoms in inoculated hosts, principally D. stramonium and N. benthamiana, indicate that these plants were infected by at least one potyvirus, similar to the Tobacco etch virus (TEV).

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Figura 2. Síntomas inducidos por virus separados de okra por transmisión mecánica en plantas diferenciales: A) Lesiones locales cloróticas por virus mosaico de la alfalfa (AMV) en Vigna unguiculata; B) mosaico por virus de la mancha necrotica del Impatiens (INSV) en N. rustica; C) anillos necróticos por virus enanismo arbustivo del tomate (TBSV) en tomate, en invernadero. Figure 2. Symptomps induced by virus separated from okra by mechanical transmission in differential plants: A) Localized chlorotic lessions by Alfalfa mosaic virus (AMV) in Vigna unguiculata; B) mosaic by Impatiens necrotic spotted virus (INSV) in N. rustica; C) necrotic rings by Tomato bushy stunt virus (TBSV) in tomato, in the greenhouse.

de tomate (Figura 2C). Este virus no causó ningún síntoma en plantas de okra inoculadas en invernadero (Martelli, 1990). Finalmente, se separó, por transmisión mecánica, un cuarto virus que causó pequeñas manchas semicirculares necróticas, mosaico y deformación foliar en N. tabacum var. Xanthi. En D. Stramonium este virus causó deformación severa de hojas, moteado clorótico amarillo y múltiples manchas pequeñas amarillas pálidas (Figura 3A). En plantas de N. benthamiana este virus causó un mosaico amarillo claro, deformación severa y reducción del tamaño del resto de las hojas inoculadas (Figura 3B). Las características de los síntomas inducidos en los hospedantes inoculados, principalmente en D. stramonium y N. benthamiana, indican que estas plantas estaban infectadas por al menos un potyvirus, semejante al virus jaspeado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV). Sin embargo, este virus no causó síntomas en plantas de okra por inoculación mecánica (Purcifull, 1981). En resumen, ninguno de los virus de ARN separados por transmisión mecánica en plantas indicadoras y diferenciales, fue capaz de reproducir los síntomas observadas en plantas de okra en el campo.

However, this virus did not cause symptoms in okra plants inoculated mechanically (Purcifull, 1981). Summarizing, none of the RNA viruses separated by mechanical transmission from indicator and differential plants, were able to reproduce the symptoms observed in okra plants in the field.

Transmisión por injerto

ELISA serological assays

El injerto de ramas con hojas de okra recolectadas en campo causó moteado y mosaico amarillo, con ligera deformación y reducción de la lámina foliar, en plantas de okra producidas por semilla en el invernadero (Figura 4A). El injerto de ramas de okra enfermas causó amarillamiento y deformación ligera de hojas en tomate, mientras en chile se observaron síntomas de mosaico, moteado, deformación severa de hojas y enanismo; en D.

With ELISA, direct detection of virus in field okra plants with yellow mottle symptoms was negative in all of the cases. Therefore, with this technique it was not possible to identify any known virus related to the symptoms observed in the okra plants from the field or in material obtained by grafting in the greenhouse. However, in the few cases in which separation of a virus from okra plants was achieved by mechanical transmission to host

Transmission by grafting Grafting scions with leaves of okra collected in the field caused yellow mottle and mosaic, with slight leaf deformation and reduction of the leaf lamina, in okra plants produced from seed in the greenhouse (Figure 4A). Grafting scions of diseased okra caused yellowing and slight deformation in tomato leaves, while in chili, symptoms of mosaic, mottle, severe deformation of leaves, and stunting were observed. In D. stramonium, it caused mosaic, yellow mottle and leaf deformation. Therefore, the symptoms associated with the disease of okra yellow mottle were reproduced only by grafting on healthy greenhouse okra plants. The ELISA serological assays did not indicate infection by an RNAtype virus.

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Figura 3. Síntomas inducidos por geminivirus y un potyvirus en asociación, separados de okra por transmisión mecánica: A) Moteado y lesiones locales necróticas en D. stramonium; B) mosaico y deformación de hojas en N. benthamiana, en invernadero. Figure 3. Symptoms induced by geminivirus and a potyvirus in association, separated from okra by mechanical transmission: A) Motting and localized necrotic lessions in D. stramonium; B) mosaic and deformation of leaves in N. benthamiana, in the greenhouse.

Figura 4. Síntomas inducidos por un geminivirus separado de okra: A) por injerto, moteado, mosaico amarillo y deformación de hojas en okra; B) por biobalística, deformación apical de hojas en chile, en condiciones de invernadero. Figure 4. Symptoms induced by a geminivirus separated from okra: A) By grafting, motting, yellow mosaic and deformation of leaves in okra; B) by biobalistics, apical deformation of leaves in chili, in the greenhouse.

stramonium causó mosaico, moteado amarillo y deformación de hojas. Por tanto, los síntomas asociados con la enfermedad del moteado amarillo de la okra sólo se reprodujeron por injerto en plantas de okra sanas en invernadero. Los ensayos serológicos con ELISA no indicó la infección de virus del tipo ARN.

indicator and differential plants, it was only in these that infections by the AMV, INSV, TBSV and TEV viruses were detected. It is likely that the high content of mucilaginous substances, obtained when okra tissue is macerated, affected the serological detection of these viruses, but not their mechanical transmission to other hosts.

Ensayos serológicos de ELISA Extraction and analysis of viral DNA La detección directa de virus en plantas de okra, del campo, con síntomas de moteado amarillo, utilizando ELISA, fue negativa en todos los casos. Por tanto, con esta técnica no se pudo establecer la identidad de algún virus conocido que se relacionara con los síntomas observados en las plantas de okra en campo o en el material obtenido por injerto en invernadero. Sin embargo, en los pocos casos donde se logró separar algún virus de plantas de okra, por transmisión mecánica a plantas de hospedantes indicadoras y diferenciales, sólo en éstas se detectaron infecciones por los virus AMV, INSV, TBSV y TEV. Es probable que el alto contenido de sustancias mucilaginosas, que se obtienen al macerar los tejidos de okra, afectó la detección serologica de estos virus, pero no su transmisión mecánica a otros hospedantes. Extracción y análisis de ADN viral Transmisión por biobalística La transmisión por biobalística causó síntomas severos en plantas de chile: amarillamiento y epinastia en

Transmission by biobalistics Transmission by biobalistics caused severe symptoms in chili plants: yellowing and epinasty in leaves, as well as deformation of branches and reduction of plant size (Figure 4B). In some plants of N. tabacum var. Xanthi, N. benthamiana and N. glutinosa tenuous light yellow mosaic was observed, localized only in inoculated leaves, the rest of the new leaves did not exhibit symptoms. Because of the severity of the symptoms, chili plants inoculated by biobalistics were selected to conduct tests of transmission by grafting in new chili and okra plants. Molecular hybridization Infections by geminivirus were detected by dot-blot type hybridization in all of the okra plants with yellow mottle symptoms collected in Iguala, Guerrero, and Mazatepec, Morelos. This assay permitted the rapid and reliable analysis of a large number of okra samples with yellow mottle symptoms, before performing the PCR.

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hojas, deformación de ramas y reducción del tamaño de la planta (Figura 4B). En algunas plantas de N. tabacum var. xanthi, N. benthamiana y N. glutinosa se observó un mosaico tenue amarillo claro, localizado sólo en las hojas inoculadas; el resto de las nuevas hojas no presentó síntomas. Por la severidad de síntomas, se seleccionaron las plantas de chile inoculadas por biobalística, para realizar pruebas de transmisión por injerto a plantas nuevas de okra y chile. Hibridación molecular Se detectaron infecciones por geminivirus en todas las plantas de okra con los síntomas de moteado amarillo, recolectadas en Iguala, Guerrero, y Mazatepec, Morelos, mediante el ensayo de hibridación del tipo Dotblot. Este ensayo permitió un análisis rápido y confiable de un gran número de muestras de okra con los síntomas de moteado amarillo, antes de realizar la PCR. Se detectaron infecciones por geminivirus en las plantas de okra injertadas con material del campo, así como en plantas de D. stramonium y N. benthamiana inoculadas mecánicamente y en las plantas inoculadas por bombardeo (Figura 5).

Infections by geminivirus were detected in okra plants grafted with material from the field, as well as on D. stramonium and N. benthamiana plants inoculated mechanically and in plants inoculated by bombardment (Figure 5). Amplification of viral DNA by polymerase chain reaction (PCR) The electrophoretic analysis of the PCR products of total DNA obtained from okra plants with yellow mottle symptoms collected in the field, exhibited an expected 650 pb band when the oligonucleotides Mot/CP were used; these direct the amplification of the intergene region and the capsid protein gene (Figure 6. Track 2). Also, bands of the same weight were obtained in okra and differential host plants inoculated by grafting and inoculated by bombardment, as well as from a weed (Melampodium divaricatum), which grows abundantly in okra crops (Figure 6, Track 4). Also, bands of the same weight were detected in D. stramonium and N. benthaminana plants inoculated mechanically with macerates of okra leaves with yellow mottle; these plants were infected by TEV (data not shown).

Amplificación de ADN viral por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) El análisis electroforético de los productos de la PCR del ADN total obtenido de plantas de okra con síntomas de moteado amarillo y recolectadas en campo, mostró una banda 650 pb, predicha para los oligonucleótidos Mot/CP que amplifican partes de la región intergenética y del gen de la proteína de la cápside de geminivirus (Figura 6, Carril 2). Además, se obtuvo bandas del mismo peso en las plantas de okra y de los hospedantes diferenciales inoculadas por injerto y bombardeo, así como de una maleza (Melampodium divaricatum) que crece abundantemente en el cultivo de okra (Figura 6, Carril 4). También se detectaron bandas del mismo peso en las plantas de D. stramonium y N. benthamiana inoculadas mecánicamente con macerados de hojas de okra con moteado amarillo; estas plantas estaban infectadas por TEV (datos no mostrados). Clonación y secuenciación El producto obtenido por la PCR se clonó y posteriormente se estableció su secuencia, misma que se depositó en el Genbank con el número de acceso AF349113. El análisis por comparación de un fragmento de 200 bases, que corresponde al gen de la proteína de la cápside (CP), sugiere que el virus aislado de plantas

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Figura 5. Ensayo de hibridación del tipo Dot-blot, utilizando como sonda el gen CP de Pepper huasteco virus. Muestras de okra positivas para geminivirus: A2, A5, C1 y C2; muestras de tomate y chile infectadas con geminivirus, utilizadas como testigos positivos: A3, A6, B4, B6, D5, D6, E3 y E5; muestras E2 y E6 plantas sanas testigos negativo; muestra E1 testigo positivo de PHV para la sonda. El resto son muestras negativas de okra. Figure 5. Dot-blot hybridization test, using the CP gene of Pepper huasteco virus as a probe. Samples of okra tested positive for geminivirus: A2, A5, C1 and C2; samples of tomato and chili infected with geminivirus used as positive controls: A3, A6, B4, B6, D5, D6, E3, and E5; samples E2 and E6 healthy plants negative controls; sample E1 positive control of PHV for the probe. The rest are negative okra samples.

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Cloning and sequencing

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Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa (0.8 %) de productos de la PCR, utilizando los oligonucleótidos Mot/CP, con ADN total de plantas de okra y en varias malezas de este cultivo. Carril 1 MPM 1 Kb; carril 2 Okra (producto de 650 pb); carril 3 Poinsettia pulcherrima (negativo); carril 4 Melampodium divaricatum (producto de 650 pb); carril 5 Sida accuta (negativo); carril 6 PHV (testigo positivo); carril 7 testigo negativo (sin banda de 650 pb); carril 8 MPM 1 kb. Figure 6. Electrophoresis in agar gel (0.8%) of PCR products, using Mot/CP oligonucleotides, with total DNA from okra plants and several weeds of this crop. Track 1 MPM 1 Kb; track 2 Okra (product of 650 pb); track 3 Poinsettia pulcherrima (negative); track 4 Melampodium divaricatum (product of 650 pb); track 5 Sida accuta (negative); track 6 PHV (positive control); track 7 negative control (no 650 pb band); track 8 MPM 1 kb.

de okra con moteado amarillo, pertenece a los begomovirus. El análisis de la secuencia de los primeros 64 aminoácidos del fragmento correspondiente a la CP (la región menos conservada dentro del gen de la CP en las especies de geminivirus), mostró el mayor porcentaje de identidad (89%) con el Squash leaf curl virus, pero suficiente para considerarlo como un geminivirus diferente. El análisis de sólo la parte derecha de la región intergenética (de la orquilla a CP) indicó una identidad de 85% con el Sida golden mosaic virus, pero aún diferente ésta y otras especies de geminivirus conocidos (Brown et al., 1999; Padidam et al., 1995; Regenmortel et al., 1997). Según los análisis de la secuencia del fragmento clonado del geminivirus causante del moteado amarillo de la okra, éste pudiera eventualmente ser una especie diferente de virus no reportada previamente, Por tanto, se sugiere el nombre de Okra yellow mottle virus para

The product obtained by PCR was cloned and later its sequence was established and deposited in the Genbank with access number AF349113. The analysis by comparison with a fragment of 200 bases, corresponding to the protein caspid (PC) gene, suggests that the virus separated from okra plants with yellow mottle belongs to the group of begomoviruses. The analysis of the sequence of the first 64 amino acids of the fragment corresponding to the PC (the least preserved region within the PC gene in species of geminiviruses) had the highest percentage of identity (89%) with Squash leaf curl virus, but it was sufficient to consider it a different geminivirus. The analysis of only the right side of the intergene region (from the loop to the PC) indicated an 85% identity with Sida golden mosaic virus, but still different from this and other known species of geminiviruses (Brown et al., 1999; Padidam et al., 1995; Regenmortel et al., 1997). According to the analysis of the sequence of the cloned fragment of the geminivirus that causes okra yellow mottle virus, this could eventually be a different, previously unreported virus. Therefore, the name Okra yellow mottle virus is proposed to designate this pathogen, although it is necessary to continue molecular analysis of the entire genome. In other countries it has been determined that okra is susceptible to the viruses Abelia latent tymovirus, Abutilon mosaic begomovirus, Alfalfa mosaic alfamovirus, Beet curly top curtovirus, Beet mosaic potyvirus, Beet western yellows luteovirus, Bhendi yellow vein mosaic begomovirus, Clitoria yellow vein tymovirus, Cotton leaf curl begomovirus, Cucumber mosaic cumovirus, Epirus cherry ourmiavirus, Okra leaf curl begomovirus, Rhynchosia mosaic begomovirus, Sweet potato ringspot nepovirus, Tobacco ringspot nepovirus, Tobacco streak ilarvirus and Watermelon mosaic 2 potyvirus (Brunt et al., 1997). In the present study, the viruses INSV, TBSV and TEV are reported for the first time to be infecting okra in México; only AMV had been described in other regions of the world. All of these viruses were characterized after separation and mechanical transmission to indicator and differential hosts. However, these viruses could not be detected in the macerates of okra tissue by serology (ELISA), nor did they cause apparent symptoms in the okra plants inoculated mechanically in the greenhouse. It is possible that mechanical transmission of these viruses from okra to okra is blocked by some chemical element present in the leaves of this plant. This allows us to conclude that natural infection of these viruses occurs through the intervention of insect vectors. It was determined that the symptoms of the yellow mottle disease in okra, observed in the field, were induced

DE LA TORRE-ALMARÁZ et al.: UN NUEVO GEMINIVIRUS ASOCIADO AL MOTEADO AMARILLO DE OKRA

designar este patógeno, aunque es necesario continuar con el análisis molecular del genoma completo. En otros países se ha determinado que la okra es susceptible a los virus Abelia latent tymovirus, Abutilon mosaic begomovirus, Alfalfa mosaic alfamovirus, Beet curly top curtovirus, Beet mosaic potyvirus, Beet western yellows luteovirus, Bhendi yellow vein mosaic begomovirus, Clitoria yellow vein tymovirus, Cotton leaf curl begomovirus, Cucumber mosaic cumovirus, Epirus cherry ourmiavirus, Okra leaf curl begomovirus, Rhynchosia mosaic begomovirus, Sweet potato ringspot nepovirus, Tobacco ringspot nepovirus, Tobacco streak ilarvirus y Watermelon mosaic 2 potyvirus (Brunt et al., 1997). En este trabajo se reporta por primera vez los virus INSV, TBSV y TEV que infectan la okra en México; sólo el AMV se había descrito en otras regiones del mundo. Todos estos virus se caracterizaron después de separarlos por transmisión mecánica a hospedantes indicadoras y diferenciales. Sin embargo, estos virus no se pudieron detectar en los macerados de tejidos de okra por serología (ELISA), ni causaron síntoma aparente en las plantas de okra inoculadas mecánicamente en invernadero. Es posible que la transmisión mecánica de estos virus de okra a okra, sea bloqueada por algún elemento químico presente en las hojas de esta planta. Esto permite concluir que la infección natural de estos virus es por intervención de insectos vectores. Se determinó que los síntomas de la enfermedad del moteado amarillo de la okra, observados en campo, fueron inducidos consistentemente en plantas de okra producidas en el invernadero, sólo por injerto o biobalística. En estas plantas siempre se determinó la presencia de un geminivirus utilizando el ensayo de PCR o por hibridación molecular. El análisis molecular de la Región Común completa y parte del gen CP, del geminivirus asociado con la enfermedad del moteado amarillo de la okra, indicó que se trata, al parecer de un geminivirus no descrito previamente. Por tanto, se justifica la caracterización completa de su genoma. Eventualmente, se logró transmitir mecánicamente al geminivirus en plantas de D. stramonium y N. benthamiana, pero siempre en asociación con un potyvirus semejante a TEV. Esta situación tendrá que estudiarse más a fondo, dado que TEV no es un patógeno reconocido de okra y la transmisión mecánica es relativamente baja en la mayoría de los geminivirus. Además, este tipo de interacciones (sinergismo en la transmisión) tendría implicaciones epidemiológicas para ambos patógenos en el cultivo de la okra.

CONCLUSIONES Aunque se separaron los virus AMV, INSV, TBSV y un potyvirus semejante a TEV de plantas de okra con los

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consistently in okra plants produced in the greenhouse only by grafting or biobalistics. In these plants, the presence of a geminivirus was always determined using the PCR assay or molecular hybridization. The molecular analysis of the complete Common Region and part of the CP gene of the geminivirus associated with the yellow mottle disease of okra indicates that we are apparently dealing with a geminivirus not previously described. Therefore, the complete characterization of its genome is justified. Occasionally, mechanical transmission of the geminivirus was achieved in D. stramonium and N. benthamiana plants, but always in association with a potyvirus similar to TEV. This situation will have to be studied more in detail, given that TEV is not a recognized pathogen of okra and mechanical transmission is relatively low in most geminiviruses. Moreover, this type of interactions (synergism in transmission) could have epidemiological implications for both pathogens in the cultivation of okra.

CONCLUSIONS Although the viruses AMV, INSV, TBSV, and a potyvirus similar to TEV were separated from okra plants with symptoms of yellow streak of the fruit and yellow mottle leaves, none of them caused symptoms in okra plants after mechanical and independent inoculation. However, it is not ruled out that these viruses could be related to part of the complex symptomatology of viral origin observed in the field. It was determined that the principal causal agent of the symptoms of yellow mottle in okra is a geminivirus belonging to the genus Begomovirus and related to Squash leaf curl virus and Sida golden mosaic virus. The molecular analyses indicated that this virus could be a new, different viral species not previously reported. Therefore, the name Okra yellow mottle virus is proposed to designate this pathogen. The determination of this characteristics of the complete genome of this geminivirus, its origin and natural reservoirs, as well as the characteristics of possible mechanical transmission in co-infection with other viruses, are important aspects. —End of the English version—




 síntomas de rayado amarillo del fruto y moteado amarillo foliar, ninguno de ellos causó síntomas en plantas de okra después de una inoculación mecánica e independiente. Sin embargo, no se descarta que estos virus puedan estar relacionados con parte de la compleja sintomatologia de origen viral observada en campo.

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Se determinó que el principal agente causal de los síntomas de moteado amarillo en la okra es un geminivirus, perteneciente al género Begomovirus y relacionado con el Squash leaf curl virus y con el Sida golden mosaic virus. Los análisis moleculares indicaron que este virus pudiera ser una especie viral diferente no reportada previamente. Por tanto, se propone el nombre de Okra yellow mottle virus para designar este patógeno. La determinación de las características del genoma completo de este geminivirus, su origen y reservorios naturales, así como las características de la posible transmisión mecánica en coinfección con otros virus, son aspectos importantes. RECONOCIMIENTOS Esta investigación fue totalmente financiada por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la UNAM, México, Proyecto IN207601 “Movilidad celular de un nuevo geminivirus por coinfección con una variante del tobacco etch virus”. Se contó también con el apoyo logístico del Departamento de Parasitología Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo.

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