CAROTENOS EN YUCA: MAPEO GENÉTICO Y ANÁLISIS DE QTLs EN UNA POBLACIÓN S1 DE YUCA (Manihot esculenta Crantz)
JAIME ALBERTO MARIN COLORADO
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA DE POSGRADOS PALMIRA 2008
1
CAROTENOS EN YUCA: MAPEO GENÉTICO Y ANÁLISIS DE QTLs EN UNA POBLACIÓN S1 DE YUCA (Manihot esculenta Crantz)
JAIME ALBERTO MARIN COLORADO Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Magíster en Ciencias Agrarias, Area Mejoramiento Genético de Plantas
Director MARTÍN FREGENE, PhD. Genetista del programa de Yuca CIAT
Codirector HERNANDO RAMÍREZ, PhD. Biólogo Genetista y Fitomejorador Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA DE POSGRADOS PALMIRA 2008
2
Nota de aceptación: _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________
_______________________________ Firma del presidente del jurado
_____________________________ Firma del Jurado
_____________________________ Firma del Jurado
Palmira, 21 junio de 2008
3
DEDICATORIA
A mis padres; Elvia Colorado de Marín y Rodrigo Marín Tabares A mis hermanos; Víctor Marín y Juan Carlos Marín A mi sobrina; Maria Alejandra A Dios y a su hijo
Porque siempre han estado y estarán en cada uno de los pasos que doy, los logros y las caídas, los aciertos y los desaciertos, con su inmenso amor, su comprensión y esfuerzo.
4
AGRADECIMIENTOS
Al Doctor Martin Fregene por creer en mi y haberme dado esta oportunidad para trabajar y a la vez realizar la maestría en ciencias agrarias, en la Universidad Nacional de Colombia.
Al profesor Hernando Ramírez por su apoyo académico como director de este trabajo.
A los integrantes del Laboratorio de Genética de yuca, muy especialmente a Janneth Gutiérrez, Adriana Alzate, Adriana Núñez y Diana Falla por su apoyo moral y las tertulias en momentos de estrés.
A los trabajadores de campo del programa genética de yuca; Jairo Valencia, Armando Bedoya, Antonio López por su colaboración y asesoría.
Al laboratorio de Bioquímica del CIAT, especialmente a Alba Lucia Chávez, por su colaboración en todo lo relacionado con los análisis de datos fenotipicos, carotenos totales.
A las estudiantes de PhD Yacenia Morillo y muy especialmente a Ana Morillo por su amistad y su tiempo en esos momentos de discusión respecto de la tesis.
A la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira y a los profesores del posgrado, por sus enseñanzas académicas y sugerencias durante el proceso de formación en la maestría.
A los compañeros de curso tanto de maestría como de doctorado, especialmente a Jorge Pachon por sus consejos y amistad.
5
En general quiero dar las gracias a todas aquellas personas que de una u otra forma contribuyeron con este trabajo.
6
“La facultad y los jurados de tesis no se hacen responsables de las ideas emitidas por el autor de la misma”, (Artículo 24, Resolución 04 de 1974)
7
TABLA DE CONTENIDO
Pág RESUMEN SUMMARY 1.
INTRODUCCION
22
2.
OBJETIVOS
26
2.1.
OBJETIVO GENERAL
26
2.2.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
26
3.
MARCO TEORICO
27
3.1
DESCRIPCION DE LA ESPECIE
29
3.1.1 Clasificación Taxonómica
29
3.1.2 Caracteristicas morfológicas
29
3.2
ORIGEN Y DISTRIBUCION
30
3.3
CITOGENÉTICA DE YUCA
31
3.4
UTILIDAD E IMPORTANCIA
32
3.4.1 La yuca en Colombia
35
3.4.2 Valor Nutritivo de la yuca
35
3.5
IMPORTANCIA DE LOS MICRONUTRIENTES EN LA SALUD HUMANA
36
3.5.1 Vitamina A, e importancia en la salud humana
37
3.6
39
PIGMENTOS CAROTENOIDES
3.6.1 Importancia de los Carotenoides en la Alimentación Humana
8
46
3.6.2 Ruta Biosintetica de los Carotenoides
47
3.6.3 Ruta biosintética de carotenos en plantas
48
3.6.4 Regulación de la ruta biosintética
50
3.6.5 Trabajos de carotenoides en Yuca
51
3.7
ESPECTROFOTOMETRÍA DE LUZ ULTRAVIOLETA –VISIBLE (UV-VIS)
52
3.7.1 Absorbancia
55
3.7.1.1
Análisis cualitativo
58
3.7.1.2
Análisis cuantitativo
58
3.8
CROMATOGRAFÍA
61
3.9
EL MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON AYUDA DE MARCADORES MOLECULARES
61
3.9.1 Marcadores no basados en PCR
63
3.9.1.1
63
Isoenzimas
Ventajas
64
Desventajas
64
3.9.1.2
64
RFLP
Ventajas
65
Desventajas
65
3.9.2 Marcadores basados en PCR
65
3.9.2.1
69
Minisatélites
Ventajas 3.9.2.2
69 RAPD
70 9
Ventajas
70
Desventajas
70
3.9.2.3
71
AFLP
Ventajas
71
Desventajas
71
3.9.2.4
72
SSR
Ventajas
73
Desventajas
73
3.9.3 Aplicación de marcadores moleculares en el mejoramiento de plantas
73
3.10
74
MAPEO GENETICO MOLECULAR
3.10.1 Construcción de mapas genéticos
76
3.10.2 Tipos de Población
76
3.10.3 Mapa Molecular en Yuca
77
3.11
MEJORAMIENTO GENETICO Y BIOTECNOLOGIA EN PLANTAS 78
3.11.1 Mejoramiento genético en plantas
78
3.11.2 Biotecnología en plantas
79
3.11.2.1
79
Biotecnología aplicada al cultivo de Yuca
4.
QTLs (Loci Características Cuantitativas)
79
4.1
USO DE MARCADORES MOLECULARES EN ESTUDIOS
80
4.2
EPISTASIS
81
4.2.1 Clasificación de la epistasis
82
4.2.2 Modelos genéticos cuantitativos para epistasis
83
10
5.
HEREDABILIDAD
83
5.1
TIPOS DE VARIANZA GENOTÍPICA
84
5.2
FACTORES INFLUENCIANDO LA MAGNITUD DE LA HEREDABILIDAD
84
5.2.1 Población caracterizada
84
5.2.2 Muestra de genotipos evaluados
84
5.2.3 Métodos de calculación
85
5.2.4 Extensividad de la evaluación del genotipo
86
5.2.5 Desequilibrio de ligamiento
86
6.
MATERIALES Y METODOS
87
6.1
MATERIALES
88
6.1.1 Material vegetal
88
6.1.2 Localización
88
6.2
90
METODOS
6.2.1 Diseño Experimental y Evaluación Fenotípica
90
6.2.2 Escala de Colores en la Raíz
90
6.2.3 Análisis de carotenos totales
92
6.2.3.1
Método de extracción y cuantificación de carotenos totales en raíces-Método por Centrifugación 92
6.2.3.2
Método de extracción y cuantificación de carotenos totales en raíces-Método por Filtración 93
6.2.3.3
Cuantificación de carotenos totales por el método calorimétrico
6.2.4 Análisis molecular
94 96
11
6.2.4.1
Extracción de ADN
96
6.2.4.2
Calidad y cuantificación de ADN
96
6.2.4.3
Amplificación de los microsatélites
96
6.2.4.3.1
Evaluación de los marcadores microsatélites
98
6.2.4.4 6.2.4.4.1
Electroforesis vertical con geles de poliacrilamida Tinción con Nitrato de Plata
98 99
7.
ANALISIS DE DATOS
99
7.1
Análisis de datos fenotípicos
99
7.2
Registro de datos
99
7.3
Rangos de segregación de marcadores individuales
99
7.4
Mapeo de microsatélites
100
7.5
Mapeo de QTLs
101
8.
RESULTADOS Y DISCUSION
105
8.1
DATOS FENOTÍPICOS
105
8.1.1 Medidas de las características
105
8.1.2 Análisis de Correlación de las características
106
8.2
114
DATOS MOLECULARES
8.2.1 Marcadores
114
8.2.2 Análisis de segregación
115
8.2.2.1
Datos de Segregación
115
8.2.2.2
Porcentaje de polimorfismo
115
8.2.2.3
Evaluación en la progenie de la población S1
116
8.3
CONSTRUCCION DEL MAPA GENETICO PARA LA S1 12
118
8.4
ANÁLISIS DE QTLs
123
8.4.1 Análisis de simple marcador (A.S.M)
123
8.4.2 Analisis de mapeo por intervalo (A.M.I)
131
8.4.2.1
Número de QTLs identificados para la característica carotenos totales
132
8.4.2.1.1
Contenido de Carotenos Totales (2008)
132
8.4.2.1.2
Color pulpa de Raíz (2006-2008)
133
8.4.2.1.3
Varianza fenotípica y genotípica explicada
134
8.4.3 Análisis de mapeo por intervalo compuesto (A.M.I.C)
136
8.4.3.1
Usando 1000 permutaciones
136
8.4.3.1.1
Contenido de Carotenos Totales (2008)
136
8.4.3.1.2
Color pulpa de Raíz (2006-2008)
137
8.4.3.2
Usando 10000 permutaciones
139
8.4.3.2.1
Contenido de Carotenos Totales (2008)
139
8.4.3.2.2
Color pulpa de Raíz (2006-2008)
140
8.4.3.2.3
Varianza fenotípica y genotípica explicada
142
9.
CONCLUSIONES
151
10.
PERSPECTIVAS
154
BIBLIOGRAFIA
156
13
LISTA DE TABLAS
Pág
Tabla 1.
Población en riesgo y afectada por malnutrición de micronutrientes(millones).
Tabla 2.
34
Actividad relativa como pro-vitamina a de diversos carotenoides (Simpson, Tsou, 1986).
Tabla 3.
Características de marcadores moleculares frecuentemente empleados para mapeo genético.
Tabla 4.
60
Aplicaciones de los marcadores moleculares para el mejoramiento de plantas.
Tabla 5.
41
71
Ecuaciones para computar la heredabilidad para el método de componentes de varianza con cuatro unidades de selección diferentes.
Tabla 6.
82
Media, desviación estándar, rango, para las características medidas: carotenos totales, color pulpa raíz y materia seca en la población S1.
Tabla 7.
103
Coeficiente de correlación entre las características (Carotenos Totales, Materia Seca, Color de Pulpa de raíz) para la población
Tabla 8.
S1.
106
Clasificación de los 700 marcadores SSR evaluados
111
14
Tabla 9.
14 Marcadores SSR asociados con carotenos totales (2008) para análisis de regresión simple con QGENE.
Tabla 10.
122
31 Marcadores SSR asociados con color de pulpa de raíz (2006-2008) para análisis de regresión simple con QGENE. 123
Tabla 11.
16 Marcadores SSR asociados con materia seca (2006-2008) para análisis de regresión simple con QGENE.
Tabla 12.
6 Marcadores SSR asociados con contenido carotenos totales (2008) para análisis de mapeo por intervalo con QGENE.
Tabla 13.
124
130
12 Marcadores SSR asociados con color de pulpa de raíz (2006-2008) para análisis de mapeo por intervalo con QGENE.
Tabla 14.
131
QTLs individuales afectando contenido de carotenos totales (CCT) y color pulpa de raíz (CPR) en la población S1, mediante análisis de MIC-1000 permutaciones.
Tabla 15.
135
QTLs individuales afectando contenido de carotenos totales (CCT) y color pulpa de raíz (CPR) en la población S1, mediante análisis de MIC-10000 permutaciones.
15
138
LISTA DE FIGURAS
Pág
Figura 1.
Morfología de la planta de yuca (manihot esculenta crantz) a. Aspecto general; b. hojas; c. flores; d. sistema radical; e. corte de raíz tuberosa. Tomado de ekanayake et al (1997).
26
Figura 2.
Estructura de algunos carotenoides.
38
Figura 3.
Ruta de biosíntesis de los carotenos en plantas. Abreviaciones de los genes PSY fitoeno sintasa, PDS fitoeno desaturasa, ZDS z-caroteno desaturasa, CRTISO caroteno isomerasa, LCYb licopeno β-ciclasa, CRTISO caroteno isomerasa (Cunningham, 2002).
Figura 4.
46
Longitud de onda para la fracción del espectro electromagnético de luz visible.
50
Figura 5.
Los componentes básicos de un espectrofotómetro.
52
Figura 6.
Ilustración de las definiciones de I e I0, tomado de Kenkel (1992).
Figura 7.
54
Algunos datos de estándares y una gráfica de la ley de Beer de los datos, mostrando la determinación de la concentración desconocida, tomado de Kenkel (1992).
16
57
Figura 8.
Ejercicio sobre absorbancia y transmitancia según la ley de Beer.
57
Figura 9.
Ciclos del PCR.
64
Figura 10.
Amplificación exponencial de un gen mediante PCR.
65
Figura 11.
Esquema General de la Metodología Empleada para la Mapeo genético para el carácter carotenos totales usando una población S1.
84
Figura 12.
Autofecundación del individuo TAI8 (AM320) en campo.
86
Figura 13.
Ensayo en campo de la población S1 producto del cruce entre TAI8 X TAI8 (AM320).
87
Figura 14a. Variedad de colores de pulpa de raíz en la población s1 de yuca.
88
Figura 14b. Regleta de colores de parénquima de yuca.
Figura 15.
Diagrama de flujo para la extracción de carotenos totales usando el Método de centrifugación.
Figura 16.
91
Diagrama de flujo para la extracción de carotenos totales usando el Método de filtración.
Figura 17.
88
92
Regresión Lineal para las características (Carotenos Totales-2008, Materia Seca (2006-2008), Color de Pulpa de raíz(2006-2008)) para la población S1.
17
106
Figura 18.
Frecuencia de distribución para Carotenos Totales 2008, color de pulpa 2006, color de pulpa 2008, materia seca 2006, materia seca 2008 para la población S1 de yuca.
110
Figura 19.
Análisis de BSA en diferentes microsatélites.
114
Figura 20.
Segregación de los alelos únicos para el parental (TAI8) y la población S1 evaluada con el marcador SSRY-251.
Figura 21.
Mapa de ligamiento genético de Yuca (Mahihot esculenta Crantz) basado en un cruce S1 y marcadores SSR.
Figura 22.
114
118
Frecuencia de distribución para el porcentaje de heterocigotos (AB) y porcentaje de homocigotos (AA) y (BB) en la progenie de la población S1 de yuca. Los valores en % indican las medias.
Figura 23.
119
SSR asociados a posibles QTLs para las características carotenos totales (2008), color pulpa de raíz (2006-2008) y materia seca (2006-2008), hechos con análisis en Qgene y Mapdisto.
Figura 24.
5 Posibles QTLs relacionados con las caracteristicas color pulpa de raíz y carotenos totales mediante el modelo A.M.I.
Figura 25.
132
4-3 Posibles QTLs estarian asociados a los rasgos color pulpa de raíz y carotenos totales mediante el modelo A.M.I.C.
Figura 26.
127
135
4-3 Posibles QTLs asociados a los rasgos color de pulpa y carotenos totales mediante el modelo A.M.I.C.
18
138
LISTA DE ANEXOS
Pág
ANEXO A.
Lista de material vegetal S1 producto de la autofecundación del individuo TAI8 de la familia AM320 de yuca.
ANEXO B.
164
Protocolo de Miniextracción de ADN (Dellaporta S.L, et al. 1983, A plant ADN minipreparation version ll. Plant Molecular Biology Reporter 1(14):19-21.) Modificado por el Programa de Genética de Yuca.
167
ANEXO C.
Lista de los 700 marcadores SSR usados en este studio.
169
ANEXO D.
Protocolo para la preparación del gel y corrida en Electroforesis Vertical con geles de poliacrilamida.
ANEXO E.
Registro de datos en una matriz en un archivo microsoft excel texto.
ANEXO F.
184
187
Chi2 para evaluar el porcentaje de segregación en la población S1.
188
19
Resumen
El contenido de Caroteno total (Beta-caroteno) en yuca es importante como precursor en la síntesis de la vitamina A, este micronutriente puede llegar a suplir la deficiencia en regiones donde la yuca es la principal fuente de alimento, especialmente en países del tercer mundo en donde la yuca se ha posicionado como el cultivo bandera. Dentro de los objetivos para la fortificación de variedades de yuca se encuentran aquellos materiales con altos niveles de contenido de caroteno. Para cumplir con estos planteamientos se busca incrementar el contenido de este metabolito secundario en yuca, con la ayuda del mejoramiento convencional y el uso de la genética molecular. La variedad tailandesa MTAI8 (AM320), fue empleada para generar la población S1 producto de una autofecundación, la cual presenta patrones de segregación para el contenido de carotenos totales (Beta-caroteno) bien definidos. Luego se sometió a un análisis genético molecular, el cual consistió en un análisis de bulk segregante empleando 700 marcadores moleculares tipo microsatélites o SSR, con la correspondiente construcción del mapa, generando 25 grupos de ligamiento y la identificación de 3 QTLs mayores asociados a una región del genoma de yuca con el contenido de carotenos totales. Tres marcadores SSR; NS109, rSSRY251, rSSRY313, explican el 37.2%, 32%, 27.7% respectivamente de la varianza fenotipica total, ubicados en el grupo de ligamiento D para el mapa de yuca (Fregene et al, 1997), estos tres SSR están fuertemente asociados con el contenido de carotenos totales en la familia AM320 S1 obtenida de la variedad amarilla MTAI8 de yuca. Además se estableció una fuerte correlación entre color de pulpa de raíz y contenido de carotenos totales r=0.81, y una correlación negativa entre carotenos totales y materia seca r= -0.31. Estos tres posibles QTLs presenta un efecto positivo y de carácter aditivo para el contenido de carotenos totales, puede ser la oportunidad para implementar selección asistida por marcadores para carotenos totales en yuca.
Palabras claves: Yuca, Caroteno, QTLs, SSR.
20
SUMMARY
The content of cassava in total carotene is important as a precursor in the synthesis of vitamin A, this micronutrient might fill the gap in regions where cassava is the main source of food, especially in third world countries where cassava is has positioned itself as the cultivation flag. Among the objectives for the fortification of cassava varieties are those materials with high levels of carotene content. To meet these approaches are looking to increase the content of this secondary metabolite in cassava, with the help of conventional breeding and use of molecular genetics. The Thai variety MTAI8 (AM320) was used to generate the population S1 proceeds from an inbred, which presents well-defined patterns of segregation. It then underwent a molecular genetic analysis, which consisted of an analysis of segregating bulk employing 700 markers SSR, with a corresponding map of the building, creating 25 groups and identifying tying 3 QTLs associated with a larger region of the genome of cassava with the total content of carotenes, using molecular markers type microsatellite. Three markers SSR; NS109, rSSRY251, rSSRY313, explaining 37.2%, 32%, 27.7% respectively of the total phenotypic variance, located in Group D for linkage map of cassava (Fregene et al, 1997), these three SSR are strongly associated with the content of carotenes total family AM320 S1 obtained from the yellow variety MTAI8 cassava. In addition there was a strong correlation between color and content root pulp carotenes total r = 0.81, and a negative correlation between total carotenes and dry r = -0.31. These three possible QTLs presents a positive effect and additive for the content of carotenes totals may be an opportunity to implement assisted selection markers for carotenes total cassava.
Key words: Cassava, Carotene, QTLs, SSR-Microsatellites.
21
1. INTRODUCCIÓN
La yuca (Manihot esculenta Crantz), también conocida como mandioca, cassava, manioc, manioca, tapioca, mhogo y omowgo, es una planta monoíca, de origen Brasilera e introducida en África en el siglo XVI; es un alimento básico en América latina desde el período precolombino (Jones, 1959). La yuca se ha convertido en un alimento básico para luchar contra el hambre, contribuyendo con la seguridad alimentaría en países tercer mundistas, y cerca de 500 millones de personas lo consumen (FAO, 1997), en la última decada es el cuarto producto básico más importante después del arroz, el trigo y el maíz (Wenham, 1995; FAO, 2000; Ceballos et al, 2004), y según ciertas estimativas estadísticas de la ONU (Organización de Naciones Unidas) y FAO el consumo de la yuca aumentara de 96 millones de toneladas en el año 2000 a 182 millones de toneladas en el año 2010 (FAO, 2004).
Pero como en cualquier cultivo, la yuca tiene ciertos inconvenientes en el campo, ya que puede ser atacada por más de 30 agentes bacterianos, fungosos, vírales, micoplasmas o similares. Dentro de las enfermedades más importantes esta el añublo bacterial (Xanthomonas campestris pv. manihotis), la pudrición bacterial de tallo (Erwinia carotovora p.v. carrtovora), el mosaico africano (ACMD African Cassava Mosaic Disease), la antracnosis, la pudrición de tallo, ataques de plagas como ácaros, la mosca blanca (Aleurotrachelus socialis, Aleutothrixus aepin, Bermisia tabaci), entre otros. Los anteriores agentes ocasionan perdidas en el establecimiento del cultivo, disminuyendo el vigor normal de las plantas, reduciendo la capacidad fotosintética, causando pudriciones radiculares, que traerían consecuencias nefastas en la producción y el rendimiento del cultivo, que se traduce en perdidas económicas (Lozano, 1981). Todos estos problemas unido a la dificultad de mejoramiento debido a su largo ciclo de crecimiento de 18-24 meses, su propagación vegetativa, alogamia y alelotetraploidia motivan a realizar investigaciones que ayuden
a entender la genética y eliminar dichos
22
inconvenientes. Para lo cual se han realizado hasta la fecha trabajos que se fundamentan en estudios de mapeo genético, caracterización molecular, análisis de QTLs, filogenia y diversidad.
Uno de los grandes problemas que presentan los países en vías de desarrollo es la deficiencia en vitaminas y minerales, las cuales pueden ser perjudiciales para la salud humana. La malnutrición por micronutrientes afecta a más de dos mil millones de personas, y sus consecuencias son entre otros: problemas de salud, baja productividad en el trabajo, altas tasas de mortalidad y morbilidad, incremento en las tasas de enfermedades crónicas y deterioro permanente de habilidades cognitivas de niños (Latham, 2002). Actualmente las tasas de malnutrición de micronutrientes siguen siendo altas en algunas partes del mundo especialmente las deficiencias de vitamina A, hierro, zinc, yodo. Estas deficiencias son en gran parte generadas por la dieta simple, que representa una fuente pobre de macronutrientes y algunos micronutrientes, dietas que están compuestas principalmente por alimentos básicos (Ej.: arroz, maíz, yuca, trigo), (Calloway 1995; Kawano 2003) y han capturado la atención al ser temas de interés en salud publica (Underwood, 2000). En cuanto a la deficiencia de vitamina A, este es un problema en los países en vía de desarrollo Asia, África, América Latina y el Cercano Oriente afectando principalmente a niños, se estima que cada año entre 250000 y 500000 niños padecen de ceguera permanente por deficiencias en esta vitamina (Latham, 2002).
En yuca el aporte de micronutrientes es dado por vitamina C, B2, B6, magnesio y potasio, con bajos niveles de vitamina A. Según la UNICEF (2002) la deficiencia en vitamina A es uno de los problemas nutricionales más importantes a nivel mundial, produciendo de uno a dos millones de muertes infantiles anualmente.
Debido ha todos estos problemas de salud desde los años 90 y con ayuda de la biotecnología, se ha venido trabajando en la identificación de los genes y los
23
cDNA que codifican para casi todas las enzimas requeridas para la biosíntesis de carotenos (Wurtzel, 2001). Estos genes han sido secuenciados y sus productos caracterizados (Cunningham & Grantte, 1998), y hoy en día varios grupos de investigación han encaminado sus estudios en aumentar el contenido de vitamina A en los alimentos básicos como son; El arroz, tomate y la canola.
El primer paso para el inicio del mejoramiento es identificar los genotipos que pueden aportar las características deseadas. Los trabajos realizados durante cinco años en el banco de germoplasma de yuca de CIAT, que comprende razas nativas de América Latina y de Asia y clones élite seleccionados por el CIAT y el IITA, han permitido la evaluación del contenido de carotenoides en más de 3000 clones de yuca y el contenido de minerales en más de 450 clones. Sin embargo se deben tener en cuenta ciertas condiciones para asegurar un beneficio a las personas que se encuentran en riesgo de desarrollar malnutrición por micronutrientes (Welsch y Graham, 2002).
Dada su importancia y la posición que ha alcanzado la yuca como producto de consumo a escala mundial, los estudios encaminados a conocer su genética mediante mapeo genético y estudios genéticos asistido por marcadores moleculares son relevantes para optimizar el mejoramiento de su potencial, y de rendimiento. Los mapas genéticos moleculares y estudios asistidos por marcadores de características complejas pueden emplearse para conocer la genética e identificar factores genéticos involucrados en los procesos y productos de fotosíntesis, además se pueden emplear para elucidar el control genético de calidad de raíz, contenido de almidón, deterioro postcosecha y localizar genes involucrados en la resistencia a enfermedades y pesticidas, uso eficiente de nutrientes, la floración y otros aspectos (Fregene et al, 2000).
Los marcadores moleculares "Microsatélites" (Litt, 1989) o SSR (Secuencias simples repetidas) son usados para mapeo genético, ya que presentan ciertas
24
características que los hace especiales, existen en el genoma de cualquier organismo eucariota, muestran altos niveles de heterozigosidad, codominancia y lo más importante es que son hipervariables, basados en la técnica de PCR (Reacción en cadena de la enzima Polimerasa) (Mullis, 1990), ideales para hacer estudios de mapeo, genética de poblaciones, estudios filogenéticos y de diversidad (Wang, 1994; Zhao, 1993; Broun, 1992; Gupta, 1996).
En el presente estudio, se evaluó la genética de características cuantitativas para carotenos totales, y se mapeó la población S1 producto de una autofecundación del individuo TAI8 de la familia AM320 de yuca (Manihot esculenta crantz) el cual presenta buena calidad culinaria, alto rendimiento, alto contenido de glucósidos cianogenicos y color de raíz amarillo (Chavez et al. 2005), según Iglesias (1997) se ha establecido una relación entre el color amarillo y la concentración de provitamina A en raíces de yuca. El color amarillo se evalua en una escala que va de 1 hasta 8, siendo el color blanco en la raíz el de 1, con contenido bajo de carotenos totales y 8
es el color amarillo, con alto contenido de carotenos.
Trabajos de Ceballos & Ospina (2002) argumentan que casi todos los cultivares de yuca tienen raíces de color blanco y Jos (1990) dice, que tienen bajo niveles de carotenos. Un segundo punto a estudiar es un análisis de QTLs para carotenos totales, llegando a entender un poco el comportamiento genético de este rasgo usando una población S1, y determinar parcialmente las regiones del genoma involucrados en el contenido de carotenos en yuca. Una vez determinadas las regiones del genoma asociadas a carotenos totales se puede emplear la selección asistida por marcadores (MAS en ingles Marker Asisted Selection) para identificar los genotipos con atributos de alto contenido de carotenos, que luego puedan ser transferidos a variedades mejoradas, con el fin de suplir la deficiencia de vitamina A que tiene la yuca como alimento.
25
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Construir un mapa genético molecular de Yuca (Manihot esculenta crantz) para la característica carotenos totales en raíces de yuca e identificar QTLs asociados usando una población S1, producto de una autofecundación del individuo (TAI8) de la familia AM320.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1 Evaluar fenotípicamente la característica carotenos totales en la población S1. 2.2.2 Genotipificar la población S1 producto de la autofecundación del individuo TAI8 de la familia AM320 mediante el uso de marcadores moleculares "Microsatélites" (SSR).
2.2.3 Identificar loci de características cuantitativas (QTLs)
para carotenos
totales mediante marcadores SSR (Simples secuencias repetidas) en la población S1. 2.2.3 Correlacionar el contenido de carotenos totales con caracteres como color de raíz y materia seca.
26
3. MARCO TEÓRICO
3.1 DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE
3.1.1 Clasificación Taxonómica. Reino:
Vegetal
División:
Espermatofita
Subdivisión:
Angiosperma
Clase:
Dicotiledonea
Subclase:
Anchichlamydeae
Orden:
Euforbiales
Familia:
Euforbiaceae
Género:
Manihot
Especie:
esculenta
3.1.2 Características Morfológicas. La yuca Manihot esculenta Crantz, es una planta de la familia Euforbiaceae, calificada como un arbusto perenne con ciclo de vida entre 7 a 24 meses, presenta unas 7200 especies caracterizadas por el desarrollo de vasos laticiferos, compuestas por células secretoras denominadas galactocitos, lo que le produce la característica de secreción lechosa típica de esta familia (CIAT, 2002).
Sus raíces se caracterizan por presentar nudos los cuales hacen contacto con el suelo, esta característica favorece en la absorción de agua y nutrientes del suelo mediante el desarrollo interno de sistema de raíces fibrosas. Una raíz de yuca madura puede almacenar de 15 a 100 cm y en peso de 0.25 kg. a 5.0 kg., las raíces maduras son predominantemente de color café y de superficie áspera, la cascara tiene de 1 a 4 mm de grosor y esta compuesta de epidermis, una subepidermis (blanca o rosada) y una capa interior que separa la pulpa (Villamayor, 1986).
27
La raíz tuberosa (Figura 1e), que anatómicamente no es un tubérculo (Alves, 2002) puede ser cilíndrica o cónica, está cubierta por una cáscara formada por periderma, el cual es un tejido corchoso que varía de color blanco crema a café oscuro, siendo este último el color más común. Debajo del periderma existe una capa cortical (córtex) de 1 a 2 mm de espesor con una coloración blanca o crema rosada, compuesta de esclerénquima, parénquima cortical y floema, el cual contiene glucósidos cianogénicos responsables de la formación del ácido cianhídrico y también es el sitio en donde se encuentran los canales laticíferos, en especial en las raíces jóvenes (Domínguez, 1983). Debajo de estos dos tejidos está la pulpa, que es la porción comestible de la raíz. La pulpa está compuesta de parénquima, la cual comprende aproximadamente el 85% del peso total de la raíz, contiene además vasos de xilema radialmente distribuidos en una matriz de células almacenadoras de almidón (Alves, 2002).
Las flores de yuca terminan sobre paniculas, es una planta monoica con gran cantidad de flores femeninas cerca de la base y pequeñas flores masculinas cerca del extremo de la panicula. Ambas flores tienen 5 tepalos unidos, el color puede ser amarillo o rojo. La flor masculina tiene 10 estambres arreglados en dos círculos de 5 estambres cada uno; los filamentos están libres y las anteras son pequeñas con 200 a 300 granos de polen por antera. La flor femenina tiene un ovario montado sobre un disco glandular de 10 lóbulos, el estigma tiene 3 lóbulos los cuales se unen y forman el estilo (Villamayor, 1986).
El fruto maduro esta en un endocarpio de madera, en forma globular, de 1.0 a 1.5 cm de diámetro, cuando el fruto esta maduro y seco, el endocarpio de madera explota entonces se dispersa la semilla. La semilla tiene forma elipsoidal y mide de 1 a 1.5 cm de largo (Villamayor, 1986). Las variedades de yuca se reproduce mediante fecundación cruzada, lo cual le da un alto grado de heterozigosidad en
28
plantas (Byrne, 1984), son individuos heterozigotos, los cuales son propagados vegetativamente para reproducir el genotipo (Kawano, 1980). Además tiene un fuerte entrecruzamiento entre especies monoicas y sufre de depresión por endogamia, haciendo difícil el desarrollo apropiado de líneas para el estudio de la genética clásica.
Figura 1. Morfología de la planta de yuca (manihot esculenta crantz) a. Aspecto general; b. hojas; c. flores; d. sistema radical; e. corte de raíz tuberosa. tomado de ekanayake et al (1997).
29
El cultivo es considerado un alopoliploide segmental (Magoon, 1969) o un alopoliploide (Umanah, 1973), no es bien conocido el ancestro diploide de yuca con 36 cromosomas somáticos. No hay evidencia de herencia tetrasomica de especies silvestres de manihot relacionadas con un número de cromosomas de 2n = 36, sin embargo han sido creadas teorías las cuales sostienen la alelopoliploide en yuca (Magoon, 1969; Umanah, 1973).
3.2 ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN
Él genero Manihot comprende 98 especies (Rogers, 1973), se encuentra distribuida a través de los Neotrópicos, y la identificación de la yuca dentro del genero ha sido fuente de especulación (Rogers, 1965), los progenitores directos del cultivo han sido identificados en Sur América (Allem, 1987; 1994). Las poblaciones silvestres de M. esculenta se dieron primariamente en el centro oeste del Brasil, el este del Perú, México, Guatemala, y el norte de Colombia (Allem, 1994; 1992), todas las poblaciones de esta especie se encuentran referidas como M. esculenta subsp. flabellifolia, ya que esta se estableció en una zona de transición en la amazonia del Brasil, encontrándose a lo largo del sur y el este del borde de la amazonia (Olsen, 1999).
Para el estudio del origen
y la filogeografía de Manihot esculenta Crantz
(Euphorbiaceae) se uso un gen nuclear de copia simple, una porción del gen no codificado gliceraldheido 3 fosfato deshidrogenasa (G3pdh) que suministra altos niveles de variación en la secuencia de Manihot, los datos del G3pdh fueron usados para investigar el origen evolutivo de la yuca y específicamente el origen geográfico del cultivo dentro del rango de las silvestres (Olsen, 1999).
Olsen y Achaal estudiaron el origen de la yuca con la subespecie flabellifolia, incluyendo a Manihot pruinosa Pohl, por estar estrechamente relacionada, estas dos son muy similares morfológicamente (Allem, 1992) y también están
30
relacionadas en la región espaciada transcrita interna del ADN nuclear ribosomal (B.A.S. Datos sin publicar). Se hicieron unos
trancsectos para colectar M,
pruinosa y la subespecie flabellifolia a lo largo del borde del este de la amazonia y otro a lo largo del borde del sur este. Con el estudio realizado por Olsen y Achaal demostraron como genes nucleares de copia simple pueden ser utilizados para examinar la filogeografía en especies de plantas, para este caso un sistema de cultivo relacionado consistente de yuca y sus progenitores silvestres, además este gen provee una fuente alta de variación intraespecifica para estudios filogeográficos. El cultivo parece ser derivado de poblaciones de subespecies flabellifolia a lo largo del borde del sureste de la Amazonia, pero los padres y el grado de variación en el cultivo versus el silvestre M esculenta y M pruinosa, indica que la subespecie flabellifolia solo puede informar de la variación genética observada en yuca (Olsen, 1999).
3.3 CITOGENÉTICA DE YUCA
La familia Euphorbiaceaes, tiene un número cromosómico de 8, con una variación de 6 a 12, siendo la mayoría de las especies poliploides (Martin, 1976). Todos los cultivares de yuca, junto con las especies silvestres tienen un número cromosómico de 36 (Hershey, 1983). La evidencia de un origen alopoliploide en la yuca, se debe a la presencia de dos regiones nucleares diferentes. Magoon et al., 1969 y Umanah y Hartman 1973 consideran la yuca como un alotetraploide segmental con 36 cromosomas, formando 18 bivalentes en la meiosis, referenciados por Fregene et al, 1997. Según Acosta (1984) el número de frutos y la época de floración de los genotipos es variable, el alto número de cromosomas (36) de tamaño reducido, ciclo de vida tan largo de 18 a 24 meses, su naturaleza poliploide y su alta heterocigocidad son los factores que no permiten un estudio profundo de la citogenética de yuca.
31
El origen genético de la yuca como un diploide, aloploide o autopoliploide (Nassar, 1997 y 2001), es un tema en discusión, debido a que existen autores que consideran la yuca como un alotetraploide diploidizado, porque no se conoce hasta el momento ancestros con 18 cromosomas, pero De Carvahlo y Guerra (2002), evaluaron mediante estudios citogenéticos cultivares de yuca y especies silvestres de Manihot y encontraron un cariotipo 2n=36, sugiriendo que todas las especies de Manihot presentan un complemento cromosómico similar.
Mediciones por citometría de flujo, han revelado que el contenido haploide de ADN de la planta por célula es de 1.67 pg, (Awoleye et al., 1994), valor que corresponde a 772 Mpb en el genoma haploide, presentando la yuca un genoma de menor tamaño dentro de las plantas superiores (Bennet et al., 1992; Fregene et al., 1997).
Otros estudios genéticos han permitido identificar genes marcadores de la forma del lóbulo foliar y color de la corteza de las raíces (Graner 1942; Jos y Hrishí 1976), demostrando que la segregación de los rasgos ancho y angosto de los lóbulos de las hojas están controlados por un solo gen, influenciados por la edad y el ambiente. Los resultados indicaron que los lóbulos angostos son dominantes y los anchos recesivos. Y en cuanto al color de la corteza de las raíces, se encontró que el color oscuro es dominante sobre el claro (Graner, 1942).
3.4 UTILIDAD E IMPORTANCIA
Manihot esculenta Crantz, es uno de los cultivos que ha tomado mucha fuerza en las últimas dos décadas, especialmente en América latina, Asia y África SubSahara. Su producción a escala industrial ha aumentado debido a su consumo, gracias a su alto valor nutricional con referencia a su contenido de almidón, y tuvo un crecimiento a escala mundial en un 4.7 por ciento anual entre 1980 y 1997, de 16 a 35 millones de toneladas para almidones de todas las fuentes (FAO, 2000).
32
Su componente nutricional esta basado en energía de carbohidratos, que generan muchas calorías, convirtiéndose en la fuente de calorías más importante para cerca de 600 millones de personas en el mundo y 250 millones de africanos asegurando su alimentación. (Nweke et al, 2002; Zhang et al, 2003; Sayre, 2006) Gracias a su elevado componente de calorías, puede acumular almidón en las raíces, por consiguiente su productividad es medida en términos de materia seca, con un rango de 30 a 40 % en condiciones para producción normal y cerca del 85% de materia seca almacenada en la raíz es almidón (Cock, J. 1985). En cuanto a su contenido de proteínas es mínimo de 1 a 2% en peso fresco, pero es rica en vitamina C y calcio, presenta niveles aceptables de vitamina A,
B y otros
minerales (Cock, J. 1985). La yuca, es una de las principales fuentes energéticas de la dieta de más de 700 millones de personas en el mundo (Ceballos, 2002), el alto valor calórico de las raíces contrasta con el bajo contenido de proteínas, minerales y vitaminas, el 30% del peso seco de las hojas son fuente de proteínas y vitamina C (Gulick et al., 1983).
La producción mundial de yuca se sitúa alrededor de 152 millones de toneladas por año (Kawano, 2003). Se considera que es uno de los cultivos más importantes que
produce
calorías
en
los
trópicos,
el
65%
esta
concentrada
en
agroecosistemas de tierras bajas húmedas y subhumedas, de los 16 millones de hectáreas dedicadas al cultivo de la yuca se encuentran en África, un 30 por ciento en Asia y el 20 por ciento restante en América Latina (Kawano et al, 1998; Duke et al, 1994). De acuerdo con el Anuario de Producción de la FAO de 1984 a escala mundial se produjeron 14.151.000 ha con un rendimiento de 129.020.000 toneladas métricas, siendo el mayor productor África con 7.482.000 has, es decir un 53% del total área sembrada a nivel mundial, ocupando Asia un segundo lugar con 30% (FAO, 1997).
La yuca es cultivada en más de 90 países y le da subsistencia a quinientos mil personas de países en desarrollo, cerca de 70 millones de personas producen
33
alrededor de 500 Kilocalorías por día, llegando a consumir 100 kilocalorías por día 500 millones de personas (Kawano et al, 1998, Kawano, 2003) Esta raíz rústica no sólo es un alimento básico para muchas familias campesinas de escasos recursos sino también la materia prima para elaborar concentrados comerciales para animales, fibra para los fabricantes de papel y cartón, en donde se emplea como base para pegantes con los que se elabora productos adhesivos o colas baratas; estos pegantes se utilizan para fabricar materiales de embalaje, etiquetas, papel de envoltura y cinta pegante. En la industria de alimentos se utiliza el almidón natural en la elaboración de macarrones, harinas: de las cuales se preparan pudines, pasteles, galletas, obleas, bizcochos, almojábanas, cremas, helados, sopas, ensaladas, embutidos y otros productos. También se usa como aditivo para espesar, estabilizar o recubrir torta de frutas, mezclas secas, pudines, crema de leche (CIAT, 2002).
A escala mundial el producto se transa, según sus usos, en cinco mercados principales: como raíz fresca o congelada para el consumo humano, como comida procesada, por ejemplo harinas y granulos tostada, hecho por pequeños agricultores, como insumo en la industria alimenticia; como materia prima en la industria productora de alimentos balanceados para animales y como producto intermedio en la industria no alimenticia (http://www.cci.org.co)
el principal
producto económico de la yuca son sus raíces, utilizadas como alimentos y en la elaboración de almidón, papel, textiles, adhesivos y productos químicos como el alcohol carburante (Montaño, 1996), las hojas contienen apreciables cantidades de vitaminas y proteínas que se consumen como hortalizas en África occidental y central, Indonesia y ciertas partes del Brasil (Montaño, 1996).
En la industria textil se emplea en las diferentes colas textiles, como engomado ya que se pueden tratar tejidos muy blancos y se degrada menos que el almidón proveniente de otra fuente, este engomado se emplea en el proceso de acabado del tejido, mejora la textura de la tela, aumenta el brillo superficial, le da cuerpo y
34
solidez para facilitar su manipulación, eleva el peso y la calidad del estampado y aumenta la apariencia y la sensación textil de buena calidad de la tela. Y en la industria farmacéutica el almidón se emplea para diluir, aglutinar, lubricar diversos productos sólidos, actúa como absorbente, da viscosidad y sirve de vehículo a sustancias pastosas, liquidas o semisólidas en la elaboración de cremas y lociones de uso dermatológico (CIAT, 2002). También se emplea para fabricar polvos faciales finos, polvos compactos y polvos nutritivos, además es usada como medicina para control de escalofríos, fiebre, erupciones cutáneas y para controlar diarreas (Duke, et al, 1994).
3.4.1 La yuca en Colombia
En Colombia la yuca fresca ha tenido una gran importancia como alimento básico en la dieta humana y en la alimentación animal, en los últimos años la yuca ha tenido un fuerte desarrollo en la costa norte y ha pasado a sustituir el maíz y el sorgo en la preparación de dietas balanceadas para animales; se han generado y organizado cooperativas en el interior del país para el secado natural y la extracción de almidón (CIAT. 1991, 1997).
En 1984 la yuca se cultivó en 149.000 has que produjeron 1.386.300 ton de raíces frescas, obteniendo un rendimiento de 9.1 ton/ha, según cifras del ministerio de Agricultura. En términos generales el 80% de la producción de yuca se utiliza para consumo humano, animal y en la elaboración de harina y almidón. La producción de yuca en Colombia ascendió en el año de 1999 a 2 millones de toneladas métricas, ubicándose en el puesto 16 en el mundo (FAO, 1999); con rendimiento medio de 9.93 ton/ha. La principal zona productora de yuca en Colombia es la Costa Atlántica y el departamento del Cauca figura con 4.6% de la producción total del país (CIAT 2002).
35
3.4.2 Valor Nutritivo de la yuca
Las hojas de la yuca se utilizan generalmente como hortaliza verde y su valor nutritivo es similar al de otras hojas verde oscuro, además son muy valiosas como fuente de carotenos (provitamina A), vitamina c, hierro y calcio (Lancaster y Brooch, 1983), tanto las raíces como las hojas de yuca son adecuadas para el consumo humano, las primeras son una fuente importante de carbohidratos y las segundas de proteínas, minerales y vitaminas (montaldo, 1994). El rendimiento energético por hectárea de las raíces de yuca es generalmente muy alto, y potencialmente mucho mayor que la de los cereales. Aunque las raíces de yuca son deficientes en aminoácidos esenciales y en gran parte de minerales y vitaminas, su valor radica en que son un producto básico en las zonas marginales del mundo como algunas partes de Africa, Asia y Latinoamérica, en donde se consumen grandes cantidades de yuca representando la principal fuente de carbohidratos y un aporte importante a la cantidad total de vitaminas y minerales consumidas por estas poblaciones (Olusola y Yemisi, 2003).
En cuanto a la raíz, la yuca es esencialmente un alimento almidonado y sus raíces tienen de 30 a 40% de materia seca, una proporción más alta que el de otras raíces y tubérculos, su contenido de materia seca depende de factores tales como variedad, edad de las raíces al momento de la cosecha, el suelo, las condiciones climáticas y la sanidad de la planta (cock, 1997) la materia seca de la yuca está compuesta en su mayor proporción de carbohidratos (aproximadamente 85%) y los contenidos de calcio, vitamina C, tiamina, riboflavina, y niacina son considerables. Se ha estimado que 1 kg de raíces frescas puede contribuir con 66% de calcio, 125% de hierro, 58% de tiamina, 83% de riboflavina, 40% de niacina de los requerimientos diarios de un humano adulto que vive en el trópico (Onuma, 1987).
36
3.5 IMPORTANCIA DE LOS MICRONUTRIENTES EN LA SALUD HUMANA
Los micronutrientes son aquellas vitaminas y minerales necesarios en pequeñas cantidades para poder mantener las funciones fisiológicas. Estos deben ser provistos en la alimentación o en suplementos ya que no pueden ser sintetizados en el cuerpo en cantidades suficientes para satisfacer sus necesidades. Generalmente tres micronutrientes han capturado la atención al ser temas de interés en salud publica: Hierro, vitamina A y yodo (Underwood, 2000) que se han convertido en los problemas nutricionales más serios y de mayor prevalencia en casi todos los países de Asia, África, América Latina y el Cercano Oriente.
La OMS (Organización mundial de la salud) estimó las carencias de hierro, vitamina A y yodo en 1995 (Tabla 1) Las cifras sugieren que aproximadamente una de cada cinco personas del mundo en desarrollo presentan subnutrición crónica, y más de 2000 millones tienen carencias de micronutrientes (Latham, 2002), hoy en día la malnutrición por micronutrientes comúnmente conocida como hambre oculta, disminuye la salud, productividad y bienestar de más de la mitad de la población mundial con un mayor impacto en las mujeres y niños de las familias de escasos recursos (Welsch y Graham, 2002). Tabla 1. Población en riesgo y afectada por malnutrición de micronutrientes (millones)
Región1
Enfermedades por Carencia de vitamina Carencia 2 carencia de Yodo A1 hierro anemia4 En Afectados En Afectados riesgo
(bocio)
riesgo3 (xeroftalmia)
África
295
124
31
1,0
206
América
196
39
14
0,1
94
Sudeste asiático
599
172
123
1,7
616
Europa
275
130
-
-
27
37
de o
Mediterráneo oriental
348
152
18
0,2
149
Pacífico occidental5
513
124
42
0,1
1 058
2 225
740
228
3,1
2 150
Total
1. Regiones OMS. 2. UN ACC/SCN2000. 3. Únicamente niños preescolares. 4. OMS 1995. 5. Incluye China. Fuente: Nutrición Humana en el mundo en Desarrollo, FAO, Latham. 2002.
3.5.1 Vitamina A, e importancia en la salud humana La vitamina A es un nutriente esencial, requerido en pequeñas cantidades para mantener una salud normal (Chakravarti, 2000). La vitamina A es el descriptor genérico para los compuestos con la actividad biológica cualitativa del retinol. Estos compuestos se derivan formalmente de un compuesto monocíclico que contiene cinco enlaces dobles carbono – carbono y un grupo funcional en él término de la porción acíclica. Debido a sus estrechas similitudes estructurales con el retinol son llamados retinoides y pertenecen al grupo de las vitaminas liposolubles (Combs. 1998).
En la dieta la vitamina A aparece de dos formas: Como vitamina A preformada (Retinol) que en su forma cristalina pura, es una sustancia amarillo verdosa, pálida, Es soluble en grasa, pero insoluble en agua, y se encuentra únicamente en productos animales, dicha vitamina también se obtiene a partir de carotenoides provenientes de plantas, que son convertidos en retinol en el intestino e hígado (Vuong, 2000)
La carencia de vitamina A afecta frecuentemente y de manera importante a los ojos y puede llevar a la ceguera (Latham, 2002) Los bastoncillos de la retina contienen una proteína, la opsina, ligada a una forma de vitamina A, el 11- cis
38
retinal, que forma un compuesto sensible a la luz, la rodopsina o púrpura visual. Cuando hay deficiencia de vitamina A, se reduce el suministro de retinol con el deterioro consiguiente de la función de los bastoncillos (Mc Laren y Frigg. 2002).
Cuando hay deficiencia de vitamina A, las células que secretan mucus en muchos tejidos epiteliales son reemplazadas por células productoras de queratina, este fenómeno es responsable de la xerosís y la queratinización de la conjuntiva y la córnea, y también de otros tejidos, lo que se observa principalmente en niños de corta edad (Mc Laren y Frigg, 2002; Latham, 2002). Cuando hay deficiencia de esta vitamina las células epiteliales se dañan, facilitando la invasión por parte de agentes patógenos. Se estima que esta deficiencia está poniendo en peligro los sistemas inmunológicos de aproximadamente el 40% de los niños menores de cinco años y se estima que está llevando a una muerte temprana a 1 millón de niños pequeños cada año, sobre todo en niños con sarampión (UNICEF, 2002)
Estudios efectuados en animales demuestran la participación de la vitamina A en la espermatogénesis en el hombre y en la prevención de necrosis placentaria y absorción fetal en la mujer. En la hematopoyesis existe un vínculo entre el hierro y la vitamina A. La anemia por deficiencia de hierro responde mejor si se agrega vitamina A al tratamiento con hierro. Aún no se comprende bien este mecanismo de acción (McLaren y Friggs, 2002). Se sabe que la vitamina A participa en el crecimiento normal del sistema muscular y esquelético. Varios estudios han demostrado que la deficiencia severa de vitamina A disminuye el crecimiento de los niños (McLaren y Friggs, 2002).
3.6 PIGMENTOS CAROTENOIDES
Los carotenoides son los más comunes de todos los grupos de pigmentos naturales. Son rojos, anaranjados o amarillos y se encuentran en muchas plantas y animales. Hasta el presente, se han aislado y caracterizado completamente más
39
de 600 carotenoides (Olson, 1999, tomado de McLaren y Friggs, 2002). Además son sustancias hidrofóbicas y lipofílicas virtualmente insolubles en agua, aquellos que están basados en hidrocarbonos son colectivamente llamados carotenos, mientras que aquellos que contienen átomos de oxígeno con grupos funcionales como hidroxi, metoxi-, oxo-, epoxi-, carboxi-, aldehido, etc, son comúnmente llamados xantofilas (Armstrong, 1997). La mayoría son xantofilas, los cuales tienen uno o varios grupos de oxígeno sobre el anillo o en la cadena, los miembros de este grupo imparten las tonalidades llamativas en las hojas de los árboles, y los colores atractivos de algunas frutas y hortalizas.
Todo los carotenoides pertenecen al gran grupo químico de los terpenoides y la mayoría de ellos son tetraterpenos, compuestos C40 (es decir están formados por 40 átomos de carbono) constituidos de ocho unidades de isopreno C5. La estructura de un carotenoide es la que en últimas determina qué funciones biológicas potenciales puede tener. El patrón distintivo de alternación de enlaces dobles y simples en el esqueleto de los carotenoides es lo que les permite absorber excesos de energía de otras moléculas, mientras que las moléculas terminales específicas en estos pigmentos pueden influenciar su polaridad. La primera característica puede contribuir a las propiedades anti-oxidantes de los carotenoides biológicos, mientras que la última puede explicar las diferencias en la forma que los carotenoides individuales interaccionan con las membranas biológicas. En la figura 2 Se presentan las estructuras de los carotenoides más conocidos.
(Axtaxanthin
Molecular
Grafic,
http//www.astaxanthin.org/carotenoids.htm). Los carotenoides están presentes en forma de cristales o sólidos amorfos en solución, medio líquido, dispersión coloidal o también unidos a proteínas de manera no covalente en fase acuosa (Rodriguez, 1996). Los cromoplastos contienen estructuras especializadas en forma globular, membranosa, fibrilar o tubular, compuestas de lípidos y proteínas que funcionan para retener grandes cantidades de carotenoides (Snodderly, 1995). En los cloroplastos de hojas senescentes los carotenoides se pueden encontrar en las
40
membranas, los cuerpos grasos u otras estructuras dentro del estroma. (Cunningham y Grantte, 1998).
Ciertos carotenoides son capaces de convertirse en vitamina A, como ocurre en insectos, peces, reptiles, aves y mamíferos. Estos carotenoides de pro-vitamina A, según se los conoce, totalizan más de 50, de estos, el trans β-caroteno efectúa la contribución más extensa a la actividad de la vitamina A en productos alimenticios. α -caroteno, γ-caroteno y β-criptoxantina (3-hidroxi-β-caroteno) contribuyen en menor grado (Cunningham y Grantte, 1998). La tabla 2 y la figura 2, muestran varias actividades de pro-vitamina A de los carotenoides expresadas en función de la actividad del β - caroteno, que se considera del 100%. La composición de carotenoides es invariante en el cloroplasto, pero existe una amplia variedad de diferentes carotenoides en los cromoplastos, se ha encontrado licopeno en el tomate maduro, beta caroteno en las raíces de zanahoria, luteína y zeaxantina en el
endospermo
de
maíz,
etc
(Axtaxanthin
Molecular
Grafic,
http//www.astaxanthin.org/carotenoids.htm). Los colores de la mayoría de los carotenos resultan de la absorción de luz por los cromóforos de siete o más enlaces conjugados (Cunningham y Grantte, 1998), así, mientras el incoloro caroteno llamado fitoeno, que solo posee tres enlaces conjugados, absorbe luz ultravioleta, los carotenos más insaturados como es el caso de licopeno que posee diecisiete (17) enlaces conjugados, absorben longitudes de onda visibles. Este caroteno en particular adquiere una tonalidad rojiza (Rodríguez, 1997).
41
Figura 2. Estructura de algunos carotenoides.
Los carotenoides también juegan un papel potencial importante en la salud, actuando como antioxidantes biológicos, protegiendo células y tejidos de los efectos dañinos de radicales libres. El licopeno que es el caroteno que da a los tomates su coloración roja, es particularmente efectivo al controlar el poder destructivo de oxígenos “libres”. La luteína, la zeaxantína y xantofilas encontradas en maíz y en vegetales de hoja verde se cree que funcionan como antioxidantes protectores en la región macular de la retina humana. (Axtaxanthin Molecular Grafic, http//www.astaxanthin.org/carotenoids.htm). Según Bartley (1994) los carotenoides sirven de protectores contra la fotooxidación en células, como
42
determinantes estructurales de complejos pigmento-proteína en los plastidos y como pigmentos accesorios. Además los carotenoides absorben la luz del sol en la región azul del espectro (400-600 nm), transfiriendo esta energía al centro de reacción fotosintética actuando como atenuadores de los estados excitados en las clorofilas (Bartley, 1994).
Muchos
trabajos
caracterización
de
hechos
en
yuca
germoplasma,
han
fisiologia
aportado de
gran
carotenos,
información
de
caracterización
bioquímica, un ejemplo de ellos es el trabajo de Safo-Kantanka et al (1984) que llevó a cabo un estudio en donde se siguió un aumento en el contenido de carotenoides en la raíz de yuca a medida que la planta crece. Con la variedad amarilla Bankye Borode (BB) se encontró que el contenido de carotenoides de la yuca aumentaba con la edad, con concentraciones de 300, 325 y 350.6 ug/100 g. La extracción de carotenoides se llevó a cabo con una mezcla de éter de petróleo y acetona (1:1), y el extracto se introdujo en una columna abierta y el análisis cualitativo y cuantitativo se hizo por medio de espectrofotometría de UV-VIS y cromatografía de capa delgada. En 1983 Mcdowell & Oduro determinaron el contenido de β-caroteno en seis variedades de yuca provenientes de Colombia y Jamaica, y en dos muestras de gari de Ghana. Los carotenos fueron extraídos con cloroformo y los extractos fueron examinados por HPLC de fase reversa. Los valores obtenidos para las raíces frescas oscilaron entres 0.10 y 1.13 0.79 ug/100 g de peso fresco y para las muestras de gari se obtuvieron valores bajos de 0.01 y 0.07 ug/100 g de peso seco. Un estudio hecho por Pepping et al (1988) cuantificó el contenido de α y βcaroteno en hojas de yuca por medio de un método de HPLC de fase reversa, encontrando una concentración de β-caroteno de 2820 µg/100 g de materia fresca en la porción comestible. En un trabajo similar Van der Pol et al (1988)
43
determinaron la presencia de isómeros cis en cuatro vegetales de hoja verde después de diferentes métodos de procesamiento tradicionales utilizados en Indonesia, los cuales incluían: cocción al agua, cocción al vapor, cocción en leche de coco “sayur” y sofreído. Entre los vegetales de hoja examinados estaba la hoja de yuca. La extracción de carotenos se llevó a cabo con una solución de éter de petróleo-acetona (3:2) y el extracto de carotenos fue corrido en dos columnas de cromatografía abierta. Los carotenos se identificaron por sus espectros de absorción en ultravioleta-visible y se cuantificaron utilizando los coeficientes de extinción. El contenido de carotenos en las hojas de yuca fresca fue de 0.2 ug/100 g de α-caroteno, 9.7 ug/100 g de β-caroteno todo trans, 0.9 de neo-B-beta caroteno y 4.1 de neo-U-beta caroteno.
Ortega (1991), llegó a la conclusión que los carotenoides presentes en raíces de yuca analizadas fueron el β-caroteno, junto con sus isómeros neo-β-caroteno neoβ-caroteno
U,
y
trans-β-caroteno.
Encontrandose
en
ciertas
variedades
carotenoides 5,6 monoepoxi-α criptoxantina y fitoflueno. Adewusi & Bradbury (1992) analizaron el contenido de carotenoides en hojas y raíces de yuca en seis cultivares por medio de cromatografía de columna abierta y por HPLC. Los carotenoides encontrados en hojas fueron la luteína en un rango de 8.6-29 ug/100 g de peso fresco, y el carotenoide provitamina A β-caroteno con un rango de concentraciones de 1.3 a 7.8 ug/100 g de peso fresco. Las raíces presentaron de 0.01 a 0.3 ug/100 g de peso fresco de β-caroteno y de 0.005 a 0.06 ug/100 g de peso fresco de luteína.
En otro estudio donde se caracteriza carotenoides en 5 cultivares de yuca usando hojas, se encontró que el β-caroteno es el carotenoide más abundante con papel de provitamina A, mientras que α y β-criptoxantina se encontraban en cantidades detectables sólo en dos cultivares. También se descubrieron cantidades considerables de luteína, el cual no posee actividad pro-vitamínica. (Adewusi y Bradbury.1992)
44
Tabla 2. Actividad relativa como pro-vitamina a de diversos carotenoides (simpson, tsou, 1986)
Marinho (1996), en un trabajo realizado en raíces de 7 cultivares de yuca, verificó 3 fracciones de carotenoides, la primera fracción fue identificada como β – caroteno, las otras dos no pudieron ser identificadas debido a que se encontraban en pequeñas trazas, en la fracción identificada se aislaron 3 isómeros: trans β caroteno, 13 cis β caroteno y 9 cis β caroteno con biopotencias del 100, 53 y 38% respectivamente, las mayores cantidades encontradas fueron del isómero trans β caroteno.
45
Rodríguez & Amaya (1996) estudiaron la composición y el contenido de los carotenoides provitamina A en yuca, y los valores encontrados de β-caroteno fueron desde trazas hasta 0.8 µg/g. Bedoya (1999), cuantificó el contenido de carotenos totales en raíces y hojas de yuca para la colección núcleo de CIAT (600 genotipos que representan el Banco de Germoplasma) por medio del método de espectrofotometría de ultravioleta visible (colorimetría). Las concentraciones en raíces oscilaron entre 0.102 y 1.040 ug/100 g de materia fresca. En hojas el rango encontrado fue de 23.28 a 86.22 ug/100 g de materia fresca.
Echeverry (2001), evaluó el contenido de carotenos totales por medio del método de colorimetría en raíces y hojas de 500 genotipos de yuca pertenecientes al Banco de Germoplasma de CIAT. El rango encontrado para contenido de carotenos totales en raíces fue de 0.12 a 0.93 ug/100 g de materia fresca.
Chávez et al (2000) estudiaron el efecto de los diferentes métodos de procesamiento sobre el contenido de carotenos en 28 genotipos de yuca, encontrando que la cocción fue el método que menos redujo el contenido de carotenos (34%), seguido por el secado al horno para producir harina con un 44% de reducción. La producción de harina secada al sol redujo la concentración de carotenos al nivel más bajo (73% de reducción), lo cual indica que los carotenos son fotolábiles.
Bolaños (2001), cuantificó el contenido de carotenos totales por medio de colorimetría en hojas y raíces de 682 genotipos de yuca pertenecientes al Banco de Germoplasma del CIAT. Las concentraciones de carotenos totales en raíces oscilaron entre 0.13 y 0.92 ug/100 g de materia fresca, y en hojas el rango de concentraciones para carotenos osciló entre 18.71 y 96.2 ug/100 g de materia fresca.
46
Cárdenas (2003), en un trabajo realizado en raíces de 100 cultivares de yuca verificó la presencia de tres fracciones de carotenoides, la primera fracción fue identificada como β - caroteno, la segunda como α - caroteno y la tercera como luteína.
Según reportes realizados por Chávez et al (2005), la concentración de carotenos totales presentes en raíces de 1789 genotipos de yuca se encuentran entre 1.02 y 10.4 µg/g de materia fresca.
3.6.1 Importancia de los Carotenoides en la Alimentación Humana
En los seres humanos, el papel más ampliamente estudiado y mejor entendido de los carotenoides es su actividad de provitamina A, la deficiencia de vitamina A es una causa principal de muerte prematura en los países menos desarrollados, particularmente entre niños. La vitamina A, la cual tiene muchas funciones vitales en los humanos, puede ser producida dentro del cuerpo a partir de ciertos carotenoides, notablemente el β-caroteno. El β-caroteno dietario es obtenido a partir de varios vegetales y frutas, tales como zanahorias, espinaca, duraznos, albaricoques y batatas. (http://www.astaxanthin.org/carotenoides.htm)
Los carotenoides también juegan un papel potencialmente importante en la salud humana actuando como antioxidantes biológicos, protegiendo células y tejidos de los efectos dañinos de los radicales libres y el oxígeno. Entre algunos usos potenciales se incluyen, la intensificación de la función del sistema inmune, protección contra las quemaduras del sol e inhibición de ciertos tipos de cáncer. (http://www.astaxanthin.org/carotenoides.htm). El β-caroteno, junto con otros carotenos como el licopeno, también han sido relacionados con la disminución del riesgo de adquirir cáncer de pulmón (Wurtzel, 2001), cáncer de seno, cáncer de próstata (Agarwal, 2000) entre otros. De igual manera, estos carotenos se han
47
relacionado con la protección contra enfermedades coronarias (Bartley & Scolnik, 1994; Palace et al, 1999) y degenerativas, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (DellaPenna, 1999a). Adicionalmente los carotenoides se han destacado como promotores de la respuesta inmune, como antioxidantes (Wurtzel, 2001), y activadores de las células oxidadoras de carcinógenos (Palace et al, 1999). Se cree también que la ingestión de vitamina A y C incrementan la absorción
de
hierro
en
humanos
(www.css.cornell.edu/foodsystems/advAgron4.html).
3.6.2 Ruta Biosintetica de los Carotenoides
Los
carotenoides
son
tetraterpenoides,
sintetizados
por
un
complejo
multienzimático. Las dos funciones principales de los carotenoides en los organismos fotosintéticos y en las plantas son, la absorción de energía necesaria para la fotosíntesis y la protección de la clorofila contra los procesos oxidativos o el fotodaño. Avances recientes han mejorado nuestro conocimiento de la genética y la biología molecular de la biosíntesis de los carotenoides en bacterias, algas, hongos y plantas. Así la síntesis de los carotenoides es un proceso metabólico crucial para el entendimiento de dichas funciones (Fraser y Bramley, 2004).
Avances significativos en el campo de la bioquímica, la genética, la fisiología y la biología Molecular, entre otras ramas del conocimiento, han permitido dilucidar los diferentes procesos y reacciones que ocurren en los diferentes organismos y que conducen a la formación de una gama muy variada de carotenoides de importancia biológica como nutricional (β-caroteno). Numerosos estudios de genética molecular
han conducido
a la caracterización de todos los genes
responsables de la síntesis de las enzimas de la ruta biosíntetica de los carotenoides, a partir de diversos organismos como las bacterias Rodobacter capsulatum o diferentes formas de especies de Erwinia (Fraser y Bramley, 2004).
48
Varios grupos de investigación de distintos países, han encaminado sus esfuerzos para incrementar el aporte de vitamina A de los alimentos de la dieta básica humana mediante biotecnología; entre estas especies se encuentran el arroz, la canola y el tomate, en las cuales se ha logrado insertar genes que codifican enzimas de la ruta de biosíntesis de carotenoides, obteniendo variedades con altos niveles de carotenoides, incluyendo por supuesto el β-caroteno (Boiteux et al, 2001).
Estudios de manipulación transgénica de la ruta, mutantes naturales o inducidos, silenciamiento de genes, mapeo de loci con características cuantitativas (QTL) en algunas plantas cono tomate, canola, pimienta, maiz, arroz, entre otras, han permitido descifrar la ruta y su control, brindando así oportunidades directas para la manipulación del tipo y las cantidades de esos componentes nutricionalmente importantes. Avances significativos han mejorado nuestro entendimiento de la biología molecular de la carotenogenesis (Cunnigham y Gantt, 1998), sin embargo hace falta comprender las señales y los mecanismos que dirigen la regulación espacial y temporal de esta ruta biosintética.
3.6.3 Ruta biosintética de carotenos en plantas
La biosíntesis de carotenos tiene un origen evolutivo muy antiguo, evidencia de ello es su síntesis en bacterias con fotosíntesis anaerobia y aerobia al igual que en eubacterias que no realizan fotosíntesis (Harker y Bramley, 1999). Los pasos iniciales de su síntesis han sido conservados a través del proceso evolutivo (Cerrullo, 2002). En plantas los carotenos son sintetizados y almacenados en los plastidios, existiendo evidencia sustancial de la participación de las membranas plastídicas en su biosíntesis (Fraser & Bramley, 2004). Adicionalmente se han encontrado ejemplos de una diversidad bioquímica en la ruta de biosíntesis para carotenos y en la compartimentalización de sus constituyentes en tejidos específicos, como es el caso de las raíces tuberosas de yuca en donde se ha
49
identificado en algunos cultivares la presencia de carotenos como licopeno y luteína (Boiteux et al, 2001).
La ruta biosintética que envuelve la formación de los carotenoides fue dilucidada entre 1950 y 1960 usando aproximaciones bioquímicas clásicas, con inhibidores específicos y mutantes bloqueados en ciertos pasos en la ruta (Figura 3) (Cunningham, 2002). La primera reacción específica de la ruta de biosíntesis de carotenos es la condensación cabeza-cabeza de dos moléculas de trans de GGPP (Geranyl-geranylpirofosfato) para formar fitoeno. Todas las reacciones subsecuentes involucran la conversión de esta estructura básica (Cunningham y Grantte, 1998).
ESTROMA IPP + DMAPP
GGPS
GIBERILINAS Y OTROS ISOPRENOIDES
GGPP PSY
MEMBRANA PLASTIDICA
FITOENO PDS ZDS LCY ε
LICOPENO
LCY ε
ε-caroteno
LCY b LCY b
LCY ε LCY b
α-caroteno
β-caroteno
CHY ε CHY ε
CHY b
CHY ε CHY ε
Lactucaxanthina
CRTISO
Luteina
CHY b
Zeanthina
Figura 3. Ruta de biosíntesis de los carotenos en plantas. Abreviaciones de los genes PSY fitoeno sintasa, PDS fitoeno desaturasa, ZDS z-caroteno desaturasa, CRTISO caroteno isomerasa, LCYb licopeno β-ciclasa, CRTISO caroteno isomerasa (Cunningham, 2002).
50
La reacción de síntesis de fitoeno está catalizada por la enzima Fitoeno sintasa, el cual sufre una serie de cuatro reacciones de desaturación, hasta formar licopeno. La introducción de dobles enlaces procede en sucesión alternante a la derecha e izquierda de la parte central de fitoeno (Cunningham, 2002). Esas desaturaciones sirven para alargar las series conjugadas de enlaces carbono-carbono que constituyen el cromóforo en los pigmentos carotenoides (Fraser & Bramley, 2004).
En contraste con las bacterias y hongos, en donde se realizan las reacciones de desaturación con una única enzima (crtI), en plantas son necesarias cuatro reacciones secuenciales para transformar fitoeno en licopenos que son catalizadas por dos enzimas, Fitoeno desaturasa (PDS) y Z-Caroteno desaturasa (ZDS) (Shaub et al; 2005). La primera desaturasa (PDS) utiliza cada lado del simétrico fitoeno para producir z-caroteno. La segunda desaturasa (ZDS) lleva a cabo la reacción con z- caroteno para formar licopeno (Cunningham, 2002).
Las desaturasas están asociadas a las membranas de cloroplastos y cromoplastos (Bartley & Scolnik, 1994). En las plantas producen una forma cis de licopeno, produciendo pro-licopeno el cual debe ser isomerizado a la forma translicopeno por la isomerasa recientemente identificada CRTISO (Isaacson et al; 2002).
Los carotenoides en el aparato fotosintético de las plantas son componentes bicíclicos (Cunningham y Grantte, 1998). En esta reacción de ciclización sobre licopeno, son formados dos tipos de anillos, los anillos beta como un grupo final a ambos lados del β-caroteno y los anillos con α-caroteno. Estos anillos difieren únicamente en la posición del doble enlace en el anillo (Cunningham, 2002).
Un único producto génico, la Licopeno β-ciclasa (LCY-β) cataliza la formación del β-caroteno (Fraser & Bramley, 2004) y de un anillo de α-caroteno a partir de licopeno. (Cunningham, 2002). A partir de α-caroteno ó β-caroteno se forman los
51
carotenoides oxigenados (xantofilas), los cuales comprenden la mayoría de los pigmentos en la membrana del tilacoide en plantas (Cunningham, 2002).
3.6.4 Regulación de la ruta biosintética
La regulación de la biosíntesis a nivel enzimático y de expresión génica de la ruta biosintética de los carotenoides en plantas, es poco conocida; además no se han aislado genes con función reguladora en carotenoides.
La biosíntesis y la acumulación de los carotenoides en los plastos se realizan al tiempo con el ensamblaje del complejo de la antena colectora para la captación lumínica y los centros de reacción, donde estos pigmentos están íntimamente asociados. (Cunningham, 2002). El papel central de los carotenoides en el desarrollo y adaptación de la planta sugiere que su síntesis es coordinada con otros procesos de desarrollo como la formación de plastos, floración y desarrollo del fruto (Fraser & Bramley, 2004).
Falta conocer aún mas para responder la pregunta ¿cuáles son los mecanismos empleados por las plantas para determinar que carotenoides y en que cantidad son acumulados en los plastos?. Hasta el momento existe mucha evidencia de que la reacción catalizada por Fitoeno sintasa (PSY) es un importante punto de control para regular el flujo a través de la ruta biosintética (Welsch et al, 2002). Además de este reconocido punto regulatorio, Cunnningham en el 2002 reconoce dos puntos más: Disponibilidad de sustrato y ramificaciones de la ruta metabólica.
Una ruta ramificada como la de la formación de los carotenoides, es poco probable que sea controlado por un solo proceso regulatorio; por el contrario es más probable que existan puntos de control en cada ramificación y que además involucre eventos transcripcionales y postranscripcionales (Welsch et al; 2002).
52
3.6.5 Trabajos de carotenoides en Yuca.
Desde hace 5 años el CIAT junto con el IFPRI coordinan el programa (HarvestPlus), el cual consiste en una alianza global de instituciones de investigación que busca reducir el efecto de la malnutrición usando el mejoramiento de plantas y la biotecnología-genómica para desarrollar cultivos ricos en micronutrientes, como Carotenos, Hierro, Zinc entre otros, proceso denominado biofortificación. Uno de estos trabajos fue el desarrollado por Bolaños (2001) determinando la influencia de los factores genéticos, ambientales y de interacción genotipo por ambiente en las concentraciones de los caracteres carotenos, hierro y zinc en raíces de yuca. Además estableció las pérdidas de carotenos totales por almacenamiento en una preparación común a escala mundial como lo es el secado al horno, concluyendo que los efectos principales de genotipo, ambiente y la interacción genotipo por ambiente en los análisis de varianza para el carácter contenido de carotenos totales fue estadísticamente significativo. Cárdenas en el 2003, compara dos métodos de cuantificación de carotenos en raíces de 100 genotipos de yuca.
Salcedo (2005), desarrolló una metodología para la clonación de genes que codifican para las enzimas involucradas en la biosíntesis de carotenos en raíces de yuca (Manihot esculenta), usando como modelo dos variedades de yuca con diferencias significativas en el contenido de carotenos de sus raíces, logrando encontrar la expresión de los genes de biosíntesis de carotenos en diferentes etapas del desarrollo de la raíz tuberosa en yuca, puede ser evaluada empleando los cebadores consenso diseñados, o nuevos obtenidos de los fragmentos secuenciados.
Arango en el 2006, estudió la ruta biosintetica de carotenos en yuca, para lo cual cuantificó los niveles de expresión de los genes que codifican las enzimas de la ruta de biosíntesis de β-caroteno en las hojas y en la raíz, encontrando una
53
relación directa entre la coloración de la raíz y los patrones bioquímicas de carotenos; pero no hubo relación a nivel molecular con la expresión de los genes estudiados, además los genes MeGGPS, MePSY, MePZDS y MeLCYB presentaron una expresión mayor en hoja que en raíces y en el gen MePDS se observó lo contrario. Nuñez (2007), trabajó con secuencias codificantes funcionales asociados al metabolismo de carotenos en raíces de yuca, para su posterior mejoramiento nutricional mediante transformación genética, permitiendo a futuro el análisis al nivel de la biología enzimática de fitoeno sintasa y su actividad en plastídios no fotosintéticos.
3.7 ESPECTROFOTOMETRÍA DE LUZ ULTRAVIOLETA –VISIBLE (UV-VIS)
Desde Newton, se sabe que la luz blanca se descompone en los colores que la integran si la hacemos pasar a través de un prisma. Es el efecto que se repite, por ejemplo en el arco iris, el cual se dice es el espectro de la luz visible procedente del sol,
son las gotas de lluvia y el aire atmosférico lo que hacen de
espectroscopio. La principal emisión de radiación de los cuerpos es la radiación electromagnética en forma de luz visible, de la misma manera cada elemento químico absorbe y emite luz de colores que componen su espectro (Figura 4) (Kenkel, 1992).
Rayos γ
Rayos X
Ultravioleta
Visible Infrarojo Microondas T V
Longitud de onda (λ λ)
Fracción VIS del Espectro EM
54
Radio
Figura 4. Longitud de onda para la fracción del espectro electromagnético de luz visible. Tomado de
[email protected].
La longitud de onda de la radiación puede ser desde muy pequeña, en el caso de la llamada radiación gamma, hasta muy grande en las ondas de radio. Se mide, pues, usando desde nanómetros y ángstroms hasta cientos de metros. Recordemos que un nanómetro es la milmillonésima parte de un metro (1 m = 109 nm) y que un Ángstrom es la diez mil millonésima parte de un metro (1 m = 1010 A), por lo que un nanómetro equivale a 10 Ángstrom (1nm = 10 A) (Kenkel, 1992).
La luz que recibimos del Sol es radiación electromagnética que se desplaza a 300.000 kms/s, en su totalidad, pero la longitud de onda no es la misma en todos los fotones luminosos, sino que varía entre los 4000 A y los 7000 A, aproximadamente, o lo que es lo mismo, entre los 400 nm y los 700 nm. La luz blanca se descompone, en definitiva, en un espectro de diferentes bandas coloreadas, cada una definida por una longitud de onda distinta. Así, la luz de menor longitud de onda es la luz violeta, que es de alrededor de unos 400 nm, y la luz de mayor longitud de onda es la luz roja, que es de alrededor de unos 700 nm. Sin embargo, hay radiaciones de mayor y también de menor longitud de onda, es decir, que tienen una longitud de onda inferior a 400 nm y que tienen una longitud de onda superior a los 700 nm (Kenkel, 1992).
Las radiaciones que van desde la violeta al rojo se dice que forman el espectro visible, pues proceden de la descomposición de la luz blanca. Las radiaciones de longitud de onda inferior a la violeta se llaman radiaciones ultravioletas, rayos X y rayos gamma, por orden decreciente en la longitud de onda. Las radiaciones de longitud de onda superior al rojo son las denominadas infrarrojas, microondas y ondas de radio, por orden creciente en longitud de onda. Esta técnica involucra el
55
uso de un instrumento de laboratorio que mide el grado de absorción de luz por una muestra. El diseño del instrumento es tal que una longitud de onda monocromática de luz proveniente de una fuente de luz (dentro del instrumento) incide a través de una solución de muestra. La cantidad de luz absorbida por esta solución es medida electrónicamente por un tubo fotomultiplicador y visualizada en un dispositivo de lectura. El analista es capaz de cuantificar un constituyente en la muestra relacionado este grado de absorbancia mostrado por el instrumento en la concentración del constituyente (
[email protected]). . Además de este análisis cuantitativo, también se puede realizar un análisis cualitativo observando el patrón de absorción que una muestra exhibe a lo largo de un rango de longitudes de onda, lo que se conoce como “espectro de absorción molecular”. En teoría los patrones de absorción de dos especies químicas diferentes no son exactamente iguales. Por lo tanto, se podría decir que se tiene una “huella digital” molecular y esto es lo que hace que la identificación o análisis cualitativo sea posible.
Un espectrofotómetro moderno es capaz de llevar tanto el análisis cualitativo como el cuantitativo de una muestra química (Kenkel, 1992). En la figura 5 se muestran los instrumentos básicos de un espectrofotómetro. La fuente de luz (policromática) proporciona la luz que va a ser dirigida a la muestra. El selector de longitud de onda o monocromador, aísla la longitud de onda que va a ser usada. El compartimento de la muestra es una “caja” estrecha donde se sostiene la solución de la muestra, y los componentes del detector/lector son los módulos electrónicos los cuales miden y muestran el grado de absorción (Kenkel, 1992).
56
E sp e c tr o fo to m etro
L a m p a ra
c o m p u ta d o r a
D e te c to r C e ld a
S elec to r P a y a la @ c a m p u s . c o b .ite s m . m x
Figura 5. Los componentes
[email protected].
básicos
de
un
espectrofotómetro.
Tomado
de
3.7.1 Absorbancia Los cuerpos, al incidir sobre ellos una radiación y dependiendo de sus características superficiales, absorben una parte de la radiación y reflejan el resto. Se llama absorbancia (representada por α), al cociente entre la radiación absorbida y la radiación incidente. La absorbancia varía entre 0 y 1.
Un cuerpo con una absorbancia α = 0 es un espejo perfecto, no absorbe nada de radiación. Un cuerpo con α = 1, es un cuerpo perfecto, ya que absorbe toda la radiación y por lo tanto, al no emitir ninguna, es de color negro. Los cuerpos reales
57
son, desde este punto de vista, grises, es decir, de propiedades intermedias. Los valores más bajos de absorbancia están alrededor de 0.03 (un 3%) para superficies especulares, y los más elevados del 0,97 (97%) para superficies de color negro mate. En el caso particular de que el cuerpo sea una superficie plana, o pueda asimilarse a una superficie más o menos plana, al incidir la radiación solar, parte de la radiación se absorbe y la superficie se calienta.
La intensidad de luz que golpea el detector cuando una solución “blanco” está presente en la cubeta se le da el símbolo de “I0”. El blanco es una solución que contiene todas las especies químicas que estarán presentes en los estándares y en las muestras que serán medidas (a los mismos niveles de concentración), excepto por la especie analítica. Una solución de este tipo no debe mostrar absorción y por lo tanto I0 representa la intensidad máxima que puede golpear al detector en cualquier momento. Cuando el blanco es reemplazado por una solución del analito, se detectará un haz de luz menos intenso. La intensidad de la luz para esta solución es denotada por el símbolo “I” (Figura 6). Por lo tanto, la fracción de luz transmitida es I/I0. Esta fracción es definida como la “transmitancia” “T” (Kenkel, 1992).
58
A b s o r b a n c ia y T r a n s m it a n c ia I0
Io L á m p a ra
SBlanco: e le c to r
Especies absorbentes no están presentes
I
C e ld a d e m u e s tr a
A b s o r b a n c ia
T r a n s m ita n c ia
A = L og I o/ I
T = I I/ I o
Muestra: Especies absorbentes
A b s o r bestán a npresentes c ia y t r a n s m it a n c ia
A = L o g 1 /T A b s o r b a n c ia y t r a n s m it a n c ia
A = - L og T Figura 6. Ilustración de las definiciones de I e I0, tomado de Kenkel (1992). Tomado de
[email protected].
Entonces: T= I/ I0. El porcentaje de transmitancia es similarmente definido: %T= T x 100. El aspecto infortunado de la transmitancia es que no es linear con la concentración. Concentraciones bajas resultan en transmitancias altas y concentraciones altas producen bajas transmitancias. Sin embargo, la relación no es linear sino logarítmica. Debido a que la relación es logarítmica, se espera que el logaritmo de la transmitancia sea linear. Por lo tanto, se definió el parámetro de “absorbancia” como el logaritmo negativo de la transmitancia y se le dio el símbolo “A”: A= -log T
Entonces la absorbancia es un parámetro que aumenta linealmente con la concentración, por lo tanto es importante para el análisis cuantitativo.
59
3.7.1.1 Análisis Cualitativo
Las aplicaciones analíticas del comportamiento de absorción de luz de las sustancias puede ser cualitativas o cuantitativas. Las aplicaciones cualitativas de la espectrometría de absorción dependen del hecho de que una especie molecular dada absorbe luz solamente en regiones específicas del espectro, y en grados variables característicos de esa especie en particular. Una exhibición de este tipo es llamada un espectro de absorción de esa especie molecular, y sirve como una huella digital para propósitos de identificación (Willard et al., 1981). Entonces, el espectro de absorción molecular es el patrón de absorción a lo largo de un rango de longitudes de onda, y es la huella digital molecular de una especie química en particular. Dos especies químicas diferentes no mostrarán espectros de absorción idénticos. El análisis cualitativo puede involucrar simplemente una comparación de espectros, conocido contra desconocido (Kenkel, 1992).
3.7.1.2 Análisis Cuantitativo
La relación exacta entre la absorbancia y la concentración es conocida como la ley de Beer-Lambert, o simplemente como la ley de Beer. Un enunciado de la ley de Beer es: A= a b c En donde A es absorbancia, a es “absortividad” o “coeficiente de extinción, b es la “longitud de la trayectoria”, y c es la concentración. La absortividad es la habilidad inherente de una especie química a absorber luz y es constante a una longitud de onda dada. La longitud de la trayectoria es la distancia que la luz viaja a través de la solución medida. Es el diámetro interno de la cubeta. La longitud de la trayectoria es medida en unidades de longitud, usualmente centímetros o milímetros. La concentración puede ser expresa en varias unidades, usualmente en molaridad, partes por millón, o gramos por 100 ml. Las unidades de absortividad dependen de las unidades de estos otros parámetros, ya que la
60
absorbancia es una cantidad adimensional. Cuando la concentración está en molaridad y la longitud de la trayectoria está en centímetros, las unidades de absortividad debe ser litros/(mol x centímetro). Bajo estas condiciones específicas, la absortividad es llamada la “absortividad molar” o el “coeficiente de extinción molar”, y se le da un símbolo especial, la letra griega epsilon (ε)(Kenkel, 1992). Por lo tanto la ley de Beer a veces se da como: A=εbc La definición del parámetro de absortividad molar presenta a los químicos analíticos un método estandarizado para comparar métodos espectrofotométricos. Entre más grande sea la absortividad molar, el método es más sensible. No es raro encontrar valores de absortividad molar tan grandes como 10000 L/mol cm y aún mayores. Por ejemplo, la absortividad molar del β-caroteno es de (A1%1cm) 2592 a 453 nm en éter de petróleo (Rodríguez-Amaya, 1989). Como se dijo arriba la absortividad es constante a una “longitud de onda dada”, lo cual implica que cambia con la longitud de onda. La mayor sensibilidad analítica ocurre a la longitud de onda a la cual la absortividad es máxima. Esta es la misma longitud de onda que exhibe la absorbancia máxima en el espectro de absorción molecular de esa especie química (Kenkel, 1992).
Cuando se va a hacer un análisis cuantitativo utilizando la ley de Beer, generalmente se siguen los siguientes pasos. Se preparan una serie de soluciones estándar, se mide la absorbancia de cada una de estas soluciones en cubetas idénticas y a continuación se grafica la absorbancia registrada contra la concentración de cada uno de los estándares, creando lo que se conoce como una curva estándar. De esta forma se puede medir la absorbancia de una solución desconocida y su concentración puede ser determinada a partir de la gráfica. Una gráfica de este tipo se conoce como gráfica de la ley de Beer (Figura 7 y 8). Obviamente, se puede determinar una concentración desconocida comparando su absorbancia con un solo estándar (Kenkel, 1992).
61
C u Au = Cs As En donde Cu es la concentración de la solución desconocida, Cs es la concentración del estándar, Au es la absorbancia de la solución desconocida y As es la absorbancia del estándar. La concentración también puede ser determinada por un cálculo directo, si se conocen con precisión los valores de absortividad y longitud de la trayectoria, así:
c = A/a b Datos de estándares A 0,102 0,199 0,310 0,400 0,506 0,375
C (ppm) 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 unk
A
C Figura 7. Algunos datos de estándares y una gráfica de la ley de Beer de los datos, mostrando la determinación de la concentración desconocida (unkown), tomado de Kenkel (1992).
A b s o r b a n c ia
A = - L o g (% T /1 0 0 ) t r a n s m ita n c ia
% T = (1 0 0 ) (A n tiL o g – A ) A B S O R B A N C IA
E je r c ic io
% T = 56 A = ?0 .2 5 1
0 .3
2
1
50
0
% T R A N S M IT A N C IA
0 100
Figura 8. Ejercicio sobre absorbancia y transmitancia según la ley de Beer. Tomado de
[email protected].
62
3.8 CROMATOGRAFÍA
La cromatografía puede ser considerada como la separación de los componentes de una mezcla basada en los diferentes grados de interacción de estos componentes en dos fases materiales separadas. La naturaleza de las dos fases y el tipo de interacción pueden variar, y esto da origen a los diferentes “tipos” de cromatografía. Una de las dos fases, es una fase en movimiento (la fase “móvil”) mientras que la otra no se mueve (la fase “estacionaria”). La mezcla que va a ser separada usualmente se introduce en la fase móvil, la cual se hace mover o filtrar a través de la fase estacionaria ya sea por gravedad o por cualquier otra fuerza. Los componentes de la mezcla son atraídos y retardados por la fase estacionaria en grados variables, y como resultado, se mueven junto con la fase móvil a velocidades diferentes y por lo tanto son separados (Kenkel, 1992).
La fase móvil puede ser un gas o un líquido, mientras que la fase estacionaria puede ser un líquido o un sólido. Un esquema de clasificación está basado en la naturaleza de las dos fases. Todas las técnicas que utilizan un gas como fase móvil, viene bajo el encabezamiento de “Cromatografía de Gas” (GC). Todas las técnicas que utilizan una fase móvil líquida vienen bajo el encabezamiento de “Cromatografía Líquida” (LC). Adicionalmente, se tiene cromatografía gas-líquido (GLC), cromatografía líquido-sólido (LSC) si queremos estipular la naturaleza de la fase estacionaria así como la de la fase móvil. Sin embargo, es más útil clasificar las técnicas de acuerdo a la naturaleza de la interacción de los componentes de la mezcla con las dos fases. Estas clasificaciones se pueden denominar como “tipos” de cromatografía. Los tipos de cromatografía más importantes son: partición, adsorción, intercambio iónico y exclusión por tamaño (Kenkel, 1992).
3.9 EL MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON AYUDA DE MARCADORES MOLECULARES
63
Desde hace ya unos cientos de años el hombre ha venido practicando el mejoramiento genético de plantas mediante la evaluación fenotipica, teniendo la limitante de influencia del ambiente, el tiempo y la heredabilidad del carácter en estudio. Gracias a los marcadores moleculares actualmente se puede aumentar la eficiencia en el mejoramiento convencional dirigiendo la selección con marcadores moleculares ligados a la característica en estudio, además los marcadores no están influenciados por el ambiente, ni por la edad de la planta. Los marcadores moleculares se refieren a como secuencias de ADN que segregan de forma independiente.
Los marcadores de ADN pueden entonces ser usados para indicar cuando se ha alcanzado o pasado por un gen particular de interés (Paterson, 1996), el mapeo genético se ha hecho posible porque el genoma nuclear en organismos superiores esta organizado y es transmitido como unidades lineales, llamados cromosomas, un mapa genético de una especie animal o vegetal es un modelo abstracto del arreglo lineal de un grupo de genes y marcadores, ambos, el gen y el marcador pueden tener simple herencia que se va a trasmitir a través de las generaciones (Paterson, 1996). Un gen con una función conocida puede ser considerado un marcador si este contiene variación detectable (Liu, 1998), es decir un marcador visible puede ser una simple mutación en un gen particular. El mapeo y el secuenciamiento del genoma de plantas pueden probablemente ayudar a dilucidar la función de un gen, su regulación y su expresión (Mohan, 1997).
Los marcadores genéticos de locus especifico han sido cruciales para estudiar la variación genética en poblaciones silvestres para identificar los procesos que causan cambio microevolutivo. Estos marcadores fueron usados durante 30 años, y a mediados de los 60 nuevas tecnologías fueron desarrolladas para medir variación genética (Soltis et al, 1998).
64
Durante las pasadas dos décadas una variedad de marcadores moleculares han sido desarrollados, los cuales difieren ampliamente en términos de variabilidad, herencia y conservación de distancias taxonómicas. Además existen grandes diferencias en mano de obra calificada, costos y alta tecnología para desarrollar estos marcadores, existen ventajas y limitaciones de las 5 clases de marcadores comúnmente empleados para el mapeo de plantas. A continuación se presenta una tabla en donde se hace una comparación de las 5 clases de marcadores en varios aspectos (Soltis et al, 1998).
Tabla 3. Características de marcadores moleculares frecuentemente empleados para mapeo genético. Tomado de Soltis et al. 1998.
Marcador Tiempo de Desarrollo Costo desarrollo Dificultad de La técnica
AFLPs Bajo
Isoenzimas Bajo
Microsatélite Alto
RAPDs Bajo
RFLPs Moderado
Bajo
Bajo
Alto
Bajo
Moderado
Moderado
Bajo
Moderado
Bajo
Moderado
Alta
Moderado
Bajo
Moderado
Moderado
Costo
Moderado
Bajo
Moderado
Moderado
Moderado
Herencia
Dominante
Codominante
Dominante
Variabilidad
Moderado
Codominant e Alto
Alto
Moderado
Codominant e Moderado
Conservació n
Bajo
Moderado
Bajo
Alto
Eficiencia
Los marcadores moleculares pueden ser de dos tipos: los no basados en el PCR y los que se basan en la técnica de amplificación de fragmentos de ADN vía PCR.
65
3.9.1 Marcadores no basados en PCR.
3.9.1.1 Isoenzimas. Dentro de los marcadores bioquímicos están las isoenzimas (Lewontin, 1966) su principio básico consiste en el uso de electroforesis en geles de almidón o poliacrilamida-SDS-PAGE (Smithies, 1955) y la posterior visualización del producto enzimático por métodos histoquímicos (Hunter, 1957). Los loci de las isoenzimas exhiben niveles intermedios de variabilidad alelica, los alelos son típicamente codominantes (Soltis, 1998).
Los datos producidos mediante marcadores isoenzimaticos pueden ser menos informativos y posiblemente sujetos a error, en análisis filogenéticos
con
problemas asociados con inferencia homologa, pero pueden ser usados para medir subestructuración de poblaciones entre especies y discriminación entre poblaciones de taxa relativamente cerradas (Hamrick, 1989).
Ventajas. Este tipo de marcador es todavía empleado para análisis genético que no necesitan un gran muestreo del genoma, además estos marcadores son codominantes, permitiendo evaluar parámetros como frecuencias genotípicas, frecuencias alelicas y con ellas coeficientes de diversidad genética y heterocigosidad. También se puede analizar desviaciones del equilibrio HardyWeinberg en un locus o el equilibrio de ligamiento de los gametos entre los loci (Weir B, 1990).
Desventajas. Para el caso que se requiera una cobertura total del genoma, las isoenzimas tienen ciertas desventajas como: el número total de loci que se pueden identificar en el genoma es mínimo, el nivel de polimorfismo genético detectable en cada locus es mínimo y es dependiente de las condiciones ambientales, influyendo en la actividad enzimático, existe además especificidad de múltiples formas isoenzimaticas para tejidos vegetales. También las diferentes actividades están asociadas a diferentes fases del desarrollo (Ferreira M, 1998).
66
3.9.1.2 RFLP.
Polimorfismo en la Longitud de Fragmentos de Restricción
(Botstein et al, 1980) . Se identifica como el polimorfismo observado por el corte de la doble cadena del ADN mediante enzimas de restricción; el ADN geonómico se aísla del material biológico a estudiar (ADN de alta pureza y libre de inhibidores de las enzimas de restricción). Luego el ADN se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos generados por dichas enzimas se separan por electroforesis en gel de agarosa, para luego ser separados por tamaños.
Para identificar las
secuencias de interés en dicho producto heterogéneo (de bandas), es necesario híbridar con otras secuencias de cadena sencilla (sondas que deben ser marcadas radiactivamente con
32
P) previamente obtenidas en el laboratorio
(Ferreira M, 1998).
El uso más amplio de los marcadores de ADN nuclear es para medir variación genética en poblaciones de plantas, se hace mediante los loci del ribosoma, se caracterizan por ser moderadamente variables y de fácil detección. La cantidad de variabilidad típicamente observada la hace ideal para medir tales procesos como flujo de genes dentro y entre taxas (Soltis, 1998).
Ventajas. A diferencia de los isoenzimas los RFLP pueden cubrir todo el genoma del organismo en estudio, el cual dependerá del tipo de biblioteca de sondas utilizada. Los RFLP son ampliamente utilizados para identificar genes que controlan un carácter de interés, necesitando solamente una población segregante y que los caracteres evaluados estén segregando en la población (Tansksley et al; 1983: Soller y Beckmann, 1983).
Los RFLP presentan expresión codominante, esto quiere decir que para cada locus estudiado se puede identificar genotipos homocigotos y heterocigotos permitiendo un análisis de la acción genética y de la interacción entre alelos. Estos presentan un polimorfismo alelico en cada locus alto. Este tipo de marcador
67
permite una alta estabilidad a la molécula de ADN, el cual puede ser extraído, conservado y reutilizado por mucho tiempo; al igual que el ADN, las membranas de hibridación también pueden ser conservadas y reutilizadas hasta más de 15 veces (Tanksley, 1983b; Soller, 1983).
Desventajas.
Las limitaciones de este tipo de marcador son: el uso de
radioactividad, el diseño previo de una biblioteca de sondas y los clones que van hacer utilizados como sondas, luego de obtener la sonda en unos cuantos meses, se puede iniciar la evaluación de los RFLP (Ferreira, 1998).
3.9.2 Marcadores basados en PCR.
El PCR es una de las técnicas que
revoluciono la biología en la década de los 80. Kary B. Mullis desarrolló un proceso que produce un número ilimitado de copias del ADN, llamado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica comprende la síntesis enzimática in vitro de millones de copias de un segmento específico de ADN con la enzima Taq polimerasa, algunos reactivos y una fuente de calor. El ADN a ser usado puede ser de cualquier tejido, un cabello, una gota de sangre, tejidos de un cerebro momificado muerto hace mucho tiempo (Mullis, 1990).
La reacción de PCR se basa en el apareamiento y la polimerización enzimática de un par de oligonucleótidos (pequeñas moléculas de ADN de cadena sencilla) utilizado como indicadores "primers" que delimitan la secuencia de ADN de doble cadena, "blanco" de la amplificación. Estos primers son sintetizados de forma artificial de manera que sus secuencias de nucleótidos se complementen a las secuencias que flanquean la región "blanco" (Ferreira, 1998). La técnica consta de tres pasos, la denaturaciónde ADN a 94oC, el alineamiento o pareamiento de los cebadores y la extensión del cebador. En la figura 9, se puede observar que en el primer ciclo, el ADN es denaturado a una temperatura de 92oC a 95oC, el segundo paso se realiza de 45oC a 55oC dependiendo del tamaño y la
68
secuencia del "primer", en donde sé hibridiza el ADN de cada primer con las secuencias complementarias que flanquean la región blanco, el último paso es el de extensión del primer a 72oC en donde la enzima taq polimerasa incorpora nucleótidos a la cadena molde 3' terminal de los "primers", de tal forma que se produce una copia de esta secuencia y en pocos ciclos se producen muchas copias de ADN de la misma secuencia (Mullis, 1990).
Figura 9. Pasos del PCR Tomado de http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html.
La figura 10, muestra como es el proceso de amplificación que tiene un crecimiento geométrico, que puede producir hasta 100.000 millones de moléculas idénticas de "secuencia blanco" (Mullis, 1990).
69
Figura 10. Amplificación exponencial de un gen mediante PCR. Tomado de http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html.
Ha pasado mucho tiempo desde el día en que se desarrolló esta metodología y hoy se utiliza la técnica de PCR en todas las ciencias biológicas, siendo tal vez el adelanto tecnológico y científico del siglo XX.
70
3.9.2.1 Minisatélites.
Marcadores basados en Loci Hipervariables de
Minisatélites. Están constituidos por un número variable de secuencias idénticas, repetidas lado a lado, poseen de 15 a 100 pares de bases y se repiten hasta 50 veces en cada locus hipervariable (Ferreria, 1998). El nombre de satélite se debe a que las secuencias repetitivas forman un nódulo satélite distinto al nódulo principal de ADN genómico en la separación del ADN en gradientes de Cloruro de Cesio, por contener una proporción de pares de bases G-C diferentes a la media del resto del genoma (Lewin, 1990).
Los minisatélites están dispersos por todo el genoma, y representan una proporción detectable del mismo, constituyéndose varios loci en diferentes números de repeticiones. Han sido caracterizadas diferentes familias de minisatélites, y se han usado para la identificación de variedades, cultivares y clones, así como para el análisis de diversidad y determinación de paternidad (Dallas, 1988; Nybom, 1991; Rogstad et al, 1988; Gepts et al, 1992; Broun, 1992).
La diferencia básica entre los marcadores RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada en la etapa de detección del polimorfismo. Con los RFLP, se usan sondas homólogas a secuencias únicas del genoma, detectándose pocos loci cada vez. Para VNTR, se usan sondas constituidas por secuencias núcleo homólogas a las secuencias repetidas de los minisatélites, es decir todos los loci hipervariables son detectados simultáneamente (Ferreira, 1998).
Ventajas. Estos comparten las mismas ventajas y limitaciones de los RFLP. Los marcadores de loci hipervariable son ampliamente utilizados para identificar paternidad responsable, más no para la construcción de mapas genéticos o para identificación de QTL. Además muchas de las sondas utilizadas para la detección de loci hipervariables pueden ser empleadas en un amplio espectro de organismos desde virus hasta plantas y mamíferos (Ferreira, 1998).
71
3.9.2.2 RAPD. Polimorfismo de ADN Amplificado Arbitrariamente (Williams et al, 1990). Los RAPD son básicamente una variación del protocolo de PCR: utilizan un solo "primer = 10 nucleotidos" único en vez de un par de "primers", el "primer único" tiene secuencia arbitraria y por tal razón su secuencia blanco es desconocida, estas secuencias de primers arbitrarios amplifican regiones anónimas de ADN y produce una serie de una o muchas bandas que pueden ser visualizadas en geles de agarosa (Soltis, 1998). El análisis de RAPDs originalmente fue descrito como un método para mapeo genético (Williams, 1990) y ha sido ampliamente usado para este propósito. También ha sido empleado para la cuantificación de poblaciones de variabilidad genética en especies de cultivos relacionados (Soltis, 1998).
La base molecular de este tipo de polimorfismo no es muy conocida, por lo que diferencias de solo un par de bases, (mutación de punto) son suficientes para causar la no-complementariedad del "primer" con el sitio de iniciación, e impedir así la amplificación de un segmento (Williams, 1990; Ferreira, 1998).
Ventajas.
Los RAPD no necesitan una biblioteca de sondas establecida,
solamente unos primers al azar son necesarios para cualquier organismo. Con respecto a los RFLP los RAPD son 6 veces más eficientes en el mapeamiento de polimorfismos ligados a loci de resistencia a enfermedades y 10 veces más eficiente en tiempo y mano de obra (Ferreira, 1998). Estos necesitan cantidades mínimas de ADN equivalentes en nanogramos, también permiten la detección de polimorfismo de ADN a lo largo de todo el genoma, junto con regiones repetidas de ADN.
En cuanto a costos los RAPD son menos costosos que los RFLP, el uso de esta técnica no requiere una experiencia avanzada en biología molecular ni instalaciones sofisticadas (Ferreira, 1998).
72
Desventajas. Una de las limitaciones más importante es la poca información genética por locus, solamente un alelo es detectado, esto se conoce como dominancia. La gran sensibilidad de detección puede influir en generación de error cuando se usa un mismo marcador para individuos genéticamente distantes y la reproducibilidad de un laboratorio a otro (Ferreira, 1998).
3.9.2.3 AFLP. Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (Zabeau, 1993). Este tipo de marcador se fundamenta en la digestión del ADN genómico con 2 enzimas de restricción, seguido por la detección del polimorfismo previa amplificación vía PCR empleando primers específicos y los fragmentos amplificados son separados en geles de alta resolución (Ferreira, 1998).
La metodología de los AFLPs incluye una digestión total de ADN geonómico con dos endonucleasas, ligación de adaptadores que son oligonucleotidos de ADN cortos para facilitar las dos sucesivas amplificaciones de PCR usando diferentes juego de primers. La primera amplificación usa un juego de primers que incorpora una secuencia núcleo, la secuencia reconoce las dos endonucleasas empieza una adición de pares de bases. La segunda amplificación usa oligonucleotidos que tienen tres pares de bases adheridas al final de la cadena 3' para hacer la amplificación más selectiva. Los fragmentos de ADN producidos por este análisis son separados mediante geles de poliacrilamida (Soltis, 1998).
Ventajas. Esta tecnología es bien eficiente para realizar un muestreo amplio y simultáneo de cualquier genoma, esta cualidad se atribuye a su poder de generar un gran número de fragmentos, es decir el número de marcadores analizados simultáneamente es alto. A su vez presenta un poder de detección de variabilidad genética, debido a que explora simultáneamente el polimorfismo de presencia y ausencia de sitios de restricción, junto con la existencia o no de amplificación a partir de secuencias arbitrarias. Una última ventaja es la especificidad de la técnica de PCR (Ferreira, 1998).
73
Desventajas. Con este tipo de marcador solo se detecta un alelo, o sea que su contenido de información generado por locus es bajo, amplificándose sólo el fragmento usado. El ADN empleado para este análisis debe ser muy puro, por consiguiente el tipo de extracción a emplear debe ser altamente eficiente, con el fin de que funcione la técnica, ya que se realizan digestiones con enzimas de restricción las cuales requieren ADN de muy buena calidad (Ferreira, 1998).
3.9.2.4 SSR.
Marcadores basados en la Amplificación de Microsatélites. La
importancia de los marcadores "Microsatélites" (Litt, 1989), radica en que son secuencias sencillas repetidas ("SSR-Simple Sequence Repeats") y consisten en pequeñas secuencias de 1 a 4 nucleótidos adyacentes repetidos lado a lado, por ser secuencias tan pequeñas se presentan con mucha frecuencia en el genoma (Ferreira, 1998). Según Jarne y Lagoda (1996) los SSR o microsatélites constan de unidades cortas de nucleótidos repetidas en tandem una seguida de la otra, donde las repeticiones más comunes son las di, tri y tetranucleótidos ampliamente distribuidos por el genoma de plantas y animales.
Los microsatélites presentan ciertas ventajas que los hacen un buen tipo de marcador molecular ya que son altamente polimórficos, por esta razón cualquier población segregante puede ser utilizada como población de referencia para estudios de ligamiento y mapeo genético (Ferreira, 1998), y por lo tanto proporcionan una valiosa información debido a que proveen alelos diferentes para cada marcador evaluado, son de herencia codominante y de segregación mendeliana simple, poseen alta reproducibilidad y neutralidad selectiva (Ashley, 1994). Morgante y Olivieri (1993) resaltan la cantidad de información que suministran los microsatélites y la facilidad con que pueden ser identificados, lo cual hace que sean los marcadores ideales para el mapeo de ligamiento, tanto genético como físico. Una de las desventajas de los microsatélites es su elevado costo y el tiempo gastado para obtener el diseño de los primers.
74
Estos marcadores presentan características que los hacen útiles para estudios genéticos: no tienen influencia del medio ambiente, son independientes del estado de crecimiento de la planta, son de actividad neutra en el desarrollo de la planta y no presentan efectos epistáticos, así mismo se pueden usar dependiendo del tipo de investigación que se lleve a cabo (Soltis, 1998).
Ventajas.
Este tipo de marcador presenta el más alto contenido de
información de polimorfismo PIC (Polymorphism Information Content). Se puede emplear para estudios de ligamiento, mapeo genético y físico, para la identificación y discriminación de genotipos y para estudio de poblaciones usando una población segregante. Estas secuencias están muy frecuentes y se encuentran de manera al azar, permitiendo una amplia cobertura del genoma (Ferreira, 1998).
Desventajas. Una de las mayores limitaciones de los microsatélites es el trabajo que se requiere para obtener los cebadores o primers, además se necesita personal especializado y una alta tecnología para el secuenciamiento y por ende los costos muy elevados para desarrollar proyectos de esta magnitud (Ferreira, 1998).
3.9.3 Aplicación de marcadores moleculares en el mejoramiento de plantas En la tabla 4 se encuentran las principales aplicaciones de los diferentes marcadores moleculares usados para el mejoramiento de plantas. Tabla 4. Aplicaciones de los marcadores moleculares para el mejoramiento de plantas. Tomado de Ferreira y Grattapaglia. 1998.
MEJORAMIENTO CLÁSICO Aplicaciones a corto plazo Identificación de origen parental y prueba de paternidad Identificación y protección de variedades y/o clones patentados Atribución de líneas a grupos heteróticos
75
Certificación de pureza genética de líneas e híbridos Control de fecundación cruzada y autofecundación en plantaciones de semillas forestales Evaluación de germoplasma y poblaciones de mejoramiento (variabilidad, diversidad, clasificación, distancia genética y filogenia) Construcción de colecciones nucleares (“Core collections”) en bancos de germoplasma a partir de estudios sobre diversidad y distancia genética. Aplicaciones a medio y largo plazo Camino analítico Construcción de mapas genéticos de ligamiento Mapeamiento genético de QTL y/o ETL (“Quantitative”y “Economic Trait Loci”), controladores de características cuantitativas y/o de importancia económica Análisis de la arquitectura de características cuantitativas (número, posición, acción genética, magnitud de efecto e interacciones de QTLs) Detección de loci homólogos en otras especies o géneros a través de mapas comparativos (“Comparative” o “Synteny mapping”) Camino sintético Introgresión de características por retrocruzamiento asistido por marcadores Selección y recombinación dirigida de genotipos superiores Selección durante el desarrollo de líneas endógamas Predicción de fenotipos esperados Selección indirecta para características de difícil evaluación (resistencia a factores bióticos y abióticos, o para características industriales) Selección precoz en cultivos perennes MEJORAMIENTO TRANSGENICO Mapeamiento genético detallado para clonación de genes basada en mapas (“Positional cloning” o “Map-based cloning”)
3.10 MAPEO GENÉTICO MOLECULAR
Para construir un mapa genético en una población, es posible hacerlo con el uso de marcadores bioquímicos o moleculares, los cuales se definen como cualquier genotipo propio de la expresión de un gen determinado, que corresponde a regiones expresadas o no del genoma (Ferreira, M., 1998). Los marcadores moleculares son usados para identificar y etiquetar regiones deseadas (Mohan et al, 1997) y son como las señales o puntos de referencia que guían por un camino determinado, en este caso por los cromosomas (el genoma), creando un mapa en el cual se pueda identificar áreas determinadas y especificas (genes de interés).
76
Los mapas genéticos pueden entenderse como un mapa de carretera, que refleja la relativa proximidad de diferentes señales una de la otra, igual que las señales de carretera, guían al motorista a lo largo del camino, las herramientas moleculares permiten al genetista establecer "marcadores de ADN" en lugares definidos a lo largo del cromosoma (Paterson, 1996). También un mapa genético puede ser representado según un orden especifico de marcadores moleculares y las distancias que se generan entre ellos a lo largo de los cromosomas de la especie en estudio. Gracias a los mapas genéticos se puede:
Hacer una cobertura total y un análisis de los genotipos empleados. Estudiar
características
complejas
de
tipo
poligénico,
con
la
descomposición mediante segregaciones mendelianas. Identificar regiones en el genoma (QTLs) las cuales controlan rasgos de interés agronómico. Aplicar toda esta información en un programa de mejoramiento. El análisis de ligamiento consiste en que dos loci ubicados en diferentes cromosomas
tiene
una
probabilidad
de
recombinarse
y
de
segregar
independientemente comparado con dos loci que se encuentran ubicados en el mismo cromosoma y segregan juntos. Entendiéndose como fracción de rembinación una medida indirecta de la distancia entre dos loci, definiéndose como una distancia genética. En otras palabras 1% de recombinación es igual a 1 centimorgan (cM), equivalente a 1 unidad de mapa. Según Morton (1955), el análisis de ligamiento permite distinguir entre segregación independiente de caracteres mediante la estimación de la fracción de recombinación llamado θ, por ejemplo si dos loci segregan independientemente, θ asume un valor de 0.50 y Lod Score es el logaritmo del cociente entre la probabilidad de cualquier fracción de recombinación, dos loci estarían ligados según la probabilidad de que esos loci tengan una segregación independiente (Morton, 1955). Gracias a esta información
77
se puede decir que la distancia de mapa es la razón entre el número observado de individuos con genotipos recombinantes y el número total de individuos evaluados. Se presentan dos tipos de función de mapeo una de ellas es; la función de mapeo de Kosambi, la cual realiza una corrección del fenómeno de interferencia y doble recombinación, el cual se fundamenta en que el efecto de recombinación inhibe la formación de otro en una región cercana; y la otra función de mapeo es la de Haldane, la cual asume que las recombinaciones se generan al azar entre los bivalentes sin que influyan entre ellas (Crow, 1990; Kosambi, 1944; Haldane, 1919).
Cuando dos loci, A – B (cada uno con dos alelos; A-a; B-b) están en el mismo cromosoma, ósea que están ligados, se presentan dos tipos de configuración: Se dice que los dos genes están en fase de acoplamiento cuando los genes A-B se encuentran en el mismo cromosoma homólogo y los genes a-b están en el otro cromosoma. Y estarían en fase de repulsión cuando la configuración alélica es Ab/aB. Según las leyes de Mendel, solamente los genes que se encuentran en cromosomas diferentes pueden segregar independientemente el uno del otro, el resto se transmiten conjuntamente, llamado ligamento genético.
3.10.1 Construcción de mapas genéticos. Para el análisis genético de cualquier especie, especialmente para el mejoramiento de plantas, la construcción de mapas genéticos juega un papel muy importante dentro de las aplicaciones a mediano y largo plazo. Por consiguiente los mapas moleculares facilitan la cobertura y análisis completo de genotipos, la descomposición de características genéticas complejas en sus componentes mendelianos, su correspondiente localización en regiones del genoma que controlan características de importancia, el nivel del efecto de estas regiones causadas por dichas características y la mejor forma de orientar toda la información generada en programas de mejoramiento (Ferreira, 1998).
78
Además los mapas proporcionan información sobre la estructura y organización del genoma, patrones de distorsión de segregación Mendeliana de segmentos cromosómicos o la presencia de inversiones, translocaciones y duplicaciones de segmentos de ADN (Slocum et al, 1990; Tanksley et al, 1992; Ferreira, 1994).
3.10.2
Tipo de población.
Para desarrollar un mapa genético se debe
seleccionar una población segregante, pueden servir poblaciones F2 (Intercruce), híbridos F1, retrocruces, dobles haploides, líneas autogamas recombinantes (RILs) (Soller, 1990). La elección de los parentales y el tamaño de la población es fundamental para el estudio de características cuantitativas, ya que la segregación de QTLs puede estar afectada por el grado de diferencia de los parentales para la característica de interés, por lo tanto la selección de parentales contrastantes para dicha característica incrementa él numero de QTLs detectables (Soller, 1990). Para la construcción de mapas genéticos el aumento del tamaño de la población (progenie), incrementa la exactitud estadística para la detección y la precisión en la estimación del efecto y localización de QTLs, estas poblaciones tienden a estar entre 150 y 400 individuos (Melchinguera et al, 1998).
3.10.3 Mapa Molecular en Yuca. En yuca se ha dado un primer gran paso con la construcción de un mapa molecular basado en marcadores como: isoenzimas, RFLPs, RAPDs en un cruce intra-especifico F1, con este trabajo se da inicio a los estudios de selección asistida por marcadores de la genética de características de importancia agronómica (Fregene et al, 1997). El cruce F1 se usó para identificar características complejas y su herencia entre una línea resistente al virus del mosaico de la Yuca (ACMD) y precoz (TMS 30572) establecida en África y una línea élite altamente productiva (CM 2177-2) de Colombia. Esta F1 tiene una población de 150 individuos, el mapa se saturó en un 80 %, empleando diferentes marcadores: 239 RFLP, 80 RAPD, 7 SSR, 3 Isoenzimas (Fregene, 2000). Siguiendo con la búsqueda de marcadores para completar totalmente el mapa en la F1 de yuca, Mba et al (2001) desarrollaron mediante el aislamiento y la
79
caracterización de clones, 186 marcadores moleculares microsatélites (SSR) con el fin de saturar el mapa existente.
Chavarriaga y Maya (1998) realizaron la clonación de microsatélites en yuca, con el fin de mapear y caracterizar la variabilidad genética de la colección core (núcleo) de Yuca, donde se establecieron 12 microsatélites que contienen repeticiones GA, con gran heterozigosidad, modo de herencia y aspectos de relevancia en cuanto al tamaño de los alelos de microsatélite usando un sistema basado en fluorescencia y genotipado semiautomático. Se hizo un trabajo similar empleando mapeo de características morfológicas y calidad de raíz asociadas a QTLs en una población F1 de parientes no híbridos de variedades élite TMS 30572 y CM 2177-2 (Okogbenin, 2002). En el 2006 Okogbenin, estableció el primer mapa molecular de yuca empleando solamente marcadores de tipo SSR.
3.11 MEJORAMIENTO GENÉTICO Y BIOTECNOLOGÍA EN PLANTAS
3.11.1 Mejoramiento genético en plantas. Las ciencias de la genética y el mejoramiento de plantas emergieron desde hace 200 años atrás, sin embargo, las plantas han sido seleccionadas y mejoradas desde tiempos prehistóricos. Existen dos selecciones primitivas de tipo silvestre como mecanismo para dispersión de semilla; estos eran la falta de apertura de los raquis de los tallos de los cereales (Zohary, 1969; Harlan et al, 1973) y la vaina que permanece tiempo cerrada mientras se seca (Waines, 1975; Ladizinsky, 1979ª). Otra característica es la selección inadvertida, por ejemplo la tolerancia a aluminio de ciertos cultivares creciendo en suelos ácidos (Foy et al, 1974).
El mejoramiento moderno de plantas toma ventaja de la variabilidad genética existente en taxas relacionadas estrechamente, y puede considerar estrategias para incorporar genes de fuentes ajenas y distantes, cuando hay un esfuerzo para modificar genomas de plantas para un propósito en particular (Murray, 1991).
80
La reserva de la variabilidad genética viable para el mejoramiento de plantas incluye colección de cultivares, y lo más importante, la colección de especies silvestres y malas hierbas que parten de un ancestro inmediatamente común con el cultivo en consideración (Murray, 1991). Para identificar la base de progenitores silvestres sobre observaciones citogenéticas, se hacen estudios comparativos de electroforesis de proteínas de la semilla (Ladizinsky, 1979b; Murray, 1984; Krishna, 1988).
Para el mejoramiento de la productividad o eficiencia de las plantas, el mejorador debe estar completamente enterado de los atributos y la historia de la planta a mejorar. Los atributos más convencionales son los concernientes a resistencia a enfermedades
y
control
de
floración,
algunos
factores
ambientales
desestabilizantes deben ser considerados con mayor atención, los genotipos predominantes para cada cultivo necesitan en un futuro ser evaluados mediante ensayos como los siguientes:
Incremento global en la concentración atmosférica del CO2 (Tucker, 1981).
Cambio climático el cual afecta los patrones de precipitación y rango de temperatura (Daly, 1989; Schneider, 1990).
Incremento en la penetración de la radiación ultravioleta en la superficie de la tierra como consecuencia del debilitamiento de la capa de ozono de la estratosfera (Worrest, 1986) llamado calentamiento global.
3.11.2 Biotecnología en plantas. La ingeniería genética y la biotecnología han sido ampliamente adoptadas para aplicarse en la alteración del genoma por métodos bioquímicos, posiblemente incorporando ADN de procariotes, o de eucariotes, hongos, algas y animales (Murray. D.R. 1991).
81
3.11.2.1 Biotecnología aplicada al cultivo de la Yuca.
En CIAT (Centro
Internacional de Agricultura Tropical) se viene trabajando en biotecnología aplicada al cultivo de yuca con el fin de resolver problemas relacionados con la producción, enfermedades, la falta de material sano y certificado para siembra y el deterioro rápido de las raíces después de cosechadas, sus esfuerzos se han concentrado en 3 áreas con el fin de entender y aplicar la biotecnología. En primer lugar se trabaja en la conservación del germoplasma y la multiplicación rápida de material sano (certificado), a través de Cultivo de tejidos; en segundo lugar se estudia la resistencia a enfermedades y la mejora en la calidad de raíces con ayuda de la transformación genética; y en tercer lugar el uso de marcadores moleculares para mejorar la eficiencia en el mejoramiento del cultivo y entender su diversidad genética (CIAT, 2000).
4. QTLs (Loci de Características Cuantitativas)
La acción de un
número de genes influye en la expresión de características
heredables de importancia económica, dichas características son llamadas poligénicas, cuantitativas o de herencia compleja. Dentro de algunos ejemplos de características de herencia cuantitativa se presentan; la precocidad, la productividad y el crecimiento volumétrico. Los loci que controlan la expresión de la mayoría de las características cuantitativas son llamados “QTL- Quantitative Trait Loci”, loci que controlan características cuantitativas. Con la ayuda de los mapas genéticos construidos con base en marcadores moleculares se puede estudiar la arquitectura de características cuantitativas logrando identificar, mapear y medir la magnitud del efecto de los principales factores genéticos involucrados en el control de estas características y llegar a manipular estos factores individualmente durante los procedimientos de selección y recombinación genética (Ferreira, 1998).
82
El ligamiento genético entre marcadores y QTLs depende de la existencia de desequilibrio de ligamiento (“linkage disequilibrium”) entre los alelos en el locus marcador y los alelos del QTL, este desequilibrio genera efectos cuantitativos asociados al marcador que pueden ser detectados y estimados a través del análisis estadístico más acorde. Se puede decir que cuando las frecuencias genotípicas de los gametos difieren del producto de las frecuencias de los alelos componentes ha ocurrido un desequilibrio de ligamiento entre dos loci, produciéndose una asociación significativa entre dichos loci (Ferreira, 1998).
Para detectar un QTL, es necesario saber la magnitud del efecto del QTL sobre la característica, la distancia entre marcadores, el tipo de poblacion, el tamaño de la población segregante en evaluación, la frecuencia de recombinación del marcador y el QTL, y la heredabilidad del carácter en estudio (Ferreira, 1998; Melchinguera, 1998).
El número de QTLs segregantes y el tamaño de su efecto en un cruce está determinado por las diferencias fenotípicas de los parentales y por la varianza genotípica de la progenie. La varianza genotípica puede ser estimada como la diferencia entre la varianza experimental total o varianza fenotípica y la varianza ambiental. La varianza ambiental puede ser estimada a partir de las medias genotípicas de la población progenie replicada en diferentes ambientes (Lee, 1995).
4.1 USO DE MARCADORES MOLECULARES EN ESTUDIOS GENÉTICOS E IDENTIFICACIÓN DE QTLs.
Otro aspecto importante en el mapeo genético, es la selección asistida por marcadores y los QTLs (loci de características cuantitativas). El mapeo de QTLs es una valiosa herramienta para detectar regiones del genoma ligados a características de interés agronómico. La principal dificultad de esta técnica es el
83
hecho intrínseco que tanto factores genéticos como ambientales afectan la expresión final del fenotipo. A pesar del reducido número de estudios de mapeo de QTLs, utilizando progenies relativamente pequeñas se ha detectado un número significativo de asociaciones entre marcadores y QTLs. Es importante recordar que un QTL puede en realidad estar constituido por varios genes que funcionen en conjunto en una especie de complejo genético coadaptado (Ferreira, 1998).
El mapeo de QTLs consiste en buscar asociaciones entre marcadores polimórficos y caracteres cuantitativos, si la asociación resulta significativa el QTL está cercano al marcador. Los QTLs pueden ser mapeados en el genoma mediante el uso de marcadores moleculares que cubran buena parte del mismo lo cual da la posibilidad que algunos QTLs estén asociados con éstos, es decir si los genes como los marcadores están segregando en una población genéticamente definida pueden establecerse relaciones de ligamiento entre ellos mediante la asociación de la variación de las características cuantitativas y el marcador molecular (Teran, 1999).
4.2 EPISTASIS
Bateson explica la epistasis como aquellos genes que enmascaran o cubren el efecto de otros genes, en otras palabras son interacciones no lineales entre alelos de diferente loci. La epistasis es una importante base genética para entender fenotipos complejos (Paterson, 1998).
Diferentes estudios de evolución y genética de poblaciones sugieren que la epistasis cumple un papel muy importante en la variación de características complejas como el vigor “fitness” y sus componentes, además ayudan a mantener la integridad genética de una especie o subespecie (Tanksley et al, 1988). La importancia de la epistasis que afecta características complejas en experimentos de mapeo de QTLs demuestra que sólo se puede mapear un número limitado de
84
QTLs para cada característica en estudio, dando una porción del total de la variación fenotípica de la característica. Varios estudios de selección asistida por marcadores (M.A.S) muestran fuerte evidencia que explica la epistasis como una importante base genética para entender características complejas (Tanksley et al, 1988).
4.2.1 Clasificación de la epistasis. La epistasis entre un par de loci afectando una característica cuantitativa compleja solo puede ser detectada por desviación en los valores de la característica basado en lo esperado sobre los muchos efectos de los dos loci. Estudios evolutivos y de mapeo de QTLs sugieren 3 tipos de epistasis que afectan características complejas:
1. Interacción entre QTLs. Explica la acción de poligenes con muchos efectos (Aditividad y Dominancia) sobre una característica cuantitativa estando involucrada la epistasis que afectan la misma característica.
2. Interacción entre QTLs y loci modificado. Es un tipo de epistasis que afecta características cuantitativas.
3. Interacción entre loci complementario. Es la interacción entre alelos incompatibles, los alelos del loci que interactúan en el mismo pool de genes, son complementarios o compatibles con los de diferentes especies o son incompatibles con las poblaciones. Y en una población derivada del cruce entre padre distantemente relacionados, los loci complementarios no han sido emparentados como QTLs de los alelos de diferente loci que tienen efecto reciproco sobre el fenotipo.
4.2.2 Modelos genéticos cuantitativos para epistasis
Modelo genético de epistasis digénica.
85
Modelo genético aditivo para epistasis digénica. Modelo
de
epistasis
dominante
para
interacciones
entre
dos
genes
completamente dominantes.
Modelo de epistasis mezclado para interacción entre un gen aditivo y un gen completamente dominante.
5. HEREDABILIDAD
La efectividad de selección para una característica depende de factores genéticos y no genéticos en la expresión de diferencias fenotípicas entre genotipos en una población. La selección de una planta puede ser efectiva para un carácter con alta heredabilidad e inefectivo para uno con baja heredabilidad (Fehr, 1987). La heredabilidad (h2) puede ser definida como el rango de la varianza fenotípica (σg2) a la varianza fenotípica (σ2ph); h = σg2 / σ2ph. La varianza fenotípica puede ser subdividida dentro de componentes de varianza atribuibles a factores que causan diferencias en la eficiencia entre individuos. Esta relación es expresada como σ2ph = σ2e + σ2ge + σ2g. El componente de varianza σ2e es una medida de la diferencia en la cantidad de fenotipos causada por la falla para tratar cada genotipo, se refiere al error experimental o varianza ambiental. σ2ge representa diferencias entre fenotipos que son causadas por la interacción genotipo x ambiente, siendo la falla de genotipos cuando son evaluados en diferentes locaciones y años. σ2ge es la suma de la interacción genotipo x locación (σ2gl), genotipo x año (σ2gy), y genotipo x locación x año (σ2gly). La variación genotípica, σ2g, es la variación causada por la cantidad de diferencia genética entre individuos. La varianza genética es la suma de la varianza aditiva (σ2A), varianza dominante (σ2D), y varianza epistatica (σ2I) (Fehr W.R. 1987).
86
5.1 TIPOS DE VARIANZA GENOTÍPICA.
La cantidad de varianza genotípica en una población puede ser expresada como: σ2g = σ2A + σ2D + σ2I σ2g representa la variación genotípica total. σ2A, la varianza aditiva, es la variación en valores mejorados en cantidad de individuos. σ2D, la varianza dominante, es la variación en cantidad de individuos para desviación en la dominancia. La varianza epistatica, σ2I, es la variación asociada con diferencias en cantidades individuales para interacciones epistáticas. La interacción epistática puede ser subdividida dentro de componentes asociado con diferentes tipos de interacción Inter Locus, como aditividad x aditividad (σ2AA), aditividad X dominancia (σ2AD), aditividad x aditividad x aditividad (σ2AAA) (Fehr , R. 1987).
5.2 FACTORES QUE AFECTAN LA MAGNITUD DE LA HEREDABILIDAD.
5.2.1 Población caracterizada.
La estimación de la heredabilidad está
influenciada por la cantidad de varianza genotípica presente para una característica en la población que ha sido estudiada. El número y la diversidad genética de los padres usados para formar la población
pueden tener una
relación directa sobre la cantidad de varianza genética presente. Una población derivada de cruces con muchas divergencias en los padres se espera más variación genética que en una población derivado de padres poco relacionados. La cantidad de autopolinizaciones en una población puede influenciar la varianza genética entre individuos (Fehr W.R. 1987).
5.2.2 Muestra de genotipos evaluados. La heredabilidad estimada es obtenida por evaluación de un pequeño número de individuos en una población. Si todas
87
las posibles segregaciones de una población son evaluadas, la verdadera varianza genética de una población puede ser determinada. La relación entre una heredabilidad estimada obtenida de una muestra de genotipos y la heredabilidad verdadera de una población depende de la manera en la cual la muestra es escogida para la evaluación. Si los genotipos son escogidos al azar de todos los posibles miembros de la población, la varianza genética entre los genotipos al azar es considerada una estimación válida de la varianza genética verdadera de la población, y la heredabilidad estimada es considerada una estimación válida de la heredabilidad verdadera (Fehr, 1987).
5.2.3 Métodos de calculación. El método de componente de varianza, el cual provee una gran flexibilidad para predecir la efectividad de procedimientos de selección alternativa se basa sobre componentes de varianza obtenidos de análisis de varianza. Los componentes de varianza pueden ser usados para calcular la heredabilidad estimada para una planta, un lote o una base entre medias. Tabla 5. Ecuaciones para calcular la heredabilidad para el método de componentes de varianza con cuatro unidades de selección diferentes. Heredabilidad basada en simple-planta cuando la selección es basada en plantas de una población que no esta subdividida dentro de lotes o bloques. 2 σg 2 h = 2 2 2 2 σ w + σ + σ ge + σ g Heredabilidad basado en simple-planta cuando la selección es basada en comparación de plantas en un lote. La formula también se aplica cuando las plantas de una población están dividido dentro de bloques. 2 σg 2 h = 2 2 2 σ w + σ ge + σ g Heredabilidad sobre base de lote σ
2
σ
2 g
h =
2 g
= σ
2
+ σ +σ 2
w
2 ge
+σ
σ
2 g
Heredabilidad en base entre medias
88
2 e
+σ
2 ge
+σ
2 g
σ
2
2 g
h = σ e/rt + σ 2
2
get
+σ
2 g
h = heredabilidad; σ g = varianza genética; σ w = varianza de plantas en un lote; σ = varianza 2 2 2 2 entre lotes o bloques; σ e = error experimental = (σ w/n) + σ ; σ ge = interacción genotipo x ambiente; n = numero de plantas en un lote o bloque; r = numero de replicaciones; t = numero de ambientes. 2
2
2
2
5.2.4 Extensividad de la evaluación del genotipo. La selección entre genotipos en una especie de planta puede ser basada sobre la eficiencia de simple plantas o el promedio de la progenie de un genotipo evaluado en uno o más replicaciones, localidades y años. La heredabilidad de una característica y la efectividad de selección son una función de la extensividad con la cual un genotipo es evaluado. La heredabilidad de un carácter puede ser baja cuando plantas individuales son evaluadas por selección y alta cuando los individuos son seleccionados sobre la base del promedio eficiente de su progenie cuando es probado en múltiples ambientes (Fehr, 1987).
5.2.5 Desequilibrio de ligamiento. Dos alelos de cada dos loci pueden ir ligados en acoplamiento AB/ab o en repulsión Ab/aB. Una población está en desequilibrio de ligamiento cuando la frecuencia en la fase de ligamiento de acoplamiento y repulsión no es igual. El desequilibrio de ligamiento puede influenciar la heredabilidad estimada causando un aumento o una disminución en la varianza genética estimada de aditividad y dominancia.
89
6. MATERIALES Y MÉTODOS
M APEO CAROTENOS TOTALES (M C O L 1684 X M T ai 1 )
T A I8X T A I8 P O B L A C IÓ N S 1
E X T R A C C IÓ N D E A D N G E N Ó M IC O E X P E R IM E N T O E N C A M PO B C A -S 1 A N Á L IS IS D E G R U P O S S E G R E G A N T E S “B S A
E V A L U A C IÓ N M O L E C U L A R S C R E E N 700 M A R C A D O R E S SS R
A N Á L IS IS M O L E C U L A R B U L K A B IE R T O S SR P O L IM O R F IC O S
E V A L U A C IÓ N F E N O T IPIC A CAROTENOS TOTALES
E V A L U A C IÓ N P O B L A C IÓ N S 1 U S A N D O S S R P O L IM O R F IC O S
L E C T U R A , G E N E R A C IÓ N M A T R IZ D E D A T O S
C O N S T R U C C IÓ N M A P A
Figura 11.
A N Á L IS IS Q T L s
Esquema General de la Metodología Empleada para la Mapeo genético para el carácter carotenos totales usando una población S1.
90
6.1 MATERIALES
6.1.1 Material vegetal
La
población para este estudio fue una S1 compuesta por 229 individuos
producto de la autofecundación de la variedad tailandesa MTAI-8 (Ver figura 12 y 13), producto del cruzamiento de la variedad colombiana MCOL 1684 y la variedad Tailandesa MTAI 1, perteneciente a la familia AM320, el cual fue seleccionado por presentar ciertas características: aceptable calidad culinaria, alto rendimiento, alto contenido de glucósidos cianogenicos y color de raíz amarillo. Dentro de sus características morfológicas; presenta raíz cónica cilíndrica, con color externo blanco, corteza y pulpa cremas, y epidermis de textura lisa, presenta un cogollo verde morado con presencia de pubescencia, hojas verdes claro, lóbulo foliar de forma lanceolada y pecíolo verde con tonalidades rojizas. En cuanto a sus características agronómicas tiene rendimiento de raíces frescas entre el 25.0-35.0 t/ha y rendimiento de materia seca de 8.5-11.5 t/ha, y alelos favorables por ser una especie altamente heterocigota y exhibe alta variabilidad genética para identificar QTLs para estas características.
6.1.2 Localización
La evaluación en campo de la población S1 fue establecida en CIAT en el año 2005 y 2007, en parcelas simples de 6 plantas por fila cada una, en un diseño de bloques completamente al azar con dos repeticiones, las plantas fueron sembradas a 0.8 m entre plantas y 1 m entre filas, para un total de 1560 genotipos sembrados. Las características de materia seca, contenido de carotenos totales y color de raíz fueron evaluadas a los 11 meses de sembradas las plantas, para el estudio usando la S1 para posterior análisis de QTLs.
91
La característica fenotípica de las muestras se llevó a cabo en el laboratorio de genética molecular de Yuca, de la Unidad de Biotecnología del CIAT, Palmira, departamento del Valle del Cauca, situado a 3°16’ l atitud norte, 76°32’ oeste y una altitud de 965 m.s.n.m., como parte del megaproyecto“Harvest Plus” del CIAT.
A partir de esta población S1 se hizo un mapa genético y un análisis de QTLs para el contenido de carotenos totales, color de pulpa y materia seca. En el anexo A, se encuentra una tabla con el material vegetal utilizado en este estudio.
Figura 12. Autofecundación del individuo TAI8 (AM320) en campo.
92
Figura 13. Ensayo en campo de la población S1 producto del cruce entre TAI8 X TAI8 (AM320).
6.2 MÉTODOS
6.2.1 Diseño Experimental y Evaluación Fenotípica El diseño experimental utilizado fue el de Bloques Completos al Azar BCA con 2 repeticiones en una localidad (CIAT) con 5 plantas/fila y cada 20 filas se sembró el cultivar TAI8 como control. Se realizaron 2 evaluaciones, una en el año 2005 a nivel cualitativo (Color de raíz) y otra en el año 2007 a nivel cualitativo (Color de raíz) y cuantitativo (Contenido de carotenos totales).
6.2.2 Escala de Colores en la Raíz
Para evaluar el color de raíz en el parénquima se utilizó una regleta de colores, evaluando el color amarillo en una escala que va de 1 hasta 8, siendo el color
93
blanco en la raíz el de 1, con contenido bajo de carotenos totales y 8 es el color amarillo, con alto contenido de carotenos, como se observa en la figura 14.
Figura 14.A. Variabilidad de colores en la pulpa de raíz de yuca en la población S1.
Figura 14.B. Regleta de colores de parénquima de yuca.
94
6.2.3 Análisis de carotenos totales
Se cosecharon 2 plantas para cada repetición y se eligieron las 5 mejores raíces caracterizadas por su excelente estado fitosanitario, libre de daños mecánicos y sin pudrición precosecha. Se desecharon las partes distal y proximal de cada una y las fracciones restantes se partieron longitudinalmente en cuatro, se escogieron de cada raíz dos cuartos opuestos, se picaron, mezclaron y se extrajeron tres muestras: 5 g para el análisis de carotenos, 20 - 50 g para determinar porcentaje de materia seca y 30 g para copia de seguridad en caso de tener problemas con la muestra. Esta última se almacenó a - 80° C.
6.2.3.1 Método de extracción y cuantificación de carotenos totales en raícesMétodo por Centrifugación (Ver figura 15):
* Extracción: •
Pesar 5 g de raíces frescas previamente mezcladas.
•
Adicionar 5 ml de éter de petróleo y 5 ml de acetona.
•
Homogeneizar en homogenizador (turrax) durante 1 min.
•
Centrifugar a 3000 rpm, 10 min, 10° C.
•
Extraer fase etérea
•
Re extraer el residuo con 5 ml de éter de petróleo y 5 ml de acetona.
•
Homogeneizar en turrax durante 1 min.
•
Centrifugar a 3000 rpm, 10 min, 10° C.
•
Extraer fase etérea y juntarla con la anterior.
•
Agregar 10 ml de agua deionizada y agitar en agitador (vortex)
•
Centrifugar a 3000 rpm, 10 min, 10° C.
•
Extraer agua y desecharla
•
Agregar 10 ml de agua deionizada y agitar en vortex
•
Centrifugar a 3000 rpm, 10 min, 10° C.
95
•
Extraer agua y desecharla
•
Completar volumen final a 15 ml con éter de petróleo y leer en el espectofotómetro.
6.2.3.2 Método de extracción y cuantificación de carotenos totales en raícesMétodo por Filtración (Ver figura 16):
* Extracción: •
Pesar 5 g de raíces frescas previamente mezcladas.
•
Adicionar 15 ml de acetona.
•
Homogeneizar en turrax durante 1 min (Repetir 2 veces).
•
Filtración con membrana de vidrio sinterizado (Repetir 2 veces).
•
Pasar la mezcla a un balón de destilación con 20 ml de éter de petróleo.
•
Recuperar el solvente usando solución salina por 3 veces.
•
Desechar solución salina.
•
Extraer fase etérea.
•
Completar volumen final a 15 ml con éter de petróleo y leer inmediatamente.
•
Lectura en espectrofotómetro.
96
1
5 mejores raíces Cuartos opuestos Picar y mezclar
7
Espectrofotóm etro de UVVIS
2
Pesar 5 g de la muestra
6
3
Agregar 5ml de Acetona y 5ml de Éter de Petróleo
5
Extracción fase etérea
Centrifugar
4
Homogeneizar con turrax
Tomado de Alba Lucia Chavez. Bioquímica. CIAT. Figura 15. Diagrama de flujo para la extracción de carotenos totales usando el método de Centrifugación.
6.2.3.3 Cuantificación de carotenos totales por el método colorimétrico. Equipo: Espectrofotómetro Shimadzu UV-VIS 160A Cubetas de vidrio para espectrofotómetro. Pipeta de 1000 µl. Reactivos: Éter de petróleo, 35–65 ºC (J. T. Baker) B-carotene standard (Sigma C4582) Procedimiento: 1. Fijar absorbancia para una longitud de onda de 450 nm.
97
2. medir blanco usando éter de petróleo como referencia. 3. Medir absorbancia de las muestras. 5. Calcular el contenido de carotenoides totales utilizando la siguiente formula: µg/g = (A x Volumen final x 104) / (A 1cm-1%) x peso de la muestra donde: * A= absorbancia a 450 nm * Volumen final = Volumen en mililitros de la solución antes de la lectura. * A 1cm-1% = Coeficiente de absorción del β-caroteno en éter de petróleo = 2592 *Peso de la muestra en gramos.
6. Comparar el espectro de la muestra con el espectro del estándar.
2 E V A L U A C IÓ N COLOR
1 COSECHA
4 LAVAR
3 CUARTOS O PU ESTO S P IC A R
5 M OLER
5 R A IC E S
PE SA R 5g
7 F IL T R A R
9 LECTURA ESPEC TRO FOTO M ETR O
8 E X T R A C C IÓ N FA SE ETER EA
3 VECES
6 H O M O G E N E IZA R CON TURRAX
Figura 16. Diagrama de flujo para la extracción de carotenos totales usando el método de filtración.
98
6.2.4 Análisis molecular
6.2.4.1 Extracción de ADN. Se cosecharon hojas jóvenes de plantas que se encontraban en el invernadero de CIAT, las cuales eran replicas para llevar a campo y para el estudio con marcadores moleculares. Estas hojas se colectaron en bolsas de papel correctamente rotuladas, luego almacenadas para secado en un horno a una temperatura de 50 °C por 48 horas. De cada uno de los 229 genotipos se tomaron 0.5g de tejido y se maceraron con la ayuda de un taladro y arena, con la finalidad de romper el tejido para obtener una buena extracción de ADN, se siguió el protocolo de Dellaporta (1983), modificado para miniextracción en el laboratorio de genética de yuca del CIAT, para pruebas de PCR (Anexo B). El ADN obtenido se almacenó a 4°C para diluir completamente el pellet.
6.2.4.2 Calidad y cuantificación de ADN. Después de hacer la extracción se procedió a evaluar la calidad del ADN, mediante un gel de agarosa al 1%, TBE 0.5X y teñido con bromuro de etidio, los geles fueron corridos a 220 voltios durante 40 minutos, luego observados y fotografiados con una Cámara polaroid (Foto/U.V. 21- USA). Se cuantifico el ADN en un Fluorometro (DyNA Quant TM. 200 Fluoromete. Hoefer pharmacia Biotech), el cual mide la concentración de ADN por absorbancia en ng/ul,
empleando como patrón de calibración un ADN
estándar de timo de ternero a 100 ng/uL. También se cuantifico en un espectrofotómetro (Shimadzu UV-VIS 160ª).
Luego de tener la concentración del ADN de toda la población se procede a hacer diluciones llevadas a concentración final de 10 ng/ul y 500 ul de volumen total, y se almacenaron a 40C.
6.2.4.3 Amplificación de los microsatélites. Un conjunto de aproximadamente 700 pares de primers (Ver anexo C) diseñados por el CIAT (Fregene et al, 2000, datos no publicados) a partir de clones de una librería genómica enriquecida por
99
secuencias Microsatélites (Mba. et.al., 2001) fueron utilizados para amplificar vía PCR los microsatélites para este estudio. 1. Las temperaturas de alineamiento para los microsatelites fueron de 45oC y 55oC, previa evaluación del programa genética de yuca.
2. Coctel para realizar la reacción de amplificación:
Reactivos para la amplificación
Volumen para 1 muestra
(ul) 1. Agua HPLC
13.2
2. Solución tampon 10X (Buffer)
2.5
3. MgCl2 (25 mM)
2.0
4. dNTPs (200 uM)
1.0
5. Primer F (0.2 uM)
0.5
Primer R (0.2 uM)
0.5
6. Taq Polimerasa (1 unidad)
0.3
7. ADN 10 ng/ul
5.0
3. El coctel junto con el ADN de cada genotipo se sirvió en placas de 96 pozos y se colocaron en un PTC-100TM Programmable Thermal Controller con hot bonnet (MJ Research, Inc – USA), con las siguientes condiciones de amplificación (ciclo de PCR modificado de Mba et al., 2001).
Programa de PCR Paso 1:
94 °C
por
2 minutos
Paso 2:
94 °C
por
1 minuto
Paso 3:
45 o 55 °C
Paso 4:
72 °C
Paso 5:
Ir al paso 2 por 30 veces
por
por
1 minuto
2 minutos
100
Paso 6:
72 oC
por
5 minutos
o
Paso 7:
14 C
Paso 8:
Fin
6.2.4.3.1 Evaluación de los marcadores Microsatélites. Se evaluaron cerca de 700 pares de primers con el parental TAI8 (Familia AM320) mediante análisis de BSA (Bulk segregant analysis) usando bulk de alto y bajo contenido de carotenos (michlemore, 1991). La amplificación se corrió en geles de poliacrilamida al 4%, utilizando peines de 100 pozos, evaluando entre 14 y 16 primers por gel, para seleccionar los microsatélites polimorficos, que serian luego evaluados en la progenie de la población S1. 6.2.4.4 Electroforesis Vertical con geles de poliacrilamida. Para la detección y visualización de los "Microsatélites" se hizo mediante una electroforesis de tipo vertical en geles de poliacrilamida, al 4% (Acrilamida al 30%, Buffer TBE 10X, Urea 5 M), con un espesor de 0.4mm (McCouch et al, 1997), preparados en un equipo de secuenciación Sequi-Gen GT Nucleic Acid Electrophoresis Inc U.S.A. Bio-Rad 2001 (S3OWL). Despues de armada la camara y polimerizado el gel se precorrió con una fuente de poder a un voltaje de 1400, un voltaje de 100, hasta que alcanzara la temperatura de 55oC. Luego se adicionó 15 ul de solución tampon de carga (Stop solution) a cada uno de las reacciones de amplificación, se denaturaron las muestras por 3 minutos a una temperatura de 94oC y se pasaron a hielo antes de ser servidas en el gel. Cuando la camara alcanzo la temperatura de 55oC se cargaron 2 ul de la reaccion de amplificacion (cada individuo de la S1) en un pozo hecho previamente con un peine para 68 y 100 pozos, catalogo No. 165-3847, longitud 30 cm y espesor de 4mm (BIO RAD-S3OWL Laboratories, 2001), corriendo el gel a 100 W/cm2, cada gel se sirvió 3 veces (cada servida de 96 individuos), y el intervalo de siembra varió según el tamaño del polimorfismo de cada microsatelite. Evaluando 229
101
individuos de la población S1 con su padre y 5 genotipos, con un promedio de 1 gel por microsatelite (Figura 16 y 17). Las muestras fueron servidas con pipeta Hamilton Multiplex Company.P.O. BOX10030 (0.4 mm/1”/ 3). Reno, Nevada. Despues de la primera servida se corrio el gel 40 min a 1 hora dependiendo del tamaño del microsatelite (Ver anexo D).
6.2.4.4.1 Tinción con Nitrato de Plata
Después de la electroforesis las bandas fueron visualizadas mediante tinción con nitrato de plata, según el siguiente protocolo: 20 minutos en solución fijadora (Acido acético al 10%), seguido de 15 minutos de lavado con agua destilada, con el fin de elimar la solución fijadora, luego 30 minutos en solución de nitrato de plata (1g/L de AgNO-3 , 1.29ml de HCOH 37%/L), 1 lavado de 5-10 segundos en agua destilada, solución reveladora a 14°C (30g/L NaCO3, 1.86mg/L Na2S2O3 , 1.29ml de HCOH 37%/L) hasta que aparescan las bandas, posteriormente se lleva a solución de parada (Acido acético al 10%) por 5 minutos, después se realizan lavados con agua destilada para remover la solución anterior y por último se dejan secar a temperatura ambiente.
7. ANÁLISIS DE DATOS
7.1 Análisis de datos fenotipicos. En las características genotípicas: contenido de carotenos totales, color de raíz y materia seca, se analiza la media para cada característica, la correlación entre características y desviación estándar. Estos parámetros fueron determinados usando el análisis de factor simple de varianza con el programa SAS (SAS, 1996).
7.2 Registro de datos. La evaluación de los microsatélites polimórficos para la progenie de la población S1, fue registrada en una matriz de datos; En donde se tiene los 229 individuos en una fila y en otra fila la presencia del alelo segregado
102
por parte del padre-TAI8 (H) y los alelos que segregan (B) y (A), para la ausencia de algunas de estas bandas o nula amplificación se representó con el símbolo ( - ) que significa dato perdido, los datos se ingresaron en una matriz en un archivo Microsoft Excel texto (Ver anexo E).
7.3 Rangos de segregación de marcadores individuales. Estos datos fueron calculados con chi-cuadrado computado usando el PC de un computador, para la población S1 cada microsatélite presento tres diferentes clases genotípicas. 7.4 Mapeo de microsatélites. Para los datos del polimorfismo en la progenie S1 se le aplicó las pruebas para permutaciones a los 140 microsatélites y se interpretaron de acuerdo con la información aportada por TAI8 y los 5 genotipos, haciendo una prueba de Chi cuadrado (P