UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DE CASILDA

COMBINACION DE ALCOHOL 70° Y RADIACION UV COMO MEDIDA DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICOBACTERIAS AMBIENTALES

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MAGISTER EN BIOSEGURIDAD

Medica Veterinaria Valeria Graciela Buey 2013

COMBINACION DE ALCOHOL 70° Y RADIACION UV COMO MEDIDA DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICOBACTERIAS AMBIENTALES

TESISTA: Medico Veterinaria Valeria Graciela Buey DIRECTOR: Magister en Ciencias Delia Susana Oriani

Prefacio

Esta tesis es presentada como parte de los requisitos para optar por el grado Académico de Magister en Bioseguridad, de la Universidad Nacional de Rosario y no ha sido presentada previamente para la obtención de otro título en esta Universidad u otras. La misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a cabo en el Laboratorio de Microbiología, dependiente de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Pampa, bajo la dirección de Delia Susana Oriani, Profesor Titular de Bacteriología y Micología de la UNLPam.

Diciembre 2013 Facultad de Ciencias Veterinarias de Casilda UNR.

Valeria Graciela Buey

Agradecimientos

A mi directora por su apoyo incondicional en el transcurso de todo el proceso de investigación. A las autoridades de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNLPam por brindarme el apoyo económico para realizar esta maestría A mis compañeras de la Cátedra de Microbiología. Y principalmente a mi familia.

Dedico esta tesis a mi marido y a mis hijos, Que me apoyaron mes a mes para poder culminar esta maestría.

Índice

Resumen

1

Introducción

2

Características del género

6

Generalidades de Bioseguridad

8

Generalidades de desinfección y esterilización

14

Problema Científico

21

Hipótesis

22

Objetivos

22

Materiales y Métodos

23

Resultados

25

Discusión

28

Conclusión

32

Bibliografía

33

Resumen

El personal que trabaja en los laboratorios de microbiología está expuesto en general a una serie de riesgos biológicos a partir de las muestras que se procesan. Además del riesgo compartido con los laboratorios de microbiología clínica convencional, los laboratoristas de micobacterias lo están aún más debido

a

los

complejos

fundamentalmente

en la

pasos

que

presenta

dicho

diagnóstico,

descontaminación de la muestra. Este proceso

involucra el uso de líquidos, micropipetas, tips , lavados y centrifugaciones que favorecen la generación de aerosoles y salpicaduras,

pudiendo traer

aparejado la transferencia accidental de bacilos desde los cultivos positivos tanto a las soluciones como a las y superficies de trabajo o del material. Estos errores, que en

general pasan inadvertidos,

generan consecuencias

indeseables ya sea por la contaminación cruzada y la interferencia en el diagnóstico, como por el riesgo potencial de infecciones en el personal del laboratorio. El objetivo del presente trabajo fue valorar el poder desinfectante de la combinación

de alcohol 70°-UV en la superficie de la campana de

contención posteriormente

a la contaminación de la misma con una

suspensión de una cepa propia de Mycobacterium porcinum aislada de agua de red. El proceso de secado de las microgotas inoculadas de la suspensión 1 Mac Farland de M.porcinum sobre la superficie de la campana, redujo en un 50% el número de microorganismos evidenciando la viabilidad de los microorganismos en los extendidos secados por calor.

La combinación de alcohol 70º y la exposición a UV simultánea durante en 30 minutos redujo entre uno y dos logaritmos el inoculo seco; a los 60 min de exposición no se logró recuperar M. porcinum considerando que el número de bacterias viables se redujo a una unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas.

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INTRODUCCION Al abordar el tema de la bioseguridad en microbiología ambiental debemos tener presente que el medio ambiente alberga tanto microorganismos altamente patógenos como son entre otros las esporas del Bacillus antrhacis, como así también

bacterias saprofíticas que interactúan con los vegetales

facilitando el desarrollo de la agricultura tales como las distintas especies del genero Rhizobium. Los microorganismos en el ambiente pueden ser transitorios y encontrarse ocasionalmente (alóctonos) o bien formar parte de la flora residente (autóctona). La concentración de microorganismos patógenos viables en el medio ambiente es inferior si la comparamos a la que se presenta en especímenes provenientes de individuos enfermos o portadores debido la mayor competencia que le proporcionan los microorganismos autóctonos. Cuando nos referimos a la bioseguridad en el laboratorio de microbiología y específicamente en el área micobacterias debemos considerar que el género Mycobacterium comprende más de 130 especies, 49 de ellas son consideradas ambientales. Actualmente se han propuestos tres epítetos para clasificar a las micobacterias (Kazda, et. al., 2009): Micobacterias Patogenas Obligadas (OPM): son altamente virulentas, su supervivencia en el ambiente es muy limitada (Complejo tuberculosis: M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M canetti, M. capreae, M. microti y M. pinnipedii y complejo Lepra: M. leprae y M. lepraemurium). Micobacterias Potencialmente patógenas (PPM): se aíslan tanto de ambientes terrestres como

acuáticos pudiendo,

bajo ciertas circunstancias causar

enfermedades en individuos que padecen enfermedades crónicas o trastornos en el sistema inmune,

ejemplo de estos son: el complejo

Mycobacterium

avium (MAC) y complejo MAIS (M. avium-intracellulare-scrofulaceum). Micobacterias Saprofitas Ambientales (ESM): comprende especies saprofitas que no son patógenas o lo son esporádicamente. Estas especies son importantes en el desarrollo de la agricultura, ya sea, interviniendo en la degradación de hidrocarburos, tal es el caso de M. flavum y M. vaccae en la fijación libre de nitrógeno y en la solubilización del fosfato de calcio.

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Las especies del segundo y tercer grupo se las denomina comúnmente como micobacterias no tuberculosas (MNT), micobacterias atípicas,

mycobacteria

other than tuberculosis (MOTT) , o simplemente micobacterias ambientales (MA) cabe destacar que no presentan huésped animal primario, se encuentran en el polvo, suelo y agua ; se trasmiten por inhalación, ingestión e inoculación. No existe evidencia de transmisión directa entre individuos, las afecciones que producen se conocen como micobacteriosis, (Hernandez Borje y García Hidalgo, 2008). Algunas especies de micobacterias ambientales son consideradas como patógenos emergentes causando infecciones oportunistas tanto en animales como en el hombre. La lentitud en reproducirse, debido a la hidrofobicidad, parece ser una desventaja de las MA, sin embargo le garantiza resistencia a la cloración, a los biosidas y a los antibióticos. La hidrofobicidad también le facilita la adquisición de nutrientes, la formación de biofilm y la consecuente propagación

por aerosoles. Otra característica importante que favorece la

sobrevida y perdurabilidad de las MA en el medio ambiente es la marcada tolerancia al stress así como la capacidad para invadir a protozoos de vida libre, estableciendo asociaciones tanto de parasitismo como de simbiosis. Los mecanismos moleculares de patogénesis intracelular en animales y en protozoos son similares ( Primm et. al., 2004). Los individuos inmunocompetentes pueden ser susceptibles a micobacteriosis cutáneas que suelen aparecer después del contacto de heridas traumáticas o quirúrgicas, con agua u otros productos contaminados, formando pápulas, pústulas, ulceras o lesiones de paniculitis como manifestaciones más comunes. La vía de entrada puede ser única o múltiple como sucede en el caso de la mesoterapia, la depilación, la acupuntura, manicura , pedicura, tatuajes y liposucción entre otros. Han sido reportado casos de infección de este tipo por M. chelonae y M. abcessus (DaMataJardın, 2010). Respecto a los tatuajes, las lesiones presentadas

incluyen dermatitis de contacto, fotodermatosis,

reacciones liquenoides y granulomas. El origen aparente es la contaminación de la tinta (Ara et. al., 2001). En pediatría, la manifestación más común es las linfadenitis cervical crónica

ocacionada por Mycobacterium avium complex

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seguida de M.scrofulaceum y M. kansasii . La enfermedad micobacteriana diseminada, se presenta especialmente en pacientes inmunodeprimidos, (Baquero y Artigao, 2005). En Argentina, Oldrino y colaboradores (2010) han reportado un caso de micobacteriosis pulmonar causada por Mycobacterium simiae en un paciente pediátrico infectado por el virus de inmunodeficiencia humana. En la provincia de Córdoba, el 32% de los casos reportados entre 1991 y 2000 de micobacteriosis pulmonar corresponden a micobacterias ambientales de especies como M. fortuitum, M.kansasii, M. chelonae y en mayor proporción M. avium-intracelulare (Barnes, et. al., 2004).

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CARACTERISTICA DEL GÉNERO El género Mycobacterium se caracteriza por ser bacilos aerobios estrictos, mesófilos,

inmóviles, pleomórficos, acapsulados y no esporulados. La

membrana celular le otorga a la célula protección osmótica y transporte de iones

y moléculas, en tanto que la pared le brinda soporte mecánico y

protección ya que presenta en su composición un elevado contenido lipídico (60 % del peso seco de la misma). Los principales compuestos de la pared son peptidoglicanos, arabinogalactanos, acidos micólicos y glicopeptidolípidos. En la membrana encontramos moléculas de liposacaridos, lipoarabinomananos (LAM), lipomananos (LM) y fosfatidil inositol monosidos. Algunos de ellos implicados en la vida endocelular tales como los glicopeptidolipidos, LAM y LM, acidos micólicos, 2,3-Di-O-aciltrehalosa (DAT), glicanos, cera C, sulfolípidos, proteínas del choque térmico y enzimas como la catalasa y micobactina. La pared le confiere escasa permeabilidad celular, dificultad para la tinción de Gram, así como un tiempo de generación prolongado (3 a 18 h) (Alcaide Fernández de Vega et. al, 2005). En el medio ambiente la hidrofobicidad le premite sobrevivir en ecosistemas oligotrofos ya que atraen nutrientes

y

pequeños compuestos orgánicos, condición que les otorga ser los pioneros en la formación del biofilm. Además la tendencia a desarrollarse en la interfase aire- agua favorece la formación de aerosoles y estos son uno de los mecanismos más efectivos para acceder al pulmón (Primm et. al., 2004). Las necesidades nutritivas de las micobacterias ambientales son sencillas siendo necesaria una fuente de carbono como el glicerol o el piruvato, nitrógeno, sales minerales y lípidos aportados por huevos preferentemente de gallinas alimentadas a grano (Löwenstein Jensen y Stonebrink). Los factores de virulencia de las MNT incluyen componentes de la envoltura celular, enzimas y otras moléculas que actúan como moduladores de la respuesta inmune. Los factores de virulencia son determinantes para la colonización, supervivencia y proliferación micobacteriana en diversos tejidos del huésped y la resistencia en el medio ambiente. En la envoltura celular micobacteriana se encuentran aquellos compuestos que le otorgan una importante barrera de permeabilidad para moléculas polares y le

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confiere además resistencia a la acción de ácidos y álcalis e hipoclorito (Elhers y Daffe ,1998). Entre ellos se encuentran los: Glicopeptidolípidos (GPL). Constituyentes predominantes de la envoltura de numerosas MNT

(Schorey y Sweet, 2008). Su presencia, se asocia a

al

deslizamiento “sliding” que presentan algunas cepas. Esta característica se encuentra

relacionada a la capacidad de producir biofilm que actúa como

protector de una gran variedad de condiciones de stress ambiental (rayos ultravioleta, cambios de pH, shock osmótico y desecación) (Loera Muro et. al., 2012). Los ácidos micólicos le confieren al microorganismo resistencia

al daño

químico, a la deshidratación, a diversos antibióticos y sustratos hidrofílicos (Gao, et. al 2003).

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GENERALIDADES DE BIOSEGURIDAD

La bioseguridad en microbiología, es el conjunto de medidas mínimas que deben ser adoptadas, con el fin de reducir o minimizar los riesgos para el personal, la comunidad y el medio ambiente, que pueden ser producidos por los agentes infecciosos. El término “contención” se refiere a los

métodos seguros para manejar

materiales infecciosos en el ambiente del laboratorio. La contención primaria es la protección contra la exposición de agentes infecciosos del personal así como del

ambiente inmediato del laboratorio;

mientras que la contención

secundaria se refiere, a la protección del medio ambiente externo al laboratorio. Para que ambas contenciones sean efectivas debe existir una combinación entre el diseño de la instalación y las prácticas operativas, siendo el requisito más importante el cumplimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas ( National Institutes of Health, 2007). Las

personas

que

trabajan

con

agentes

infecciosos

o

materiales

potencialmente infectados deben conocer los riesgos potenciales y también estar capacitadas y ser expertas en las prácticas y técnicas requeridas para manipular dichos materiales en forma segura. Los laboratorios deben disponer de protocolos de trabajo para las técnicas que se realizan en dicha instalación, así como un manual de bioseguridad, propio, que contenga información sobre las normas de bioseguridad y de prevención sanitaria del personal, manejo de residuos, equipos de seguridad, planes de contingencia y procedimientos de emergencia y transporte de sustancias peligrosas (Jonathan et. al.,1999). En 1983, fue publicada la primera edición del manual de bioseguridad en los laboratorios, proporcionando así la orientación práctica sobre las técnicas de bioseguridad en todos sus niveles. Las técnicas microbiológicas apropiadas y el uso correcto del equipo de bioseguridad fueron promovidas por personal bien adiestrado, siendo los pilares fundamentales de la bioseguridad en el laboratorio. Sin embargo, los importantes avances tecnológicos, la aparición de nuevas enfermedades y las graves amenazas que suponen el uso indebido así como la liberación de agentes microbiológicos y toxinas han hecho necesario revisar los procedimientos conocidos (OMS, 2005).

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Fernández y Castillo en el año 2000, enumeraron algunas de las causas más frecuentes de infecciones en el personal de laboratorio entre las que se encuentran:  Auto inoculación accidental con agujas, pipetas, bisturíes u otros elementos punzantes.  Exposición de la piel o mucosas a sangre, hemoderivados u otros fluidos biológicos contaminados, especialmente cuando la permeabilidad de las mismas se encuentra alterada por heridas, escoriaciones, eczemas, herpes, conjuntivitis o quemaduras.  Inhalación de aerosoles producidos al agitar muestras, al destapar tubos, al expulsar la última gota de una pipeta o bien durante la centrifugación ya sea al emplear tubos abiertos o con mayor volumen del aconsejado, así como en la utilización de

centrífugas de ángulo fijo o cuando son

frenadas abruptamente.  Salpicaduras en los ojos o aspiración bucal. Los Aerosoles fueron clasificados por la agencia de protección ambiental (E.P.A) en el año 1983. Las partículas de rango de 1 µ a 10 µ caen con una velocidad constante y calculable en aire quieto (Ley de Stokes). Sin embargo, su mantenimiento en el aire puede deberse a corrientes del mismo. Las partículas mayores de 10 µ, caen rápidamente aunque pueden mantenerse en el aire cerca de donde se generan. Según el tamaño de partícula se distinguen los núcleos de Well (1-10 micras de diámetro) y las gotitas de Pflugge (alrededor de 100 micras). La medida de la mayoría de las bacterias fluctúa entre 0,2 µ y 0,7 µ, aunque normalmente están agrupadas en colonias o alojadas en partículas de mayor tamaño (Arden Pope, III et. al., 2009).

Para poder conocer los peligros relativos que entrañan los microorganismos infecciosos se los ha clasificado en 4 grupos sobre la base del riesgo individual y el riesgo para la comunidad. De esta manera el Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo) abarca microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales. El grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo) contiene agentes patógenos que pueden provocar enfermedades 8

humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces siendo limitado.el riesgo de propagación que presentan. El grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo) incluye agentes patógenos que provocan enfermedades humanas o animales graves, que raramente se

propagan de

un individuo a otro y existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Por ultimo el grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado) en el cual los agentes patógenos provocan enfermedades graves en el humano y/o los animales, se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. En general no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Cada región o país deberá elaborar su propia clasificación de microorganismos teniendo en cuenta factores como microorganismo;

la patogenicidad del

el modo de transmisión y la gama de huéspedes; la

disponibilidad local de medidas preventivas y

tratamientos eficaces (OMS

2005). Por otro lado, los laboratorios también se clasifican en distintos niveles de bioseguridad basándose en una combinación de las características de diseño, construcción,

medidas

de

contención,

equipamientos,

prácticas

y

procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo. El nivel de bioseguridad (BSL) 1 laboratorio básico en el cual los requisitos son mínimos en lo referido a contención primaria

y

secundaria,

haciéndose

hincapié

en

las

prácticas

y

los

procedimientos de laboratorio que constituyen la base de las técnicas microbiológicas apropiadas, las cuales se encuentran enumeradas en el Código de Practicas del Manual de Bioseguridad de la OMS. En el BSL 1 se realizan tareas de enseñanza e investigación. En el nivel de bioseguridad 2 (BSL 2)

además de lo requerido en el

BSL1 se le agregan mayores

requerimientos como dispositivos de pipeteo, según el trabajo a realizar, una campana vidriada con mechero de Bunsen o una cabina de bioseguridad con incinerador de ansa, autoclaves para esterilizar material contaminado. Todos

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los aparatos deben ser validados por métodos apropiados antes de ser utilizados. El personal debe estar capacitado para realizar las técnicas y/o procedimientos, debe contar con un manejo de desechos adecuado. En este nivel de laboratorio pueden realizarse tareas de diagnóstico e investigación. Respecto al nivel de bioseguridad 3 (BSL 3) es un laboratorio de contención que se encuentra concebido e instalado para trabajar con microorganismos del grupo de riesgo 3, así como con grandes volúmenes o concentraciones de microorganismos del grupo de riesgo 2, por entrañar un mayor riesgo de difusión de aerosoles. A los requerimientos mencionados para el BSL 2 se le agregan otras modificaciones, principalmente en las instalaciones (transito restringido, doble puerta, pisos, paredes y techos impermeables, filtrado del aire que se libera al medio ambiente antes de salir, ventilación direccionada entre otras). Los requerimientos de equipamiento son mayores. Se trabaja siempre en cabinas de bioseguridad I y II, el agua debe ser tratada antes de acceder al sistema público de cloacas. En este nivel de laboratorio se realizan diagnósticos especiales e investigación. En el laboratorio de bioseguridad 4, a los requisitos de contención expuestos en el nivel de bioseguridad 3 se le agregan otros requisitos haciendo hincapié no solo en lo edilicio sino en la contención primaria. Se trabaja con unidades de patógenos peligrosos (Nivel 4 de microorganismos) siendo necesario el uso de una contención primaria muy eficiente (uso de trajes especiales, cabinas de bioseguridad III y IV) así como un mayor control en la contención secundaria (tratamiento de efluentes, ventilación, decontaminación de todo los materiales, la energía eléctrica debe ser redundante, entradas herméticas) (OMS 2005). En todos los niveles el personal debe ser entrenado y concientizado de las prácticas a realizar y de los riesgos a los que está expuesto. La asignación de un microorganismo a un nivel de bioseguridad para el trabajo de laboratorio, dependerá de la valoración del riesgo que presente. El nivel de bioseguridad, para un trabajo concreto dependerá del juicio profesional elaborado mediante la evaluación del riesgo, considerando por un lado, el microorganismo utilizado, las instalaciones disponibles, el equipamiento y las prácticas y/o procedimientos apropiados (World Health Organization 2012 ).

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Se han establecido diversos criterios para la clasificación de los laboratorios de micobacterias, de forma que las necesidades de equipamiento y la capacidad de los mismos pudiesen estar de acuerdo con las posibilidades diagnósticas que éstos pudiesen ofrecer. Es recomendado el nivel de BSL 2 para el laboratorio de micobacterias ambientales con los elementos de contención ya descriptos anteriormente (Alcaide Fernández de Vega et. al., 2005). La mayoría de los accidentes en el laboratorio de micobacterias puede reducirse mediante la práctica de procedimientos microbiológicos adecuados, el uso de dispositivos de contención y protección y un diseño de las instalaciones apropiado (López-Cerero, et. al., 2006). El cultivo de todas las micobacterias requiere de procedimientos especiales que consisten en la descontaminación de la muestra, la neutralización y la concentración de estos microorganismos, ya sea por centrifugación (método de Petroff para M. tuberculosis y M. bovis) o por filtración (Método de Kamala 1994, Iivanainien

1999 para micobacterias ambientales). Esta compleja

técnica del cultivo favorece sutiles errores de manipulación que suelen pasar inadvertidos, los puntos críticos consisten en la formación de aerosoles ya sea en la centrifugación, filtración

así como en la manipulación de líquidos

contaminando superficies que alberguen bacilos por períodos prolongados , pudiendo generar además transferencia de bacilos de una muestra a otra (De Ramos et. al, 1999); (Burman y Reves ,2000). La probabilidad de estos accidentes es mayor cuando existe sobrecarga de trabajo o bien cuando se procesan escasas muestras por falta de habilidades de los operarios (Boer et. al., 2002). Se atribuye un riesgo mayor de falsos cultivos positivos al uso de medios líquidos. La manipulación de líquidos favorece la formación de aerosoles, lo que acrecienta el riesgo de contaminación cruzada. Además, las pipetas y en particular,

las

micropipetas

empleadas

para

dispensarlos,

pueden

contaminarse y transferir bacilos (Gascoyne-Binzi, et al., 2001). Todos las especies de micobacterias, tuberculosas y no tuberculosas, están clasificadas en segundo lugar en la escala de resistencia a los desinfectantes luego de las esporas bacterianas (Primm, 2004). 11

Estudios realizados muestran que para la desinfección de superficies como mesadas o campanas de contención, el hipoclorito de sodio al 1% y el alcohol al 70° con un tiempo de exposición de 25 minutos son suficientes para inactivarlas ( Oriani y Sagardoy 2006). Otros estudios muestran la resistencia de distintas micobacterias no tuberculosas al hipoclorito de sodio en distintas condiciones de pH

y

temperatura. También fue evaluada la resistencia a la UV aplicándola en distintas intensidades, hallando que dentro de las especies utilizadas M. fortuitum fue la más resistente (Lee et. al., 2010).

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GENERALIDADES DE DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACION. Cuando una población bacteriana es sometida a un proceso de desinfección o de esterilización, que le provoca una pérdida de viabilidad, se observa una disminución progresiva en el número de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición al agente esterilizante o desinfectante. La muerte microbiana sigue un comportamiento de tipo exponencial, por lo que se hace asintótico y nunca se llega a un número de microorganismos igual a cero. Una forma útil de caracterizar la inactivación de los microorganismos por agentes físicos o químicos es mediante la ley de Chick- Watson. Esta

ley

puede tomarse como referencia para conocer el comportamiento de un determinado proceso de desinfección. Conociendo el número de microorganismos y la cantidad de ellos en un determinado tiempo (N/N0), se puede determinar el valor de k es decir, la velocidad de reacción con el desinfectante ya sea físico o químico. Básicamente se parte de la siguiente ecuación: N= N0 . e –Kt N= número de sobrevivientes N0= número inicial de microorganismos K es la tasa de muerte (min -1) t es el tiempo de exposición al agente. El coeficiente K (pendiente de la recta) es función de las condiciones de esterilización (temperatura, tenor de humedad, concentración del agente) y de la resistencia del microorganismo al proceso de esterilización. Cuando se trata de esterilización por calor se determina el tiempo en el cual una fracción defina del microorganismo muere independientemente del inóculo inicial. Denominado tiempo de reducción decimal (D) esto es el tiempo

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requerido para reducir la población microbiana un 90 % o un orden de magnitud. N=N0. 10 –1 Menores valores de D significan una mayor tasa de muerte o una muerte más rápida. Graficando el logaritmo del número de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición a un determinado agente esterilizante se obtiene una recta. La pendiente está dada por -1/D y la ordenada al origen es Log N0. Por lo explicado anteriormente, la pendiente de la recta está determinada por las condiciones de esterilización y de la resistencia del microorganismo. Cuando el Log del número de sobrevivientes es menor a cero se habla de probabilidad de sobrevivencia. Por lo tanto cuando el valor de la probabilidad sea -1 significa que hay 0.1 microorganismos viables por unidad, o correctamente expresado: una unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas. Un producto se considera estéril cuando la probabilidad de encontrar unidades contaminadas es menor o igual a 10 -6, esto es una unidad contaminada cada millón de unidades idénticas procesadas. (Medigan, 2010)

Grafico 1. Representacion de tiempo de reducción decimal (D).

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Uno de los métodos físicos de esterilización es el calor: todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del mismo. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos. El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Se utiliza el autoclave con y sin presión. El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. A su vez el calor seco puede utilizarse directa o indirectamente. La primera puede realizarse por

incineración o por llama

directa y la segunda con aire caliente utilizando hornos. La esterilización por llama directa se utiliza principalmente para eliminar microorganismos del ansa, teniendo en cuenta las distintas zonas de temperatura que presenta esta fuente de calor para evitar la formación de aerosoles. Cabe recordar que un mechero Bunsen alcanza un halo de esterilidad del aire de 30 cm. (Medigan, 2010). Otro método físico empleado en la desinfección del aire, agua, alimentos y gabinetes de seguridad biológica es la radiación ultravioleta (UV), considerada una alternativa a la desinfección química para la reducción de formas vegetativas de bacterias, virus y hongos. Posee propiedades germicidas en un rango de longitudes de onda de entre 100 y 280 nm. El mecanismo de inactivación de la UV se debe a la transformación fotoquímica de las pirimidinas en el ADN bacteriano o viral formando dímeros impidiendo de esta manera la multiplicación. Las tasas de inactivación microbiana varían dependiendo de la especie de microbios, la población microbiana y la longitud de onda de la luz UV. Estas radiaciones pueden ser de cuatro tipos UV entre 100 y 200 nm, UVC entre 200 y 280 nm, UVB entre 280 y 315 nm, y UVA entre 315 y 400 nm dependiendo de su longitud de onda. La aplicación práctica de la desinfección UV se basa en la capacidad germicida de UVC y UVB. La radiación UV 254 nm destruye en primer término a las formas vegetativas bacterianas, luego a los virus y por último a las formas esporuladas (Wright y Cairns, 1998). La UV no penetra superficies sólidas, opacas, adsorbente de luz y su utilidad se limita a la desinfección de superficies (Medigan, 2010).

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Esquema 1. Espectro de radiaciones. www.alimentosargentinos.gob.ar

La radiación emitida se mide en Watts (W) y la intensidad de la radiación en W/m². Para una desinfección eficaz es importante conocer la dosis de radiación necesaria para reducir la carga del microorganismo, la misma es el producto entre la intensidad de la radiación (I), expresada como energía por unidad de área y el tiempo de residencia o contacto con la luz UV (t) en segundos. La dosis (D) se mide en J/m² (1 Joule = 1 Watt): D (J/m²) = I (W/m²) x t (s) También suele expresarse en mJ/cm2 = μW s/cm2 La resistencia de los organismos a la luz ultravioleta es variada. El ambiente en el que se encuentran también influye en la dosis necesaria para su destrucción. La relación entre la dosis y la destrucción de un microorganismo por tratamiento con luz UV puede verse de la siguiente forma N = N0 e-KD Donde: N0 = número inicial de microorganismos

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N = Numero de microorganismos después del tratamiento Para M. tuberculosis la dosificación necesaria para inactivar 1 Log es de 6 mWs/cm2 y para reducir 2 log es necesario aplicar 10 mWs/cm2. Mientras que para M. smegmatis es de 200J/m2 (Dominguez; www.alimentosargentinos.gob.ar). Y para reducir la misma cantidad de M. intracellulare yM. fortuitum son necesarias 25 y 103 mJ/cm2 respectivamente (Bohrerova y Linden, 2006) . Otra alternativa dentro de los agentes germicidas la constituyen los químicos. La resistencia de los microorganismos a

estos, no es uniforme debido a

diferencias en la estructura, tamaño y características de los microorganismos, jerarquizando la resistencia a los distintos agentes químicos (Leon et. al., 2004). Las variables que influyen en la efectividad de los procesos de desinfección son: el tiempo de contacto con el desinfectante, la carga bacteriana y la cantidad de materia orgánica presente (Vives et. al., 2004). La velocidad de muerte mediante agentes químicos o físicos sigue una recta de orden logarítmico, donde el número de microorganismos muertos en cada período de tiempo es un porcentaje constante del número de microorganismos vivos al comienzo de dicho período ( Vives et. al., 2004) . Al aplicar la ley de Chick - Watson en el empleo de germicidas químicos es necesarios agregar la concentración del desinfectante: N/No= e-KTC El tiempo necesario para destruir los microorganismos presentes en un área a desinfectar es directamente proporcional al logaritmo de la concentración inicial. Por lo tanto, se requiere mayor tiempo para destruir concentraciones altas de microorganismos (Vignoli , 2008). El mecanismo bactericida de los alcoholes consiste en solubilizar las membranas lipídicas celulares y desnaturalizando sus proteínas. La máxima eficacia se alcanza al diluirlos en agua hasta alcanzar una concentración final de 70° en el caso del alcohol etílico ya que en concentraciones mayores la deshidratación inicial de las proteínas celulares las hace resistentes a la 17

desnaturalización (Adams , 2001). La temperatura influye en la desinfección química aumentando la velocidad de muerte por cada grado de incremento de la misma. La actividad de un agente antimicrobiano se ve influenciado por los cambios de pH. El pH influye sobre los desinfectantes químicos determinando el grado de disociación de sus moléculas activas y este hecho puede estar estrechamente ligado al poder antimicrobiano. (Vignoli , 2008). La presencia de materia orgánica puede alterar dichas combinaciones disminuyendo la concentración efectiva con la consecuente pérdida parcial o total de eficacia (por causas como adsorción superficial del desinfectante por coloides, formación de compuestos inertes o bien la presencia de una capa protectora formada por el microorganismo que impida el contacto adecuado) (Vignoli , 2008). La mayoría de los desinfectantes de uso corriente actúan eficientemente frente a formas vegetativas de bacterias. Las bacterias Gram positivas en general son más sensibles que las Gram negativas a algunos desinfectantes. Las formas que ofrecen mayor resistencia son las esporas bacterianas y las bacterias acido alcohol resistentes las cuales se ven afectadas por algunos de los agentes químicos luego de prolongados períodos de exposición. (Vives et. al., 2004; Leon, et. al., 2004). Los mecanismos de acción desinfectante son complejos. Una de las clasificaciónes de los agentes desinfectantes se basa en el blanco de acción (Vignoli , 2008). De acuerdo al lugar de la célula sobre el cual actúan tenemos a) Pared y membrana celular: provocan una desorganización de la pared y/o membrana celular interfiriendo con sus funciones, pudiendo ocasionar la pérdida de diferentes metabolitos. Ej: Aldehídos, tensioactivos aniónicos, agentes quelantes, fenoles y derivados. b) Material nuclear: provocan reacciones de alquilación de las bases puricas 18

(guanina y adeninas) reemplazando un atomo de hidrógeno con un grupo alquilo,causando el daño o muerte del microorganismo Ej.: Agentes alquilantes, colorantes, acridinas, óxido de etileno. c) Grupos enzimáticos o proteínas: provocan desnaturalización y precipitación de las proteínas por oxidación o alquilación de grupos sulfhídrilos, carbonilos, etc. Ej: Agentes oxidantes, halógenos, agentes alquilantes y alcoholes (Arévalo, et. al., 1996). Niveles de eliminación de microorganismos Los agentes químicos pueden ser clasificados desde diferentes puntos de vista. El C.D.C. (Center of Disease Control) en 1985 definió los niveles de Eliminación de microorganismos como: esterilización , desinfección de alto nivel; desinfección de nivel intermedio; desinfección de bajo nivel. La desinfección de alto nivel destruirá todos los microorganismos, con la excepción de un alto número de esporas bacterianas. La desinfección de nivel intermedio inactiva Mycobacterium tuberculosis, formas vegetativas, muchos virus, muchos hongos, pero no necesariamente esporas bacterianas. Una desinfección de bajo nivel puede eliminar muchas bacterias, algunos virus y algunos hongos, pero no puede eliminar microorganismos resistentes tales como M. tuberculosis y esporas bacterianas. La Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) editó en 2009 las normas para la determinación de la actividad bactericida de desinfectantes y antisépticos que se utilicen en forma líquida y que sean miscibles en agua. En todos los casos se debe tener en cuenta: la elección de la cepa bacteriana, el tiempo de contacto,

el umbral de actividad mínima buscada y las

condiciones físico-químicas en que se realiza el ensayo.

19

PROBLEMA CIENTIFICO

Es reconocido que todo el personal que trabaja en un laboratorio de microbiología está expuesto a una serie de riesgos biológicos a partir de las muestras que se procesen y de los cultivos que se manipulen. Específicamente en el laboratorio de investigación de micobacterias ambientales reconocemos dos situaciones donde debemos valorar el proceso de inactivación total de las micobacterias que, debido a que su viabilidad, resultaría un riesgo potencial de infección por la formación de aerosoles. Dichas situaciones son : 1) en los procesos de manipulación de las cepas aisladas para tipificación bioquímica y 2) en el procesamiento de las muestras ambientales con menor carga de microorganismos que el proceso antes mencionado. El mayor riesgo de contaminar las superficies de trabajo se produce cada vez que se destapan los tubos tapa a rosca conteniendo micobacterias, cuando se suspenden cepas, así como en la incineración del ansa cargada de microorganismos en el mechero de Bunsen debido a la

generación de

aerosoles de partícula mínima. Por su pequeño tamaño pueden permanecer largo tiempo en la campana hasta que son sedimentados y de no ser inactivados física o químicamente, ante débiles corrientes de aire generadas por la manipulación dentro de la campana pueden re suspenderse nuevamente. Los bacilos pueden permanecer viables en equipos o soluciones de trabajo contaminadas durante períodos prolongados lo cual induce a obtener resultados falsos positivos. (Ramos, et. al., 1999); (Kantor, et. al., 1999)

La realización de controles rutinarios o periódicos son un excelente indicador para evaluar el adecuado funcionamiento de los proceso de inactivación. El punto crítico de control establecido es la campana de contención después de manipular cepas de micobacterias ambientales. En el laboratorio de micobacterias, perteneciente a la

Cátedra

de

Microbiología de la Universidad Nacional de La Pampa se manipulan fundamentalmente

especies

micobacterias

no

tuberculosas

para

la

20

investigación. Como resultado de estas prácticas el personal de laboratorio, está expuesto a los riesgos antes mencionados, siendo entonces, necesaria la validación de los procesos de inactivación empleados con el propósito de minimizar el riesgo biológico en este laboratorio. La cepa elegida para este trabajo fue Mycobacterim porcinum. Es una micobacteria no cromógena de crecimiento rápido descrita por Tsukamura y colaboradores en 1983, asociada a infecciones en animales, que no ha sido referida en muestras clínicas humanas hasta el año 2004

donde fue

identificado como Mycobacterium fortuitum tercera biovariedad D-sorbitolnegativo. Existen reportes de aislamiento en casos de osteomielitis esternal posquirúrgica en porcinos (Idigoras et. al., 2007) y hallazgo de necropsia en los nódulos linfáticos de animales. (Wallace et. al., 2004). Tiene capacidad para formar en medios como el MB 7H9 (MB) con y sin glicerol (Oriani et. al., 2013).

HIPOTESIS La combinación de

alcohol 70º y la luz ultravioleta sobre

un inoculo

previamente secado por calor de M. porcinum son efectivos para reducir el número de bacterias viables en un tiempo inferior a 120 minutos.

OBJETIVOS

El objetivo general de este trabajo es valorar una combinación de un método físico y químico en el proceso de inactivación en micobacterias ambientales.

Objetivo especifico

Evaluar el procedimiento de desinfección con alcohol 70º y UV

en la

campana de contención, posteriormente a la manipulación de una cepa de Mycobacterium porcinum.

21

MATERIALES Y METODOS El proceso de aislamiento de MA se realiza en una campana de contención vidriada con puerta tipo guillotina (foto1) que cuenta con mechero de bunsen y luz ultravioleta. Se trabajó con una cepa de M. porcinum aislada de agua corriente de la ciudad de General Pico La Pampa en época estival, tipificada bioquímicamente y molecularmente. Se establecieron 5 sitios (foto 2) 1, 2, 3, 4 y 5 con una superficie de 25 cm2 delimitados por una plancha de acero inoxidable,

cada uno a 3 cm del

mechero de Bunsen. Se preparó una suspensión de un cultivo joven de M. porcinum equivalente al tubo 1 de Mac Farland (3 x 108 b/ml). Los sitios se contaminaron con 100µL (5 x 25 µL) de dicha suspensión. Se esperó el tiempo necesario hasta el secado de las mismas (aproximadamente 50 min) con el mechero encendido y la campana cerrada alcanzando una temperatura de 27 +/- 2 ºC. Una vez seco, se hisopó el sitio 1 para establecer el número real de bacterias al comenzar el experimento. Para el muestreo de todas las áreas, se utilizaron hisopos estériles embebidos en solución de NaCl 0,85% estéril. Una vez muestreada la superficie el hisopo se resuspendió en 3 mL de solución de NaCl 0,85%. A la cual se le determino el número de M. porcinum viables, siguiendo el método de las diluciones en base 10 sembrando 100 µL, por duplicado, en placas con agar Müller Hinton (MH). Además se inocularon 100 µL de la suspensión en tubos pico de flauta con medio Lówenstein Jensen (LJ) para observar posibles alteraciones en el fenotipo de la colonia. Las placas y tubos se incubaron a 32ºC hasta la visualización de colonias (foto 3). Posteriormente se aplicó

en toda la campana de contención con mechero

apagado, el tratamiento de desinfección propuesto, que consistió en la pulverización de alcohol 70º (diluido al momento del experimento) y a la exposición de

UV (260 nm) durante 1 hora (el tubo de luz UV se encuentra

ubicado a 72 cm del área a muestrear, los rayos inciden en forma perpendicular a la muestra). La campana se mantuvo cerrada y la habitación iluminada con luz natural y artificial.

22

Cada 30 minutos se realizaron los muestreos correspondientes a los sitios preestablecidos (2, 3, 4 y 5) correspondiéndoles 30, 60, 90 y 120 minutos de tratamiento respectivamente. Se determinó el tiempo de reducción decimal para el pre tratamiento de secado y el método de desinfección con alcohol 70 º y UV en 30 minutos.

Foto1. Campana vidriada con puerta guillotina.

Foto 2. Distribución de los sitios de muestreo 1 (N0 real), 2, 3, 4, 5 (sitios muestreados del tratamiento químico- físico).

23

RESULTADOS En la siguiente tabla se muestra el número de bacterias en el inoculo inicial (N0), el número de bacterias/mL (N0r) resultante de la acción desecación y el número final de micobacterias/mL Nf obtenido posteriormente a acción

del

alcohol 70° y UV expresada en logaritmo de reducción después de 30, 60, 90 y 120 min. de exposición. Los ensayos fueron realizados por duplicado Tabla 1: recuento de viables de M. pocinum en agar MH Ex N0 B/mL N0r B/mL Nf30 B/mL Nf60 B/mL Nf90 B/mL Nf120 B/mL

1

8.6x108

8x105

8x104

neg

neg

Neg

2

6.92x107

2x104

4x102

neg

neg

Neg

3

3.5x108

1.38x105

4x103

neg

neg

Neg

4

5.7x108

2.8x104

4x102

neg

neg

Neg

N0: bacterias/ml del inoculo inicial; N0r: sobrevivientes al tratamiento físico por calor; Nf30 Nf60 Nf90 Nf120, poesterior al tratamiento con alcohol 70°-UV

Tabla 2 . Tiempo de reducción decimal de M.porcinum por acción del secado en campana de contención durante 50 min de exposición Ex

N0 Log10 mL-1

N0r Log10 mL-

Red.Unid Log10 (D)30 min

1

8,9

5,9

3

16,66

2

7,8

4,3

3,5

14,28

3

8,5

5,1

3,4

14,7

5

8,7

4,4

4,3

11,6

_ X

14,56

24

Tabla 3 . Tiempo de reducción decimal de M.porcinum por acción del alcohol 70º y UV durante 30 min de exposición. Ex N0 Log10 mL-1 N0r Log10 mLRed. Unid (D) min Log10 1

5,9

4,9

1

30

2

4,3

2,6

1,7

17,64

4

5,1

3,6

1,5

20

5

4,4

2,6

1,8

16,6

_ X

21,6

El inoculo se redujo entre 2 y 4 logaritmos por la acción de la desecación lograda campana de vidrio, cerrada y con el mechero encendido durante 50 minutos con una temperatura ambiente de 27+/-2ºC. Con el tratamiento de alcohol 70° y UV (perpendicular y a 72 cm del área problema) la reducción de microorganismos fue de 1 a 4 logaritmos (gráfico 4). Cabe destacar que a partir de los 60 minutos de tratamiento no se recuperaron micobacterias viables, pudiendo inferir que puede existir una unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas.

25

Grafico 1. Reducción decimal observada en las 4 experiencias con M. porcinum 9 8 7 6 5

E1

4

E2

3

E3

2

E4

1 0

T0

T1 Tiempo min

Foto 3. Desarrollo de M.porcinum en L.J

T2

Foto 4. Desarrollo de M. porcinum en MH

26

DISCUSION Los resultados obtenidos demuestran que si bien se reduce el número de viables en el 50% de M. porcinum por el efecto de la desecación ocasionada en la muestra por la cercanía al mechero de bunsen, es importante destacar que el otro 50% permanece viable, pudiendo ser responsable contaminaciones cruzadas en cultivos negativos como de

tanto de

aumentar el riesgo

de infección en los operarios. Según lo publicado por algunos autores, entre 0.33% y 16% de los cultivos positivos a micobacterias

son falsos cultivos positivos,

debido al error de

transferencia cruzada ya sea por salpicaduras inadvertidas, fundamentalmente cuando se procesa un número de muestras superior a la media de procesamiento, o bien cuando las muestras son esporádicas y los operarios no están lo

suficientemente entrenados. Un estudio realizado en Argentina

detecto 27 episodios de contaminación cruzada sobre 12 laboratorios encuestados en el periodo comprendido entre 1996 y 2003

(Alonso, et. al.,

2007). La viabilidad de las micobacterias en los extendidos secados y/o fijados por calor fue comprobada por Allen, BW en 1987 cuando alimento adultos de Blatta orientalis con extendidos realizados con esputos humanos con tuberculosis que habían sido fijados por calor. Pudo recuperar micobacterias de las heces de dichos insectos. Resalta este estudio la importancia de no dejar extendidos sin colorear al descubierto fundamentalmente en la noche o en los horarios que no se trabaja en los laboratorios. Respecto al uso del alcohol 70º como micobactericida existe discrepancia entre los autores ya que algunos consideran que su uso en equipos de laboratorio parece ser un factor de riesgo

ya que encontraron mayor contaminación

cruzada en aquellos laboratorios que utilizaban dicho desinfectante

como

descontaminante (Boer, et al 2002). Sin embargo Griffiths et al, 1998 demostraron que el alcohol 70 es efectivo para inactivar a M.tuberculosis

y

Mycobacterium terrae, aunque

M.avium –

intracellulare mostro ser más resistente.

27

Estudios realizados con 9 aislamientos de micobacterias ambientales aisladas de suelo mostraron que una exposición de 25 min de al alcohol 70° inactivaron inoculos variables entre 104 b/mL a 109 b/ mL. (Oriani y Sagardoy, 2006). Nomura et al., (2000) comprobaron la efectividad en la desinfección de M. chelonae con etanol al 70 º en las máquinas de desinfección de broncoscopios, mientras que no obtuvieron los mismos resultados usando glutaraldehído al 2%. Es sabido que existen desinfectantes más potentes y rápidos en su accionar que el alcohol 70° como el glutaraldehído 0,5% y el hipoclorito de sodio 0.2% que destruyen Mycobacterium fortuitum en 10 min y 5 min respectivamente (Leon et. al, 2002) Es importante agregar que el glutaraldehído es un agente de alto poder desinfectante

de amplio espectro de acción, es activo en

presencia de material orgánico y no es corrosivo Su desventaja principal es su toxicidad para el que lo manipula. El hipoclorito de sodio es un desinfectante de alto poder que tiene un uso clínico más limitado ya que disminuye su actividad con pH alcalino y materia orgánica. Otra desventaja es que corroe los metales por lo que no puede ser usado en equipos. (Meza Vera, 2006) . Asociado a la creciente preocupación por la exposición humana a M. avium en los sistemas de distribución de agua potable debido a su alta resistencia a la mayoría de los desinfectantes químicos en los procesos de tratamiento de agua, muchos países están estudiando el fenómeno de desinfección con UV como una nueva alternativa, debido a su notable eficacia contra protozoarios resistentes al cloro (Shin, et. al., 2008). Experimentos realizados por Lee, et. al. (2010) respecto a la radiación UV como desinfectante

con cuatro especies de micobacterias ambientales (M.

fortuitum, M.avium, M.intracellulare y M.lentiflavum) determinaron que la susceptibilidad fue especifica de especie, siendo el más resistente M. fortuitum . Estos autores también comprobaron que las micobacterias fueron entre 2 y 10 veces más resistentes a los rayos UV que E. coli.

28

Está comprobado además que una exposición de 20 minutos a la luz UV (85mJ/cm2/s) es suficiente para inactivar una suspensión 1 Mac Farland de Mycobacterium brumae ( Julian Gomez et. al., 2008) Shin, et. al. (2008) determinaron que la dosis de UV necesaria para lograr la inactivación de 1 log de distintas cepas de M, avium y de M. intracellulare oscilo entre 3,5 y 7 mJ/cm2. Estos investigadores detectaron además que una cepa de M. avium fue más resistente que la mayoría de los protozoos y bacterias patógenas. ; (Collins, 1970) (Lee et. al., 2010). Hijnen y colaboradores, (2006)

informaron sobre el incremento de la

resistencia de bacterias ambientales a la radiación UV necesitando mayores dosis para inactivar el mismo número de bacterias. Esto puede deberse al al efecto tailing o cola , ( modificaciones a la ley de Chick y Watson) que se refieren a cierto número de microoganismos dentro de una población que presentan protección estructural y persistencia fenotípica lo que hace que no se inactiven luego de la exposición al desinfectante. Se ha demostrado que la persistencia fenotípica es un factor importante a considerar cuando se evalúan las curvas de dosis-respuesta de un desinfectante (Pennell et. al., 2007). Considerando nuestros resultados podemos inferir que no se presentó dicho efecto debido, posiblemente, a la combinación de los dos métodos. Mycobacterium terrae fue estudiado por Bohrerova y Linden (2006) quienes midieron la inactivación con UV y la capacidad de foto-reparación bacteriana utilizando 4 lámparas de 15 W/cm2 a 45-52 cm. Los resultados indicaron que M. terrae fue el más resistente de las bacterias estudiadas por otros autores como Bacillus subtilis y E. coli. Es reconocido que las cepas de micobacterias ambientales pigmentadas son más resistentes a los efectos nocivos de la UV debido a la presencia de los carotenos que evitan la foto oxidación, favoreciendo su permanencia en el medio ambiente. La capacidad de reparación en las micobacterias depende fundamentalmente de la especie en estudio siendo las que presentan más desarrollada esta capacidad: M. tuberculosis, M.marinum y M. parafortuitum. 29

Podemos inferir, según nuestros resultados, que la metodología empleada en este proyecto cumplió con lo mencionado por Kovacs et. al., (1999) respecto a la valoración de los germicidas. Ya que obtuvimos reducciones del orden 6 o más logaritmos.

30

CONCLUSIONES. •

Existe contaminación cruzada en los laboratorios de micobacterias

debido a la transferencia de bacilos cuando se procesan secuencialmente muestras positivas y muestras negativas, conduciendo a

consecuencias

desfavorables ya sea desde, la proyección de los datos estadísticos, hasta el incremento del riesgo de los operarios. •

El procedimiento bacteriológico más vulnerable para el aislamiento de

micobacterias de diferente origen (muestras clínicas y/o ambientales) es la descontaminación de las muestras, específicamente por la generación de aerosoles y microgotas.

•

En los

extendidos de micobacterias y/o salpicaduras

el efecto del

secado por calor reduce un 50 % en número de viables, siendo este un punto crítico en la contaminación cruzada de muestras.

•

La combinación de la luz UV y la pulverización con alcohol 70º son

suficientes para reducir el número de M. porcinum a una unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas en un periodo de tiempo entre 30 y 60 minutos.

•

El efecto del secado de la muestra ocasiono una disminución de viables

más rápida (D= 14,56) que la combinación del alcohol 70 y la UV (D= 21,6).

31

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